CN104250641B - 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用 - Google Patents

一种高保真dna聚合酶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种高保真DNA聚合酶、编码该高保真DNA聚合酶的基因，以及该高保真DNA聚合酶的制备方法，及其在核酸扩增中的应用。本发明公开的高保真DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。该高保真DNA聚合酶能够扩增高GC含量的核酸模板、样品纯度较低的核酸模板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA聚合酶的灵敏度和扩增效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增试剂盒中的高保真DNA聚合酶。

Description

一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用。
背景技术
DNA聚合酶广泛应用于分子生物学研究中，如DNA测序、标记、突变和核酸扩增等反应。耐热DNA聚合酶由于其热稳定性，在核酸高温变性的条件下不会失活，是目前核酸扩增的常用酶。根据序列的不同，DNA聚合酶可以分为六大族：A、B、C、D、X和Y，耐热DNA聚合酶主要属于A族和B族，并具有相似的生物学性质。A族DNA聚合酶的代表是Taq DNA聚合酶,该聚合酶分离自Thermus aquaticus YT-1的基因组，具有5’-3’的DNA外切酶活性和5’-3’DNA聚合酶活性，其菌株生长于75℃左右的温泉中，由于其能耐受高温变性，自发现后被广泛应用于PCR反应，目前已被开发成多种试剂盒；后来的研究又从其他物种中分离出了多种A族DNA聚合酶，但由于其不具有3’-5’的外切酶校正活性，容易在扩增时掺入错误的碱基，导致不能忠实地扩增模板，直到B族DNA聚合酶的发现，才使得高保真地扩增模板成为可能。B族DNA聚合酶主要分离自古细菌，包括广古菌、泉古菌、纳古菌和初古菌，其具有更高的热稳定性，同时其3’-5’外切酶校正活性能识别错误掺入延伸链中的碱基，并将其切下，利用DNA聚合酶活性添加为与模板互补的碱基，从而保证了新扩增链与模板的高度一致性。
超嗜热古菌具有严格厌氧和超嗜热生长的特性，如Pyrodictium和Methanopyrus属的物种能在110℃生长，而低于80℃则不能生长；从大西洋中脊3650米的超热烟囱中分离的Pyrolobus fumarii是目前已知最耐热的古菌，其能在高达113℃的高温条件下增值，而低于90℃则停止生长。目前已经从Pyrococcus和Thermococcus属中分离出了许多DNA聚合酶，某些DNA聚合酶在极高的温度下仍能保持稳定，被应用于分子生物学研究，尤其是核酸扩增中。其中，Pfu DNA聚合酶是一种来源于Pyrococcus furiosus的热稳定的DNA聚合酶，具有5’-3’DNA聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性。由于Pfu DNA聚合酶有3’-5’的外切酶活性，因此在核酸扩增过程中出错的机率大大降低，保真性约为Taq DNA聚合酶的6倍。目前，Pfu DNA聚合酶通常作为首选的高保真DNA聚合酶，用于核酸的高保真扩增，但是，在实际应用过程中，Pfu DNA聚合酶对引物和样品的结构、纯度和浓度要求比较高，反应灵敏度较低，扩增效率较低，限制了Pfu DNA聚合酶的使用和推广。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高扩增效率的高保真DNA聚合酶及其制备和应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种高保真DNA聚合酶，命名为Tco DNA聚合酶，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明提供了一种Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明提供了一种编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，其具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：
Ⅰ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Ⅱ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明提供了一种重组载体，其含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，该DNA分子具有具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：
Ⅰ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Ⅱ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
优选地，上述的重组载体为含有T7启动子的重组载体。
本发明提供了一种PCR扩增试剂盒，其含有Tco DNA聚合酶，该Tco DNA聚合酶具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明还提供一种高保真DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子；
取上述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
取上述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
诱导上述转化体表达融合蛋白，经分离纯化，获得高保真DNA聚合酶；
(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
优选地，具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为具有Ⅰ、Ⅱ所示的核苷酸序列中任意一个：
Ⅰ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Ⅱ具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列。
优选地，获得具有编码如(Ⅰ)或(Ⅱ)所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为从超嗜热古菌Thermococcus coalescens中分离、重组构建出上述的DNA分子；上述的超嗜热古菌购自日本微生物菌种保藏中心，其保藏编号为JCM:12540，其分离自伊豆小笠原海沟水耀海山的超高温海水中，为0.5-2μM的不规则球形，在指数生长期时，能融合为约5μM的融合细胞；该细菌生长于57-90℃，pH值为5.2-8.7，其最适pH值为6.5，最佳生长温度为87℃，具有超强嗜热生长特性；
(Ⅰ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(Ⅱ)为：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中所用到的宿主细胞，为原核系统宿主细胞。
优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中所用到的宿主细胞，为大肠杆菌宿主细胞。
优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中的纯化操作，具体为，采用凝胶介质纯化。
在本发明的一些实施例中，一种制备Tco DNA聚合酶的方法，具体为：
（1）通过同源比对Thermococcus属不同DNA聚合酶基因核苷酸序列，以相似性较高的区段设计引物，扩增Thermococcus coalescens DNA聚合酶基因片段，再根据得到的序列信息，不断扩增得到基因的全长序列如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
（2）分析上述基因结构，扩增成熟蛋白编码序列，通过重叠PCR得到如SEQ ID NO:2所示的基因片段，构建至含T7启动子的载体上，得到重组载体；
（3）将上述重组载体转化至宿主细胞E.coli Rosetta(DE3)中，得到能生产该高保真DNA聚合酶的转化体；
（4）扩大培养该转化体，诱导后用于制备该高保真DNA聚合酶；
（5）利用镍凝胶介质和肝素层析柱依次纯化，获得该高保真DNA聚合酶。
本发明提供了一种高保真DNA聚合酶及其制备方法和在核酸扩增中的应用。该高保真DNA聚合酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。实验数据表明，采用本发明所公布的制备方法所制备得的高保真DNA聚合酶的纯度达95%以上，与Pfu高保真DNA聚合酶相比，本发明提供的高保真DNA聚合酶能够扩增高GC含量的核酸模板、样品纯度较低的核酸模板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA聚合酶的灵敏度和扩增效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增试剂盒中的高保真DNA聚合酶。
附图说明
图1示Tco DNA聚合酶的纯化结果；其中，泳道1示纯化的Tco DNA聚合酶；泳道M示蛋白分子量Marker；
图2示Tco DNA聚合酶扩增不同长度的核酸片段的结果；其中，泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示人基因组800bpβ-Actin片段；泳道2示人基因组1.3kbβ-globin片段；泳道3示人基因组1.5kbβ-globin片段；泳道4示人基因组3.0kbβ-globin片段；泳道5示4.1kbβ-globin片段；泳道6示λ基因组8kb片段；
图3示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增高GC含量核酸模板和含抑制剂模板的结果；其中，1～4示Tco DNA聚合酶扩增结果；a～d示PfuDNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示人全血237bp片段；泳道2示大肠杆菌菌液1.5kb16srDNA片段；泳道3示Thermus thermophilus HB8基因2kb片段；泳道4示人基因组1.5kb片段；泳道a示人全血扩增237bp片段；泳道b示大肠杆菌菌液1.5kb16srDNA片段；泳道c示Thermus thermophilusHB8基因2kb片段；泳道d示人基因组1.5kb片段；
图4示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增不同模板量的pUC19质粒的结果；其中1～5示Tco DNA聚合酶扩增结果；6～10示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示10ng的pUC19;泳道2示1ng的pUC19；泳道3示0.1ng的pUC19；泳道4示0.01ng的pUC19；泳道5示0.001ng的pUC19；泳道6示10ng的pUC19；泳道7示1ng的pUC19；泳道8示0.1ng的pUC19；泳道9示0.01ng的pUC19；泳道10示0.001ng的pUC19；
图5示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增不同模板量的人基因组DNA的结果；其中1～4示Tco DNA聚合酶扩增结果；5～8示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示25ng的人基因组1.3kb片段；泳道2示10ng的人基因组1.3kb片段；泳道3示5ng的人基因组1.3kb片段；泳道4示1ng的人基因组1.3kb片段；泳道5示25ng的人基因组1.3kb片段；泳道6示10ng的人基因组1.3kb片段；泳道7示5ng的人基因组1.3kb片段；泳道8示1ng的人基因组1.3kb片段；
图6示不同DNA聚合酶扩增错误率；其中1示Taq DNA聚合酶；2示Pfu DNA聚合酶；3示Tco DNA聚合酶。
具体实施方式
本发明公开了一种高保真DNA聚合酶，Tco DNA聚合酶，以及所述的高保真DNA聚合酶的制备方法和在核酸扩增中的应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得所述的高保真DNA聚合酶，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用中所用到的试剂及原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的获得
菌种Thermococcus coalescens，购买于日本微生物菌种保藏中心，其保藏编号为JCM:12540。将购买的菌种以12000rpm离心5min，弃上清；细胞沉淀，参照Promega公司的 Genomic DNA Purification kit提取基因组DNA，其简要步骤如下：
细胞沉淀以600μL Nuclei Lysis Solution重悬，80℃水浴5min裂解细胞；冷却至室温后，加入200μL Protein Preciptitation Solution，震荡混匀，冰浴5min；12000rpm离心5min；吸取上清至另一个干净的离心管，加入600μL异丙醇，混匀后冰浴10min；12000rpm离心5min；核酸沉淀以700μL70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心5min后，弃上清，室温干燥核酸沉淀10min至无酒精味，加入50μL TE溶解，即获得该菌种的基因组DNA。
获得的Thermococcus coalescens基因组DNA未进行全基因组测序，因此无法得到其DNA聚合酶的基因序列。通过BLAST相似性分析得到同属已测序菌种DNA聚合酶序列相似度高的区域，设计引物调取Tco DNA聚合酶编码序列。从NCBI数据库中搜索已测序古菌DNA聚合酶全长基因及其上下游1kb左右核苷酸序列，使用Clustal W软件比对Thermococcusgammatolerans EJ3、Pyrococcus yayanosii CH1、Thermococcus kodakarensis KOD1、Thermococcus onnurineus NA1、Thermococcus sibiricus MM739序列，设计引物：
引物BamHITcoF:具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
引物Tco493R:具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
引物Tco3085F:具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
引物TcoDownR:具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
以提取的该菌种的基因组DNA为模板，按照下列体系分别配制PCR反应液，50μL体系中包含：上述基因组DNA50ng，引物各400nmol/L，dNTPs200μmol/L，（Mg2+plus）10μL，宝生物公司的 PCR扩增程序为：98℃2min，（94℃10s；55℃20s；68℃3min）25cycles，68℃延伸5min。PCR产物电泳检测，使用引物BamHITcoF+Tco493R扩增得到约2.5kb片段，引物Tco3085F+TcoDownR扩增得到约3kb片段，分别回收目的条带，并分别使用Taq DNA聚合酶加A后，将所得的两个DNA分子分别连接至pGM-T载体中，将得到阳性克隆测序确认。
将上述测序得到的核苷酸序列，通过NCBI搜索，确认其与Thermococcus和Pyrococcus属的编码DNA聚合酶B基因相似性最高，与Thermococcus sp.AM4DNA聚合酶B序列相似性达到79%，说明扩增得到的是Tco DNA聚合酶的编码序列。分析其序列得知，其编码的DNA聚合酶含有内含肽，且扩增得到的两个序列无法拼接为全长基因。
根据测序结果、分析结果再设计引物：
引物Tco30F:具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
以Tco30F和TcoDownR为引物，所提取的菌种基因组DNA为模板，扩增得到约3.5kb的片段，构建至pGM-T载体后测序，分析序列发现其中还含有内含肽。根据测序结果拼接该3.5kb片段与由引物BamHITcoF+Tco493R扩增得到的约2.5kb的片段，得到Tco DNA聚合酶全长基因，其全序列包含6186bp，其序列如SEQ ID NO:3所示，编码的蛋白共2061aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
将拼接所得的基因序列与NCBI数据库中其他DNA聚合酶成熟蛋白的编码序列比对发现，Tco DNA聚合酶基因被三个内含肽分割为四个编码框，去除内含肽后其基因包括2328bp，编码的成熟蛋白为775aa。
根据分析得到的Tco DNA聚合酶成熟蛋白编码序列，设计引物分别扩增四个ORF：
引物Tco12R:具有如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
引物TcoORF12F:具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
引物NTcoORF2R:具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
引物NTcoORF23F:具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
引物TcoORF3R:具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
引物NTcoORF34F:具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
引物NotITcoWR:具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
以提取得到的菌种基因组DNA为模板，PrimeSTAR扩增不同编码框，其中BamHITcoF和Tco12R扩增得到约1.2kb的ORF1，TcoORF12F和NTcoORF2R扩增得到约250bp的ORF2，NTcoORF23F和TcoORF3R扩增得到约150bp的ORF3，NTcoORF34F和NotITcoWR扩增得到约700bp的ORF4。四个ORF分别连接至pGM-T载体，测序后与拼接的全长基因比对，结果显示一一对应。
加相同摩尔量的ORF1、2、3、4片段，以基因两端引物BamHITcoF和NotITcoWR进行重叠PCR，拼接得到全长编码区，其序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，回收得到的全长约2.3kb片段，所得片段即为编码Tco DNA聚合酶的DNA分子。
实施例2含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的重组载体的构建
将实施例1获得的全长约2.3kb的目的片段以BamH Ⅰ和Not Ⅰ进行酶切，连接至同样酶切的含T7启动子的载体中，转化至DH5α感受态细胞中。
通过菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，证实编码Tco DNA聚合酶的基因序列的正确性，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的重组载体。
实施例3表达Tco DNA聚合酶融合蛋白的转化体的制备
将实施例2获得含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的重组载体转化到宿主细胞E.coli Rosetta(DE3)中，挑取单菌落培养至OD600=0.4，加入IPTG，至其浓度为0.1mmol/L诱导4h，收集菌体超声破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备得的转化体能够表达Tco DNA聚合酶融合蛋白。
实施例4Tco DNA聚合酶的制备
将实施例3获得的能够表达Tco DNA聚合酶融合蛋白的转化体菌种，按1:100接种至500mL含200mL LB培养基的锥形瓶中，加入卡那霉素至其终浓度为30mg/L和氯霉素至其终浓度为34mg/L，37℃200rpm振荡培养至OD600=0.4，加入IPTG至其终浓度为0.1mmol/L，于30℃诱导4h；收集诱导后菌液，12000rpm离心2min，弃上清，细胞用20mL的pH值为7.8，20mmol/LTris-HCl，0.1mol/L KCl，50mmol/L NaCl的buffer A加30mmol/L咪唑重悬，于-80℃冰箱中冻存12h；37℃溶解细胞，超声波破碎后于70℃水浴锅处理30min，12000rpm离心10min；上清过购买于国家生化工程技术研究中心的镍亲和介质，以含400mmol/L咪唑的buffer A洗脱；洗脱液过购买于国家生化工程技术研究中心的肝素亲和介质，以含200mmol/L、400mmol/L、600mmol/L、1mol/L NaCl的buffer A进行洗脱；收集各蛋白峰，经SDS-PAGE检测，发现，含200mmol/L NaCl的buffer A能洗脱部分目的蛋白，含400mmol/LNaCl的buffer A大量洗脱目的蛋白，将得到的产物透析至Storage buffer:pH值为7.4，20mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，0.1%Tween20，0.5%Nonidet P40，0.1mol/L KCl，50%甘油。
结果表明成功获得了Tco DNA聚合酶。SDS-PAGE显示其纯化结果如图1所示：其中，泳道1示纯化的Tco DNA聚合酶；泳道M示蛋白分子量Marker。由图可得，所获得的Tco DNA聚合酶的分子量约为90KDa，与其理论大小相一致，采用BandScan软件分析得其纯度达到95%以上。
实施例5Tco DNA聚合酶活性的测定
将实施例4制备得的Tco DNA聚合酶以72℃30min掺入的核苷酸量确定其活性，稀释为2.5u/μL，以荧光探针法测试其3’-5’外切酶活性，结果显示Tco DNA聚合酶具有较强的校正活性，说明其扩增保真性能较好。为了测试Tco DNA聚合酶的热稳定性，将酶于90℃孵育，取0、1、2、3、4、5、6h处理的酶测DNA聚合酶活性，结果显示Tco DNA聚合酶具有极高的热稳定性，其90℃半衰期为6h。
实施例6Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用
将实施例4制备得的Tco DNA聚合酶应用于核酸扩增。首先，测试该Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的反应条件，以pUC19质粒为模板，设计引物PCR扩增约2.7kb片段确定其反应的最适pH值及K+、NH4+、Mg2+离子浓度。配制10×buffer B:500mmol/L Tris-HCl，pH值为7.4～8.8,15mmol/L MgCl2，分别添加不同浓度KCl、(NH4)2SO4，反应体系为20μL，其中含：不同条件的10×buffer B2μL，2.5mmol/L的dNTPs1.6μL，10μmol/L的引物PAs0.5μL，10μmol/L的引物PAa0.5μL，Tco DNA聚合酶0.2μL，15ng/μL的pUC190.5μL，按98℃2min，（98℃10s，60℃20s，68℃2min40s）25cycles，最后68℃延伸5min，电泳检测，确定最适buffer。根据结果，确定Tco DNA聚合酶的最适反应条件为10×Tco buffer:pH值为8.4,500mmol/L Tris-HCl,150mmol/L KCl,100mmol/L(NH4)2SO4,15mmol/L MgCl2。
以所述的10×Tco buffer和实施例4制备得的Tco DNA聚合酶分别扩增：约800bpβ-Actin、1.3kb、1.5kb、3.0kb和4.1kbβ-globin片段的人基因组DNA和8kb片段的λ基因组，琼脂糖凝胶电泳结果显示均能很好地扩增得到目的片段。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示人基因组800bpβ-Actin片段；泳道2示人基因组1.3kbβ-globin片段；泳道3示人基因组1.5kbβ-globin片段；泳道4示人基因组3.0kbβ-globin片段；泳道5示4.1kbβ-globin片段；泳道6示λ基因组8kb片段。
实施例7Tco DNA聚合酶对高GC含量核酸模板和含抑制剂模板的扩增
嗜热微生物为了适应高温环境，其基因组含有较高的GC含量，如Thermusthermophilus HB8基因组GC含量约为70%，对普通PCR反应来说这类模板的扩增存在一定困难；而有的模板在纯化过程中容易受材料来源中抑制剂污染，导致PCR反应失败，如血液中抗凝剂EDTA、肝素等。
为了测试实施例4制备得的Tco DNA聚合酶对此类复杂模板和含抑制剂模板的扩增效果，以含EDTA的人全血为模板，直接PCR扩增237bp的SOX21非编码片段；以大肠杆菌菌液为模板扩增16srDNA约1.5kb片段；以Thermus thermophilus HB8基因组为模板，扩增其约2kb高GC片段，其GC含量约72%；以人基因组为模板，扩增其约1.5kb高GC片段，其GC含量约为65.9%；以购买于天根生化科技（北京）有限公司的Pfu DNA聚合酶为对比例，按各自最适条件扩增，反应完成后吸取相同量的产物电泳检测。Tco DNA聚合酶均能很好地扩增得到目的条带，而对比例没有目的条带出现。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，1～4示Tco DNA聚合酶扩增结果；a～d示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示人全血237bp片段；泳道2示大肠杆菌菌液1.5kb16srDNA片段；泳道3示Thermusthermophilus HB8基因2kb片段；泳道4示人基因组1.5kb片段；泳道a示人全血扩增237bp片段；泳道b示大肠杆菌菌液1.5kb16srDNA片段；泳道c示Thermus thermophilus HB8基因2kb片段；泳道d示人基因组1.5kb片段。
实施例8不同模板量条件下，Tco DNA聚合酶的扩增能力
以pUC19质粒为模版，采用实施例4制备得的Tco DNA聚合酶扩增2.7kb的pUC19质粒。分别以10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng pUC19质粒，50μL反应体系，实施例4所制备得的Tco DNA聚合酶和购买于天根生化科技（北京）有限公司的Pfu DNA聚合酶按各自最适条件扩增，反应完成后吸取5μL产物电泳检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示Tco DNA聚合酶的扩增灵敏度远高于Pfu DNA聚合酶。电泳检测结果如图4所示，其中1～5示Tco DNA聚合酶扩增结果；6～10示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示10ng的pUC19;泳道2示1ng的pUC19；泳道3示0.1ng的pUC19；泳道4示0.01ng的pUC19；泳道5示0.001ng的pUC19；泳道6示10ng的pUC19；泳道7示1ng的pUC19；泳道8示0.1ng的pUC19；泳道9示0.01ng的pUC19；泳道10示0.001ng的pUC19。由图4可观察到50μL反应体系扩增质粒模板时，TcoDNA聚合酶能检测到0.01ng pUC19质粒，而Pfu DNA聚合酶仅在10ng的条件下能扩增该质粒。
实施例9不同模板量条件下，Tco DNA聚合酶的扩增能力
以人基因组为模板，采用实施例4制备得的Tco DNA聚合酶扩增人的1.3kb片段。分别以25ng、10ng、5ng、1ng的人基因组DNA，50μL反应体系，实施例4所制备得的Tco DNA聚合酶和购买于天根生化科技（北京）有限公司的Pfu DNA聚合酶按各自最适条件扩增，反应完成后吸取5μL产物电泳检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示Tco DNA聚合酶的扩增灵敏度远高于Pfu DNA聚合酶。电泳检测结果如图5所示，其中1～4示Tco DNA聚合酶扩增结果；5～8示PfuDNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量Marker；泳道1示25ng的人基因组1.3kb片段；泳道2示10ng的人基因组1.3kb片段；泳道3示5ng的人基因组1.3kb片段；泳道4示1ng的人基因组1.3kb片段；泳道5示25ng的人基因组1.3kb片段；泳道6示10ng的人基因组1.3kb片段；泳道7示5ng的人基因组1.3kb片段；泳道8示1ng的人基因组1.3kb片段。由图5可得Tco DNA聚合酶能扩增低至5ng人基因组模板，而Pfu DNA聚合酶仅能在最高模板量25ng时得到微弱扩增。
实施例10Tco DNA聚合酶保真性测试
以蓝白斑的方法测试实施例4所制备得的Tco DNA聚合酶的保真能力，以pUC19质粒为模板，Tco DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶分别扩增全长质粒，测定各酶的扩增倍数。扩增倍数d，符合公式：2d=PCR产物量/起始模板量；Dpn Ⅰ消化模板质粒并酶切、连接后转化DH5α细胞，涂布含IPTG和显色底物X-Gal的平板，并计数蓝白斑。突变频率mf，符合公式mf=白斑数/菌落总数。以公式ER=mf/(bp×d）计算不同DNA聚合酶扩增错误率，DNA聚合酶的保真性为1/ER，错误率越低，其保真性越好。结果表明，Tco DNA聚合酶具有良好的保真性能，其保真性为Pfu的1.8倍，Taq的9.2倍。实验结果，图6所示为三者的错误率，其中1示Taq DNA聚合酶；2示Pfu DNA聚合酶；3示Tco DNA聚合酶。Tco DNA聚合酶的错误率为：1.2×10-6、Pfu DNA聚合酶的错误率为：2.2×10-6、Taq DNA聚合酶的错误率为：10.9×10-6。根据DNA聚合酶的保真性为1/ER得：Tco DNA聚合酶的保真性为Pfu DNA聚合酶的1.8倍，为Taq DNA聚合酶的9.2倍。
由以上实施例可知，本发明所公开的一种高保真DNA聚合酶，即TcoDNA聚合酶，具有扩增不同模板和片段的能力，同时对复杂模板和含抑制剂模板也能得到较好的结果，且具有高保真扩增能力，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增试剂盒中高保真DNA聚合酶。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高保真DNA聚合酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。
3.一种编码如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求3所述的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为含有T7启动子的重组载体。
6.一种PCR扩增试剂盒，其特征在于，其含有高保真DNA聚合酶；所述的高保真DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.一种高保真DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；
取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；
诱导所述转化体表达融合蛋白，经分离纯化，获得高保真DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核系统宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述原核系统宿主细胞为大肠杆菌。
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