CN110628725B - 柑橘黄化脉明病毒突变体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘黄化脉明病毒突变体，是在CYVCV的外壳蛋白基因上进行定点突变或者基因插入/缺失获得，定点突变是指将外壳蛋白基因上的第6817位碱基T突变为C得到，基因插入/缺失是指外壳蛋白基因上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰共486个碱基片段被绿色荧光蛋白基因mgfp5序列替换。该突变体的构建方法：(1)质粒酶切：pCY‑CYVCV‑mcp(T→C)突变体构建的酶切反应采用限制性内切酶SalI和Rsrl，pCY‑CYVCV‑△cp‑gfp突变体构建的酶切反应采用Bgl II；(2)PCR扩增突变体构建所需序列片段；(3)PCR产物与质粒酶切产物重组连接构建突变体质粒，测序验证。

Description

柑橘黄化脉明病毒突变体及其构建方法

技术领域

本发明属于病毒技术领域，具体涉及一种柑橘黄化脉明病毒突变体及其构建方法。

背景技术

柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow clearing vein virus，CYVCV)作为2009年我国发现侵染柑橘的一种新病毒，会引起柠檬和酸橙嫩叶脉明、黄化、叶片反卷和皱缩等症状，严重时可导致嫩叶脱落、叶脉坏死，造成树势衰弱、果实产量下降，有时甚至绝收；近几年，该病毒在我国柑橘产区的发生呈现逐年上升趋势。CYVCV不仅可以侵染柠檬、酸橙、香橼，产生严重为害，而且可以侵染甜橙、宽皮柑橘、葡萄柚等柑橘种类。同时，CYVCV在自然界具有高效的传播虫媒，在我国的绝大多数柑橘产区均已检测到CYVCV病毒的存在。因此，CYVCV具有暴发流行的巨大风险，已经成为影响我国柑橘产业尤其是柠檬产业的一个重要问题。CYVCV的致病机理目前尚不清楚，柑橘在分子水平上响应CYVCV侵染的机制也尚不明确，这很大程度地限制了对于该病毒的有效防控。植物病毒侵染性克隆构建是研究病毒基因功能和致病机理的基础，对病毒侵染性cDNA进行定点突变、插入、置换等构建系列突变体是研究病毒基因功能有效策略。

CYVCV为正义单链RNA病毒，病毒粒子呈弯曲线状，属于甲型线性病毒科病毒科(Alphaflexiviridae)印度柑橘病毒属(Mandarivirus)。CYVCV可通过柑橘粉虱和绣线菊蚜(Aphis spiraecola传播，也可通过嫁接以及田间农事操作工具传播。目前，CYVCV致病相关基因的研究尚未有报道，对于CYVCV基因组上各基因功能的了解也是通过亲缘关系较近的病毒或基因组结构相似的病毒进行推测。CYVCV基因组包含有6个ORFs，其中ORF2、ORF3和ORF4组成了三基因连锁结构(Triple gene block，TGB)。

侵染性cDNA克隆是指具有侵染性的cDNA或cDNA具有侵染性的体外转录物。因DNA病毒的DNA本身就可当作侵染性克隆，其最早用于侵染性克隆构建，但DNA病毒基因组的易重组性限制了其应用。20世纪90年代，随着反转录及体外转录技术的发展和反转录酶的商业化，研究者可以广泛利用植物RNA病毒的cDNA克隆进行研究，使RNA病毒的侵染性克隆构建取得了很大进展。植物病毒侵染性cDNA克隆克服了RNA病毒难以遗传操作的限制，可提供病毒功能基因组学信息和背景单一可靠的遗传材料，可通过定点突变和DNA重组技术研究病毒基因的表达与复制、病毒移动与致病机理以及病毒与寄主互作等，同时植物病毒侵染性克隆可改造成为表达载体用来表达外源蛋白，也可作为一种抗病毒策略。植物病毒的侵染性克隆可根据启动子选用的不同分为两种类型：一类是侵染性RNA(病毒cDNA具有侵染性的体外转录物)：含有病毒全长基因组cDNA序列的载体经线性化后，体外转录为具有侵染活性的RNA；另一类是侵染性cDNA：在花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子控制下的病毒基因组cDNA。侵染性cDNA克隆策略是将病毒的全长cDNA融合在CaMV35S真核启动子的下游，将此cDNA克隆质粒接种寄主，质粒DNA进入寄主细胞后利用35S启动子启动病毒基因组全长cDNA的转录，从而产生侵染性的RNA，继而进行病毒基因组的复制与表达。

植物病毒侵染性cDNA克隆的成功构建为多项研究工作的进一步开展奠定了坚实基础：1、植物病毒基因功能研究构建侵染性克隆已成为研究病毒基因组功能的基本手段；研究者可通过对病毒侵染性cDNA进行定点突变、插入、置换等构建系列突变体从而研究病毒基因功能。2、植物病毒表达载体构建：植物病毒侵染性克隆经改造可以作为高效的植物外源蛋白基因表达载体；目前已有多种植物病毒侵染性克隆改造为植物表达载体用于外源基因的表达，并在生产中得到了广泛应用。不同基因组结构和功能的病毒，构建表达载体的策略也不同。3、弱毒系交叉保护：弱毒系交叉保护(Mild strain cross protection，MSCP)是指植物受某一病毒株系(通常是弱毒株系)侵染后，可以免受同种病毒的不同株系或亲缘关系较近的另一种病毒(即强毒株或挑战毒株)的侵染；获得弱毒株系的传统方法主要有三种：从自然发病的植株中选择，在发病群题中生长状况较好的植株就最有可能是感染了弱毒株系而受到了保护作用，防治柑橘衰退病毒病的弱毒株系就是如此发现的；通过高温诱变获得；化学诱变获得。随着植物病毒侵染性克隆构建技术的发展，研究者可以在明确病毒致病力和基因组功能的基础上，通过定点突变获得弱毒株系。利用植物病毒侵染性克隆表达病毒的基因也能介导对病毒的交叉保护作用。4、植物病毒VIGS载体：植物病毒侵染性克隆可以改造为VIGS(Virus-induced gene silencing，病毒诱导的基因沉默)载体进行植物基因功能研究，其策略是将植物未知功能的目的基因插入到病毒载体中，接种植物后可诱导目的基因发生基因沉默而出现表现变异，从而通过植物表现或生理指标的变化来推测该基因的功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述问题，提供一种柑橘黄化脉明病毒突变体及其构建方法。

本发明的技术方案如下：

一种柑橘黄化脉明病毒突变体，所述突变体是在柑橘黄化脉明病毒的外壳蛋白基因上进行定点突变或者基因插入/缺失获得，所述定点突变是指将外壳蛋白基因上的第6817位碱基T突变为C得到，所述基因插入/缺失是指外壳蛋白基因上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰共486个碱基片段被绿色荧光蛋白基因mgfp5序列替换。

在上述技术方案中，所述定点突变或者基因插入/缺失是在CYVCV强致病力侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221基础上获得，所述侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221是将CYVCV分离株AY221的序列插入进载体pCY中得到，所述CYVCV分离株AY221的核酸序列如序列SEQ ID NO:3所示，定点突变获得突变体pCY-CYVCV-mcp(T→C)，基因插入/缺失获得突变体pCY-CYVCV-△cp-gfp。

上述的柑橘黄化脉明病毒突变体的构建方法，包括如下步骤：

(1)pCY-CYVCV-AY221质粒酶切：pCY-CYVCV-mcp(T→C)突变体构建的酶切反应采用限制性内切酶SalI和Rsrl，pCY-CYVCV-△cp-gfp突变体构建的酶切反应采用限制性内切酶BglII；

(2)PCR扩增突变体构建所需序列片段；

(3)PCR产物与pCY-CYVCV-AY211质粒酶切产物重组连接构建突变体质粒，测序验证突变体是否构建成功。

所述步骤(2)PCR扩增突变体构建所需序列片段具体包括：pCY-CYVCV-mcp(T→C)突变体构建扩增采用pCY-CYVCV-AY221质粒为模板，以引物对CP(T-C)1F/CP(T-C)1R、CP(T-C)2F/CP(T-C)2R扩增所需序列片段；pCY-CYVCV-△cp-gfp突变体构建扩增分别采用pCY-CYVCV-AY221质粒为模板、以引物CP-GFP1F、CP-GFP1R扩增，和采用GFP基因模板以引物CP-GFP2F、CP-GFP2R扩增；所述引物CP-GFP1F、CP-GFP1R、CP-GFP2F、CP-GFP2R、CP(T-C)1F、CP(T-C)1R、CP(T-C)2F、CP(T-C)2R的序列依次如SEQ ID NO:8～15所示。

所述GFP基因模板为pCY载体。

所述PCR扩增的反应体系为：LA Taq(5U/μl)0.5μL、2×GC缓冲液I12.5μL、dNTP混合液(各2.5mM)4μL、模板2μL、引物F(10μM)1μL、引物R(10μM)1μL、DN/RNase-free H₂O加至25μL；PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，36个循环；72℃5min。

本发明的有益效果是：本发明构建的CYVCV的cp上单碱基突变体对CYVCV的侵染力影响不大，但会使其致病力显著下降，构建的cp上片段序列缺失和非病毒序列的插入突变使CYVCV在某些柑橘品种上不仅致病力丧失且侵染率相较于野生型减少明显。本发明获得的突变体可应用于病毒基因功能研究、构建植物病毒表达载体、弱毒系交叉保护、构建植物病毒VIGS载体进而研究植物基因功能等等。

附图说明

图1为CYVCV全基因组核苷酸系统进化树。

图2为多重序列比对与MFE二级结构预测图(T⁶⁸¹⁷→C)。

图3为不同柑橘品种接种pCY-CYVCV-AY221或空载体pCY后的症状表现联合对比图。

图4为CYVCV突变体构建所需序列PCR扩增产物电泳图。

图5为pCY-CYVCV-△cp-gfp和pCY-CYVCV-mcp(T→C)与mgfp5和pCY-CYVCV-AY221多重序列比对图。

图6为尤力克柠檬接种CYVCV突变体、pCY-CYVCV-AY221(野生型)或pCY(空载体)后的症状表现。

图7为烟草接种pTRV-cp、pCLBV-cp、pTRV或pCLBV后的症状表现。

图8为尤力克柠檬接种pCLBV-cp、pCLBV、pCY-CYVCV-AY221或pCY载体30d后的症状表现。

具体实施方式

实施例1构建CYVCV侵染性克隆

按照中国专利申请CN201810367775.0中实施例4中公开的方法构建CYVCV侵染性克隆，构建了22个CYVCV全长cDNA克隆，其中15个克隆完成了病毒全基因组序鉴定。从这15个CYVCV全长cDNA克隆中选取10个，其中7个是四川安岳来源的分离株构建的：CYVCV-AY222、CYVCV-AY221、CYVCV-AY212、CYVCV-AY112、CYVCV-AY142、CYVCV-AY141和CYVCV-AY132，另外3个是来源于重庆的分离株构建的：CYVCV-CQ451、CYVCV-CQ331和CYVCV-CQ101。

将以上10个CYVCV全长cDNA克隆质粒(命名为pCY-CYVCV-AY/CQ)分别电击转化农杆菌C58C1，并通过农杆菌真空浸润法接种指示植物尤力克柠檬(将尤力克柠檬鲜果种子播于MS固体培养基上，26℃黑暗培养，待种子萌发根长至3-5cm即可用于接种)，每克隆侵染6株，并以pCY空载体(即为中国专利申请201810367775.0中的载体pCY)为负对照，以强毒株系为正对照。

实施例2不同CYVCV全长cDNA克隆差异分析

一、不同CYVCV全长cDNA克隆以农杆菌介导接种尤力克柠檬

(1)致病性比较

①RT-PCR鉴定

待接种植株长出2-4片新叶，抽提植株叶片总RNA，反转录为cDNA，以2×TaqMaster Mix(Novoprotein)试剂盒进行PCR扩增检测，反应体系如下：

试剂	使用量
		2×Taq Master Mix	10μL
DN/RNase-free ddH<sub>2</sub>O	7μL
		CYVCV-614F(10μM)	1μL
CYVCV-614R(10μM)	1μL
		cDNA	1μL

引物CYVCV-614F(SEQ ID NO:1)序列为：5’-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3’，引物CYVCV-614R(SEQ ID NO:2)序列为：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’。

PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，36个循环；72℃5min。

②血清学鉴定

以直接组织点免疫检测(Direct tissue blot immunoassay，DTBIA)，具体方法参照如下文献进行：宾羽,宋震,李中安,周常勇.柑橘黄化脉明病毒DTBIA检测方法的建立[J].园艺学报,2015,42(9):1843-1850。

利用CYVCV免疫层析试纸对接种苗木平行进行CYVCV血清学鉴定。该CYVCV免疫层析试纸即为中国专利申请201710333029.5中的免疫胶体金试纸条。

③生物学鉴定

对接种苗木长出的新叶做好症状观察记录。

(2)病毒基因组序列差异分析

①构建系统进化树

根据测得的CYVCV病毒全基因组cDNA克隆序列，利用MEGA 6.0软件将所选择的10个全长cDNA克隆的CYVCV序列与目前GenBank中已登录的CYVCV序列进行比对分析，以Neighbor-joining法构建系统进化树，其中‘bootstrap’设定为1000次重复。

②二级结构分析

对安岳来源的7个CYVCV全长cDNA克隆，在上一步病毒全核苷酸序列比对的基础上寻找某些统一差异位点，并对差异位点附近的序列片段使用RNAfold web server进行二级结构预测，并绘制二级结构图。

(3)实验结果

①致病性差异分析

不同CYVCV全长cDNA克隆共10个分别以农杆菌真空浸润接种尤力克柠檬幼苗各6株，在浸润后第50d，对各植株样品分别平行进行RT-PCR、血清学(DTBIA和免疫层析试纸)鉴定以及症状观察，以鉴定各克隆的侵染性和致病力。如表1，通过RT-PCR鉴定显示10个克隆中除pCY-CYVCV-AY142外，其它9个均具有侵染性，其中pCY-CYVCV-AY212、pCY-CYVCV-AY221、pCY-CYVCV-AY222、pCY-CYVCV-CQ451、pCY-CYVCV-CQ331、pCY-CYVCV-CQ101在尤力克柠檬的侵染率分别为5/6(83.33％)、6/6(100％)、5/6(83.33％)、5/6(83.33％)、4/6(66.66％)和5/6(83.33％)，感染CYVCV-AY212、CYVCV-AY221(AY221的核酸序列如SEQ IDNO:3所示)、CYVCV-AY222、CYVCV-CQ451、CYVCV-CQ331、CYVCV-CQ101的柠檬上通过DTBIA和免疫层析试纸可检测到CYVCV的外壳蛋白，并且这些克隆与CYVCV野生型一样可引起尤力克柠檬叶片皱缩和侧脉黄明化的症状；另外3个克隆pCY-CYVCV-AY132、pCY-CYVCV-AY141、pCY-CYVCV-AY112在尤力克柠檬上的侵染率分别为3/6(50％)、2/6(33.33％)和3/6(50％)，但被侵染的尤力克柠檬上无生物学症状或症状轻微，同时CYVCV外壳蛋白血清学检测均为阴性。因此我们认为CYVCV-AY132、CYVCV-AY141、CYVCV-AY112可能为CYVCV弱毒株；此外，CYVCV外壳蛋白血清学检测为阳性的尤力克柠檬均有症状表现，从而推测CYVCV的外壳蛋白或是影响其致病的相关因素。

表1不同CYVCV全长cDNA克隆在尤力克柠檬上的侵染力比较

②不同CYVCV全长cDNA克隆的基因组序列差异分析

a、系统进化树分析

将该10个CYVCV分离物的全长cDNA克隆中病毒全核苷酸序列与GenBank中已登录的CYVCV序列进行比对分析，以Neighbor-joining法构建系统进化树。进行比对用的GenBank中已登录的CYVCV序列及其来源和序列号为：CYVCV-GD(中国广东，KX156739)、CYVCV-HN(中国湖南、KX156744)、CYVCV-FJ(中国福建、KX156737)、CYVCV-CQ(中国重庆、KP313240)、CYVCV-YN(中国云南、KP313242)、CYVCV-PK(巴基斯坦、KP313241)、CYVCV-Y1(土耳其、JX040635)。

如图1所示，进化树分析结果表明，四川安岳来源的CYVCV-AY132、CYVCV-AY141、CYVCV-AY142、CYVCV-AY112、CYVCV-AY212、CYVCV-AY221、CYVCV-AY222与CYVCV-YN聚未一簇，而重庆来源的CYVCV-CQ451、CYVCV-CQ331、CYVCV-CQ101与CYVCV-CQ、CYVCV-GD、CYVCV-HN、CYVCV-FJ聚为一簇。联合上一步的致病性差异分析结果发现，四川安岳来源中的4个弱毒或无侵染性的CYVCV-AY132、CYVCV-AY141、CYVCV-AY142、CYVCV-AY112聚为一簇，另外具有侵染和致病性的CYVCV-AY212、CYVCV-AY221、CYVCV-AY222聚为一簇。进一步研究同样来源于四川安岳却具有不同侵染和致病性的这7个CYVCV分离物的全基因组cDNA序列中是否存在某些统一差异位点。

b、二级结构分析

以致病性强弱和侵染性有无将四川安岳来源的7个CYVCV分离物分为A、B两组，A组为有侵染和致病性的CYVCV-AY212、CYVCV-AY221、CYVCV-AY222，B组为弱毒或无侵染性的CYVCV-AY132、CYVCV-AY141、CYVCV-AY142、CYVCV-AY112。以Clustal W法将这这两组分离物的全基因组cDNA与CYVCV云南分离物(CYVCV-YN)cDNA进行多重序列比对分析，寻找组间统一差异位点。结果共筛选到了6个统一差异碱基位点，这些位点分别位于CYVCV基因组的三基因连锁模块(Triple gene block，TGB)和外壳蛋白(Coat protein,CP)基因上。对差异位点附近的cDNA序列使用RNAfold web server进行mRNA二级结构预测，并绘制MFE二级结构图(Minimum free energy secondary structures)。

相对于CYVCV-YN和有侵染和致病性的A组主序列，弱毒或无侵染性的B组序列中的统一变异位点分别为位于TGB区域的T⁵³⁰⁶→C，A⁵⁴⁸²→G，T⁵⁷⁹²→C，A⁶⁰⁵⁸→G，C⁶⁰⁹⁶→T，以及位于CP基因上的T⁶⁸¹⁷→C；对两组分离物序列比对所展示出的部分序列预测其mRNA二级结构，结果显示A⁵⁴⁸²→G，A⁶⁰⁵⁸→G，C⁶⁰⁹⁶→T和T⁶⁸¹⁷→C(如图2所示)的突变对其二级结构有明显改变。CYVCV基因组上编码外壳蛋白的ORF5(Open reading frame,ORF)的3’端与编码P23蛋白的ORF6的5’端有部分重叠，其中T⁶⁸¹⁷→C突变位点位于ORF6前的第9位碱基，因此该突变可能不仅会影响CP还可能会影响ORF6的复制和翻译。基于以上结果，推测这些位点的突变或包含突变位点的TGB和CP基因可能影响或参与CYVCV的侵染和致病。

二、CYVCV全长cDNA侵染性克隆以农杆菌介导接种不同柑橘品种

(1)在不同柑橘品种上的侵染率比较

RT-PCR检测、血清学检测检测方法同前。

(2)接种后不同时期不同柑橘品种内病毒相对含量测定

对各柑橘品种在接种后感染CYVCV的植株，在接种后的第25d、50d、75d和100d进行幼叶取样，提取总RNA，并进行反转录合成cDNA，随后以CYVCV外壳蛋白基因检测引物(引物见表2)进行实时荧光定量PCR测定CYVCV含量，其中采用柑橘Actin基因(引物为CitActin-F、CitActin-R)作为对照。

表2实时荧光定量PCR扩增引物

实时荧光定量PCR体系如下：2×SYBR Green Supermix 12.5μL、DN/RNase-freeddH₂O 11.1μL、CYVCV-qF(10μM)0.2μL、CYVCV-qR(10μM)0.2μL、cDNA 1μL。扩增条件：95℃2min；(95℃10s，60℃30s，采集荧光)×40个循环；扩增后采集溶解曲线：95℃15s后以每30s上升0.5℃的速度从60℃到95℃采集荧光信号。每个样品3个技术重复，同时设置正、负和水对照。根据Ct值，以CitActin内参基因进行校正，采用2^-ΔΔCt方法分析CYVCV含量(cp相对表达量)。

(3)不同柑橘品种植株上的症状观察

对各柑橘品种在接种后感染CYVCV的植株，在接种后的第25d、50d、75d和100d对新生叶片的症状表现进行观察记录。

(4)结果

a、不同柑橘品种上的侵染率

将上一步中已鉴定过侵染和致病性的CYVCV侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221以农杆菌介导真空浸润接种不同柑橘品种，每个品种浸润8株，通过RT-PCR、DTBIA和免疫层析检测对CYVCV侵染性克隆在不同柑橘品种上的侵染率进行测定。结果显示，pCY-CYVCV-AY221在新生椪柑、太田椪柑、鲁斯克枳橙、锦橙、赛蒙斯甜橙、脆香甜柚、代代酸橙、费米耐劳柠檬和尤力克柠檬上的侵染率分别为25％、37.5％、62.5％、50％、75％、87.5％、87.5％、75％和100％。由此可见，pCY-CYVCV-AY221不仅可以侵染以上9个不同的柑橘品种，还具有高的侵染率。

b、不同时期不同柑橘品种内病毒相对含量

对各柑橘品种在接种后感染CYVCV的植株，于接种后的第25dpi(dayspostinoculation)、50dpi、75dpi和100dpi进行qRT-PCR检测，并以25dpi鲁斯克枳橙为对照分析CYVCV含量(cp相对表达量)。结果显示，不同柑橘品种在接种后的不同时期中CYVCV含量大多具有显著差异，尤力克柠檬和费米耐劳柠檬体内的CYVCV含量在4个时期均位于前三位，一直保持显著较高的水平。对各品种中CYVCV含量绘制变化趋势图发现：脆香甜柚、代代酸橙、费米耐劳柠檬、尤力克柠檬和鲁斯克枳橙5个品种中CYVCV含量在100dpi时显著高于最初25dpi时的含量；锦橙、赛蒙斯甜橙、太田椪柑、新生椪柑4品种CYVCV含量在100dpi显著低于于最初25dpi时的含量；这9种柑橘品种中CYVCV含量在不同时期并不是稳定不变，而是处于波动变化的状态，除太田椪柑体内CYVCV含量在50dpi和75dpi之间无显著变化外，其余品种在4个时期的CYVCV含量均有显著性变化。将各品种在不同时期的CYVCV含量(cp相对表达量)和症状表现对应比较分析，结果发现整体上CYVCV含量(cp相对表达量)与品种植株上其症状表现严重程度有一定的正相关。我们将100dpi时各柑橘品种植株上的症状表现、CYVCV外壳蛋白血清学检测(DTBIA)和CYVCV含量(cp相对表达量)构建联合对比图，如图3所示，CYVCV含量(cp相对表达量)较高的品种植株对应的DTBIA外壳蛋白血清学检测结果显色更加明显，其相应症状表现也更严重。这进一步说明了CYVCV外壳蛋白(基因)可能是其致病的重要因素。

三、结论

本实施例对10个CYVCV全长cDNA克隆在尤力克柠檬上的侵染进行鉴定比较，获得了9个具有侵染性的CYVCV全长cDNA克隆，其中3个为弱致病力侵染性克隆，6个为强致力侵染性病克隆。弱致病力侵染性克隆在尤力克柠檬上通过血清学未检测到病毒外壳蛋白，且在尤力克柠檬上的侵染率低于强致病力克隆。将弱致病力或无侵染性克隆与强致病力侵染性克隆的病毒基因组序列进行比对，筛选到了T⁵³⁰⁶→C，A⁵⁴⁸²→G，T⁵⁷⁹²→C，A⁶⁰⁵⁸→G，C⁶⁰⁹⁶→T和T⁶⁸¹⁷→C共6个稳定差异位点，其中A⁵⁴⁸²→G，A⁶⁰⁵⁸→G，C⁶⁰⁹⁶→T和T⁶⁸¹⁷→C会引起二级结构的改变，A⁵⁴⁸²→G，A⁶⁰⁵⁸→G，C⁶⁰⁹⁶→T位于CYVCV基因组TGB区域内，T⁶⁸¹⁷→C位于CP基因上。我们分析认为，A⁵⁴⁸²→G，A⁶⁰⁵⁸→G，C⁶⁰⁹⁶→T和T⁶⁸¹⁷→C四个位点以及包含它们的TGB和CP基因可能参与或影响病毒的侵染和致病；其中T⁶⁸¹⁶→C位点不仅位于CP基因上，它还位于于编码P23的ORF6前第9位碱基，该位点的的突变会使CYVCV中第2273位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为脯氨酸(Pro)，因此该突变可能不仅会影响CP基因mRNA二级结构还可能会影响其后的ORF6的复制和翻译，是一个值得深入研究其作用的位点。

pCY-CYVCV-AY221可侵染以上9个柑橘品种植株，且具有高的侵染率，最低在太田椪柑上侵染率为25％，最高在尤力克柠檬上侵染率可达100％；在接种后的不同时期，虽然各个品种植株内的CYVCV含量(cp相对表达量)均是波动变化的，但柠檬品种中CYVCV含量(cp相对表达量)与其他品种相比一直处于较高水平，且其新叶持续表现皱缩和侧脉明化的症状；不同品种在接种后的不同时期整体来看CYVCV含量(cp相对表达量)高的品种植株其症状表现也更严重。这表明，cp可能与CYVCV的致病性密切相关是其致病的重要因素，这也与我们不同致病性侵染性克隆序列比对分析结果对应。

实施例3构建CYVCV突变体

在实施例2的研究基础上，本实施例通过对CYVCV强致病力侵染性克隆cDNA上的cp序列进行加工和修饰(定点突变、基因插入/缺失)，构建CYVCV突变体，对CYVCV致病相关基因和位点进行分析验证。

一、实验材料：

CYVCV外壳蛋白抗体由浙江大学生物技术研究所洪健研究员惠赠。酵母菌株YPH501、农杆菌菌株C58C1由法国波尔多大学Thierry Candresse教授惠赠。基于柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus，CLBV)cDNA侵染性克隆载体pCLBV(即中国专利申请CN201810367775.0中构建的pCY-CLBV)由本实验室构建。烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus，TRV)载体pTRV由北京农学院姚允冲教授馈赠。

LigaFast Rapid DNA Ligation System购自Promega公司；限制性内切酶均购自New England Biolabs(NEB)公司；大肠杆菌DH10B感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司；Endo-free Plasmid Mini Kit II(无内毒素小量质粒提取试剂盒)购自OMEGA公司；DNA Marker、PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(RNA反转录试剂盒)、LA

with GC Buffer(高保真PCR扩增试剂盒)、

HD Cloning Kit购自TaKaRa公司；2×Taq Master Mix购自Novoprotein公司。

二、实验方法

(1)CYVCV突变体构建

以CYVCV强致病力侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221为骨架，对克隆质粒上CYVCV基因组进行定点突变或基因插入/缺失以构建突变体，分别为cp上(T⁶⁸¹⁷→C⁶⁸¹⁷)点突变的突变体pCY-CYVCV-mcp(T→C)；cp上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰共486个碱基片段被绿色荧光蛋白基因(mgfp5)序列替换的突变体pCY-CYVCV-△cp-gfp。

①pCY-CYVCV-AY221质粒酶切

pCY-CYVCV-mcp(T→C)突变体构建的酶切反应体系：10×NEB缓冲液(CutSmart)5μL、pCY-CYVCV-AY221质粒1μg、限制性内切酶SalI 1μL、限制性内切酶Rsrl II 1μL、加ddH₂O至50μL，37℃，孵育0.5h，4℃过夜,酶切目的产物：14853bp。pCY-CYVCV-△cp-gfp突变体构建的酶切反应体系：10×NEBuffer(3.1)5μL、pCY-CYVCV-AY221质粒1μg、限制性内切酶BglII 1μL、加dd H₂O至50μL，37℃，孵育0.5h，4℃过夜，酶切目的产物：15296bp。

酶切产物回收：以

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒回收纯化酶切目的片段，步骤参照试剂盒说明书。

②PCR扩增突变体构建所需序列片段

扩增引物：根据各突变体构建的需要设计序列扩增引物，引物信息如表3。pCY载体上含有绿色荧光蛋白基因片段，可以用pCY载体为模板扩增mgfp5。

表3构建CYVCV突变体所用引物

PCR扩增体系：

以所需序列片段以LA

with GC Buffer(高保真扩增试剂盒)按如下体系进行扩增：

试剂	使用量
		TaKaRa LA Taq(5U/μl)	0.5μL
2×GC缓冲液I	12.5μL
		dNTP混合液(各2.5mM)	4μL
模板	2μL
		引物F(10μM)	1μL
引物R(10μM)	1μL
		DN/RNase-free H<sub>2</sub>O	加至25μL

PCR扩增条件：94℃3min；(94℃30s，60℃30s，72℃2min)×36；72℃5min。

PCR扩增产物回收：以

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒进行扩增产物纯化回收，步骤参照试剂盒说明书。

③PCR产物与pCY-CYVCV-AY211质粒酶切产物重组连接构建突变体质粒

a、重组连接体系

将上一步中PCR产物和质粒酶切线型产物以各突变体构建的需要按照

HDCloning试剂盒说明进行重组连接，连接体系如下：

试剂	使用量
		纯化DNA片段-1	100ng
纯化DNA片段-2	100ng
		线型载体	200ng
5×In-Fusion HD Enzyme Premix	2μL
		Nuclease-free ddH<sub>2</sub>O	加至10μL

反应条件：50℃水浴30-45min，置于冰上等待转化，余下-20℃保存。

b、连接产物转化大肠杆菌DH10B

取以上连接产物4-5μL转化大肠杆菌DH10B，转化方法参照感受态细胞说明书。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落扩繁后以表3中的引物进行菌液PCR鉴定，随后将阳性菌液送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序验证突变体是否构建成功。

c、CYVCV突变体质粒提取

将测序验证正确的大肠杆菌单克隆扩繁，以Endo-free Plasmid Mini Kit II无内毒素质粒提取试剂盒提取突变体质粒，提取方法参照试剂盒说明书。

(2)CYVCV突变体质粒转化农杆菌

将各CYVCV突变质粒pCY-CYVCV-mcp(T→C)、pCY-CYVCV-△cp-gfp分别电击转化农杆菌C58C1，挑取农杆菌单菌落扩繁后以以表3中的引物进行菌液PCR鉴定。

(3)农杆菌介导CYVCV突变体接种尤力克柠檬

a、柑橘苗木准备：将尤力克柠檬鲜果种子播于MS固体培养基上，26℃黑暗培养，待种子萌发根长至3-5cm，即可用于接种。

b、农杆菌接种菌液配制

将分别携带pCY-CYVCV-mcp(T→C)、pCY-CYVCV-△cp-gfp的农杆菌按照如下步骤配制接种菌液：吸取200μL活化的农杆菌加入40mL的农杆菌扩繁培养基中，28℃，200rpm扩繁培养菌液至OD₆₀₀＝1.0；4℃，6000rpm离心8min，弃上清收集菌体；以农杆菌接种缓冲液重悬菌体配置接种液，使得样品OD₆₀₀＝1.0，沉默抑制子OD₆₀₀＝0.3～0.5(沉默抑制子由本实验室提供)。

c、农杆菌真空浸润柑橘

将CYVCV突变体以农杆菌介导真空浸润接种尤力克柠檬幼苗植株，每个突变体接种6株。以CYVCV强致病力侵染性克隆pCY-CYVCV-AY211作为对照。

(4)突变对CYVCV侵染和致病影响的分析

①RT-PCR鉴定

待接种植株长出2-4片新叶，即可抽提总RNA进行RT-PCR鉴定。以CYVCV-614F/R、GFP-F/R引物鉴定pCY-CYVCV-mcp(T→C)、pCY-CYVCV-△cp-gfp在尤力克柠檬植株上的侵染性。引物信息见表4。以2×Taq Master Mix(Novoprotein)试剂盒进行PCR扩增检测，反应体系如下：

试剂	使用量
		2×Taq Master Mix	10μL
DN/RNase-free H<sub>2</sub>O	7μL
		引物F(10μM)	1μL
引物R(10μM)	1μL
		cDNA	1μL

PCR扩增条件：94℃3min；(94℃30s，60℃30s，72℃45s)×36；72℃5min。

表4突变体侵染性鉴定引物

②生物学鉴定

对接种苗木新发叶片做好症状观察记录。

(5)CYVCV基因表达载体的构建

以CYVCV强致病力侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221为模板，扩增CYVCV的cp全序列，并将它们分别连接到pTRV和pCLBV载体上以构建各CYVCV基因表达载体。

①pCLBV和pTRV质粒酶切

酶切反应体系：

酶切产物回收：以

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒回收纯化酶切目的片段，步骤参照试剂盒说明书。

②PCR扩增CYVCV目的基因

扩增引物：根据CYVCV的cp序列设计扩增引物，并添加Sma I酶切位点，引物信息如表5。

表5构建CYVCV基因表达体所用引物

PCR扩增体系：

以CY-CP-Sma I F/R扩增cp cDNA。扩增体系参照LA

with GC Buffer(高保真扩增试剂盒)如下：

PCR扩增条件：94℃3min；(94℃30s，60℃30s，72℃2min)×36；72℃5min。

PCR扩增产物酶切：按照前面Sma I的酶切体系对PCR扩增产物酶切。

酶切产物回收：以

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒进行酶切产物纯化回收，步骤参照试剂盒说明书。

③PCR产物与线型载体连接构建表达质粒

酶连体系：将上一步中PCR酶切产物和线型化载体分别以LigaFast Rapid DNALigation System连接，连接体系如下：

连接产物转化大肠杆菌DH10B：取以上连接产物4-5μL转化大肠杆菌DH10B，转化方法参照感受态细胞说明书。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落扩繁后以表4中的引物进行菌液PCR鉴定，随后将阳性菌液送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序验证表达体质粒是否构建成功。

CYVCV基因表达质粒提取：将测序验证正确的大肠杆菌单克隆扩繁，以Endo-freePlasmid Mini Kit II无内毒素质粒提取试剂盒提取CYVCV基因表达质粒，提取方法参照试剂盒说明书。

(6)CYVCV基因表达载体质粒转化农杆菌

①农杆菌感受态细胞制备

②CYVCV基因表达载体转化农杆菌

将各CYVCV基因表达载体pCLBV-cp、pTRV-cp分别电击转化农杆菌C58C1，pCLBV、pTRV和pCY-CYVCV-AY221同步转化。

③农杆菌菌液PCR检测验证

挑取农杆菌单菌落扩繁后以表4中的引物进行菌液PCR鉴定。

(7)农杆菌介导CYVCV基因表达载体接种尤力克柠檬和本生烟

①苗木准备

将尤力克柠檬鲜果种子播于MS固体培养基上，26℃黑暗培养，待种子萌发根长至3-5cm，即可用于接种。本生烟种子播于营养土中，待长出4-6片真叶时即可用于接种。

②农杆菌接种菌液配制

将分别携带pCLBV-cp、pTRV-cp的农杆配制接种菌液，pTRV载体相关接种菌液配制时注意TRV1与TRV2按1:1混合。

③农杆菌真空浸润柑橘

将CYVCV各基因表达载体以农杆菌介导真空浸润接种尤力克柠檬幼苗植株各6株和本生烟3株，以pCLBV、pTRV和pCY-CYVCV-AY221作为对照。

(8)CYVCV基因在柑橘和烟草上的表达及致病分析

①生物学鉴定

对接种CYVCV基因表达载体的本生烟和尤力克柠檬每周做好症状观察和记录，分析比较携带CYVCV的基因对于pTRV和pCLBV致病性的影响。

②RT-PCR检测

待接种植株长出新叶，即可抽提总RNA进行RT-PCR检测。对于接种pCLBV-cp和pTRV-cp的植株以CYVCV外壳蛋白基因检测引物CYVCV-614F/R来检测cp。并以TRV-F/R和CLBV-F/R鉴定病毒载体是否成功侵染植株。以2×Taq Master Mix(Novoprotein)试剂盒进行PCR扩增检测。

三、实验结果与分析

(1)CYVCV突变体构建

①pCY-CYVCV-AY221质粒酶切

为构建CYVCV突变体，将pCY-CYVCV-AY221质粒进行酶切为引入突变做准备。BglII酶切pCY-CYVCV-AY221以备后续构建pCY-CYVCV-△cp-gfp载体，SalI和RsrlII双酶切pCY-CYVCV-AY221以备后续构建pCY-CYVCV-mcp(T→C)载体，酶切结果符合预期，获得了目的片段。

②通过PCR获取突变体目的片段

为了构建各突变体，通过PCR扩增所需序列片段，结果如图4所示，各突变体构建所需序列片段都成功扩增。

③CYVCV突变体质粒构建

将以上PCR产物与pCY-CYVCV-AY221质粒酶切目的片段重组连接构建CYVCV突变体质粒。将突变体质粒测序结果与pCY-CYVCV-AY221和mgfp5序列比对，结果如图5所示，突变体突变体pCY-CYVCV-△cp(T→C)在pCY-CYVCV-AY221的cp上引入点突变(T⁶⁸¹⁷→C⁶⁸¹⁷)；突变体pCY-CYVCV-△cp-gfp将cp上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰的序列替换为mgfp5序列，测序表明CYVCV突变体构建成功，符合预期。(2)CYVCV突变体的侵染性和致病性鉴定

①突变体侵染性鉴定

农杆菌介导各突变体真空浸润接种尤力克柠檬，待接种植株长出2-4片新叶，抽提植株总RNA，DNase I处理去除DNA后通过RT-PCR鉴定各突变体对尤力克柠檬的侵染性。

如表6所示，CYVCV侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221在尤力克柠檬上的侵染率为6/6(100％)，与实施例2中的侵染率一致；cp上单碱基突变(T⁶⁸¹⁷→C⁶⁸¹⁷)的pCY-CYVCV-mcp(T→C)突变体侵染率为5/6(83.33％)；cp上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰序列替换为绿色荧光蛋白基因序列的pCY-CYVCV-△cp-gfp突变体侵染率为3/6(50％)。因此，cp上T⁶⁸¹⁷→C⁶⁸¹⁷单碱基突变对CYVCV的侵染力影响较小(侵染率相较于野生型降低16.67％)，而cp上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰序列缺失和非病毒序列的插入突变对CYVCV的侵染力影响较大(侵染率相较于野生型减少50％)。

表6 CYVCV突变体与CYVCV-AY221(野生型)在尤力克柠檬上30dpi的侵染率比较

*感染植株/接种植株(侵染率)

②CYVCV突变体的指示植物鉴定

对接种CYVCV突变体和野生型的尤力克柠檬植株进行生物学症状观察。结果如图6所示，感染pCY-CYVCV-AY211(野生型)的尤力克柠檬植株叶片表现出严重的皱缩、侧脉黄明化等柑橘黄明病典型症状；感染CYVCV-mcp(T→C)的植株叶片有轻微卷曲和黄化的表现，但无侧脉明化症状；感染CYVCV-△cp-gfp的植株与接种空载体对照的植株一样无任何病症表现。由此可见，cp区域的大片段序列突变均会使CYVCV丧失致病性，且cp上T⁶⁸¹⁷→C⁶⁸¹⁷的单碱基突变会使CYVCV致病力显著减弱。

(3)CYVCV基因表达载体的构建

①pCLBV和pTRV载体质粒酶切

将pCLBV与pTRV质粒分别以Sma I酶切，载体片段分别为18565bp和9818bp，符合线型化载体的大小预期。

②CYVCV目的基因扩增

根据CYVCV的cp序列设计添加Sma I酶切位点的扩增引物，以pCY-CYVCV-AY221为模板进行扩增，扩增产物经Sma I酶切后，cp大小为978bp，符合预期。

③CYVCV基因表达质粒克隆构建

将前述所获cp cDNA分别与线型化的pCY-CLBV和TRV2载体连接，连接产物转化大肠杆菌构建CYVCV基因表达质粒克隆，对大肠杆菌进行PCR检测和测序鉴定，我们获得了pCLBV-cp、pTRV-cp两个CYVCV基因的表达质粒，将它们分别转化到农杆菌，随后挑取单菌落扩繁后进行PCR检测，以CY-CP-Sma I F/R引物检测转化cp表达质粒的农杆菌单克隆均扩增到978bp目的片段，这表明CYVCV基因表达质粒成功转化农杆菌。

(4)CYVCV基因在柑橘和烟草上的致病与表达分析

①CYVCV基因的致病性分析

对接种CYVCV基因表达载体的植株进行生物学症状观察，分析比较携带CYVCV基因的病毒载体和未携带CYVCV基因的病毒载体在本生烟或尤力克柠檬上的致病性。

如图7所示，接种对照pTRV和pCLBV载体的烟草均长势良好，无异常病症表现；pTRV-cp和pCLBV-cp注射接种的烟草植株，在5dpi时接种叶片注射区域有明显的黄化，在10dpi时植株顶端非接种新叶表现出萎黄和花叶，在15dpi时植株大多数叶片出现萎蔫和坏死，且所有接种pTRV-cp和pCLBV-cp的烟草植株在20至30dpi时均系统性黄萎和坏死。

对于尤力克柠檬，如图8所示，接种对照pCLBV和pCY载体的尤力克柠檬均长势良好，无病症表现。接种pCLBV-cp且能检测到CLBV核酸和CYVCV cp核酸的尤力克柠檬植株新叶上有轻微的斑驳黄化。

综上生物学观察结果，pTRV-cp和pCLB-cp加速了烟草的系统性坏死，其在烟草上的致病力较空载体显著增强；且携带cp也使pCLBV在尤力克柠檬上的致病力增强，由此推测cp是CYVCV的重要致病因素。

②CYVCV基因检测

农杆菌介导各表达载体接种尤力克柠檬和本生烟，待接种植株长出新叶，抽提植株总RNA，DNase I处理去除DNA后通过RT-PCR检测本生烟和尤力克柠檬上植株目的基因。如表7所示，我们在接种pTRV-cp和pCLBV-cp的烟草植株的新叶上均检测到了cp。如表8所示，对于尤力克柠檬，pTRV及其构建的表达载体均未能成功侵染，未检测到病毒载体和CYVCV目的基因；而pCLBV及pCLBV-cp可以侵染尤力克柠檬，对于接种表达载体的尤力克柠檬中，能检测到pCLBV的植株上均能检测到cp。

表7 RT-PCR检测接种各表达载体的本生烟

^a感染株数/接种总株数

表8 RT-PCR检测接种各表达载体的尤力克柠檬

^a感染株数/接种总株数

(5)结果分析

本实施例中，通过对CYVCV强致病力侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221进行加工和修饰构建了2个CYVCV突变体，分别是cp上单碱基突变(T⁶⁸¹⁷→C⁶⁸¹⁷)的pCY-CYVCV-mcp(T→C)突变体，cp上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰序列片段缺失并伴有非病毒序列插入的pCY-CYVCV-△cp-gfp突变体。通过分析突变体的侵染性和致病力，我们发现与野生型对照相比，以上突变体在尤力克柠檬上的侵染率均有不同程度的降低，并且致病力均有明显降低。同时以pTRV和pCLBV病毒载体构建CYVCV的cp表达载体，通过分析比较各载体在烟草和柠檬上的侵染性和致病力，我们发现与空载体病毒相比，携带有cp的载体在烟草上的致病力显著增强(烟草系统性黄萎、坏死)，在尤力克柠檬上的致病力也有所增强(尤力克柠檬叶片轻微斑驳黄化)。由此可见，CYVCV的cp与其在植株上的系统侵染和致病相关。

CYVCV的cp上T⁶⁸¹⁷→C⁶⁸¹⁷单碱基突变对CYVCV的侵染力影响不大，但会使其致病力显著下降，感染pCY-CYVCV-mcp(T→C)的尤力克柠檬叶片仅表现轻微卷曲和黄化，并无皱缩和侧脉明化症状。而cp上片段序列缺失和非病毒序列的插入突变使CYVCV在尤力克柠檬上不仅致病力丧失且侵染率相较于野生型减少50％。接种pTRV-cp和p-CLBV-cp的烟草均表现出系统性黄萎和坏死；感染pCLBV-cp的尤力克柠檬上有轻微的斑驳黄化症状，但接种空载体病毒的植株并无症状表现。本研究认为cp是CYVCV重要的致病相关基因。

序列表

<110> 西南大学

<120> 柑橘黄化脉明病毒突变体及其构建方法

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taccgcagct atccatttcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcagaaatcc cgaaccacta 20

<210> 3

<211> 7530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaaagcaaa cataaccaac acacacccaa aattgtgatc atcgtctctg catcaacagc 60

tcagctaaga accagagaaa tggccactat taggggtgcc atcgaacgca ttacagacac 120

caccgtacgc actacacttc aagaggaggc atgccgccaa atacgcgctg aacttaaaaa 180

cgtcgaacac atcaaccgtt acgctataca gcctgacgcc gccgacgcac tcgaacacct 240

aggcattggt tctaacccct tctctgtggc actgcacacg cacggtgcct gcaaagctat 300

tgagaaccaa ttactctatg tagttggtac cttactccca aaagagcgtg tcaccatgct 360

cttccttaag aaaagcaagc tcaacatcat gaaacgctgc cctaaattcc aagacatctt 420

cctgaaccaa catattgaac cacgcgacgt ttctaggtac tgcgacttta acgtccaatc 480

cacctccacc agcataccca cacgaacggc ttacatcagt gacacactcc actttatgga 540

ccgtagagac ctagtccgac tattcctaaa cagcccaaat ctagagactc tctacgccac 600

cattgtcctc ccagtcgagg ctgcttacaa acaaccgagc cgctacccag agatatacca 660

gattaactat gatttcgacg gtttccagta catacctgga ggccatgggg gcggcgccta 720

ccaccacgag ttcgaacagc tgcaatggtt agacactggc catatccact ggcgtgggcc 780

cgactgtaaa gagattcgta tgacaattac cgcccaaatg ctcgaaagct taggtgcgaa 840

tcatcttttc tgcttcaaac gtgggaaact acacacccca cgtgtacgca ctttcggccg 900

agatacccaa gtgctcttgc ccaaaatctt ccgcccggcc gacaaaaact ttaacagggc 960

aataccacta accctagcta acaaactact cctgtacgct aaatccatta acacagtgac 1020

cttccgcgac gtcgttgcca agacacgcca acttatgaag gacaaggagc ttgaaacata 1080

caccggcaac gacctgctgc atatggccaa ctatttcttc gctgttggag cactgtcagg 1140

agttaactcc tatgaccaat tgcttggcct atccgcctgg gaagcctgca ccgtccgtat 1200

caagaacacc ataacaaatc tctgggagaa gatcgccgga aagaaagagt tcggcaagct 1260

attggaggcc cttgagtggg aaacattcac atactcacgt caagtgacag gattcaccgt 1320

tacgggactg cccgccctgc tccccctccc agacatctca gaccaagaag agattttcgc 1380

ccagcaggac gagttagaca aaattactgc cggcgctacc aagatacgga ccattgacat 1440

tatgcgggga caagctaacc gcgccaaccc aaaaactccg atcaacccaa caccggccca 1500

gggaccccaa ctgcccgaca cccgcgaccc aatcgaccaa gctgcctcca aagagctcgt 1560

caccaagctt cagaaaaaca aacgcattta catccaagac gacgggccgg aataccttat 1620

gggacacatg gctgaagtcc ccgcctggta tcttgaacaa gatgacacca ccactagact 1680

caaaaaccgc tgcgcttggt tcttcggccc acccacctac agatatgggc acaacgacat 1740

tgagtacacc accatagaat actacccttg ggtcgagcgt attggagcca ttttcggcaa 1800

gtacaacacc tgtctcgctc aaacttacga cgccggagcc cgtattggat accatgctga 1860

cgacgaagac tgctacgacc ccgacgtcac cgtggtcacc gtcaacctca ctgggaacgc 1920

caccttcctg ctcaagaccc taaccggcac taggacctgg aaactcaaac ctggtgactt 1980

cattatcatg aaacccggtg cccaaaggtg tacaaaacat gccattagag actgcacaac 2040

taaccgcaca tccttaacct tcagatggca ggcccgcact tgccccacta acctcagaaa 2100

gatcactaac ctacccaaag ccaccaacca accccaaacc actgaatggc gtcctgtaac 2160

taaaccacgc cctagcacca ccgcttccag cgacacccag accccacctg tcatagacca 2220

ggaacgaggg tataccacca cctccgacgt gacaccaacg attaggctgc ccgccgaaaa 2280

tggtaataac gccggtgctg gaccctcctc cgcattaacc ctcgccgact tgaatgataa 2340

ccaagcgccg accactaaca aaggaaaaga gaaacttgag gaaatggtcg aaactggccc 2400

aactatcatg gaacgcttcc tcaacaccgt tcaggaacca acacaagatt tatgggactc 2460

cgcctctgaa tccgccgcga gctacctcgc tgaaggcctc ggcatctctg ccatccaagc 2520

actcccttgg gcacctcact tggaactcat caatgcatta ggcttccagg gcactgaaag 2580

gcaatacggc ccagacaact gtctcatatg gcccatcacg cattacagag aattgcccag 2640

aagcaacaat gtcgaagccc ctccggaagt gcttgagctg ctcgactgca tcaatagata 2700

ccccactgac gtcccaatgc tcaaaactcg agccgccgcc ttcggttcag acgtcaagaa 2760

tctacgcata ggggcacttg ttaagaacca ggacaaacag tggcgcgcat cactcgcact 2820

actttgtgag gaaaatgaac acctcctccc taccactgta atacacggcg ctggtggctc 2880

cgggaaatcc catttactcc aacagtgggt ggcgtctact gagcgcggaa atgtagtcac 2940

catcttgcca actatcgaac tccttcgaga ctggcaaaac aaatgtccac acgcaccgaa 3000

agagactttc aaaaccttcg agaaagcgct catccagaac agcgcccccg tggttatcat 3060

ggacgactac tctaaacttc ccccagggta tattgaagcc tacgtcagcc tcaagggcca 3120

gtgcaaactt ctcatactca ctggagaccc tagacagagc cactatcatg aggagaaccc 3180

tgaggcctta atctctactc ttgaccccgc cacggactac tttggcaaat tttgtgcata 3240

caacatcaac gccactcata gaaatgccaa aaccttcgcc aatgcgcttg gggtgtactc 3300

tgaaaaagaa atccccacca ctatcacctg ctcatcctac cagaaaagcg gttggccaac 3360

acttgtccca tccatcctta aaagaactgc gctcaacgac atggggcagc gctcactaac 3420

ctacgcaggc tgtcagggac tcaccacccc aaaagtgcag atagttcttg acaacgccac 3480

tccactatgc tctgacaagg tcatgtacac cgcactatct agagcggtgg accaaatcca 3540

cttcttcaac actggcccaa atcacactga ttactgggaa aagatgaacg ccacaccttt 3600

cctcaaaact ttcatcgacc acacacgtga ggagaccttt gctgagcacc aacctgccga 3660

acccacagtg cgtgagtacg caccagcaac gcatttccca ccggctaacg agaacctagc 3720

actagagccg tgggttgaac cgctgactga taaacactcg cgggaactct tccactctgc 3780

cttaggccac agcaactgcg tccagactga aaacaccgta gtccaacttt ttccccacca 3840

acaggccaaa gacgaaacac tcttctggaa aacaatagat gccagaatca agataaccac 3900

cccggaagag aacatcaggg cttgcagcat ggccactgat attggcgaca tcttgttcct 3960

aaattacaaa gaagccatgg gcttaccaca agaccccata cccttcgaac aggcactctg 4020

ggactcttgt caagccgagg tgcaactaac ctacctcagc aagcctctgg cagcactcgc 4080

aaacgccgcc caaagacaag accccgactt tgactccaac aaaatccaac tcttcctgaa 4140

atcacaatgg gtcaagaaag tcgagaagat gggctgcctt aagatcaaac ccggccaaac 4200

tattgcgtct ttcatgcaac agactgtcat gctatacgga actatggctc ggtacatgcg 4260

ccgcatccgc acctcacttt gcccacccga aattatgatc aactgcgaga ccaacccaaa 4320

ccaaatcgga acatgggtgc gtgagtattg gaacttcaac acccagagcc atgagaatga 4380

ctttgaagcg ttcgaccagt cccaagacgc caacatgtta caattcgagc tcattaaggc 4440

caaataccac tcaatccccg aggagatcat cgccgggtat cgacacctga aatgcaacgc 4500

ccacatcttc cttgggacta tatcgatcat gaggttgtct ggtgaagggc cgaccttcga 4560

cgccaacaca gagtgttcca ttgcatacaa ccacacaagg tattttgtgc ctaaaggcac 4620

cgcccagctc tacgccggag acgactctgc atgcgcgtcg cccctctctg aaaaacccag 4680

cttccaacac atctcaccag aactcagcct caagtctaag gccaagatta gaacccaaca 4740

gaaaggagac tttgcaacct tctgtggctg gctcatcact ccaaaaggcc tgatcaaaaa 4800

ccccacccag ctttacgcct cctggttatt ggctaagcac aacaaagatc tcgcggacgt 4860

ggccagaaac tatgccttgg acttacgcat tgcctatcaa cttaaagacg agctctatga 4920

gttattatca cctgaagaac ttgaccacca ccaactgctc gtccgagaga tgatcaagca 4980

caaaatgggc catctcctca acctccctga ggggtttaaa acaaactaac tcgaaatgga 5040

cttacctgag ctcctgctat ccaaaaactt cattcgcacc cgattacccc tcgccaaacc 5100

cattgtcata cacgctgttg ctggcgccgg caagacacaa cttctcgaag aattcgcgcg 5160

gtcctcaccc tcaaccaaaa tctactcacc tgtgaaacat cactctaact cactgctgct 5220

ctcgcccttc cacaaagccc tctctgaagc ttccattgtc gacgagtacc ctctaagcca 5280

gatacacgag aacgtcgagt acatctttgc tgaccccatc caatacctgg gtaacccaaa 5340

ccttagaaaa ccccactaca tctgcgcgtc ttcccatcga tttggccatt ccaccgccgc 5400

tctcctaaca aaacttggca ttgaaactta cgcacataaa gaagataccg tccgggtaga 5460

caacatcttc caggctgaac cagacggcca aatcatcgcc tgcgaccgac ccactcaaga 5520

gctcgctgcc agacacacac tagactacct gaggccctgc gaaagcatag gactaacttt 5580

cccacgaacc acgatcctga tctctcacga acttactgca gataccctca ccaaagagat 5640

ttacatcggt ttgacccgcc actccaacca ccttctcata ctcactccgg atgcctctac 5700

aacctcctcc tgaccacact tgggctttcc gactactagc tcttggcgcc gccttagcac 5760

tgctcacttt cacgctcaac cgagacacaa gtcgtcacgt cggagatcct tctcactcac 5820

ttccttttgg agggtactac cgagacggca gcaaagtagt ccattataac tccccgagag 5880

ccacaaaacc tagcacccct tccttcctgt acctgacccc aatcttactg atcctactaa 5940

ttcatgcagt caatagattt actaatcctc gccattcttg ttcttgcact cattgccagc 6000

ctattccccg cacctgaacc ttgcacaatt gtagtctctg gtgcctcagc ctccgtaact 6060

aattgcccaa accccgaaca acttgcagag cttgtcagag cgcttaaacc ggctaaaccg 6120

gtttaaaact taacacaaac tcgaactcat gagcttcgac tacactcacc ctctctaccg 6180

cagctatcca tttccacact actgcgagtt cgaccggcac caactctgcg accatcatcc 6240

agtactcaaa cctccaacgc acaaacccag cgccccgaac tctctcatgt ctaccgacga 6300

caacaagggc aaacaaccac ttcacccgac accttcgggc cctaacgaca cgaccccgaa 6360

acctatccct gtacccactc cctcaattac gcccacagct gcaggtaagg aaaaccaaga 6420

gcccatcgaa aagcgtatca cacacgcttt ccacgctgaa gcaaaaaccc acaacaatgg 6480

ggtctctcca cctgccttca acccgaacaa catgaatgct gtgccgctga acctgctcaa 6540

cctcaaccta agatactcac cggtcactaa ctccatagct aaccctaaac agaccgaggc 6600

tatcgggaaa gcttgggtcc gcatcttgaa catcgatcct gccaacgtgt tcttatacgc 6660

catcgacctc gccagagctt gcgccgacgc gggctcctcc cctgaagctg atattattgg 6720

agcgaacgaa gatctcaacc ccgttgttga acgaaacgca ttggccctag tggttaggga 6780

tttctgcccg ctgcgcgctt tttgcgctta ctactctcgg gtggtatgga acctcatgat 6840

caaggcggac cagcctccgg ccaactggat gaaatccggg gtagacgaga acgcgaaatt 6900

cgcggcattc gacttcttcc atggtatcct ctcgcccgct tccctgtatg tgcccctaga 6960

gagacaccct acttccgcgg agaggatcgc aaatcaggcc atgttcgctg tgaaaattgc 7020

caacgctcca ggaaatggca cggacctcac gatggaccac gttgccttca ccaaaggaag 7080

gactacccag cactccggcc ttcgcccgac ccctttcaac atctaaccac ctttgaacca 7140

atactcctag catgcctaca agcccttaaa ccactacccc ccgaaatcca aacagctatc 7200

atttcgtgtg tgtgtgactt ctttaattcc ttacgctgtg ccagtagcaa gtaccagggc 7260

accagccgct cagctgtcaa acgtagagcg gctcgcctga actactgcta caagtgtggg 7320

caccccttat atttaaataa acctcacccc tgccgaccag gtcaattgtg ctctgcatct 7380

atctccgagc gcctctgttt gctccacaca ggaccgatta ggtttctaac cgaaaatcct 7440

gttagtgcca gagcagctca cttcctagcg cacgagctcc ttgaccccag atgaaacata 7500

aatattcagg ctttcagttt ccattttctg 7530

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccaactcac aaacccagtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgggctctt ggttttcctt 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catccctcag caccttcc 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccaaccttag cacttctcc 19

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcacaacaa agatctcgcg gacgtggc 28

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctttactta ctggatgatg gtcgcag 27

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tccagtaagt aaaggagaag aacttttcac tg 32

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aacggggttg agatctttgt atagttcatc catgccatgt 40

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agcttccatt gtcgacgagt accctctaag ccaga 35

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gggagtagta agcgcaaaaa gcgcgc 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgcttacta ctcccgggtg gtatg 25

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgcccaggt cggaccgcga ggaggtggag a 31

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agtaaaggag aagaactttt cactggagtt gt 32

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tttgtatagt tcatccatgc catgtgtaat cc 32

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tcccccggga tgagcttcga ctacactca 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcccccgggt tagatgttga aaggggtcg 29

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttgggttgct actgattcga ct 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctgtaaggac catcatactt cgc 23

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

attcactggg agatgatacg ct 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaatctaagt ccactcgtcc gt 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agccatagtt gaaccattcc tc 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcagatcatt caccacatgc 20

Claims (5)

1.一种柑橘黄化脉明病毒突变体，其特征在于，所述突变体是在柑橘黄化脉明病毒的外壳蛋白基因上进行定点突变或者基因插入/缺失获得，所述定点突变是指将外壳蛋白基因上的第6817位碱基T突变为C得到，所述基因插入/缺失是指外壳蛋白基因上C⁶²⁴⁵至A⁶⁷³⁰共486个碱基片段被绿色荧光蛋白基因mgfp5序列替换，所述柑橘黄化脉明病毒的外壳蛋白基因序列如序列SEQ ID NO:3所示；

所述定点突变或者基因插入/缺失是在CYVCV强致病力侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221基础上获得，所述侵染性克隆pCY-CYVCV-AY221是将CYVCV分离株AY221的序列插入进载体pCY中得到，所述CYVCV分离株AY221的核酸序列如序列SEQ ID NO:3所示，定点突变获得突变体为pCY-CYVCV-mcp(T→C)，基因插入/缺失获得突变体为pCY-CYVCV-△cp-gfp。

2.如权利要求1所述的柑橘黄化脉明病毒突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）pCY-CYVCV-AY221质粒酶切：pCY-CYVCV-mcp(T→C)突变体构建的酶切反应采用限制性内切酶Sal I 和Rsrl，pCY-CYVCV-△cp-gfp突变体构建的酶切反应采用限制性内切酶Bgl II；

（2）PCR扩增突变体构建所需序列片段；

（3）PCR产物与pCY-CYVCV-AY211质粒酶切产物重组连接构建突变体质粒，测序验证突变体是否构建成功。

3.如权利要求2所述的柑橘黄化脉明病毒突变体的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）PCR扩增突变体构建所需序列片段具体包括：pCY-CYVCV-mcp(T→C)突变体构建扩增采用pCY-CYVCV-AY221质粒为模板，以引物对CP（T-C）1F/CP（T-C）1R、CP（T-C）2F/CP（T-C）2R扩增所需序列片段；pCY-CYVCV-△cp-gfp突变体构建扩增分别采用pCY-CYVCV-AY221质粒为模板、以引物CP-GFP1F、CP-GFP1R扩增，和采用GFP基因模板以引物CP-GFP2F、CP-GFP2R扩增；所述引物CP-GFP1F、CP-GFP1R、CP-GFP2F、CP-GFP2R、CP（T-C）1F、CP（T-C）1R、CP（T-C）2F、CP（T-C）2R的序列依次如SEQ ID NO:8～15所示。

4.如权利要求3所述的柑橘黄化脉明病毒突变体的构建方法，其特征在于，所述GFP基因模板为pCY载体。

5.如权利要求3所述的柑橘黄化脉明病毒突变体的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为： 5 U/μl LA Taq 0.5 µL、2×GC缓冲液 I 12.5 µL、dNTP混合液4µL、模板2 µL、10 μM引物F 1 µL、10 μM引物R 1 µL、DN/RNase-free H₂O 加至25µL；PCR扩增条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，36个循环；72℃ 5 min。

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