CN112574995B - 用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA(LAT‑miRNA)基因编辑的gRNA引物及其应用,通过对比分析不同毒力MDV‑1编码的LAT‑miRNA及其邻近基因组序列,选取该基因簇5’端和3’端两侧高度保守的区域作为gRNA靶点区,设计合成了互补配对的一系列gRNA,并构建pX459‑gRNA表达质粒,将其两两组合后均能引导CRISPR/Cas9系统精准有效地实现MDV‑1超强毒株GX0101整个LAT‑miRNA的精准编辑和敲除。由于LAT‑miRNA在不同毒力MDV‑1毒株之间具有高度的基因座位保守性和序列保守性,因此利用本发明设计的gRNA,可以精准有效地编辑不同MDV‑1毒株的LAT‑miRNA。该实验方法设计简单、gRNA靶向性好,基因编辑及敲除时效高,为研究其致病、致瘤调控机制及新型疫苗研发提供了新的思路和技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA(以下简称LAT-miRNA)基因编辑的gRNA引物设计及其应用,属于基因工程技术研究领域。
背景技术
成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)是最初在一些细菌和古生菌中发现的一种重要的外援基因,与CRISPR相关蛋白家族(Cas)共同构成自身适应免疫系统的重要组成部分,用以抵御外来质粒和噬菌体的核酸入侵。CRISPR/Cas9系统属于II型CRISPR/Cas系统,该系统只需要一个向导RNA(guide RNA,gRNA)介导即可特异性识别并结合位于靶基因下游的5’-NGG-3’(Protospacer adjacent motif,PAM)序列,从而激发Cas9的双链DNA切割功能,产生一个双链的切口(Double strandbreak,DSB),而细胞基因组DNA利用其自我修复功能,由易出错的非同源末端连接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)和同源定向修复(Homology-directed repair,DHR)的方式修复DSB切口,最终实现靶点DNA的插入和/或缺失(Insertion-deletion,InDel)。由于Cas9这种核酸酶的可控性和通过修改gRNA靶点就能轻易改变Cas9切割位点的便捷性,基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术在短短数年时间得到了迅速开发和利用。目前,科学家们已将这一技术广泛应用于许多物种活细胞基因组DNA及核苷酸序列编辑,如人类细胞、细菌、斑马鱼、酵母、小鼠、果蝇和蛔虫等。随后,CRISPR/Cas9基因编辑技术对病毒基因组尤其是大基因组DNA病毒的编辑也相继报道,且主要集中在一些致瘤性疱疹病毒。
马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,是少数几种在其自然宿主中可诱导产生肿瘤的一种致瘤性疱疹病毒。根据致病性不同可以将其分为3种血清型:MDV-1、MDV-2和MDV-3,其中只有MDV-1具有致病性和致瘤性。MDV病毒基因组为线性双股DNA,全长约180kb,编码100多个病毒基因。近年来,随着高通量测序技术的发展及应用,科学家们研究发现在MDV基因组中还存在着大量病毒微小RNA(microRNA,miRNA)基因的表达,并且这些病毒编码的miRNA与MDV的致病性及致瘤性密切相关。MDV-1共编码14个miRNA前体(Precursor miRNA,pre-miRNA),可剪切加工产生26个成熟体miRNA分子,他们全部位于病毒基因组的反转重复序列区中,形成3个明显的miRNA基因簇,分别被命名为Meq、Mid和LAT基因簇。其中LAT基因簇由miR-M6、miR-M7、miR-M8、miR-M10和miR-M13组成,这些miRNA主要位于IRS/TRS重复序列与病毒潜伏感染相关基因转录物(Latency-associatedtranscript,LAT)的第一个内含子中,与病毒潜伏感染密切相关。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一种用于马立克病病毒LAT-miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用,所述CRISPR/Cas9系统表达的gRNA可特异性靶向编辑并敲除血清I型马立克病病毒(MDV-1)基因组编码的LAT-miRNA。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:
用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物,所述gRNA引物位于马立克病病毒LAT基因簇miRNA即LAT-miRNA的5’端和3’端两侧的保守区域,分别为:LAT-gRF1、LAT-gRF2、LAT-gRF3、LAT-gRF4以及LAT-gRR1、LAT-gRR2、LAT-gRR3、LAT-gRR4,其序列分别为序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
用于马立克病病毒LAT-miRNA基因编辑的方法,包括以下步骤:
(1)gRNA引物的设计:
选取LAT-miRNA 5’端和3’端两侧的保守区域作为靶点区,进行靶点选择及gRNA设计,得到权利要求1所述的gRNA引物;
(2)pX459-gRNA质粒的构建及鉴定:
人工合成gRNA的上下游单链oligo序列,复性为互补双链后,用T4连接酶连接到Bbs I-HF酶切后的pX459v2.0质粒载体上,构建pX459-gRNA质粒;利用引物对Step2-F和Step2-R,对pX459-gRNA质粒进行鉴定;引物对Step2-F和Step2-R的序列分别为序列表中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列;
(3)LAT-miRNA的基因编辑及鉴定:
将上述pX459-gRNA质粒两两组合,分别共转染鸡胚成纤维细胞CEF,接种马立克病病毒超强毒株GX0101后,进行PCR鉴定;PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析基因编辑效果;筛选鉴定可获得LAT-miRNA完全缺失的MDV-1编辑毒株。
所述步骤(2)中gRNA的上下游单链oligo分别为:LAT-gRF1-5p、LAT-gRF1-3p、LAT-gRF2-5p、LAT-gRF2-3p、LAT-gRF3-5p、LAT-gRF3-3p、LAT-gRF4-5p、LAT-gRF4-3p以及LAT-gRR1-5p、LAT-gRR1-3p、LAT-gRR2-5p、LAT-gRR2-3p、LAT-gRR3-5p、LAT-gRR3-3p、LAT-gRR4-5p、LAT-gRR4-3p,其序列分别为序列表中SEQ ID NO.17~SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列。
所述步骤(3)中质粒转染和病毒感染的具体方法为:制备鸡胚成纤维细胞CEF,将CEF以1.5×105个/孔的数量铺入24孔细胞培养板,在38.5℃、5%CO2培养箱中培养过夜,将pX459-gRNA质粒两两组合,分别共转染CEF,在38.5℃、5%CO2培养箱中培养24h后,以5000PFU/孔的接毒量接种GX0101病毒,继续培养48h后,取样进行PCR分析鉴定。
所述PCR分析的具体方法为:用0.25%胰蛋白酶消化上述病毒感染48h后的CEF,取一半细胞悬液以1000r/min离心10min,弃掉上清后,用1×DNA提取缓冲液吹悬,金属浴65℃保温30min、95℃变性5min提取细胞和病毒总DNA,用LAT-F和LAT-R引物对进行PCR鉴定;引物对LAT-F和LAT-R的序列分别为序列表中SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
所述PCR鉴定时的反应程序为:95℃5min预变性;95℃30s,58℃30s,72℃2min,30个循环;72℃延伸5min。
所述1×DNA提取缓冲液包括10mmol/LTris HCl,1mmol/L EDTA,25mmol/LNaCl和10μg/mL的蛋白酶K。
所述的gRNA引物在与GX0101毒株具有高度保守LAT-miRNA基因序列的血清1型马立克病病毒MDV-1毒株的编辑及基因组改造中的应用。
所述的gRNA引物在LAT-miRNA基因位点的基因编辑敲除、外援基因编辑插入或重组疫苗研发中的应用。
本发明有益效果:
(1)本发明首先比对分析不同毒力MDV-1毒株编码的LAT-miRNA及其邻近基因组序列,选取该基因簇5’端和3’端两侧高度保守的区域作为gRNA靶点区,设计合成了互补配对的一系列gRNA(5’端LAT-gRF1~LAT-gRF4和3’端LAT-gRR1~LAT-gRR4),并构建pX459-gRNA质粒,将其两两组合后均能引导CRISPR/Cas9系统精准有效地实现MDV-1超强毒株GX0101整个LAT-miRNA的精准编辑和敲除。由于LAT-miRNA在不同毒力MDV-1毒株之间具有高度的基因座位保守性和基因序列保守性,因此利用本发明设计的gRNA,可以精准有效地编辑不同MDV-1毒株的LAT-miRNA。该方法设计简单、gRNA靶向性好,基因编辑及敲除时效性高。
(2)本发明设计的这组gRNA具有高效性,Cas9核酸酶的剪切位点精确的发生在gRNA的PAM序列内侧2-4个碱基处,后续仅需进行简单的病毒噬斑纯化、PCR扩增及核酸凝胶电泳分析即可筛选鉴定获得整个LAT-miRNA完全缺失的MDV-1编辑毒株,与传统的病毒基因组改造操作技术(如细菌人工染色体(BAC)技术和Rec E/T同源重组技术)相比,具有操作简单、成本低廉、编辑效率高和节约时间等优点。
(3)本发明利用设计的这组gRNA介导的CRISPR/Cas9系统构建的LAT-miRNA缺失毒株基因组中编码的LAT-miRNA被完全编辑缺失,该基因簇的缺失不影响Meq和Mid基因簇中miRNA的正常表达,不影响病毒噬斑的形成,不影响病毒蛋白编码基因gB和pp38的正常表达,也不影响病毒的体外复制和生长;且连续传代15代后基因缺失毒株均保持LAT-miRNA基因缺失的稳定性,未发生回复突变。该缺失毒株的构建,为后续揭示LAT-miRNA的调控功能提供了重要研究材料,为MDV-1的miRNA基因编辑提供了一种新的技术手段,为研究其致病/致瘤机制及新型疫苗研发提供了新的思路和技术支撑。
附图说明
图1.本发明实施例一中LAT基因簇miRNA的gRNA靶点示意图;
其中:UL,长独特序列区;US,短独特区;TRL,长末端重复序列;IRL,长内部重复序列;TRS,短末端重复序列;IRS,短内部重复序列;
图2.本发明实施例二中不同gRNA组合对LAT基因簇miRNA基因编辑的PCR鉴定;
其中:M,DNAMarker;CEF,鸡胚成纤维细胞;箭头,指示基因编辑条带;
图3.本发明实施例二中gRF1/gRR2组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析;
其中:上,野生型和突变型序列对比;下,突变型基因测序峰图;
图4.本发明实施例二中gRF1/gRR3组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析;
其中:上,野生型和突变型序列对比;下,突变型基因测序峰图;
图5.本发明实施例二中gRF1/gRR4组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析;
其中:上,野生型和突变型序列对比;下,突变型基因测序峰图;
图6.本发明实施例二中gRF3/gRR3组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析;
其中:上,野生型和突变型序列对比;下,突变型基因测序峰图;
图7.本发明实施例二中gRF3/gRR4组合对LAT基因簇miRNA的基因编辑序列测定分析;
其中:上,野生型和突变型序列对比;下,突变型基因测序峰图;
图8.本发明实施例二中GXΔLAT-miRs-C21-15传代稳定性的PCR分析;
图9.本发明实施例三中病毒miRNA的相对表达分析;
图10.本发明实施例三中病毒感染CEF中gB和pp38蛋白的IFA分析;
其中,比例尺=50μm;
图11.本发明实施例三中GX0101和GXΔLAT-miRs-C21-15毒株的体外增殖曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例一、gRNA和PCR引物设计及pX459-gRNA质粒构建
1、gRNA和PCR引物的设计
由于MDV-1编码的26个miRNA的基因座位和序列比较保守,所以本发明首先在NCBI数据库中查询MDV-1代表性强毒株Md5、GX0101、GA和疫苗株CVI988的LAT-miRNA及邻近基因组序列,经过序列比对后选取LAT-miRNA5’和3’端高度保守的区域作为靶点区,使用GenScript’s gRNA在线软件(https://www.genscript.com)进行靶点选择及gRNA设计。
如表1和图1所示,以MDV毒株GX0101(GenBank登陆号:JX844666.1)的LAT-miRNA5’端与3’端两侧及其邻近序列为例,使用GenScript’s gRNA在线软件设计选择8个gRNA编辑靶点(5’端和3’端各4个),分别命名为:LAT-gRF1、LAT-gRF2、LAT-gRF3、LAT-gRF4以及LAT-gRR1、LAT-gRR2、LAT-gRR3、LAT-gRR4(表1,序号1~8)。他们在GX0101病毒基因组中对应的基因座位依次为:140837-140856、140879-140898、140902-140921、141099-141118以及141851-141870、141826-141845、141765-141784、141731-141750。GenScript’s gRNA在线软件分析显示,上述gRNA的靶向评分(on-target score)和脱靶评分分别为:97.7*/92.5、65.7*/93、67.5*/89.5、65.0*/97.6以及67.5*/76.5、63.5*/74.5、64.7*/81.5、71.5*/71.4。
人工合成互补配对的靶向LAT-miRNA上下游5’端和3’端两侧各4个靶点的gRNA单链oligo,在gRNA上游序列的5’端和下游序列的3’端分别添加BbsI的酶切位点,并且在上游序列中非“G”开头的oligo在5’端加“G”处理(表2)。将这些oligo依次按序命名为LAT-gRF1-5p、LAT-gRF2-5p、LAT-gRF3-5p、LAT-gRF4-5p和LAT-gRR1-5p、LAT-gRR2-5p、LAT-gRR3-5p、LAT-gRR4-5p以及LAT-gRF1-3p、LAT-gRF2-3p、LAT-gRF3-3p、LAT-gRF4-3p和LAT-gRR1-3p、LAT-gRR2-3p、LAT-gRR3-3p、LAT-gRR4-3p(表2)。
同时,利用Premier Primer 5.0设计用于扩增LAT-miRNA的特异性PCR引物对LAT-F和LAT-R;用于pX459-gRNA表达质粒鉴定引物对Step2-F和Step2-R;用于病毒拷贝数测定的qRT-PCR引物对yg-gB-F和yg-gB-R以及yg-OVO-F和yg-OVO-R(表1,序号9~12)。上述gRNAoligo和PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
2、pX459-gRNA质粒的构建及鉴定
用Bbs I-HF将pX459 v2.0质粒载体酶切后割胶回收纯化,将表2中合成的gRNA 5’和3’单链oligo复性为双链DNA。然后用T4连接酶将复性后的gRNA双链与pX459 v2.0酶切载体连接,转化E.coli感受态细胞,次日挑取单菌落。利用表1中的Step2-F和Step2-R引物对进行菌液PCR鉴定后,选择阳性菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定。确证后的阳性菌液提取pX459-gRNA质粒,利用NanoDrop 2000紫外分光光度计测定质粒浓度,-20℃保存备用。
表1靶向LAT-miRNA的gRNA靶点和用于MDV突变体鉴定的PCR引物
注:括号内粗体碱基为PAM序列
表2靶向LAT-miRNA的gRNA上下游单链oligo序列
注:下划线为BbsI酶切位点
实施例二、LAT-miRNA的基因编辑及鉴定
1、pX459-gRNA质粒组合基因编辑的PCR分析
常规方法制备鸡胚成纤维细胞CEF,细胞计数后将CEF以1.5×105个/孔的数量铺入24孔细胞培养板,置38.5℃、5%CO2培养箱中培养过夜,按照转染试剂Trans-X2TMDynamic Delivery System说明书,将靶向LAT-miRNA 5’端和3’端两侧的各4个pX459-gRNA质粒两两组合(共计16对,gRF1/gRR1、gRF1/gRR2、gRF1/gRR3、gRF1/gRR4、gRF2/gRR1、gRF2/gRR2、gRF2/gRR3、gRF2/gRR4、gRF3/gRR1、gRF3/gRR2、gRF3/gRR3、gRF3/gRR4、gRF4/gRR1、gRF4/gRR2、gRF4/gRR3和gRF4/gRR4),分别共转染CEF,置38.5℃、5%CO2培养箱中培养24h后,以5000PFU/孔的接毒量接种GX0101病毒,继续培养48h后,取样进行PCR鉴定。
用0.25%胰蛋白酶消化上述病毒感染后的CEF,充分吹悬后取一半细胞悬液以1000r/min离心10min,弃掉上清后,用1×DNA提取缓冲液(10mmol/L Tris HCl,1mmol/LEDTA,25mmol/L NaCl和10μg/mL的蛋白酶K)吹悬,金属浴65℃保温30min、95℃变性5min提取细胞/病毒总DNA。用表1中LAT-F和LAT-R引物对进行PCR鉴定,反应程序为:95℃5min预变性;95℃30s,58℃30s,72℃2min,30个循环;72℃延伸5min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果显示(图2),未转染pX459-gRNA质粒的病毒感染细胞样品中仅扩增出约1835bp的特异性野生型目的条带;16个pX459-gRNA组合质粒转染并感染病毒的细胞样品中,除扩增出1835bp的野生型条带外,在约800bp左右均出现大小不等的突变型基因编辑条带;CEF阴性对照组则未扩增出任何条带。
2、LAT-miRNA基因编辑的测序鉴定
将上述16个大小不一的突变型基因编辑小条带随机选取5个gRNA组合(gRF1/gRR2、gRF1/gRR3、gRF1/gRR4、gRF3/gRR3和gRF3/gRR4),分别割胶回收纯化后连接pMD19-T转化DH5α感受态细胞,次日挑取单菌落,用LAT-F和LAT-R引物对进行PCR鉴定。阳性菌送样进行测序。
测序分析结果显示:上述pX459-gRNA质粒组合对LAT-miRNA均进行了有效的基因编辑,双链剪切位点发生在设计的gRNAPAM序列内侧2~4个碱基处(图3~图7),与预期一致。其中,pX459-gRNA质粒组合gRF1/gRR2、gRF1/gRR3、gRF1/gRR4、gRF3/gRR3和gRF3/gRR4在GX0101基因组中对LAT-miRNA编辑缺失的核苷酸片段大小分别为989bp、942bp、894bp、864bp和816bp。
3、LAT-miRNA编辑缺失毒株的纯化鉴定及稳定性分析
选取编辑效率较高的1对gRNA组合gRF1/gRR2编辑的病毒感染细胞,采用有限稀释法接种新的6孔板单层CEF培养3~5d进行病毒单克隆纯化。随机挑选72个病毒单噬斑至24孔板单层CEF中,48h后取样同上进行PCR鉴定并进行电泳分析,选择PCR仅扩增出845bp编辑小条带的第21号克隆孔,命名为GXΔLAT-miRs-C21。将其进行第二次克隆纯化,最终筛选到1株LAT-miRNA完全缺失的毒株,命名为GXΔLAT-miRs-C21-15。
将该基因缺失毒株的编辑条带再次进行测序分析,结果与之前结果完全相同(图3),证实GXΔLAT-miRs-C21-15为LAT-miRNA完全缺失的编辑毒株。将该毒株连续传代15次,PCR分析结果显示,p1~p15不同代次病毒样品中均只能扩增出845bp的基因编辑小条带(图8),而阳性对照组中,野生型毒株GX0101中仅能扩增出1835bp大小的未编辑野生型大条带,gRF1/gRR2编辑的未纯化混合毒中可同时扩增出1835bp的野生型大条带和845bp的基因编辑小条带。上述结果表明GXΔLAT-miRs-C21-15基因缺失毒株传代稳定性良好,未发生回复突变。
实施例三、LAT-miRNA编辑缺失毒株的鉴定
1、基因编辑缺失毒株相关miRNA的表达分析
为分析LAT-miRNA的编辑缺失对GX0101编码miRNA表达的影响,选择LAT基因簇中miR-M7-5p、miR-M8-3p和miR-M10-3p,Meq基因簇中miR-M9-5p和miR-M12-3p以及Mid基因簇中miR-M11-3p进行了表达分析。用GX0101和LAT-miRNA基因缺失毒株GXΔLAT-miRs-C21-15毒株分别感染6孔板单层CEF,置38.5℃、5%CO2培养箱中培养48h后,用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,离心收集病毒感染细胞沉淀。提取上述细胞总RNA,测定浓度后利用TaqmanTMMicroRNAReverse Transcription Kit试剂盒进行反转录制备cDNA。以上述cDNA为模板,利用ThermoFisher公司提供的miRNATaqman探针,通过qRT-PCR法测定上述miRNA的相对表达量。
以miR-M11-3p为内参分析的结果显示,亲本毒株GX0101中上述miRNA均正常表达;GXΔLAT-miRs-C21-15毒株中miR-M9-5p、miR-M12-3p和miR-M11-3p均正常表达,而miR-M7-5p、miR-M8-3p和miR-M10-3p均未检测到表达(图9)。上述结果进一步证实LAT-miRNA被完全编辑并缺失,且未影响Meq和Mid基因簇中miRNA的表达。
2、基因编辑缺失株相关蛋白的表达分析
为了分析LAT-miRNA的编辑缺失是否影响MDV编码蛋白的表达,以pp38和gB蛋白为对象进行了检测。取GX0101亲本毒株和LAT-miRNA基因缺失毒株GXΔLAT-miRs-C21-15,分别接种至48孔板单层CEF,置38.5℃、5%CO2培养箱中培养3d,待显微观察出现明显病毒噬斑后,弃去细胞培养基,每孔加入200μL冰浴的甲醇/丙酮(1:1)细胞固定液,室温静置10min;弃去细胞固定液后用PBST洗三遍,充分甩干后加入含5%脱脂奶的PBST封闭液,500μL/孔,置37℃温箱封闭30min;弃去封闭液,PBST洗三遍,甩干;加入MDV-gB单抗稀释液(1:2000),100μL/孔,37℃孵育30min;弃去MDV-gB单抗稀释液,加入PBST洗三遍,甩干;加入Dylight 594GoatAnti-Mouse IgG二抗稀释液(1:1000),100μL/孔,37℃孵育30min;弃去二抗稀释液,加入PBST洗三遍,甩干;同上操作孵育MDV-pp38多抗(1:5000)和Dylight488GoatAnti-Mouse IgG(1:1000)二抗;最后加入PBST洗三遍后甩干,每孔加入200μLPBST溶液后置倒置荧光显微镜下观察结果。
结果显示(图10),GX0101和GXΔLAT-miRs-C21-15感染CEF细胞后,均能形成典型且形态相似的MDV病毒噬斑,说明LAT-miRNA的缺失不影响病毒粒子的形成,并且在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光标记的gB蛋白和红色荧光标记的pp38蛋白的表达,表明LAT-miRNA的缺失并未影响gB与pp38蛋白编码基因的表达。
3、基因编辑缺失毒株体外复制能力的分析
取GX0101亲本毒株和LAT-miRNA基因缺失毒株GXΔLAT-miRs-C21-15,分别接种至6孔板单层CEF(100PFU/孔),置38.5℃、5%CO2培养箱中培养。分别于接种后24h、48h、72h、96h和120h,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,离心收集病毒感染细胞。用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取病毒感染细胞沉淀的总DNA,测定浓度后保存于-20℃。将pMD18T-gB和pMD18T-OVO质粒进行10倍比稀释后建立qPCR标准曲线,以提取的DNA为模板,用表1中列示的荧光定量引物对yg-gB-F和yg-gB-R以及yg-OVO-F和yg-OVO-R,通过SYBR GreenⅠqPCR分别测定两个毒株感染细胞后不同时间点gB和OVO的基因拷贝数。计算gB基因拷贝数/OVO基因拷贝数比值,绘制病毒的体外增殖曲线。
结果显示(图11),病毒感染后24h~120h,两个毒株的病毒量均呈现持续上升趋势,并且在病毒复制过程中呈现出相似的体外增殖曲线,同一时间点两毒株的gB基因拷贝数无显著差异,说明LAT-miRNA的编辑缺失不影响病毒的体外复制能力。
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用
<130> 基因工程
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aggctatcat ctattcaacg agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ttgcggagtt atatgttacg cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ttcccagcct ataagaatcg tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gatatgtgga tcgggaatcg agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
atcaacatgg caaaacgatg tgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
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<210> 7
<211> 23
<212> DNA
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<400> 7
gattgtgcct tggtgcgggg cgg 23
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tgactagcag tgtgtaaggg cgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gttcctgatt tccttccgct acc 23
<210> 10
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<212> DNA
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ggccgttaat gacacttacg ttgac 25
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<212> DNA
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gccttttgct ggccttttgc tc 22
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cgggccattt accgtaagtt atgtaacg 28
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tctagggcat ggcacacgac 20
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<212> DNA
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<400> 14
gaatacggaa acacagagcg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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aagcaagaga aatgggctga t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
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aggaggggaa gacatccagt a 21
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<212> DNA
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caccgaggct atcatctatt caacg 25
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<212> DNA
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caccgttgcg gagttatatg ttacg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
aaaccgtaac atataactcc gcaac 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
caccgttccc agcctataag aatcg 25
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<211> 25
<212> DNA
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aaaccgattc ttataggctg ggaac 25
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
caccgatatg tggatcggga atcg 24
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 25
caccgatcaa catggcaaaa cgatg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
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<210> 27
<211> 25
<212> DNA
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caccgccaat taaagtatta aggag 25
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<212> DNA
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<400> 28
aaacctcctt aatactttaa ttggc 25
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caccgattgt gccttggtgc gggg 24
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<211> 24
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<400> 30
aaacccccgc accaaggcac aatc 24
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<211> 25
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caccgtgact agcagtgtgt aaggg 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
aaacccctta cacactgcta gtcac 25
Claims (4)
1.用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物,其特征在于,所述gRNA引物位于马立克病病毒LAT基因簇miRNA即LAT-miRNA的5’ 端和3’端两侧的保守区域,分别为:LAT-gRF1、LAT-gRF2、LAT-gRF3、LAT-gRF4以及LAT-gRR1、LAT-gRR2、LAT-gRR3、LAT-gRR4,其序列分别为序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的gRNA引物用于马立克病病毒LAT-miRNA基因编辑的方法,其特征在于,所述方法中合成gRNA引物的上下游单链oligo分别为:LAT-gRF1-5p、LAT-gRF1-3p、LAT-gRF2-5p、LAT-gRF2-3p、LAT-gRF3-5p、LAT-gRF3-3p、LAT-gRF4-5p、LAT-gRF4-3p以及LAT-gRR1-5p、LAT-gRR1-3p、LAT-gRR2-5p、LAT-gRR2-3p、LAT-gRR3-5p、LAT-gRR3-3p、LAT-gRR4-5p、LAT-gRR4-3p,其序列分别为序列表中SEQ ID NO.17~SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列。
3.一种如权利要求1所述的gRNA引物在与GX0101毒株具有高度保守LAT-miRNA基因序列的血清1型马立克病病毒MDV-1毒株的编辑及基因组改造中的应用。
4.一种如权利要求1所述的gRNA引物在LAT-miRNA基因位点的基因编辑敲除、外援基因编辑插入或重组疫苗研发中的应用。
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Efficient Mutagenesis of Marek"s Disease Virus-Encoded microRNAs Using a CRISPR/Cas9-Based Gene Editing System;Luo J等;《Viruses》;20200420;第12卷(第4期);摘要,图1、3,第2页第2-3段,第3页第1段-第4页第3段,第11页第3段,第12页第1段 * |
Marek’s disease virus encodes MicroRNAs that map to meq and the latency-associated transcript;Burnside J等;《J Virol》;20060930(第80期);图2,表2 * |
Marek’s disease virus-encoded microRNAs: genomics, expression and function;LUO J等;《Sci China Life Sci》;20101031;1174-1180 * |
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