CN108517325A - 重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体 - Google Patents

重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体 Download PDF

Info

Publication number
CN108517325A
CN108517325A CN201810312776.5A CN201810312776A CN108517325A CN 108517325 A CN108517325 A CN 108517325A CN 201810312776 A CN201810312776 A CN 201810312776A CN 108517325 A CN108517325 A CN 108517325A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinase
uvsy
restriction enzyme
gene expression
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810312776.5A
Other languages
English (en)
Inventor
周娇娇
李泓彦
莫颜瑛
张敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201810312776.5A priority Critical patent/CN108517325A/zh
Publication of CN108517325A publication Critical patent/CN108517325A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体。一种重组酶UvsY的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。上述表达基因编码的重组酶UvsY基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的重组酶UvsY的纯度大于95％。

Description

重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体。
背景技术
DNA扩增在许多分子生物学检测方法中都是非常关键的一步。PCR是在1986年就发展起来的应用最为广泛的DNA扩增技术，常用于检测、鉴定传染性疾病、基因突变以及其他方面。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链DNA解链，再在等温条件下扩增目的片段。
随着分子生物学的不断发展，重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术使不借助精密温度循环系统进行等温核酸扩增逐渐成为可能。
重组酶聚合酶扩增技术通过模拟DNA体内扩增，在等温条件下产生目的片段，该技术主要依赖重组酶UvsX、重组酶UvsY、单链结合蛋白Gp32和链置换DNA聚合酶Bsu。重组酶UvsX能够不通过加热就解开双链DNA。重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶UvsX在ATP的参与下结合引物，形成重组酶UvsX-引物复合体，这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白Gp32与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶UvsX离开寡核苷酸的3’端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，链置换DNA聚合酶Bsu结合在核酸蛋白复合体的游离3'端进行链延伸，形成新的互补链。重组酶聚合酶扩增技术中，重组酶UvsY可以改变重组酶UvsX-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于RPA的进行。
重组酶聚合酶扩增技术中重组酶UvsY具有重要作用，但目前工业化生产能够获得的重组酶UvsY的纯度偏低，纯度能够达到40％，uvsY基因在基因工程菌中的为包涵体表达，表达量低，量产化成本高。
发明内容
基于此，有必要针对重组酶UvsY的纯度偏低且量少的问题，提供一种重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体。
一种重组酶UvsY的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
上述表达基因，编码的重组酶UvsY基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的重组酶UvsY的纯度大于95％。在重组酶聚合酶扩增技术中，重组酶UvsY能够与重组酶UvsX共同作用，可以改变重组酶UvsX-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于重组酶聚合酶扩增的进行。
一种重组表达载体，包括pET-42a载体和插入在所述pET-42a载体中的目的基因表达片段，所述pET-42a载体包括pET-42a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，所述多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点，所述目的基因表达片段中含如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述BamHI酶切位点和所述SalI酶切位点之间。
一种重组酶UvsY的制备方法，包括以下步骤：
将目的基因表达片段导入pET-42a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端；
将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；以及
对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶UvsY。
在其中一个实施例中，在将目的基因表达片段导入pET-42a载体中得到重组表达载体的步骤之前，还包括以下步骤：
以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括BamHI酶切位点，所述下游引物包括SalI酶切位点；
将所述PCR扩增产物插入到pMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；以及
用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。
在其中一个实施例中，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
在其中一个实施例中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
在其中一个实施例中，所述对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述重组酶UvsY的步骤中，包括：
在重组工程菌的菌落OD值为为0.4～0.8时，加入终浓度为0.05mM/L～0.15mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在19℃～22℃诱导表达20h～24h，固液分离收集上清，得到粗产物；以及
将所述粗产物纯化，得到所述重组酶UvsY。
在其中一个实施例中，所述将所述粗产物纯化得到所述重组酶UvsY的步骤中，包括：将所述粗产物采用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到所述重组酶UvsY。
一种重组酶UvsY，其特征在于，通过如权利要求3～8任一项所述的重组酶UvsY的制备方法获得。
上述重组酶UvsY能够不通过加热就解开双链DNA，纯度大于95％。
上述重组酶UvsY在重组酶聚合酶扩增领域的应用。
上述重组酶UvsY作为重组酶聚合酶扩增领域中的一种重要酶，在恒定温度条件下可与重组酶UvsX一起实现核酸指数扩增，重组酶UvsY的应用可以使得DNA的扩增反应灵敏、高效、性价比高。
附图说明
图1为实施例1的克隆载体的部分正向测序图；
图2为实施例1的重组工程菌的平板培养物与阴性对照及阳性对照对比图；
图3为实施例1的重组工程菌的菌落PCR电泳图；
图4为实施例1的重组工程菌诱导后菌体的SDS-PAGE电泳图；
图5为实施例1的重组工程菌诱导后菌体、诱导且超声破碎后离心上清及诱导且超声破碎后离心沉淀的SDS-PAGE电泳图；
图6为实施例1的重组工程菌诱导后超声破碎上清经GST柱纯化后的再Ni柱纯化前后的SDS-PAGE电泳结果比对图；
图7为实施例1的重组酶UvsY酶活性验证的电泳图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的重组酶UvsY的制备方法，包括以下步骤：
S110、以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，上游引物包括BamHI酶切位点，下游引物包括SalI酶切位点。
具体地，步骤S110具体包括以下步骤S111～S113：
S111、获得重组酶UvsY的基因编码序列。具体地，重组酶UvsY的基因编码序列可以从基因数据中筛选获得。
S112、重新设计编码重组酶UvsY的核苷酸序列，得到如SEQ ID No.1序列。
在本实施方式中，选取埃希氏杆菌属T4病毒(Escherichia virus T4)编码重组酶UvsY的基因序列，并对该基因序列根据大肠杆菌密码子偏好进行优化，得到优化之后的序列如SEQ ID No.1所示。如SEQ ID No.1序列中含有BamHI酶切位点及SalI酶切位点，以便于酶切。
S113、将如SEQ ID No.1序列PCR扩增，得到PCR产物。
具体地，构建包括如SEQ ID No.1序列、上游引物及下游引入上游引物的PCR体系，然后进行PCR，得到PCR产物。
进一步地，上游引物包括BamHI酶切位点，下游引物包括SalI酶切位点，以便于酶切PCR扩增产物从而构建克隆载体。
更一步地，上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的碱基序列如SEQID No.3所示。
S120、将PCR扩增产物插入到pMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体。
具体地，将S110步骤中得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BamHI酶及限制性内切酶SalI酶双酶切处理漏出粘性末端，并插入同样经过BamHI酶及SalI酶双酶切处理的pMD19-T Simple载体中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞中，扩增提取质粒，并测序验证插入序列的正确性，得到插入序列正确的克隆载体。
本实施方式中的感受态细胞为TOP10。
S130、用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。
具体地，将S120步骤中得到的插入序列正确的克隆载体进行BamHI酶及SalI酶双酶切，并将双酶切的片段产物进行纯化回收，得到目的基因表达片段。得到的目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，且其5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，3’端具有SalI酶切位点黏性末端，以便于构建重组表达载体。
本实施方式采用试剂盒进行纯化回收。当然，在其他实施方式中，也可以采用其他常用的纯化回收方式，只要能够纯化回收酶切之后的片段产物及表达载体即可。
S140、将目的基因表达片段导入pET-42a载体中，得到重组表达载体。
具体地，将目的基因表达片段导入经BamHI酶及SalI酶双酶切处理的pET-42a载体中，得到重组表达载体。pET-42a载体经BamHI酶及SalI酶双酶切处理以便于目的基因片段插入。
具体地，pET-42a载体包括pET-42a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点。
S150、将重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌。
具体地，将重组表达载体转入具有抗性标记的大肠杆菌，然后在抗性平板上培养以得到转化子。然后随机挑选一定量的转化子进行菌落PCR以验证转化的正确性，确保重组工程菌转化成功。
进一步地，具有抗性标记的大肠杆菌为BL21(DE3)，抗性平板上为含Kanr平板。
具体地，进行菌落PCR的引物如SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示。
进一步地，菌落PCR之后采用琼脂糖凝胶电泳，若琼脂糖凝胶电泳的条带与预期的大小一致，则转化成功，反之则未转化成功。
具体地，将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含Kanr平板上，培养12h～16h，观察是否有单克隆生长，若有生长，则初步判定转化成功。然后挑取转化子进行菌落PCR进一步验证。
发明人在酶切位点、表达载体以及基因工程菌方面进行了大量的探索研究，从而构建获得上述重组酶UvsY的表达片段的重组工程菌。该重组工程菌能够高效、可溶性的表达重组酶UvsY，产率高，能够实现大批量的生产。
S160、对重组工程菌进行诱导培养，得到粗产物。
具体地，将重组工程菌加入含有Kanr的LB液体培养基中培养一段时间，待菌体正常生长后，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导培养，得到粗产物。
进一步地，重组工程菌与含有Kanr的LB液体培养基的接种体积比例为10μL：800mL～1200mL。重组工程菌在含有Kanr的LB液体培养基中培养的温度为35℃～38℃，培养时间为10h～16h，以使重组工程菌复苏和扩增，得到OD值为0.4～0.8的生长活力较好的重组工程菌。
进一步地，加入终浓度为0.05mM/L～0.15mM/L的IPTG，IPTG的诱导培养温度为19℃～22℃，培养时间为20h～22h，低于扩增培养重组工程菌的温度。研究过程中发现，诱导培养的温度较低，适宜重组酶UvsY的表达，提高表达效率。
进一步地，诱导培养之后，进行重组酶UvsY是否表达的验证。具体地，取一定量的诱导培养后的菌液，离心得到菌体，加入loading buffer，煮沸，离心，冷却后取上清进行SDS-PAGE电泳。若上清的SDS-PAGE电泳条带在预期(可由SnapGene计算得重组酶UvsY的大小)处，则有表达，反之则无。当然，在其他实施方式中，若也可以用本领域内常见其他确定蛋白是否表达的方法。可以理解的是，在确定重组酶UvsY在重组工程菌中能够表达时，验证重组酶UvsY是否表达的步骤可以省略。
进一步地，确定重组酶UvsY是表达后，进行重组酶UvsY的表达方式的确认，以确定重组酶UvsY是可溶性表达还是包涵体表达，还是两者皆是。具体地，取一定量诱导培养后的菌液，进行固液分离，收集菌体，并超声破碎，得上清及沉淀，将上清和沉淀经SDS-PAGE电泳。若在上清及沉淀具有与目的蛋白大小相近的条带，则可溶性表达及包涵体表达均有，若只上清具有与目的蛋白大小相近的条带，则为可溶性表达，若只沉淀具有与目的蛋白大小相近的条带，则为包涵体表达。当然，可以理解的是，在确定表达方式之后，确认重组酶UvsY的表达方式的步骤可以省略，直接收集所需的含有重组酶UvsY的粗产物。
本实施方式中，经验证，重组酶UvsY均有表达，为进一步简化后续蛋白纯化的工艺，取超声破碎后的上清作为粗产物进行下一步纯化。
S170、将粗产物纯化，得到重组酶UvsY。
具体地，将粗产物采用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到重组酶。
具体地，将粗产物纯化，得到重组酶UvsY的操作包括以下步骤S171～S172：
S171、将粗产物硫酸铵盐析沉降，得到盐析产物。
具体地，盐析沉降时温度控制在0℃～10℃条件下，避免蛋白沉降后发生变性。
具体地，硫酸铵的终浓度为2mol/L～6mol/L，加入硫酸铵后，硫酸铵的浓度合适，通过硫酸铵盐析沉降目的蛋白，从使得粗产物得到纯化。
具体地，盐析沉降时间为20min～40min。盐析沉降后得到的沉淀中含有大量的目的蛋白。
具体地，盐析沉降后，在10000rpm～15000rpm离心10min～20min，收集沉淀得盐析产物。
S172、将盐析产物通过Ni离子亲和柱纯化，得到重组酶UvsY。
具体地，利用Ni离子亲和柱纯化盐析产物的操作包括以下步骤S1721～S1722。
S1721、将盐析产物溶解在结合缓冲液中，加入到Ni离子亲和柱中，结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L～300mmol/L的NaCl，结合缓冲液与盐析产物的体积比为2～5：1。
具体地，结合缓冲液的pH值约为8，将盐析产物溶解在结合缓冲液中并加入到Ni离子亲和柱中，粗产物中的目的蛋白结合在Ni离子亲和柱上面。
S1722、用浓度梯度的咪唑溶液洗涤Ni离子亲和柱，收集重组酶UvsY的洗脱液。
咪唑溶液能够竞争性的与Ni离子结合，从而将目的蛋白洗脱下来。
具体地，结合缓冲液的pH值约为8，将盐析产物加入到Ni离子亲和柱中后，先用8倍～12倍柱床体积结合缓冲液平衡。再用3倍～6倍柱床体积的浓度梯度咪唑溶液依次洗涤。
梯度咪唑溶液中含有终浓度为10mmol/L～30mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L～300mmol/L的NaCl和不同浓度的咪唑。具体地，浓度梯度的咪唑溶液中咪唑的浓度依次为15mmol/L、40mmol/L和240mmol/L。
先用低浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，洗脱杂蛋白。然后用高浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，出现目的蛋白峰时，收集含有重组酶UvsY(目的蛋白)的洗脱液。
具体地，收集含有重组酶UvsY的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对含有重组酶UvsY的洗脱液进行缓冲液置换，平衡缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris-HCl、终浓度为0.1mmol/L～0.4mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)和终浓度为0.5mmol/L～2mmol/L的DTT(二硫苏糖醇)，pH为8。
含有重组酶UvsY的洗脱液中还有部分咪唑，对重组酶UvsY的纯度以及稳定性产生影响。将重组酶UvsY置换到平衡缓冲液中，使得重组酶UvsY比较稳定，保存时间更长。
进一步地，将含有重组酶UvsY的洗脱液置换成平衡缓冲液后，加入等体积的甘油，置于-80℃条件下待用。
需要说明的是，实际应用中，表达纯化重组酶UvsY时，不局限于上述步骤S110～S170的顺序。本领域技术人员可以根据需要进行调整。如当预先已经构建并保存了含有重组酶UvsY表达片段的重组工程菌时，步骤S110～S150可以省略。
上述重组酶UvsY的制备方法，通过对含有重组酶UvsY的表达基因的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(重组酶UvsY)的裂解液。然后将裂解液纯化，除去杂蛋白，提高重组酶UvsY的纯度。这种制备重组酶UvsY的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，获得的重组酶UvsY纯度高，可达95％以上，能够满足重组酶聚合酶扩增技术对于重组酶UvsY的纯度要求，能够应用于重组酶聚合酶扩增领域。
一种重组酶UvsY，通过上述重组酶UvsY的制备方法获得。具体地，编码上述重组酶UvsY的基因序列包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。在不加热的条件下，重组酶UvsY能够协助重组酶UvsX解开DNA双链的解链，进而便于进行DNA的延伸、扩增。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
(1)构建克隆载体
在NCBI上查找埃希氏杆菌属T4病毒(Escherichia virus T4)编码重组酶UvsY的基因序列，GenBank序列号为NC_000866.4。对该基因序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化，优化后的序列如SEQ ID No.1所示。再将如SEQ ID No.1所示的序列通过PCR的方法拼接，然后克隆入PMD19-T SIMPLE载体并转化至感受态细胞TOP10，测序验证克隆载体中插入序列是否与要求相一致，得到插入序列正确的克隆载体。
本实施方式的克隆载体部分测序结果如图1所示。其中，图1为克隆载体的部分正向测序图。由图可知，如SEQ ID No.1所示的序列从图1中的37开始，至462结束。测序结果表明了如SEQ ID No.1所示的序列正确插入了PMD19-T SIMPLE载体。
(2)构建重组表达载体
酶切：将插入序列正确的克隆载体中的如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列从克隆载体PMD19-T SIMPLE双酶切切下，pET-42a载体也使用BamHI酶及SalI酶酶切，上述两种载体的酶切体系如下表1。
表1
酶切的条件为：先30℃酶切2h，再37℃酶切2h。并且将双酶切后的pET-42a载体进行纯化回收，目的片段进行切胶回收，具体按照试剂盒的说明书进行操作，得到纯化的均带有BamHI酶切位点黏性末端及SalI酶切位点黏性末端的pET-42a载体和目的片段。
连接：将纯化回收的pET-42a载体和目的基因表达片段按照表2的体系连接，得到重组表达载体，其中，连接反应条件为16℃，30min。
表2
(3)构建重组工程菌
将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含Kanr平板上，培养12h～16h，观察是否有单克隆生长。
结果如图2所示，由左向右依次是阴性对照组、阳性对照组、实验组，其中阴性对照组为大肠杆菌BL21(DE3)，阳性对照组为含有PET-42a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，实验组为将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)的重组工程菌。从图2中可以看出实验组平板长满了克隆，表明含有目的基因表达片段的重组工程菌构建成功。
随机挑取7个转化子编号1～7，分别溶于20μL的生理盐水，取1μL用于菌落PCR验证。其中，菌落PCR引物如表3所示，GGATCC代表BamHI的酶切位点，GTCGAC代表SalI的酶切位点。
表3
菌落PCR的扩增体系如表4，扩增条件为：1)94℃，5min；2)94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，循环30次；3)72℃，4min。然后将PCR扩增结果进行1％的琼脂糖凝胶电泳。
菌落PCR电泳结果如图3所示，其中，图3的第一泳道为Maker，Maker的分子量从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。第2～8泳道分别为挑取的7个转化子。图3中，转化子的PCR结果的条带与预期的大小一致(目的基因片段的理论大小为535bp)。菌落PCR电泳结果进一步表明了目的基因片段成功地导入了大肠杆菌BL21(DE3)中。
表4
(4)诱导重组工程菌表达及纯化
确认是否表达成功：挑取菌落PCR编号1～5的转化子所在的克隆，分别溶于20μL的生理盐水，取10μL加入1L含有Kanr的LB液体培养基中培养3h，加入IPTG诱导(1:1000)，培养2h，收取菌液，离心，去上清，加入60μL 1Xloading buffer，煮沸10min，离心，冷却，取上清，上样10μL。先恒压100V，电泳30min，再恒压200V，电泳20min。取下胶，用考马斯亮蓝染色5min，高温加热脱色5min。
SDS-PAGE结果如图4所示，图4中第一泳道为蛋白maker，蛋白marker的分子量从上到下依次为250KD、150KD、100KD、70KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD；编号1的泳道是诱导的空质粒的大肠杆菌BL21(DE3)处理的菌体；编号2-6的泳道为含重组质粒的转化子诱导后的菌体；由图4可以看出，转化子所在的泳道在40KD附近的蛋白表达量较多(根据各酶序列以及SnapGene软件计算，42a-uvsY蛋白理论大小是45.3KD)。需要说明的是，42a-uvsY蛋白包括目的蛋白及表达载体自身表达蛋白；表达载体自身表达蛋白比如GST标签。由图4的结果表明按照上述步骤制备的重组工程菌能够诱导表达重组酶UvsY。
确认表达方式：将10μL重组工程菌接种到800mL的LB培养基中，37℃培养6h，使其菌落OD值达到0.5后，加入0.1mM的IPTG，低温20℃，诱导表达22h，10000rpm离心收集菌体，并且对其菌体进行超声破碎，然后SDS-PAGE电泳。
SDS-PAGE结果如图5所示，图5中第一泳道为诱导后的菌体；第二泳道为诱导后超声破碎离心的上清；第三泳道为诱导后超声破碎离心的沉淀，第四泳道为经GST柱纯化的诱导后超声破碎离心上清，第五泳道为蛋白Maker。由图5可以看出，重组酶UvsY在大肠杆菌中存在可溶性表达和包涵体表达。
盐析：取诱导表达后的菌体进行超声破碎后，取上清，经GST柱纯化后，在4℃加入终浓度为的4mol/L硫酸铵，盐析沉降时间为30min，10000rpm离心10min，收集沉淀得盐析产物。
Ni离子亲和柱纯化：将盐析产物溶解在结合缓冲液中，并加入到Ni离子亲和柱中进行纯化，收集各段洗脱液SDS-PAGE电泳，结果如图6所示。
合并第十六泳道～十九泳道的洗脱液，测定蛋白浓度，测定结果显示按照上述制备方法制备的重组酶UvsY纯度大于95％。
用sephadexG25色谱柱进行进行缓冲液的置换。先用1CV～2CV(1～2倍柱体积)的NaOH(0.2mol/L)清洗sephadexG25色谱柱，填料、系统和管路，用NaOH清洗以确保所有接触蛋白的部位无菌。上样前色谱柱用无菌水平衡至pH中性，随后用storage buffer(20mmol/LTris-HCl，pH 8.0，150mmol/L EDTA，1mmol/L DTT)平衡色谱柱，至UV280洗脱至基线，电导、PH稳定。取收集的含有重组酶UvsY的洗脱液上样(约1/5柱床体积)，上柱过程中温度维持在4℃。凝胶过滤层析收集的样品补加等体积的甘油，-80℃保存。
(5)重组酶UvsY活性的测定
原理：UvsY属于UvsX重组酶的促进辅助蛋白。可以参考RecA蛋白活性的测定。根据链置换后凝胶成像的亮度来定性分析酶活性。
方法：用单链环状和双链状线为底物，与重组酶UvsY进行反应。在SSB与ATP存在下，重组酶UvsY催化基链交换，形成的产物为单链线状DNA及具缺刻的双链环状DNA，这几种不同结构的DNA将在琼脂糖电泳中迁移至不同的位置。同时，发生链置换之后，凝胶成像的亮度也发生改变。具体地，先制备反应缓冲液，反应缓冲液的终浓度为33mmol/L Tris醋酸(pH 7.5)，1.2mmol/L醋酸镁，2mmol/L异硫苏糖醇，100μg/mL小牛血清。然后在以上缓冲液中，加入50ng M13mp SSDNA(单链环状DNA)及不同量的(2μg、4μg、6μg)RecA蛋白/UvsY蛋白/UvsX蛋白，使终体积为20μL。在37℃下温育15min后，加入总体积为10μL的以下混合液：100ng BamHI酶切的线状的M13mp RFDNA(双链线状DNA)，33mmol/LTris醋酸(pH7.5)，60mmol/L醋酸镁，2mmol/L异硫苏糖醇，100μg/mL小牛血清，1μg SSB蛋白，48mmol/LATP，30mmol/L磷酸肌醇，40单位肌酸激酶。然后反应在37℃下继续进行20min后，65℃终止反应。最后用1％脂糖凝胶电泳，在0.5×TBE缓冲液中电泳检测。
结果：凝胶电泳结果如图7所示，图7中，第一泳道为单链DNA，作为第一对照组，第二～第四泳道为NEB的RecA蛋白，第五泳道～第七泳道为重组酶UvsY与重组酶UvsX，第八泳道～第十泳道为重组酶UvsX，第十一泳道为RFDNA，作为第二对照组。
从图7的结果可以看出，重组酶UvsY具有活性，能够促进重组酶UvsX催化M13mpSSDNA与BamHI酶切的线状的M13mp RFDNA发生链置换，形成单链线性DNA及具缺刻的双链环状DNA，在琼脂糖电泳中迁移至不同的位置。根据UvsX实验组、UvsX+UvsY实验组及RecA蛋白实验组与对照组的对比发现，UvsX实验组、UvsX+UvsY实验组及RecA蛋白实验组的结果均为：单链DNA及双链DNA的亮度均发生了改变，单链DNA的亮度增加，双链DNA的亮度减少，且UvsX+UvsY实验组与UvsX实验组相比，UvsX+UvsY实验组的单链亮度更高、双链亮度更低。结果表明重组酶UvsY具有活性，能够协助重组酶UvsX完成DNA链置换。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市艾伟迪生物科技有限公司
<120> 重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccatgc gtctggaaga tctgcaagag gaactgaaaa aagatgtgtt tatcgacagc 60
accaaactgc agtatgaagc agcaaataat gtgatgctgt atagcaaatg gctgaacaaa 120
catagcagca tcaaaaaaga aatgctgcgt attgaggccc agaaaaaagt tgcactgaaa 180
gcacgtctgg attattacag cggtcgtggt gatggtgatg aatttagcat ggatcgttat 240
gagaaaagcg agatgaaaac cgttctgagc gcagataaag atgttctgaa agttgatacc 300
agcctgcagt attggggtat tctgctggat ttttgtagcg gtgcactgga tgcaattaaa 360
agccgtggtt ttgccattaa acatatccag gacatgcgtg catttgaagc cggtaaataa 420
gtcgac 426
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggatccat gcgtctggaa gatctg 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgtcgactt atttaccggc ttcaa 25

Claims (10)

1.一种重组酶UvsY的表达基因，其特征在于，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，包括pET-42a载体和插入在所述pET-42a载体中的目的基因表达片段，所述pET-42a载体包括pET-42a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，所述多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点，所述目的基因表达片段中含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段正向插入在所述多克隆位点序列的所述BamHI酶切位点和所述SalI酶切位点之间。
3.一种重组酶UvsY的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将目的基因表达片段导入pET-42a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5’端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3’端具有SalI酶切位点黏性末端；
将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；以及
对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述重组酶UvsY。
4.如权利要求3所述的重组酶UvsY的制备方法，其特征在于，在将目的基因表达片段导入pET-42a载体中得到重组表达载体的步骤之前，还包括以下步骤：
以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括BamHI酶切位点，所述下游引物包括SalI酶切位点；
将所述PCR扩增产物插入到pMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；以及
用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。
5.如权利要求4所述的重组酶UvsY的制备方法，其特征在于，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
6.如权利要求3所述的重组酶UvsY的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
7.如权利要求3所述的重组酶UvsY的制备方法，其特征在于，所述对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述重组酶UvsY的步骤中，包括：
在重组工程菌的菌落OD值为0.4～0.8时，加入终浓度为0.05mM/L～0.15mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在19℃～22℃诱导表达20h～24h，固液分离收集上清，得到粗产物；以及
将所述粗产物纯化，得到所述重组酶UvsY。
8.如权利要求7所述的重组酶UvsY的制备方法，其特征在于，所述将所述粗产物纯化得到所述重组酶UvsY的步骤中，包括：
将所述粗产物采用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到所述重组酶UvsY。
9.一种重组酶UvsY，其特征在于，通过如权利要求3～8任一项所述的重组酶UvsY的制备方法获得。
10.如权利要求9所述的重组酶UvsY在重组酶聚合酶扩增领域的应用。
CN201810312776.5A 2018-04-09 2018-04-09 重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体 Pending CN108517325A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810312776.5A CN108517325A (zh) 2018-04-09 2018-04-09 重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810312776.5A CN108517325A (zh) 2018-04-09 2018-04-09 重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108517325A true CN108517325A (zh) 2018-09-11

Family

ID=63432082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810312776.5A Pending CN108517325A (zh) 2018-04-09 2018-04-09 重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108517325A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747187A (zh) * 2022-12-09 2023-03-07 厦门康基生物科技有限公司 一种重组酶UvsX及其表达基因和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105779578A (zh) * 2015-08-27 2016-07-20 江苏奇天基因生物科技有限公司 一种利用重组酶介导等温核酸扩增技术检测沙门氏菌的方法
CN106367413A (zh) * 2016-09-05 2017-02-01 博奥生物集团有限公司 一种核酸的扩增方法及应用
CN107177684A (zh) * 2017-06-15 2017-09-19 刘琳 一种恒温核酸扩增反应试剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105779578A (zh) * 2015-08-27 2016-07-20 江苏奇天基因生物科技有限公司 一种利用重组酶介导等温核酸扩增技术检测沙门氏菌的方法
CN106367413A (zh) * 2016-09-05 2017-02-01 博奥生物集团有限公司 一种核酸的扩增方法及应用
CN107177684A (zh) * 2017-06-15 2017-09-19 刘琳 一种恒温核酸扩增反应试剂

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION NO:4ZWQ_A: "Chain A，Recombination Protein Uvsy", 《GENBANK》 *
ACCESSION NO:NP_049799.2: "UvsY recombination,repair and ssDNA binding protein[Escherichia virus T4]", 《GENBANK》 *
GAJEWSKI S ET AL.: "Structure and mechanism of the phage T4 recombination mediator protein UvsY", 《PNAS》 *
MINAGAWA T ET AL.: "Function of cloned T4 recombination genes, uvsX and uvsY, in cells of Escherichia coli", 《MOL GEN GENET》 *
TAKAHASHI H ET AL.: "Nucleotide Sequence of Bacteriophage T4 uvsY Gene", 《VIROLOGY》 *
张蕾等: "《生物化学实验指导》", 31 August 2011, 武汉大学出版社 *
陈红等: "《生物制药工艺学》", 31 March 2018 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115747187A (zh) * 2022-12-09 2023-03-07 厦门康基生物科技有限公司 一种重组酶UvsX及其表达基因和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2202312B1 (en) DNA polymerases having improved labelled nucleotide incorporation properties
US8383370B2 (en) Modified RNA ligase for efficient 3′ modification of RNA
Oliveira et al. An AbrB-like protein regulates the expression of the bidirectional hydrogenase in Synechocystis sp. strain PCC 6803
US10883091B2 (en) DNA polymerase variant and application thereof
CN108070577B (zh) 一种抗血清干扰TaqDNA聚合酶及其制备和应用
CN102757960B (zh) 一种扩增未知序列的半随机pcr技术及其引物和试剂盒
CN112661861A (zh) 重组聚合酶、编码基因、制备方法、载体、试剂盒及应用
CN108559756A (zh) 重组酶UvsX的制备方法、表达基因及重组表达载体
CN114262697B (zh) 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌
CN111073871B (zh) 热稳定性提高的dna聚合酶突变体及其构建方法和应用
EP2566959A1 (en) System and method for purification and use of inorganic pyrophosphatase from aquifex aeolicus
CN108866085A (zh) Bsu DNA聚合酶的表达基因、重组表达载体及制备方法
CN108913700A (zh) gp32单链结合蛋白的制备方法、表达基因、重组表达载体及应用
CN108517325A (zh) 重组酶UvsY的制备方法、表达基因及重组表达载体
CN104250641B (zh) 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用
CN108929883B (zh) 芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用
CN106834252A (zh) 一种高稳定型MazF突变体及其应用
CN103881989B (zh) 一种具有持续合成能力和盐耐受度的dna聚合酶
CN106399299A (zh) 一种通过点突变提高大片段嗜热脂肪地芽孢杆菌dna聚合酶活性的方法及应用
CN102559854A (zh) 一种用于转基因大豆、玉米和棉花检测的标准质粒分子及其构建
KR20070096349A (ko) 유전자변형 면화의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법및 이에 사용되는 표준 플라스미드
CN102181555A (zh) 一种检测植物中目标基因的方法及其专用spr生物传感器
CN107012146B (zh) 基于位点特异性重组的四膜虫表达载体及其构建和应用
CN104480081A (zh) Sso7d-Sau重组DNA聚合酶
CN109943549A (zh) 一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180911

RJ01 Rejection of invention patent application after publication