CN107177684A

CN107177684A - 一种恒温核酸扩增反应试剂

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Publication number: CN107177684A
Application number: CN201710451667.7A
Authority: CN
Inventors: 刘琳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2017-09-19
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN107177684B

Abstract

本申请涉及一种恒温核酸扩增反应试剂。其包括解旋酶、甲酰胺、亚精胺、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶。

Description

一种恒温核酸扩增反应试剂

技术领域

本发明涉及一种恒温核酸扩增反应试剂。

背景技术

传统PCR在技术应用上存在几个方面的限制：第一，需要昂贵的仪器，同时仪器需要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现在很高的温度下DNA模板链的变性，在较低的温度下退火利用引物延伸模板；第二，体系中需要耐受高温的聚合酶；第三，在PCR循环中，每个循环的退火时间都很短，这就要求引物必须快速找到模板上的同源匹配区段，以实现延伸，这就要求PCR有过量的PCR引物，而过量的引物会与模板错配，引发错误扩增或产生引物二聚体。

与传统的PCR技术相比，恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在较低的温度下恒温扩增，因此，不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。恒温扩增技术日益受到重视。

但是，现有的恒温扩增技术也存在一些缺陷，比如扩增产物得率不高，对设计的引物要求较高，不能进行多重扩增以及多重扩增效率低和差，对扩增模板核酸的纯度要求较高等问题。

发明内容

本申请提供了一种恒温核酸扩增反应试剂，其包括解旋酶、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶。

在一个具体实施方式中，所述试剂中还包括甲酰胺、亚精胺和甜菜碱中的至少一种。例如，所述试剂中还包括甲酰胺和亚精胺。

在一个具体实施方式中，所述试剂包括解旋酶、甲酰胺、亚精胺、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶。

在一个具体实施方式中，解旋酶10ng/μL-15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1％-0.5％、亚精胺0.5ng/μL-5ng/μL、氯化镁5mM—100mM、冰醋酸的体积百分含量为1％-5％、UvsX蛋白40ng/μL-80ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL-90ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL-1000ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL-5mg/mL、dNTPs 50mM—100mM、Tris碱10mM—50mM、恒温DNA聚合酶1U/反应-2U/反应、以及甜菜碱0-5ng/μL。

在一个具体实施方式中，恒温核酸扩增反应试剂包括溶液I和溶液II，其中，所述溶液I包括解旋酶、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs和Tris碱；所述溶液II恒温DNA聚合酶。

在一个具体实施方式中，所述溶液I还包括甲酰胺、亚精胺和甜菜碱中的至少一种。例如所述溶液I还包括甲酰胺和亚精胺。

在一个具体实施方式中，所述溶液I包括解旋酶10ng/μL-15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1％-0.5％、亚精胺0.5ng/μL-5ng/μL、氯化镁5mM—100mM、冰醋酸的体积百分含量为1％-5％、UvsX蛋白40ng/μL-80ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL-90ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL-1000ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL-5mg/mL、dNTPs 50mM—100mM、Tris碱10mM—50mM、以及甜菜碱0-5ng/μL。

在一个具体实施方式中，所述恒温DNA聚合酶包括BstDNA聚合酶和/或phi29DNA聚合酶。

在一个具体实施方式中，所述试剂的pH值为6.5-8.2；优选所述试剂的pH为7.2-7.6。

在一个具体实施方式中，所述试剂中还包括荧光染料。

在一个具体实施方式中，所述荧光染料选自SYBR green I、SYTO-13和SYTO-12中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述试剂中还包括用于扩增靶标片段的一对引物。

在一个具体实施方式中，所述试剂中还包括逆转录酶进行RNA反转录扩增反应。此时，在完整的扩增体系中还要有相关的引物和RNA模板。

本申请的蛋白和酶，可以来源于微生物中，亦可来源于动植物中。

本申请的有益效果：

I)使用本申请的恒温核酸扩增反应试剂，对于引物设计要求低，提高了扩增效率。(1)引物设计不需要考虑引物的GC含量；(2)引物设计不需要考虑引物的退火温度Tm值；(4)对于引物的各种修饰不影响本体系的扩增效率；(3)引物设计长度为20bp—40bp之间。

II)使用本申请的恒温核酸扩增反应试剂，解决了不能进行多重扩增以及多重扩增效率低和差的问题，实现了多重引物的高效扩增。

III)使用本申请的恒温核酸扩增反应试剂，具备抗扩增抑制的作用，对扩增模板核酸的纯度要求非常低。

IV)组分中同时加入亚精胺和甲酰胺，使试剂具备了抵抗抑制模板扩增物质的作用；可以降低扩增引物的设计要求；无需考虑引物本身的GC含量及退火温度Tm值；可以提高扩增产物的得率；能够减少或消除非特异扩增。

V)本申请的恒温扩增体系可实现常规高温PCR能够实现的一切扩增，如：

本申请的恒温扩增体系可用于普通核酸扩增；

本申请的恒温扩增体系可用于反转录扩增；

本申请的恒温扩增体系可用于不对称扩增；

本申请的恒温扩增体系可用于多重扩增；

本申请的恒温扩增体系根据不同的扩增条件，其扩增温度在28-48℃之间；

本申请的恒温扩增体系根据不同的扩增条件，其扩增时间在5分钟到1小时之间。

附图说明

图1显示了实施例1恒温扩增的核酸电泳结果。

图2显示了实施例2的3#和4#号管的核酸电泳结果。

图3显示了实施例2的5#和6#号管的核酸电泳结果。

图4显示了实施例3恒温扩增的核酸电泳结果。

图5显示了实施例4恒温扩增的核酸电泳结果。

图6显示了实施例5恒温扩增的检测结果。

图7显示了实施例6的30#号管恒温扩增的检测结果。

图8显示了实施例6的31#号管恒温扩增的检测结果。

图9显示了实施例7的32#号管恒温扩增的检测结果。

图10显示了实施例6的33#号管恒温扩增的检测结果。

图11显示了实施例8恒温扩增的核酸电泳结果。

图12显示了实施例9恒温扩增的核酸电泳结果。

具体实施方式

下面通过优选的实施例加以说明。

DNA纯度检测：利用美林恒通SMA6000微量分光光度计检测。

扩增核酸模板：从宫颈脱落细胞中，利用天根核酸提取试剂盒提取人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA，由当地人民医院提供。DNA纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8，纯度较高；标记为DNA I#。

扩增核酸模板：从宫颈脱落细胞中，利用碱处理方法粗糙提取人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA。DNA纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀＝0.8，纯度较低；标记为DNAII#。

扩增核酸模板：采用结核分支杆菌RNA核酸提取试剂盒，分别从阳性临床样本中提取结核分枝杆菌RNA，标记为RNA I#；从阴性临床样本中提取RNA，标记为RNA II#。以上临床样本中的RNA由当地人民医院提供。

扩增核酸模板：人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA、18型DNA、31型DNA、33型DNA、35型DNA、39型DNA模板、45型DNA模板、51型DNA模板、52型DNA模板、56型DNA模板、58型DNA模板、59型DNA模板、68型DNA模板、26型DNA模板、53型DNA模板、66型DNA模板、73型DNA模板、82型DNA模板，人基因组DNA，由当地人民医院提供。DNA纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀均达到1.8，纯度较高。

人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA正向引物F16-1(SEQ ID No.1)：AATAACAAAATATTAGTTC；19bp，G+C含量15.8％，Tm值为30.4℃。

人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA反向引物R16-1(SEQ ID No.2)：ACTTTTCCTTTAAATTTAC；19bp，G+C含量21.1％，Tm值为35.3℃。

人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA正向引物F16-2(SEQ ID No.3)：CCGCAGGTGACGTCTAGTCACATCCTAGTCATCACATG；38bp，G+C含量70％，Tm值为68℃。

人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA反向引物R16-2(SEQ ID No.4)：CGTCGCCCATCGTCCTCCCCGTGTCGTAGGTACTCCTTAA；40bp，G+C含量71％，Tm值为70℃。

正向引物MTBF16(SEQ ID No.5)：GCGGCAUGCUUAACACA。

反向引物MTBR16(SEQ ID No.6)：UGAGUUUUAGCCUUGCGG。

HPV18型DNA正向引物F18(SEQ ID No.7)：ATGTGCCTGTATACACGGG。

HPV18型DNA反向引物R18(SEQ ID No.8)：TCAACATGTCTGCTATACTGC。

HPV31型DNA正向引物F31(SEQ ID No.9)：ATTTTTTTACAGATGTCTCTGTGGCGG。

HPV31型DNA反向引物R31(SEQ ID No.10)：GGTCAATCCAAAATTCCAATCTTCC。

HPV33型DNA正向引物F33(SEQ ID No.11)：GTGCTGACTTTGTTTTACATCC。

HPV33型DNA反向引物R33(SEQ ID No.12)：GCAGTTAAGGTAACTTTGCA。

HPV35型DNA正向引物F35(SEQ ID No.13)：ATGTCTCTGTGGCGGTCT。

HPV35型DNA反向引物R35(SEQ ID No.14)：CTCTAAAATGGACGGGTTC。

HPV39型DNA正向引物F39(SEQ ID No.15)：ATGGCTATGTGGCGGT。

HPV39型DNA反向引物R39(SEQ ID No.16)：GGAGGAGCTACAGCAAAAT。

HPV45型DNA正向引物F45(SEQ ID No.17)：CCCTATTTTTTTGCAGATGGCT。

HPV45型DNA反向引物R45(SEQ ID No.18)：GGAGGGACACCAAAATTCCAATTT。

HPV51型DNA正向引物F51(SEQ ID No.19)：GTGGGGATTACTATTTGTGG。

HPV51型DNA反向引物R51(SEQ ID No.20)：GCCATTACCTCTGTAGTTAAAG。

HPV52型DNA正向引物F52(SEQ ID No.21)：CATCCTAGTTATTTTTTACTACGTCGCAGG。

HPV52型DNA反向引物R52(SEQ ID No.22)：GCCAAATTGCCAGTCCTCTAAAATA。

HPV56型DNA正向引物F56(SEQ ID No.23)：TACCCATGATGTATATATACAGGGATCCTCC。

HPV56型DNA反向引物R56(SEQ ID No.24)：GCCATAACCTCTGCAGACAAAGTAATT。

HPV58型DNA正向引物F58(SEQ ID No.25)：ATGGTGCTGATTTTCTGTTG。

HPV58型DNA反向引物R58(SEQ ID No.26)：CCAGTCCTCCAAAATATTTG。

HPV59型DNA正向引物F59(SEQ ID No.27)：TACCACGCAGGCAGTTC。

HPV59型DNA反向引物R59(SEQ ID No.28)：CAGTAGGAGGTGGTGTAACAC。

HPV68型DNA正向引物F68(SEQ ID No.29)：ATGGCATTGTGGCGA。

HPV68型DNA反向引物R68(SEQ ID No.30)：GGCAACACCAAAATTCCA。

HPV26型DNA正向引物F26(SEQ ID No.31)：ATGGCTTTGTGGCGTAC。

HPV26型DNA反向引物R26(SEQ ID No.32)：TCCAATATGGAGGCATTC。

HPV53型DNA正向引物F53(SEQ ID No.33)：TGGCGGCCTAGTGACAGCAA。

HPV53型DNA反向引物R53(SEQ ID No.34)：TAGTGGCAACAGGAGGCGA。

HPV66型DNA正向引物F66(SEQ ID No.35)：TATATACAGGGAGCTACATTTGCAC。

HPV66型DNA反向引物R66(SEQ ID No.36)：GCAAATATGCCATAACTTCTGCAGT。

HPV73型DNA正向引物F73(SEQ ID No.37)：ATGTGGCGACCTACTGATG。

HPV73型DNA反向引物R73(SEQ ID No.38)：GGTAAGACCAAAATTCCACTC。

HPV82型DNA正向引物F82(SEQ ID No.39)：ATGGCTTTGTGGCGTAC。

HPV82型DNA反向引物R82(SEQ ID No.40)：GGTGTGCAGGTAAGCCATA。

实施例1

亚精胺和甲酰胺在反应体系中的加入与不加入对比

反应体系一(总体积50μL)(含BstDNA聚合酶、亚精胺、甲酰胺)：冰醋酸的体积百分含量为2％；氯化镁30mM；解旋酶12ng/μL；甲酰胺的体积百分含量为0.2％；亚精胺1ng/μL；甜菜碱1ng/μL；UvsX蛋白45ng/μL；UvsY蛋白45ng/μL；单链结合蛋白700ng/μL；牛血清白蛋白1.5mg/mL；dNTPs 75mM；Tris碱15mM；pH值7.5。

反应体系二(总体积50μL)(含BstDNA聚合酶，不含亚精胺、甲酰胺)：冰醋酸的体积百分含量为2％；氯化镁30mM；解旋酶12ng/μL；甜菜碱1ng/μL；UvsX蛋白45ng/μL；UvsY蛋白45ng/μL；单链结合蛋白700ng/μL；牛血清白蛋白1.5mg/mL；dNTPs 75mM；Tris碱15mM；pH值7.5。

取出1个预装了25μL反应体系一试剂管1#；和1个预装了25μL反应体系二的试剂管2#，分别向1#和2#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)；并分别在1#和2#号管中各加入5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶，然后再分别补灭菌水至50μL体积到1#和2#号管中。

将1#和2#号管分别混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后取出，分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂，震荡混匀，12000离心30秒，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，可见1#号管的电泳结果中有一条单一且亮度明显的条带；而2#号管的扩增条带中有杂带，且亮度不是太明显。结果见附图1。

实施例2

引物本身设计对扩增的影响

取出2个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管分别标记为3#和4#，向3#号管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)，向4#号管中加入2μL的F16-2(20μM)和R16-2(20μM)；并分别在3#和4#号管中各加入5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶，然后再分别补灭菌水13.5μL到3#和4#号管中。

将3#和4#号管分别混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后取出，分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂，震荡混匀，12000离心30秒，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，可见3#和4#号管的电泳结果中各有一条单一且亮度相当的条带。结果见附图2。

取出2个预装了25μL反应体系二(实施例1)试剂管分别标记为5#和6#，向5#号管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)，向6#号管中加入2μL的F16-2(20μM)和R16-2(20μM)；并分别在5#和6#号管中各加入5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶，然后再分别补灭菌水13.5μL到5#和6#号管中。

将5#和6#号管分别混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后取出，分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂，震荡混匀，12000离心30秒，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，可见5#和6#号管的电泳结果中条带不单一，有杂带出现，目的条带亮度较低。结果见附图3。

实施例3

亚精胺和甲酰胺对核酸模板纯度的要求

取出1个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管7#；和1个预装了25μL反应体系二(实施例1)的试剂管8#，分别向7#和8#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)；并分别在7#和8#号管中各加入5μLHPV16DNA模板DNA II#和1U的BstDNA聚合酶，然后再分别补灭菌水13.5μL到7#和8#号管中。

将7#和8#号管分别混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后取出，分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂，震荡混匀，12000离心30秒，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，可见7#号管的电泳结果中有一条单一的条带；而8#号管的扩增结果弥散，未见条带。结果见附图4。

实施例4

反转录扩增

取出1个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管9#；和1个预装了25μL反应体系一(实施例1)的试剂管10#，分别向9#和10#管中各加入2μL的MTBF16(20μM)和MTBR16(20μM)；并在9#号管中加入5μL RNA模板RNA I#、1U的BstDNA聚合酶和和1U的AMV反转录酶；在10#号管中加入5μL RNA模板RNA II#、1U的BstDNA聚合酶和1U的AMV反转录酶，作为阴性对照；然后再分别补无RNA酶水13.5μL到9#和10#号管中。

将9#和10#号管分别混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后取出，分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂，震荡混匀，12000离心30秒，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，可见9#号管的电泳结果中有一条单一的条带；而10#号管则没有条带出现。结果见附图5。

实施例5

多重不对称扩增

正向引物混合物：F16-1、F18、F31、F33、F35、F39、F45、F51、F52、F56、F58、F59、F68、F26、F53、F66、F73和F82各40μM。

反向引物混合物：R16-1、R18、R31、R33、R35、R39、R45、R51、R52、R56、R58、R59、R68、R26、R53、R66、R73和R82各20μM。

分别取出19个预装了25μL实施例1中的反应体系一的试剂管11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#，分别向各管中各加入10μL的正向引物混合物和2μL反向引物混合物。

并分别依次用HPV16型DNA、18型DNA、31型DNA、33型DNA、35型DNA、39型DNA、45型DNA、51型DNA、52型DNA、56型DNA、58型DNA、59型DNA、68型DNA、26型DNA、53型DNA、66型DNA、73型DNA、82型DNA和人基因组DNA(作为阴性对照)作为扩增模板。即依次在11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#号管中分别加入5μL的16型DNA、18型DNA、31型DNA、33型DNA、35型DNA、39型DNA、45型DNA、51型DNA、52型DNA、56型DNA、58型DNA、59型DNA、68型DNA、26型DNA、53型DNA、66型DNA、73型DNA、82型DNA和人基因组DNA模板，然后分别1U的BstDNA聚合酶并补灭菌水5.5μL到各管中。

分别将各管混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟，然后取出扩增产物无需热变性，用膜芯片进行杂交检测，可见肉眼可判定的显色点出现在相对应的探针位置上。结果见附图6，说明多重引物混合后，针对每一个型别的DNA模板都能成功扩增出对应型别的产物，并且扩增特异，没有非特异性扩增，实现了多重扩增效果；还能说明扩增产物是单链，扩增产物不用进行热变性，可以直接进行杂交，实现了不对称扩增效果；其中，HC和PC是两个质控点，阴性和阳性都会出现。

实施例6

荧光染料扩增

取出2个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管30#和31#，分别向30#和31#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)；并在30#号管中加入5μL DNA模板DNA I#；在31#号管中加入5μL DNA模板人基因组DNA，作为阴性对照；然后再分别加入1U的BstDNA聚合酶并补无菌水13.5μL到30#和31#号管中。

将30#和31#号管分别混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后用荧光扫描仪进行结果判读，从产物熔解曲线图可见单一峰。结果见附图7和图8，其中，实验组(图7)为单一峰，说明可以扩增出特异性产物；而阴性对照组(图8)没有峰出现，即没有产物扩增出来。

实施例7

荧光探针扩增

取出2个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管32#和33#，分别向32#和33#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)；并在32#号管中加入5μL DNA模板DNA I#；在33#号管中加入5μL DNA模板人基因组DNA，作为阴性对照；然后再分别加入4μL浓度为20μM)的荧光探针(SEQID No.41CCATATCTACTTCAGAAACTA，5端HEX+，3端BHQ修饰)、1U的BstDNA聚合酶并补无菌水至体积50μL到32#和33#号管中。

将32#和33#号管分别混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后用荧光扫描仪进行结果判读，从产物扩增曲线图可见32#号管有产物扩增。结果见附图9和图10，实验组(图9)有扩增曲线，说明扩增出产物；对照组(图10)无扩增曲线出现，说明没有产物扩增。

实施例8

体系三：解旋酶10ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1％、亚精胺0.5ng/μL、氯化镁5mM、冰醋酸的体积百分含量为1％、UvsX蛋白40ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL、dNTPs50mM、Tris碱10mM；pH6.5。

取出1个预装了25μL反应体系三试剂管34#，向34#管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)，5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶，然后再分别补灭菌水至50μL到34#号管中。

将34#号管混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后取出，加入50μL的1:1酚氯仿试剂，震荡混匀，12000离心30秒，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，可见34#号管的电泳结果中有一条单一的条带。结果见附图11。

实施例9

体系四：解旋酶15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.5％、亚精胺5ng/μL、氯化镁100mM、冰醋酸的体积百分含量为5％、UvsX蛋白80ng/μL、UvsY蛋白90ng/μL、单链结合蛋白1000ng/μL、牛血清白蛋白5mg/mL、dNTPs 100mM、Tris碱50mM、以及甜菜碱5ng/μL；pH8.2。

取出1个预装了25μL反应体系三试剂管35#，向35#管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM)，5μL HPV16DNA模板DNA I#和2U的BstDNA聚合酶，然后再分别补灭菌水13.5μL到35#号管中。

将35#号管混匀，放入到37℃的金属浴或水浴锅中，反应15分钟。然后取出，加入50μL的1:1酚氯仿试剂，震荡混匀，12000离心30秒，取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳，可见35#号管的电泳结果中有一条单一的条带。结果见附图12。

LHA1760134 核苷酸序列表

<110>刘琳

<120> 一种恒温核酸扩增反应试剂

<130> LHA1760134

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F16-1

<400> 1

AATAACAAAATATTAGTTC；

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R16-1

<400> 2

ACTTTTCCTTTAAATTTAC；

<210>3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F16-2

<400> 3

CCGCAGGTGACGTCTAGTCACATCCTAGTCATCACATG；

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R16-2

<400> 4

CGTCGCCCATCGTCCTCCCCGTGTCGTAGGTACTCCTTAA；

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<223> MTBF16

<400> 5

GCGGCAUGCUUAACACA；

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<223> MTBR16

<400> 6

UGAGUUUUAGCCUUGCGG；

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F18

<400> 7

ATGTGCCTGTATACACGGG；

<210>8

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R18

<400> 8

TCAACATGTCTGCTATACTGC；

<210>9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F31

<400> 9

ATTTTTTTACAGATGTCTCTGTGGCGG；

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R31

<400> 10

GGTCAATCCAAAATTCCAATCTTCC；

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F33

<400> 11

GTGCTGACTTTGTTTTACATCC；

<210>12

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R33

<400> 12

GCAGTTAAGGTAACTTTGCA；

<210>13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F35

<400> 13

ATGTCTCTGTGGCGGTCT；

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R35

<400> 14

CTCTAAAATGGACGGGTTC；

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F39

<400> 15

ATGGCTATGTGGCGGT；

<210>16

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R39

<400> 16

GGAGGAGCTACAGCAAAAT；

<210>17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F45

<400> 17

CCCTATTTTTTTGCAGATGGCT；

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R45

<400> 18

GGAGGGACACCAAAATTCCAATTT；

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F51

<400> 19

GTGGGGATTACTATTTGTGG；

<210>20

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R51

<400> 20

GCCATTACCTCTGTAGTTAAAG；

<210>21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F52

<400> 21

CATCCTAGTTATTTTTTACTACGTCGCAGG；

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R52

<400> 22

GCCAAATTGCCAGTCCTCTAAAATA；

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F56

<400> 23

TACCCATGATGTATATATACAGGGATCCTCC；

<210>24

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R56

<400> 24

GCCATAACCTCTGCAGACAAAGTAATT；

<210>25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F58

<400> 25

ATGGTGCTGATTTTCTGTTG；

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R58

<400> 26

CCAGTCCTCCAAAATATTTG；

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F59

<400> 27

TACCACGCAGGCAGTTC；

<210>28

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R59

<400> 28

CAGTAGGAGGTGGTGTAACAC；

<210>29

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F68

<400> 29

ATGGCATTGTGGCGA；

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R68

<400> 30

GGCAACACCAAAATTCCA；

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F26

<400> 31

ATGGCTTTGTGGCGTAC；

<210>32

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R26

<400> 32

TCCAATATGGAGGCATTC；

<210>33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F53

<400> 33

TGGCGGCCTAGTGACAGCAA；

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R53

<400> 34

TAGTGGCAACAGGAGGCGA；

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223>F66

<400> 35

TATATACAGGGAGCTACATTTGCAC；

<210>36

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R66

<400> 36

GCAAATATGCCATAACTTCTGCAGT；

<210>37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F73

<400> 37

ATGTGGCGACCTACTGATG；

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R73

<400> 38

GGTAAGACCAAAATTCCACTC；

<210>39

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> F82

<400> 39

ATGGCTTTGTGGCGTAC；

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> R82

<400> 40

GGTGTGCAGGTAAGCCATA；

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 荧光探针

<400> 41

CCATATCTACTTCAGAAACTA。

Claims

1.一种恒温核酸扩增反应试剂，其包括解旋酶、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂中还包括甲酰胺、亚精胺和甜菜碱中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，解旋酶10ng/μL-15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1％-0.5％、亚精胺0.5ng/μL-5ng/μL、氯化镁5mM-100mM、冰醋酸的体积百分含量为1％-5％、UvsX蛋白40ng/μL-80ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL-90ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL-1000ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL-5mg/mL、dNTPs 50mM—100mM、Tris碱10mM—50mM、恒温DNA聚合酶1U/反应-2U/反应、以及甜菜碱0-5ng/μL。

4.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述恒温DNA聚合酶包括BstDNA聚合酶和/或phi29DNA聚合酶。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂的pH值为6.5-8.2；优选所述试剂的pH为7.2-7.6。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂中还包括荧光染料。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述荧光染料选自SYBR green I、SYTO-13和SYTO-12中的至少一种。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂中还包括用于扩增靶标片段的一对引物。

9.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂中还包括逆转录酶。