CN105441480A - 一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用 - Google Patents

一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用 Download PDF

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张恒木
羊健
张芬
李静
陈剑平
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Abstract

本发明涉及一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法，应用一套4条病毒基因组特异性引物(基因序列如序列表所示)以病毒基因组cDNA为模板进行扩增，扩增产物经纯化后连接至线性化双元载体，将重组的双元载体导入农杆菌并接种植物并用于CWMV的温度敏感性分析，结果分析显示本接种方法不仅能够获得CWMV侵染的植物病株，而且十分高效，表明本方法适用于中国小麦花叶病毒的接种，可用于相关病毒生物学特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。

Description

一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种重要作物病毒的人工接种方法及其应用，尤其是一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用。
背景技术
中国小麦花叶病毒(Chinesewheatmosaicvirus，CWMV)是我国上世纪末在山东发现的一种土传病毒，现已划入帚状病毒科(familyVirgaviridae)菌传杆状病毒属(genusFurovirus)。CWMV在小麦病株上引起典型的症状包括：幼叶呈现褪绿条纹，老叶则黄化甚至变成紫色。严重的病株矮缩、萎蔫甚至死亡，从而导致产量损失严重。分子鉴定显示棒状的CWMV粒子内部含有2条单链正义RNA(ssRNA)基因组片段，分别称为RNA1和RNA2。基因组测序分析表明RNA1长7147nt，编码3个病毒运动和复制所必需的蛋白；而RNA2则较短，仅3564nt，编码4个蛋白，其中3个与病毒外壳蛋白有关，另一个则是富含半胱氨酸的RNA沉默抑制子。在自然条件下，中国小麦花叶病毒，由土壤专性寄生的禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)传播，该类病毒在真菌介体的休眠孢子中存活数载，这给该类病害的防控带来了严重困难。由于其介体禾谷多黏菌高度专性寄生，十分难以人工体外培养；在自然条件下，禾谷多黏菌种群复杂多样，加之土壤中微生物群落复杂多样，也难以获得高效传播CWMV的禾谷多黏菌纯系，因此，CWMV自然条件下的介体传播接种模式至今仍然无法在实验室条件下进行，这给CWMV及相关病毒的深入研究和生物学特性分析带来了困扰；另一方面，CWMV虽然能够摩擦接种，但其效率有限，也难以在抗病筛选和CWMV深入研究中发挥作用。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种简单快速高效的接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种快速高效的接种中国小麦花叶病毒的方法，包括以下步骤：
1)引物设计：通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设计4条引物，引物序列见表1，其中引物对R1f/R1r用于扩增RNA1,引物对R2f/R2r用于扩增RNA2；
2)病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的DNA聚合酶(NEB)进行扩增，其中引物对R1f/R1r扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对R2f/R2r扩增的RNA2产物长约3.6-kb；
3)病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In-Fusion克隆试剂盒(Clontech)参照商家说明书分别连接至线性化的双元载体质粒上，测序验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌；
4)人工接种：将含有CWMV基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将农杆菌混合液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化；
一种快速高效的接种中国小麦花叶病毒的方法的应用，包括以下步骤：
病毒温敏性分析：经人工接种CWMV的植株，分别置于12、15、17、20、25℃条件下继续培养，二周后进行病毒分子检测并分析病毒在不同温度下的复制等特性。
表1本发明所设计的引物
引物名称 引物序列(5'----3’)
R1f TTTCATTTGGAGAGGGTATTTCTTTCTCTCTACGTCGTTAGAC
R1r ATGCCATGCCGACCCTGGGCCGGATAACCCTC
R2f TTTCATTTGGAGAGGGTATTTCAATCTGTACAAGTGCGGTG
R2r ATGCCATGCCGACCCTGGGCCGGTTTACCCACC
发明的有益效果是：本发明针对当前中国小麦花叶病毒研究技术的难点，发展建立了一种简单快速高效的人工接种CWMV的方法，并成功地应用于CWMV的温敏特性分析，本方法可广泛应用于病毒生物学特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
附图说明
图1：不同温度条件下病毒RNA在接种叶片和系统叶片中的积累。其中，RNA1和RNA2分别表示CWMV的第一、二条基因组片段；sgRNA表示亚基因组RNA；rRNA表示核糖体RNA；
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
实施例1一种高效的人工接种CWMV的方法及其温敏性分析。
引物设计：通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设计4条引物，引物序列见表1，其中引物对R1f/R1r用于扩增RNA1,引物对R2f/R2r用于扩增RNA2。
病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的DNA聚合酶(NEB)进行扩增，其中引物对R1f/R1r扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对R2f/R2r扩增的RNA2产物长约3.6-kb；
病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In-Fusion克隆试剂盒(Clontech)参照商家说明书分别连接至线性化的双元载体质粒，测序验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌；
人工接种：将含有CWMV基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将农杆菌混合液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化。
病毒温敏性分析：经人工接种CWMV的植株，分别置于12、15、17、20、25℃条件下继续培养，2周后进行病毒分子检测并分析病毒在不同温度下的复制等特性。
结果分析：利用本发明的方法接种植物，接种效率可达到100％，而且所有接种CWMV的植株都产生典型的花叶症状，分子检测显示通过本方法接种的CWMV在植物体内能够正常滴进行蛋白表达、基因组复制和转录、病毒粒子装配；本实验室前期调查显示CWMV在自然条件下的发病严重程度与温度有密切相关，为了分析CWMV的这一特点，我们特别利用本发明的方法接种CWMV后，然后在不同温度条件下培养，2周后进行分子检测，结果见图1，在接种叶片中CWMVRNA在12℃条件下积累量最大，其次为15℃条件，而在25℃条件下病毒RNA积累量则少得多，表明较低温有利于CWMV在接种叶片的复制与转录及积累，而较高温度下则不利于CWMVRNA在接种叶片中的积累；在植株上部未接种叶片中，病毒RNA积累量在17℃条件下最多，其次为15℃条件，而在较低温度(12℃)和较高温度(20和25℃)条件下则没有检测到病毒RNA的积累信号，表明在15-17℃温度最有利于CWMV的系统侵染，而较低和较高的温度均不利于CWMV的系统侵染。综合起来看，低温有利于CWMV的复制与转录，但温度在15-17℃时更适合CWMV的系统侵染。因此，本发明针对当前中国小麦花叶病毒研究技术的难点，不仅提供了一种简单快速高效的人工接种CWMV的方法，还成功地应用于CWMV的温敏特性分析，为深入研究CWMV的温敏性机制奠定了基础。同时本发明也可广泛应用于病毒生物学特性、病毒基因功能及植物抗病性等分析。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法，包括以下步骤：
1)引物设计：通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设计4条引物，其中引物对R1f/R1r用于扩增RNA1,引物对R2f/R2r用于扩增RNA2；
2)病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的PhusionDNA聚合酶进行扩增，其中引物对R1f/R1r扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对R2f/R2r扩增的RNA2产物长约3.6-kb；
3)病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In-Fusion克隆试剂盒参照商家说明书分别连接至线性化的双元载体质粒上，测序验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌；
4)人工接种：将含有中国小麦花叶病毒基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将农杆菌混合液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化。
2.根据权利要求1所述的简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法的应用，包括以下步骤：经人工接种中国小麦花叶病毒的植株，分别置于12、15、17、20、25℃条件下继续培养，二周后进行病毒分子检测并分析病毒在不同温度下的复制等特性。
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