CN111334481B

CN111334481B - 大豆花叶病毒浸染性克隆及其构建方法和应用

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Publication number: CN111334481B
Application number: CN202010211053.3A
Authority: CN
Inventors: 王永志; 李小宇; 张淋淋; 李启云; 董英山
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: CN111334481A

Abstract

本发明提供了一种大豆花叶病毒浸染性克隆及其构建方法和应用，涉及生物技术领域。该大豆花叶病毒浸染性克隆中，大豆花叶病毒的p3基因区域内含有宿主的内含子片段，能够在大肠杆菌中增殖，浸染宿主后能使宿主产生SMV典型症状。

Description

大豆花叶病毒浸染性克隆及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种大豆花叶病毒浸染性克隆及其构建方法和应用。

背景技术

大豆花叶病是大豆的主要病害之一，由大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)侵染引起。SMV是由Clinton于1915年在豆科(Leguminosae)大豆(Glycine max(L.)，Merr.)中发现的，并于1921年由Gardner和Kendrick命名，在病毒分类学上属马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。SMV粒体为线杆状，柔韧并常有弯曲，长约630～750nm，宽约13～19nm。病毒粒子由蛋白质与RNA组成。其中，蛋白质占94.7％，RNA只占5.3％，其分子量分别为2.60×10⁴～2.65×10⁴Da与2.9×10⁶～3.2×10⁶Da。SMV基因组有1个大的开放阅读框，编码1个多聚蛋白，在自身蛋白酶的作用下切割成P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、Nia、Nib、CP等成熟蛋白。

植物病毒侵染性克隆是植物病毒学研究的重要工具，大豆花叶病毒侵染性克隆的构建十分困难，其主要原因是SMV的P3蛋白对大肠杆菌具有毒性。因此一种改进的大豆花叶病毒浸染性克隆的构建方法是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种大豆花叶病毒浸染性克隆，该大豆花叶病毒浸染性克隆能够在大肠杆菌中增殖，浸染宿主后能使宿主产生SMV典型症状。

本发明的第二目的在于提供上述大豆花叶病毒浸染性克隆的构建方法。

本发明的第三目的在于提供所述大豆花叶病毒浸染性克隆，或所述大豆花叶病毒浸染性克隆构建方法的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种大豆花叶病毒浸染性克隆，所述大豆花叶病毒浸染性克隆中，大豆花叶病毒的p3基因区域内含有宿主的内含子片段。

优选地，所述内含子片段位于大豆花叶病毒的p3基因5’端，且与内含子片段相邻的碱基与宿主中相同。

优选地，所述大豆花叶病毒的全基因组序列如SEQ ID NO.53所示，所述内含子片段位于SEQ ID NO.53所示序列的2247位和2248位之间。

优选地，所述内含子片段包括大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段。

优选地，所述大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段包括lip3-intron1、lip3-intron2或lip3-intron3；

所述lip3-intron1的序列如SEQ ID NO.54所示；所述lip3-intron2的序列如SEQID NO.55所示；所述lip3-intron3的序列如SEQ ID NO.56所示；

优选地，所述大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段包括lip3-intron1。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述大豆花叶病毒浸染性克隆的构建方法，包括在大豆花叶病毒的p3基因区域内插入宿主的内含子片段。

优选地，所述构建方法包括如下步骤：

(a)使用引物对SMV1-26s/SMV2447a、引物对SMV2448s/SMV6085a和引物对SMV6071s/SMV9589a扩增大豆花叶病毒cDNA，得到大豆花叶病毒片段；所述引物对SMV1-26s/SMV2447a序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；所述引物对SMV2448s/SMV6085a序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.19所示；所述引物对SMV6071s/SMV9589a序列如SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21所示；

(b)扩增大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段，得到大豆内含子片段lip3-intron1、lip3-intron2或lip3-intron3；

所述lip3-intron1由引物对lip3-intron1s-1/lip3-intron1a-1扩增得到，引物对lip3-intron1s-1/lip3-intron1a-1序列如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；所述lip3-intron2由引物对lip3-intron2s-1/lip3-intron2a-1扩增得到，引物对lip3-intron2s-1/lip3-intron2a-1序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示；所述lip3-intron3由引物对lip3-intron3s-1/lip3-intron3a-1扩增得到，引物对lip3-intron3s-1/lip3-intron3a-1序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；

(c)使用引物对VectorF/VectorR扩增载体，得到载体片段；所述引物对VectorF/VectorR序列如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示；

(d)将步骤(a)得到的大豆花叶病毒片段，步骤(b)得到的大豆内含子片段，以及步骤(c)得到的载体片段连接，得到所述大豆花叶病毒浸染性克隆。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述大豆花叶病毒浸染性克隆，或所述构建方法在制备大豆花叶病毒浸染的植株中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有所述大豆花叶病毒浸染性克隆的重组微生物或植株组织；

优选地，所述重组微生物包括重组大肠杆菌。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有所述大豆花叶病毒浸染性克隆，或所述重组微生物或植株组织的试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的大豆花叶病毒浸染性克隆的p3基因区域内含有宿主的内含子片段，在利用大肠杆菌进行大豆花叶病毒浸染性克隆的构建时，由于大肠杆菌没有内含子切除机制，p3基因区域内的宿主内含子片段能够使大豆花叶病毒的p3基因在大肠杆菌中不能完整表达，避免了P3蛋白对大肠杆菌的毒性。该大豆花叶病毒浸染性克隆浸染至所述宿主中时，宿主可以切除p3基因区域内的宿主的内含子片段，使大豆花叶病毒p3基因重新正常表达P3蛋白，使大豆花叶病毒浸染性克隆重新包装出与原大豆花叶病毒完全一致的病毒。

本发明提供的大豆花叶病毒浸染性克隆的构建方法，只需将大豆花叶病毒的p3基因区域内插入宿主的内含子片段，即可避免P3蛋白对大肠杆菌的毒性。该构建方法操作简单，效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为SMV全基因组侵染性克隆质粒构建示意图；

图2为SMV侵染性克隆活性分析结果；

图3为SMV侵染性克隆接种植株的SMV衣壳蛋白westernblot分析结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种大豆花叶病毒浸染性克隆，该大豆花叶病毒的p3基因区域内含有宿主的内含子片段，所述宿主指的是大豆花叶病毒侵染的目标物种，例如当该大豆花叶病毒浸染性克隆用于侵染大豆时，所述宿主即为大豆。在利用大肠杆菌进行大豆花叶病毒浸染性克隆的构建时，由于大肠杆菌没有内含子切除机制，p3基因区域内的宿主内含子片段能够使大豆花叶病毒的p3基因在大肠杆菌中不能完整表达，避免了P3蛋白对大肠杆菌的毒性。该大豆花叶病毒浸染性克隆浸染至宿主中，宿主可以切除p3基因区域内的所述宿主的内含子片段，使大豆花叶病毒p3基因重新正常表达P3蛋白，使大豆花叶病毒浸染性克隆重新包装出与原大豆花叶病毒完全一致的病毒。

本发明通过实验发现，相比于将内含子片段插入靠近大豆花叶病毒的p3基因3’端，将内含子片段插入靠近大豆花叶病毒的p3基因5’端可以更有效的避免P3蛋白在大肠杆菌中表达。同时为了更好的使宿主的内含子片段融合于p3基因中，p3基因中与内含子片段相邻的碱基应与内含子片段在宿主中相同，例如若宿主中该内含子片段的相邻上下游分别是G，则该内含子片段插入p3基因后，与其相邻的上下游也应分别是G；若宿主中该内含子片段相邻的上游是A，下游是C，则该内含子片段插入p3基因后，与其相邻的上游是A，下游是C。

在一些优选的实施方式中，所述用于构建大豆花叶病毒浸染性克隆的大豆花叶病毒采自吉林省公主岭市农田，命名为SMV-gzl，SMV-gzl的全基因组序列如SEQ ID NO.53所示。大豆花叶病毒浸染性克隆中宿主的内含子片段位于SEQ ID NO.53所示序列的2247位和2248位之间。

在一些可选的实施方式中，所述内含子片段包括大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段。所述大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段包括lip3-intron1、lip3-intron2或lip3-intron3；其中lip3-intron1的序列如SEQ ID NO.54所示；lip3-intron2的序列如SEQID NO.55所示；lip3-intron3的序列如SEQ ID NO.56所示。通过实验发现，含有lip3-intron1内含子的大豆花叶病毒浸染性克隆的致病率是100％；含有lip3-intron2内含子的大豆花叶病毒浸染性克隆的致病率是37.5％；含有lip3-intron3内含子的大豆花叶病毒浸染性克隆的致病率是12.5％。因此大豆花叶病毒浸染性克隆中p3基因区域内优选含有序列如SEQ ID NO.54所示的lip3-intron1内含子。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有上述大豆花叶病毒浸染性克隆重组微生物，或被上述大豆花叶病毒浸染性克隆侵染的植株组织，以及含有所述的大豆花叶病毒浸染性克隆，所述重组微生物或所述植株组织的试剂盒。所述重组微生物可以使大豆花叶病毒浸染性克隆在重组微生物中克隆，或表达大豆花叶病毒的蛋白。重组微生物优选包括含有上述大豆花叶病毒浸染性克隆的重组大肠杆菌。该重组微生物、植株组织和试剂盒和上述大豆花叶病毒浸染性克隆基于相同的发明构思，因此含有上述大豆花叶病毒浸染性克隆的所有有益效果，在此不再赘述。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述大豆花叶病毒浸染性克隆的构建方法，该方法包括在大豆花叶病毒的p3基因区域内插入宿主的内含子片段。

在一些优选的实施方式中，所述大豆花叶病毒浸染性克隆的构建方法包括如下步骤：

(a)使用引物对SMV1-26s/SMV2447a、引物对SMV2448s/SMV6085a和引物对SMV6071s/SMV9589a扩增大豆花叶病毒cDNA，得到大豆花叶病毒片段；

所述引物对SMV1-26s/SMV2447a序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；

所述引物对SMV2448s/SMV6085a序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.19所示；

所述引物对SMV6071s/SMV9589a序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；

(b)扩增大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段，得到大豆内含子片段lip3-intron1、lip3-intron2或lip3-intron3；所述lip3-intron1由引物对lip3-intron1s-1/lip3-intron1a-1扩增得到，引物对lip3-intron1s-1/lip3-intron1a-1序列如SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25所示；所述lip3-intron2由引物对lip3-intron2s-1/lip3-intron2a-1扩增得到，引物对lip3-intron2s-1/lip3-intron2a-1序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示；所述lip3-intron3由引物对lip3-intron3s-1/lip3-intron3a-1扩增得到，引物对lip3-intron3s-1/lip3-intron3a-1序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；

(d)将步骤(a)得到的大豆花叶病毒片段，步骤(b)得到的大豆内含子片段，以及步骤(c)得到的载体片段能够连接。采用上述步骤(a)～(c)制备得到的各片段的两端含有与相邻片段同源的区域，可以采用无缝克隆的方法将各片段连接，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，得到所述大豆花叶病毒浸染性克隆。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述的大豆花叶病毒浸染性克隆，或所述构建方法在制备大豆花叶病毒浸染的植株中的应用。上述大豆花叶病毒浸染性克隆可以在大肠杆菌中增殖，使大豆花叶病毒浸染性克隆通过在大肠杆菌中增殖来大量获得；同时，该大豆花叶病毒浸染性克隆可以正常侵染宿主，使宿主产生大豆花叶病毒侵染的典型症状。因此将上述大豆花叶病毒浸染性克隆，或所述构建方法应用于制备大豆花叶病毒浸染的植株，效率高，成本低，且不会降低大豆花叶病毒浸染性克隆对宿主的侵染效果。

下面结合优选实施例说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例

本实施例使用的SMV病毒采自吉林省公主岭市农田，命名为SMV-gzl。大豆品种Williams由吉林省农业科学院大豆资源中心保存。

本实施例使用的试剂和材料包括TRIzol，DEPC，异丙醇，氯仿，乙醇，胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉，氨苄青霉素，琼脂糖，EB，DNA Marker，DNA loading buffer，Tween-20，邻苯二胺，浓硫酸，NaHCO₃，Na₂CO₃，甘氨酸，Tris，柠檬酸，脱脂奶粉，KCl，NaCl，Na₂HPO₄，KH₂PO₄，Tris，EDTA，冰醋酸，SDS，甘氨酸。

限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、NotⅠ，LA Taq酶，T4连接酶，PhantaTM Super-Fidelity DNA聚合酶，pMD-18T载体。

反转录试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，In-Fusion HD CloningKit高效连接试剂盒。

1.大豆花叶病毒浸染性克隆的构建

1.1.SMV基因组测序

提取SMV感染大豆的叶片总RNA，以oligodT18为引物反转录合成cDNA，利用表1引物通过PCR分3段克隆SMV全基因组。将PCR产物测序，然后拼接出SMV基因组全长。

表1 SMV基因组测序引物

引物名称	引物序列(5`-3`)	编号
			SMV1-25s	AAATTAAAACTACTCATAAAGACAAC	SEQ ID NO.1
SMV3578-3556a	CTCAATACTTTGAAGACCGCATC	SEQ ID NO.2
			SMV3361-3383s	GGTGGACATCCAAGTATTGAGAA	SEQ ID NO.3
SMV6998-6975a	TCCTTTTTCCCTTGTACTGTCACTG	SEQ ID NO.4
			SMV6766-6789s	ACATCCAATGATTCAGAAAAGAAC	SEQ ID NO.5
SMV9588-9567a	AGGACAACAAACATTGCCGTACC	SEQ ID NO.6

1.2.大豆内含子克隆

提取大豆品种williams的基因组DNA，用表2引物进行PCR，克隆大豆lipoxygenase-3基因的3个内含子，对PCR产物进行测序，获得内含子lip3-intron1、lip3-intron2和lip3-intron3。

表2大豆lipoxygenase-3基因内含子克隆引物

引物名称	引物序列(5`-3`)	编号
			lip3-intron1s	GTAAATCATATATCTTACAATAGG	SEQ ID NO.7
lip3-intron1a	CTATATCACATGACATTAATTATATAAC	SEQ ID NO.8
			lip3-intron2s	GTATATAATATGATAAACTTGTG	SEQ ID NO.9
lip3-intron2a	CTTTCCAACCAAATACAATTTACTC	SEQ ID NO.10
			lip3-intron3s	GTTAGGCTTCTATTTCTATTT	SEQ ID NO.11
lip3-intron3a	CTGTTTAATGAAAATAGCAGAAC	SEQ ID NO.12

1.3.侵染性克隆构建

为构建SMV全基因组侵染性克隆，利用表3引物，以SMV基因组cDNA为模板，用大连宝生物生产的La Taq聚合酶扩增SMV全基因组的3个片段(94℃5min；94℃15s、60℃30s、72℃3min，30cycles；72℃10min。)。使用大连宝生物公司的infusion试剂盒，分别与内含子及载体质粒连接，构建SMV全基因组质粒。3个内含子分别插入如图1所示位置，具体插入位点是SMV基因组第2447位碱基之后(即GGTGATGCGCAACAAAG₂₄₄₇↓)或第3402位碱基之后(即TTTTGGACCATGTCAAG₃₄₀₂↓)，具体如下：

(1)为构建不含内含子的SMV全基因组质粒pSMV，SMV基因组分成3个片段分别用引物对SMV1-26s/SMV2447a、SMV2433s/SMV6085a、SMV6071s/SMV9589a进行扩增，质粒载体用引物对VectorF/VectorR进行PCR扩增，上述4个PCR产物等比例混合后用infusion试剂盒进行4片段连接，即获得质粒pSMV，转化大肠杆菌DH5α，涂含有氨苄青霉素的LB平板。

(2)为构建在SMV基因组第2447位碱基(即GGTGATGCGCAACAAAG₂₄₄₇↓)之后插入3个不同内含子的SMV全基因组质粒pSMV2447-intron1、pSMV2447-intron2和pSMV2447-intron3，SMV基因组分成3个片段分别用引物对SMV1-26s/SMV2447a、SMV2448s/SMV6085a、SMV6071s/SMV9589a进行扩增，质粒载体用引物对VectorF/VectorR进行PCR扩增，上述4个PCR扩增产物等比例混合后，再分别与内含子lip3-intron1(引物lip3-intron1s-1/lip3-intron1a-1)、lip3-intron2(引物lip3-intron2s-1/lip3-intron2a-1)或lip3-intron3(引物lip3-intron3s-1/lip3-intron3a-1)等比例混合，利用infusion试剂盒进行5片段连接，即获得SMV全基因组质粒pSMV₂₄₄₇-intron1、pSMV₂₄₄₇-intron2和pSMV₂₄₄₇-intron3，转化大肠杆菌DH5α，涂含有氨苄青霉素的LB平皿。

(3)为构建在SMV基因组第3402位碱基(即TTTTGGACCATGTCAAG₃₄₀₂↓)之后插入3个不同内含子的SMV全基因组质粒pSMV₃₄₀₂-intron1、pSMV₃₄₀₂-intron2和pSMV₃₄₀₂-intron3，SMV基因组分成3个片段分别用引物对SMV1-26s/SMV3402a、SMV3403s/SMV6085a、SMV6071s/SMV9589a进行扩增，质粒载体用引物对VectorF/VectorR进行PCR扩增，上述4个PCR扩增产物等比例混合后，再分别与内含子lip3-intron1(引物lip3-intron1s-2/lip3-intron1a-2)、lip3-intron2(引物lip3-intron2s-2/lip3-intron2a-2)或lip3-intron3(引物lip3-intron3s-2/lip3-intron3a-2)等比例混合，利用infusion试剂盒进行5片段连接，即获得SMV全基因组质粒pSMV3402-intron1、pSMV3402-intron2和pSMV3402-intron3，转化大肠杆菌DH5α，涂含有氨苄青霉素的LB平皿。上述SMV全基因组侵染性克隆质粒构建示意图如图1所示。

表3 SMV基因组侵染性克隆构建引物

1.4.重组质粒鉴定及生物学活性分析

统计平皿菌落数。各挑取菌落10个在氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中振荡培养(200rpm)，提取质粒进行酶切鉴定和测序。

用基因枪将阳性质粒接种到长出2片真叶的williams大豆植株中，每天观察记录叶片状态，接种14天进行RT-PCR鉴定和测序(表4)。

表4 SMV全基因组侵染性克隆测序引物

2.实验结果：

2.1 SMV基因组测序结果：SMV-gzl株全基因组测序结果表明，该病毒基因组是全长9589bp的正单链RNA。全序列如SEQ ID NO.53所示。

基因组结构如表5，在基因组的两端分别是132bp的5’端非编码区和253bp的3’端非编码区，两端非编码区中间是一个大的开放阅读框(133-9336)，编码1个多聚蛋白(3067aa)，蛋白酶解后形成9个成熟蛋白：P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa、NIb和CP。

表5 SMV-gzl株的基因组结构

基因名称	基因组中的位置	基因长度	编码蛋白长度	蛋白酶切位点
					5`UTR	1-132	132bp
P1	133-1059	927bp	309aa	EDIQHYSQ
					HC-pro	1060-2430	1371bp	457aa	KFYRVGGD
P3	2431-3471	1197bp	399aa	EDVKVQSL
					6K1	3472-3627	156bp	52aa	EDVSAQAK
CI	3628-5529	1902bp	634aa	NAVQLQSK
					6K2	5530-5688	159bp	53aa	EPVSTQGK
NIa	5689..6987	1299bp	433aa	NTVTVQGK
					Nib	6988..8538	1551bp	517aa	ESVSLQSG
CP	8539..9333	795bp	265aa
					3`UTR	9334-9589	253bp

2.2大豆内含子克隆结果

以大豆品种williams叶片基因组DNA为模板，经PCR扩增和测序，克隆得到lipoxygenase-3基因的3个内含子，分别是lip3-intron1、lip3-intron2和lip3-intron3，其序列见表6。

表6克隆得到的3个内含子序列

2.3 SMV侵染性克隆构建结果及生物活性分析

SMV基因组分3段进行PCR扩增，都得到目的产物，纯化后与载体PCR产物以及内含子PCR产物共同连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，每种连接组合各挑取10个菌落进行液体培养(如不足10个菌落，全部菌落都培养)，然后进行质粒的提取和酶切验证，酶切验证正确的质粒进行全基因组测序分析，测序正确的SMV全基因组重组质粒进行基因枪介导的接种实验。菌落数统计结果、双酶切(BamHⅠ和NotⅠ)鉴定结果和测序结果如表7所示。连接产物pSMV没有内含子插入，其转化的菌落数只有5个，经双酶切鉴定是错误的重组，没有病毒的全基因组成分，而p3基因上游插入内含子的重组质粒pSMV2447-intron1、pSMV2447-intron2和pSMV2447-intron3转化大肠杆菌后产生大量阳性菌落，证明由于第2447位核苷酸后插入内含子能终止病毒p3基因表达，避免了P3蛋白对宿主的毒性作用。而在SMV基因组第3402位核苷酸后插入内含子(pSMV3402-intron1、pSMV3402-intron2和pSMV3402-intron3)，转化大肠杆菌后，不能产生正确的阳性菌落；这证明在p3基因的末尾处插入内含子，不能有效抑制p3基因的表达及其编码蛋白P3对大肠杆菌的毒性作用。

表7大肠杆菌DH5α中提取的SMV基因组重组质粒鉴定结果

注：nt表示进行测试

经酶切和测序分析鉴定为正确的重组质粒pSMV₂₄₄₇-intron1、pSMV₂₄₄₇-intron2和pSMV₂₄₄₇-intron3通过基因枪分别接种大豆叶片后，都能导致接种植株矮化、叶片产生卷曲和花叶等SMV的典型症状，结果如图2所示。图2中a为空质粒接种植株21dpi；b为天然病毒摩擦接种植株21dpi；c为pSMV2447-intron1基因枪接种植株21dpi；d为pSMV2447-intron2基因枪接种植株21dpi；e为pSMV2447-intron3基因枪接种植株21dpi。重组质粒pSMV₂₄₄₇-intron1的致病率是100％(16/16)；重组质粒pSMV₂₄₄₇-intron2的致病率是37.5％(6/16)；重组质粒pSMV₂₄₄₇-intron3的致病率是12.5％(2/16)。RT-PCR和测序分析表明这3个SMV侵染性克隆产生的病毒基因组序列与SMV-gzl分离株完全一致，内含子被完成切除；利用SMV衣壳蛋白单克隆抗体进行免疫印迹杂交(Western blot)分析，结果如图3所示，在2447位点插入内含子的这3个侵染性克隆侵染植株发病后都能检测到衣壳蛋白。病毒致病性和SMV-gzl分离株也一致。图3中泳道1为蛋白质分子量标准；泳道2为SMV感染植株；泳道3为pSMV2447-intron1基因枪接种植株；泳道4为pSMV2447-intron2基因枪接种植株；泳道5为pSMV2447-intron3基因枪接种植株；泳道6为空质粒接种植株。由此证明，在SMV-gzl第2447位核苷酸后插入内含子，能制备SMV全基因组侵染性克隆，且内含子lip3-intron1插入的侵染性克隆感染效率最高；而在SMV-gzl分离株第3402位核苷酸后插入内含子，不能制备SMV全基因组侵染性克隆。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林省农业科学院

<120> 大豆花叶病毒浸染性克隆及其构建方法和应用

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaattaaaac tactcataaa gacaac 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcaatactt tgaagaccgc atc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtggacatc caagtattga gaa 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctttttcc cttgtactgt cactg 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acatccaatg attcagaaaa gaac 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggacaacaa acattgccgt acc 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtaaatcata tatcttacaa tagg 24

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctatatcaca tgacattaat tatataac 28

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtatataata tgataaactt gtg 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctttccaacc aaatacaatt tactc 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gttaggcttc tatttctatt t 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctgtttaatg aaaatagcag aac 23

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaattaaaac tactcataaa gacaac 26

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctttgttgcg catcaccacc aac 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gatgaagtgt gaaacggcac tc 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgatgcgcaa caaaggatga agtg 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cttgacatgg tccaaaaatt tctc 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggagttagac ccgatttact c 21

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tatttttccc aatgaaataa gcctg 25

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcattgggaa aaatacagag gaag 24

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aggacaacaa acattgccgt acctc 25

<210> 22

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aatgtttgtt gtcctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatcg atagctcgaa 60

tttccccgat c 71

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gagtagtttt aatttcctct ccaaatgaaa tgaacttc 38

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgatgcgcaa caaaggtaaa tcatatatct tacaatagg 39

<210> 25

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtttcacact tcatcctata tcacatgaca ttaattatat aac 43

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tgatgcgcaa caaaggtata taatatgata aacttgtg 38

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gtttcacact tcatcctttc caaccaaata caatttactc 40

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tgatgcgcaa caaaggttag gcttctattt ctattt 36

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gtttcacact tcatcctgtt taatgaaaat agcagaac 38

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttggaccatg tcaaggtaaa tcatatatct tacaatagg 39

<210> 31

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

atcgggtcta actccctata tcacatgaca ttaattatat aac 43

<210> 32

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ttggaccatg tcaaggtata taatatgata aacttgtg 38

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atcgggtcta actccctttc caaccaaata caatttactc 40

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ttggaccatg tcaaggttag gcttctattt ctattt 36

<210> 35

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

atcgggtcta actccctgtt taatgaaaat agcagaac 38

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

accggaagga gctgactggg tt 22

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ccttcgcaag acccttcct 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

agaagcaaga agaggaagac 20

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

aaatcacact aagttaccgt ac 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gctgccaatt caccacattg 20

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gtgataacca gttagacaag aatg 24

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

atccttgaca gttggatacc atg 23

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

ctattcagat cgcttgaagc agg 23

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gtgcagagtc ttgatgagat tc 22

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gtctgcaacg cctccaggaa g 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ccagagattc acagactgct c 21

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

cacaagagtt atacgtgaac cag 23

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cacaaatgga cacttgttca gaag 24

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gcacgttgtg aaaggaaggt g 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gcagttctgg atgttaggag c 21

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gtcaatgctc agacaagtga gc 22

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gagatgagga attctgaaag tcc 23

<210> 53

<211> 9589

<212> DNA

<213> 大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus）

<400> 53

aaattaaaac tactcataaa gacaacaaac aattcagacg caaacagaaa ctttcataac 60

tacatttctt caagcaacta taactccagt aatttgcagt ttcacaaatc tctcgcagca 120

acagcaaatc aaatggcaac aatcatgatc ggaagtgtgg cgatttctgt gccaaacact 180

cacatctctt gtgcatcgag tactgtgatg ccgattcaag cggttcaaat ggcaaaacaa 240

gtgccttctg ctagaggagt gttatacaca ctcaaaagag agggtaacac acaagtgcgc 300

aagcatgaag aagtgctgcg caagttccaa gaagcgttcg accaagatgc tggtatccag 360

cgaaggcttc tagtgaacaa acatagttcc atacaattta caaagaagag tggcttaacc 420

ttgcgtcgca taactttaga gcaggctcga gcaaaagaag cggcaattgc aaggcagaag 480

caagaagagg aagactttct caatgggaag tatgaacagc aattctatgc tggggtatcc 540

accacaaagc ccacgaagtt tgaagggaga agtgttggtt tcaggacaaa atactggaga 600

ccaactccaa agaagattaa agaaaagcgt gcaataccac aatgtaggaa accaacatat 660

gtcttagaag aggttctttc ttcagcctca aagagtggca agctagttga atttatcaca 720

gaaggtaaag gcaggaacgt caaagtccat tatgtgcgga aacatggcgc aacattgccc 780

aagttctttc ttccgcatga agaaggcaaa tatgttcatc aggagcttca atatgcacgt 840

atatatgaat ttcttcctta catttgcatg tttgcaaaat ataagagcat aagtgcggat 900

gatataactt atggagacag tggtttattg tttgatgagc gatcatcttt aaccacaaat 960

cacactaagt taccgtactt cgtcgtcaga ggaagaggaa atgggaagct cgttaatgcc 1020

tttgaagtgg ttgcaaacat agaggatatt caacattact cccaaactcc tgaagctcaa 1080

tttttccgtg gttggaagaa agtgtttgat aaaatgccgc cacatgtgga gaatcatgaa 1140

tgcaccattg attttacaaa tgaacaatgt ggtgaattgg cagcggcaat tagccaatca 1200

gtttttccag ttaagaagtt atcgtgtaag caatgtcggc aacacatcaa gaacctgagt 1260

tgggaggagt ataaacaatt ccttttagct catatgggtt gtcacagggc tgaatgggag 1320

aatatccaga aagttgatgg catgaagtat gtgaagaaag tgattgagac atcaactgca 1380

gaaaacgcaa gtttgcaaac aacaatggag attgtgcgtt taacgcagaa ctataagagt 1440

actcacatgc tgcagataca ggatattaat aaggctctaa tgaaaggtcc atcagtgaca 1500

caaagtgagc tagagcaggc ctctaaacag ctacttgcaa tgacacaatg gtggaagaac 1560

cacatggctt taactgatga agatgcactc aaggtgttca ggaataagcg atcttccaaa 1620

gcgctactta atccaagttt actttgtgat aaccagttag acaagaatgg taattttgtt 1680

tggggagagc gtggcaggca ttcaaagcga ttctttgcaa attactttga agaggtgatt 1740

ccctctgaag ggtacagcaa atatgtgatt aggaagaatc caaatggaca aagggaatta 1800

gcaattgggt ctctaattgt gccgctggat tttgagcgcg ctcggatggc attacagggc 1860

aagagcgtca caagagagcc gattacaatg tcatgtatat caagacagga tggaaacttt 1920

gtgtaccctt gttgttgcgt cacgcatgat gatggaaaag ctttctattc tgagctcaag 1980

agtcctacaa agcgccactt ggttattggg acatctggcg atccaaagta tattgatcta 2040

ccggccactg atgcagacag gatgtacata gctaaagaag gatattgtta cttaaatatc 2100

ttcttggcaa tgttggtcaa tgtaaatgaa gatgaagcca aggatttcac aaagatggta 2160

agggatgtta ttgtaccaag actaggaaag tggccgacaa tgctagatgt ggcaacagct 2220

gcatacatgc taacagtctt tcaccctgaa accaggaatg ctgagctccc acgtattttg 2280

gttgaccatg cgtgccaaac catgcacgtg atagactctt ttggatcctt gacagttgga 2340

taccatgttc ttaaagctgg tacagttaac caattgattc aatttgcttc taatgatctt 2400

cagagtgaga tgaaatttta tagagttggt ggtgatgcgc aacaaaggat gaagtgtgaa 2460

acggcactca taacaagcat tttcaaacct aagagaatgg ttcaaattct tgagaatgac 2520

ccgtacattc ttttgatggg cttggtttca ccttctattc taattcacat gtatcgtatg 2580

aagcattttg agaaaggggt agagttgtgg ataagtaaag aacatagtgt ggcaaagatt 2640

ttcatcatat tggaacaact caccaagagg gtcgctgcaa atgacgtgtt acttgagcaa 2700

cttgaaatga tttcagaaac ttctgagaga ttcatgagca ttctagagga ctgtcctcaa 2760

gcgccacagt catacaagac ggcaaaagat ttgttgacaa tatacataga aagaaaagca 2820

tctaatagcc aattggtgga gaatggtttt gtagatatga atgataaact gtatatggca 2880

tatgaaaaaa tctattcaga tcgcttgaag caggaatggc gcgcattaag ctggttggaa 2940

aaattttcta caacatggca attgaaaaga tttactccac atacggagaa atgtttgaca 3000

aagaaagttg tagaagaaag cagcgcatct tcaggaaact ttgcgagtgt gtgcttcatg 3060

aatgcccagt cacacctaag aaatgtaaga gatacacttt ttcaaaaatg tgaccaggct 3120

tggactgcat cggtgcgagc ctttgtgagg ttcataatct caacacttca cagatgctat 3180

agtgatatag tttacctggt gaacatctgc ataatctttt cattgcttgt ccaaatgact 3240

agtgtgctgc agggcattgt caacacagca aggagggaca aagcactctt aaatggatgg 3300

aaaaggaaag aagatgaaga ggccgtaatt catttgtatg aaatgtgtga aaagatggaa 3360

ggtggacatc caagtattga gaaatttttg gaccatgtca agggagttag acccgattta 3420

ctccccatag cagtgagcat gacaggacaa tcagaagatg tttccgcaca ggccaaaaca 3480

gcaactcaat tgcaacttga gaaaattgtg gcattcatgg ctttgttgac catgtgtata 3540

gataatgaaa ggagtgatgc ggtcttcaaa gtattgagca aattaaagac attcttcagc 3600

acaatgggtg aggatgttaa agtgcagagt cttgatgaga ttcaaaacat tgatgaagat 3660

aagaagctca caattgattt tgatcttgaa acaaataagg agtcttccag tgtttctttt 3720

gatgttaaat ttgaagcctg gtggaataga cagttggaac agaatagagt aattccacac 3780

tacaggtcga caggtgagtt tctggagttc acaagagaaa cagcagccaa aattgcaaat 3840

ttggtagcaa catcaagcca cacagaattc ttgattaggg gtgcagttgg ctcagggaaa 3900

tcaacaggtt taccacatca cctctcaaag aagggcaaag ttctgctgct ggagccaact 3960

agaccgttag cggagaatgt cagtaagcag ttgagctttg aacctttcta tcataatgta 4020

acactgagaa tgagagggtt gagcaagttt ggctcaagca acatagttgt catgacaagt 4080

gggtttgcgt ttcattacta tgttaacaat ccacaacagc tatctgattt cgattttatc 4140

ataatagatg agtgtcatgt tcaagatagc ccaacgattg cattcaactg tgcacttaag 4200

gagtttgaat tcagtggcaa gcttataaaa gtgtctgcaa cgcctccagg aagagagtgc 4260

gaatttacaa cgcaacatcc agttaaattg aaagttgaag accatttgtc ttttcagaac 4320

tttgtgcaag ctcaaggtac aggatcaaat gctgatatga tccaacatgg gaacaactta 4380

cttgtatatg ttgcaagcta caatgaagtt gaccaactgt cacgattatt aactgaaaaa 4440

cattacaagg tgacaaaggt tgatgggaga acaatgcaaa tgggaaatgt agagattgca 4500

accacaggca cggaaggaaa accacacttc atagtcgcaa caaacatcat tgagaatgga 4560

gtgactcttg atattgattg cgtaattgat tttgggctta aagtggtggc tactcttgac 4620

acagataacc ggtgtgtgcg ctacaacaaa caatcagttt cttatggaga gcgaattcaa 4680

agacttggta gagttggtcg ttgtaaacct ggatttgcgc ttaggattgg acacacagga 4740

aagggaattg aggaagttcc cgagttcata gctacagagg cagctttcct atcctttgct 4800

tatgggttgc cagttacaac acaaagtgtc tcgaccaata tactgtcccg ttgcacagtg 4860

aaacaagctc gagtagcttt gaattttgag ctaactccat ttttcaccac taacttcata 4920

aagtatgatg gtagcatgca cccagagatt cacagactgc tcaagtccta taaactcagg 4980

gagtctgaga tgttgctgac taagttagcc ataccatatc agtttgttgg gcagtggata 5040

acagtcaagg agtatgaacg tcaaggtgtc caccttaatt gtccagagaa agtgaaaata 5100

cctttctatg tgcatggaat accagataag ttgtatgaga tgttgtggga cacagtttgt 5160

aaatacaaga atgatgccgg gttcggctca attaagagtg tgaatgcaac gaagattagt 5220

tacactctaa gcactgatcc gacagcaatt cctcgcacac ttgcaatact ggaccatttg 5280

ttgagtgaag aaatgaccaa gaagagtcac tttgacacaa ttggttctgc tgtcactggg 5340

tattcctttt cccttgcagg catagctgat ggatttagga agaggtacct gaaggactac 5400

acacagcata atatagccgt cttacaacag gctaaagcac agctgctaga atttgactgc 5460

aacaaagttg acatcaacaa tctgcacaat gttgagggta taggcatttt aaatgcagtt 5520

caattacaaa gcaaacatga ggtgagcaaa tttttgcagc ttaaaggaaa atgggatgga 5580

aagaaattca tgaatgatgc tgtcgtggct atcttcactt tagtgggcgg tggttggatg 5640

ttgtgggatt acttcacaag agttatacgt gaaccagtat caactcaagg aaagaagagg 5700

cagatacaga agctcaaatt tagggatgcc tttgacagaa aagtaggccg tgaggtgtac 5760

gcagatgatt acaccatgga gcacaccttt ggggaggcct acaccaagaa aggaaagcag 5820

aaaggtagca ctcgcacaaa agggatgggt cgcaagtcta gaaatttcat acacttgtat 5880

ggagttgagc cagagaatta cagtatgatc agatttgttg acccgctaac tgggcacaca 5940

atggatgaac atcccagggt tgatatcaga atggtgcaac aagagtttga ggagataagg 6000

aaagacatga ttggagaggg tgaactggat cggcaaagag tctaccacaa tcctggtcta 6060

caggcttatt tcattgggaa aaatacagag gaagcactca aggttgatct cacaccacat 6120

agacccacac ttctctgcca aaatagcaat gctatagcag gttttcctga gagggaggat 6180

gaattgcgtc agacaggatt gccacaagtg gtttctaaat cagatgtccc acgtgccaaa 6240

gaaagggttg aaatggaaag caaatctgtt tacaaaggac ttagagatta tagtggcatt 6300

tccacactaa tatgtcaact tacaaattca tcagatgggc acaaagaaac aatgtttggg 6360

gttggctatg gttctttcat tatcacaaat ggacacttgt tcagaaggaa caatggaatg 6420

ctcaccgtta agacatggca tggtgagttt gtgatacaca acaccacaca gctcaagata 6480

catttcattc aagggaagga tgtgattctg attcgcatgc caaaggattt tcctccattt 6540

ggaaaacgca acctctttag gcaaccgaag cgtgaggaac gggtttgcat ggttggtaca 6600

aattttcaag agaagagttt gcgtgcaaca gtttcagaat cttctatgat attgcctgaa 6660

gggaaaggtt ctttctggat acattggatc acaacccagg atggtttttg tgggttgcct 6720

cttgtttctg ttaatgatgg gcacattgtt ggaatacacg gattaacatc caatgattca 6780

gaaaagaact tcttcgtccc actcactgat gggtttgaga aagaatatct agagaatgct 6840

gacaacttgt catgggataa gcattggttt tgggaaccaa gcaagatagc atggggctct 6900

ttgaacttag ttgaggaaca accaaaagag gagttcaaaa tatcaaagct tgtgtcagat 6960

ctctttggaa atacagtgac agtacaaggg aaaaaggaaa gatgggtttt ggatgcaatg 7020

gaaggtaact tagtggcttg tgggcaagcc gacagtgcat tagtgacaaa gcacgttgtg 7080

aaaggaaggt gcccatattt tgcacaatat ctttcggtga atcaagaggc gaagtccttc 7140

tttgaaccac tcatgggtgc gtatcagcca agtcggctaa acaaagatgc attcaaacga 7200

gacttcttca aatacaacaa accagttgtt ttgaatgaag ttgattttca atcttttgag 7260

aaggcagtgg ctggagtaaa actgatgatg atggaatttg atttcaagga gtgtgtgtat 7320

gtgactgatc ctgatgaaat atacgactcc ttgaatatga aagctgcagt tggtgcacag 7380

tacaaaggga agaagcaaga ctatttctct ggaatggaca gtttcgataa ggaacgcttg 7440

ctctatctca gttgtgaaag gttattctat ggggagaaag gagtgtggaa tggatctttg 7500

aaagcagagt tgaggccaat tgaaaaagta caagcaaaca aaacaaggac attcacagca 7560

gcaccaattg atacattact tggagcaaag gtttgtgttg atgatttcaa caatcaattt 7620

tacagtctca atctcacatg cccatggaca gttggaatga ccaaatttta tagaggttgg 7680

gataagttga tgagaagttt acccgatgga tgggtgtatt gtcatgcaga tggctcacag 7740

tttgatagtt ccctgacacc cttactactg aatgcagttc tggatgttag gagctttttc 7800

atggaagact ggtgggttgg gagagaaatg cttgaaaacc tctatgctga gatagtctac 7860

acaccaattt tagcacctga tggtacaatt tttaagaagt tcagaggaaa caacagtggg 7920

caaccatcta cagttgtgga caataccttg atggtagtca ttgccatgta ctattcttgt 7980

tgtaagcaag ggtggtcaga ggaggacatt caagaaagat tagtgttttt tgccaatggt 8040

gatgacatca tcctggcagt tagtgagaag gacacatggc tgtatgacac tcttagcact 8100

tcgtttgctg aacttggtct caattacaat tttgaggaac ggacaaagaa aagggaggaa 8160

ctgtggttca tgtcacatca agccatgtta gctgatggaa tctatattcc aaaactcgag 8220

cctgagagaa ttgtctctat tctagagtgg gacaggagca aagagcttat gcatcgcact 8280

gaagcgatat gcgcagcaat gattgaggca tggggataca ctgaattgct gcaagagatc 8340

cgcaaatttt atttgtggct cctaaacaag gatgagttta aggagcttgc ttcgtctgga 8400

aaagcaccat atattgcaga gacagctttg agaaagctat acacagatgt caatgctcag 8460

acaagtgagc tacaaagata tcttgaagtg ctggatttca atcatgctga tgactgttgt 8520

gaatcagttt ctttgcaatc aggcaaggag aaagaaggag acatggatgc aggcaacgat 8580

ccaaagaaga gtaccagcag tagcaaagga gctggtacga gcagtaaaga tgtaaatgtt 8640

ggatcaaaag gaaaggtggt tccgcgtttg cagaagatta caagaaagat gaatcttcca 8700

atggttgaag ggaagatcat tcttagcttg gaccacttgc ttgagtataa gcctaatcag 8760

gttgatttat tcaacactcg agcaacaagg acacagtttg aggcgtggta caatgcagtt 8820

aaagatgaat atgagcttga tgatgagcag atgggtgtgg tcatgaatgg tttcatggtt 8880

tggtgtattg ataatggcac atctccagat gccaatggcg tgtgggtgat gatggatgga 8940

gaggaacaga ttgaatatcc gctgaaaccc attgttgaaa atgcaaaacc aactttaagg 9000

caaatcatgc atcatttttc agatgcagca gaagcttaca ttgagatgag gaattctgaa 9060

agtccgtata tgcctagata tggactacta aggaatttga gagatagaga actggcccgc 9120

tatgcttttg acttctatga ggtcacttct aaaacaccaa acagggcaag ggaagcaata 9180

gcgcagatga aggctgcagc tctctcggga gttaacaaca agttgtttgg acttgatggg 9240

aatatctcaa ccaactccga aaatactgaa aggcacactg caagggatgt gaatcaaaac 9300

atgcacactc ttctgggcat gggcccacag cagtaaagac caagtaaatt ggtcacagtt 9360

atcatttcgg gtcgctttat agtttactat aatatagtaa ttgcactttc tttgagtata 9420

gtgtgattgc atcaccaaat aatacttttg tttagtgtgg ttttaaccac ctcagtgtgt 9480

tttatattat agtttatgaa tggcagggag aaccattgtg ttactggagc cctttgaaga 9540

gtgattttat catgtttagt ggccgaggta cggcaatgtt tgttgtcct 9589

<210> 54

<211> 107

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max (Linn.) Merr）

<400> 54

gtaaatcata tatcttacaa taggaaacat gaaactcaat ttaatttata gttaacaaaa 60

aattgaagac acttttgatg ttatataatt aatgtcatgt gatatag 107

<210> 55

<211> 131

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max (Linn.) Merr）

<400> 55

gtatataata tgataaactt gtgtttcgaa ataaaatttt atttgatgaa ttctgttatt 60

ttatgtgtct agtttttatt ttagatgatg tttctatgaa taataagagt aaattgtatt 120

tggttggaaa g 131

<210> 56

<211> 323

<212> DNA

<213> 大豆（Glycine max (Linn.) Merr）

<400> 56

gttaggcttc tatttctatt tttaaattac tctatcacag actcaaatct gttcttcaat 60

tctataatat ttatgaggtc ttagcataaa tgtactttta atatgtcaag agtcatataa 120

ctttgaattg gtatattgtt ttagctagaa gagttctaca tgtacatgtt aacataaagg 180

ttgactgttt ctaatcaagt aatcctaaat tatcaaggag tacttagaaa caaccatttc 240

attaaacttt aactgttttt caattatgag tttgaaaatt tctgtttttg ttgctaataa 300

gttctgctat tttcattaaa cag 323

Claims

1.一种大豆花叶病毒浸染性克隆，其特征在于，所述大豆花叶病毒浸染性克隆中，大豆花叶病毒的p3基因区域内含有大豆的内含子片段，所述内含子片段位于大豆花叶病毒的p3基因5’端，且与内含子片段相邻的碱基与大豆中相同；

所述大豆花叶病毒的全基因组序列如SEQ ID NO.53所示，所述内含子片段位于SEQ IDNO.53所示序列的2447位和2448位之间；

所述内含子片段包括大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段，所述大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段包括lip3-intron1、lip3-intron2或lip3-intron3；

所述lip3-intron1的序列如SEQ ID NO.54所示；

所述lip3-intron2的序列如SEQ ID NO.55所示；

所述lip3-intron3的序列如SEQ ID NO.56所示。

2.根据权利要求1所述的大豆花叶病毒浸染性克隆，其特征在于，所述大豆lipoxygenase-3基因的内含子片段包括lip3-intron1。

3.权利要求1或2所述的大豆花叶病毒浸染性克隆的构建方法，其特征在于，包括在大豆花叶病毒的p3基因区域内插入大豆的内含子片段。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

所述引物对SMV1-26s/SMV2447a序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；

所述引物对SMV2448s/SMV6085a序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.19所示；

所述引物对SMV6071s/SMV9589a序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；

所述lip3-intron1由引物对lip3-intron1s-1/lip3-intron1a-1扩增得到，引物对lip3-intron1s-1/lip3-intron1a-1序列如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示；

所述lip3-intron2由引物对lip3-intron2s-1/lip3-intron2a-1扩增得到，引物对lip3-intron2s-1/lip3-intron2a-1序列如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示；

所述lip3-intron3由引物对lip3-intron3s-1/lip3-intron3a-1扩增得到，引物对lip3-intron3s-1/lip3-intron3a-1序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；

5.权利要求1或2所述的大豆花叶病毒浸染性克隆，或权利要求3或4所述的构建方法在制备大豆花叶病毒浸染的大豆中的应用。

6.含有权利要求1或2所述的大豆花叶病毒浸染性克隆的重组微生物。

7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包括重组大肠杆菌。

8.含有权利要求1或2所述的大豆花叶病毒浸染性克隆，或权利要求6或7所述的重组微生物的试剂盒。