KR20070096349A - 유전자변형 면화의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법및 이에 사용되는 표준 플라스미드 - Google Patents

유전자변형 면화의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법및 이에 사용되는 표준 플라스미드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Cry1Ac:7S, CP4EPSPS:E9 및 CTP2:Cry2Ab 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 유전자변형 면화 3계통 대하여 특이적인 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것이다.
GM, 면화, 프라이머

Description

유전자변형 면화의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드{Primer Set for Detection of Genetically Modified Cotton, Detection Method, and Standard Plasmid used thereto}
도 1은 해충저항성 유전자변형 면화 BG531의 도입유전자를 포함하는 유전자의 구조도이다.
도 2는 제초제저항성 유전자변형 면화 RR1445의 도입유전자를 포함하는 유전자의 구조도이다.
도 3은 해충저항성 유전자변형 면화 BGⅡ15985의 도입유전자를 포함하는 유전자의 구조도이다.
도 4는 면화의 내재유전자인 fiber specific ACP 유전자에서의 프라이머 결합위치도
도 5는 본 발명에 따른 표준 플라스미드의 구성도이다.
도 6은 본 발명에 따른 프라이머 쌍에 의한 PCR 산물에 대한 전기영동사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 표준 플라스미드 pC3에 삽입된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 표준 플라스미드의 실시간 PCR 결과치를 이용하여 작성된 정량곡선(a) 및 표준곡선(b)를 나타낸다.
본 발명은 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3계통의 유전자 변형(GM) 면화의 검정에 매우 유용한 특이적 프라이머 세트, 검정방법 및 이에 사용되는 표준 플라스미드에 관한 것이다.
유전자 변형(GM) 식물이란 유전공학기술을 이용하여 특정 생물로부터 유용한 유전자를 취해 이를 기존의 작물에 도입함으로써 그와 동일한 유전자 기능을 발휘하도록 조작된 식물을 의미한다. 유전자 변형 식물은 동식물 및 미생물 등 유전자 변형생물체를 통칭하는 GMO(Genetically Modified Organism)에 속하며, 또한 형질전환작물로 통용되기도 한다. 특히 이러한 유전자 변형식물 중 농산물의 유전자 변형은 주로 제초제에 대한 내성, 병해충에 대한 저항력, 생산력의 증가, 긴 유통기간에도 쉽게 상하지 않는 특성을 지니게 하거나, 영양가치가 높은 식물을 개발하는 등의 분야에 초점을 맞추어 개발되어 왔으며, 현재까지 여러 GMO 농산물이 이미 상용화되었거나 준비 중에 있다.
유전자변형 농산물의 경우, 각각의 유전자변형 계통에 따라 도입된 유전자 및 운반체의 구조가 달라 기존의 안전성이 승인되어 유통 중인 유전자변형 옥수수 또는 콩 등에 있어서는 일부 품종들에 대하여 DNA를 이용한 검정방법이 개발되어 있다. 하지만, GM 면화의 경우 최근 국내 안전성 승인을 통과하여 국내 LMO 사료 관리대상 품목으로 중요시되고 있으나, 현재까지는 GM 면화에 대하여 아직 정확한 검정방법이 개발되어 있지 않은 실정이다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로,
본 발명의 목적은 유전자 변형체의 검정을 신속하면서 정확하게 수행할 수 있으며, 특히 Cry1Ac:7S, CP4EPSPS:E9 및 CTP2:Cry2Ab 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 GM 면화 3계통을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 변형체의 검정을 신속하면서 정확하게 수행할 수 있으며, 특히 Cry1Ac:7S, CP4EPSPS:E9 및 CTP2:Cry2Ab 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 GM 면화 3계통을 특이적으로 검출할 수 있는 검정방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 변형체의 검정을 신속하면서 정확하게 수행할 수 있으며, 특히 Cry1Ac:7S, CP4EPSPS:E9 및 CTP2:Cry2Ab 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 GM 면화 3계통을 특이적으로 검출하는데 사용가능한 표준 플라스미드를 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10 및 11의 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Bollgard 531임을 특징으로 하는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 6과, 서열번호 7 또는 서열번호 8 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Roundup Ready 1445임을 특징으로 하는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면 상기 프라이머 세트는 서열번호 10과, 서열번호 11 기재의 프라이머를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 의하면 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Bollgard Ⅱ 15985임을 특징으로 하는 프라이머 세트를 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 및 11 기재의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되어지는 어느 하나의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 준비하는 단계, 상기 준비된 프라이머 세트를 이용하여 당해 유전자 변형체의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행 결과로부터 유전자 변형체의 정성 또는 정량 분석 결과를 얻는 단계를 포함하는 유전자 변형체의 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Bollgard 531이며, 정성분석은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Roundup Ready 1445이며, 정성분석은 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 BollgardⅡ 15985이며, 정성분석은 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Bollgard 531이며, 정량분석은 서열번호 3 및 서열번호 4 기재의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Roundup Ready 1445이며, 정량분석은 서열번호 6 및 서열번호 8 기재의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 유전자 변형체는 바람직하게는 면화 Ⅱ 15985이며, 정량분석은 서열번호 10 및 서열번호 11 기재의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 5 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 9 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 12 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 정량분석에 내재유전자 fsACP유전자가 사용되며, 내재유전자의 정량 분석은 실시간 PCR에 따르고, 서열번호 13 및 서열번호 14기재의 프라이머와, 서열번호 15 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법을 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13 및 14 기재의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되어지는 어느 하나의 프라이머를 이용하여 유전자 변형 체의 게놈 DNA를 주형으로 하여 수행한 PCR 산물이 벡터의 소정 위치에 삽입된 유전자 변형체의 정량검정을 위한 표준 플라스미드를 제공한다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 해충저항성 또는 제초제내성 유전자변형 면화 3계통을 검정할 수 있는 특이적 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드와 이를 이용한 정성 및 정량적 분석방법을 제공한다.
1. 프라이머
(1) 해충저항성 유전자변형 면화 Bollgard(BG) 531 계통
BG 531 계통은 1개의 촉진 염기서열이 첨가된 컬리프라워 모자이크 프로모터(P-e35S):Cry1Ac유전자(바실러스 써린지엔시스 Bacillus thuringiensis 유래의 Bt 독소유전자):콩의 7S 종자 저장 단백질 3'말단(7S) 영역의 구조를 포함한다.
본 발명의 유전자변형 면화 BG531을 검정하기 위한 프라이머는 도입된 해충저항성 유전자 Cry1Ac:7S의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로서, 상세하게는 Cry1Ac(GenBank Accession No. M97880)를 특이적으로 인식하는 서열번호 1의 CC7S-1F 프라이머 및 서열번호 3의 CC7S-2F 프라이머, 7S(GenBank Accession No. J01293)를 특이적으로 인식하는 서열번호 2의 CC7S-1R 프라이머 및 서열번호 4의 CC7S-2R 프라이머이다.
상기에서 서열번호 1의 CC7S-1F 프라이머 및 서열번호 3의 CC7S-2F 프라이머 는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2의 CC7S-1R 프라이머 및 서열번호 4의 CC7S-2R 프라이머는 역방향 프라이머이다.
따라서, BG531에 도입된 외래유전자의 검출을 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1의 CC7S-1F 프라이머 및 서열번호 3의 CC7S-2F 프라이머에서 선택된 1종과 서열번호 2의 CC7S-1R 프라이머 및 서열번호 4의 CC7S-2R 프라이머에서 선택된 1종으로 구성된 프라이머 세트를 사용한다.
본 발명에 따른 각 프라이머의 서열은 하기에 나타낸 바와 같으며, 유전자에서의 결합위치는 도 1에 제시된 바와 같다.
CC7S-1F: 5'-TCG GTG AAA CCG AGG GAA C-3' (19mers, 서열번호1)
CC7S-1R: 5'-CGA TAC TTT CCT CGC TCA CTA TGA G-3' (25mers, 서열번호2)
CC7S-2F: 5'-GGG AAC CTT CAT CGT GGA CA-3' (20mers, 서열번호3)
CC7S-2R: 5'-ATT GAA GAC AAA GGA CGG GAT C-3' (22mers, 서열번호4)
또한, 본 발명에 의하면 상기 각 프라이머는 염기의 일부가 변형된 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 변형 서열은 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 나타날 수 있다. 어느 것이나, 이러한 염기서열의 변형은 Cry1Ac:7S 유전자의 연결부위에 특이적으로 인지하는 특성을 변형시키지 않는 범위내에서 실험적, 경험적으로 결정되어질 수 있다.
(2) 제초제내성 유전자변형 면화 Roundup Ready(RR) 1445 계통
RR 1445 계통은 변형된 Figwort 바이러스 35S 프로모터(P-CmoVb):엽록체 전달 단백질 유전자(CTP2):CP4 EPSPS유전자(아그로박테리아 CP4균주로부터 유래):완두콩의 rbcS E9 유전자 3'말단 영역의 구조를 포함한다.
본 발명의 유전자변형 면화 RR1445를 검정하기 위한 프라이머는 도입된 제초제내성 유전자 CP4 EPSPS:E9의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로서, 상세하게는 CP4 EPSPS(GenBank Accession No. AF464188)를 특이적으로 인식하는 서열번호 6의 EPE9-2F 프라이머, E9(GenBank Accession No. X00806)을 특이적으로 인식하는 서열번호 7의 EPE9-1R 프라이머 및 서열번호 8의 EPE9-2R 프라이머이다.
상기에서 서열번호 6의 EPE9-2F 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 7의 EPE9-1R 프라이머 및 서열번호 8의 EPE9-2R 프라이머는 역방향 프라이머이다. 따라서 RR1445에 도입된 외래유전자의 검출을 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 6의 EPE9-2F 프라이머 1종과 서열번호 7의 EPE9-1R 프라이머 및 서열번호 8의 EPE9-2R 프라이머에서 선택된 1종으로 구성된 프라이머 세트를 사용한다.
본 발명에 따른 각 프라이머의 서열은 하기에 나타낸 바와 같으며, 유전자에서의 결합위치는 도 2에 제시된 바와 같다.
EPE9-2F: 5'-TCC GAC ACT AAG GCT GCT TGA T-3' (22mers, 서열번호6)
EPE9-1R: 5'-GAA ACT GAT GCA TTG AAC TTG ACG-3' (24mers, 서열번호7)
EPE9-2R: 5'-ATG CAT TGA ACT TGA CGA ACG T-3' (22mers, 서열번호8)
또한 본 발명에 의하면 상기 각 프라이머는 염기의 일부가 변형된 서열을 포 함할 수 있다. 이와 같은 변형 서열은 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 나타날 수 있다. 어느 것이나, 이러한 염기서열의 변형은 CP4 EPSPS:E9 유전자의 연결부위에 특이적으로 인지하는 특성을 변형시키지 않는 범위내에서 실험적, 경험적으로 결정되어질 수 있다.
(3) 해충저항성 유전자변형 면화 Bollgard(BG)Ⅱ15985 계통
BGⅡ15985 계통은 1개의 촉진 염기서열이 첨가된 컬리프라워 모자이크 프로모터(P-e35S):열충격 단백질 70(hsp70, 페튜니아에서 유래):엽록체 전달 단백질 유전자(CTP2):Cry2Ab유전자(바실러스 써린지엔시스 Bacillus thuringiensis 유래의 Bt 독소유전자):NOS 터미네이터 영역의 구조를 포함한다.
본 발명의 유전자변형 면화 BGⅡ15985를 검정하기 위한 프라이머는 도입된 해충저항성 유전자의 CTP2:Cry2Ab의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로서, 상세하게는 CTP2(GenBank Accession No. X06613)를 특이적으로 인식하는 서열번호 10의 CTCR-2F 프라이머, Cry2Ab(GenBank Accession No. X55416)를 특이적으로 인식하는 서열번호 11의 CTCR-2R 프라이머이다.
상기에서 서열번호 10의 CTCR-2F 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 11의 CTCR-2R 프라이머는 역방향 프라이머이다.
따라서, BGⅡ15985에 도입된 외래유전자의 검출을 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 10의 CTCR-2F 프라이머 1종과 서열번호 11의 CTCR-2R 프라이머 1종으로 구성된 프라이머 세트를 사용한다.
CTCR-2F: 5'-ATT GAA GAA GAG TGG GAT GAC GTT A-3' (25mers, 서열번호10)
CTCR-2R: 5'-GAC CAG AGT TCA GGA CGG AGT T-3' (22mers, 서열번호11)
또한 본 발명에 의하면 상기 각 프라이머는 염기의 일부가 변형된 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 변형 서열은 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 나타날 수 있다. 어느 것이나, 이러한 염기서열의 변형은 CTP2:Cry2Ab 유전자의 연결부위에 특이적으로 인지하는 특성을 변형시키지 않는 범위내에서 실험적, 경험적으로 결정되어질 수 있다.
(4) 면화의 내재유전자
면화는 고유의 내재유전자로 fiber specific Acyl Carrier Protein 유전자를 포함한다.
본 발명의 면화의 내재유전자를 검정하기 위한 프라이머는 고유의 fiber specific Acyl Carrier Protein 유전자의 일부를 증폭할 수 있는 프라이머로서, 상세하게는 fiber specific Acyl Carrier Protein 유전자(GenBank Accession No. U48777)를 특이적으로 인식하는 서열번호 13의 fsACP-2F 프라이머와 서열번호 14의 fsACP-2R 프라이머이다.
상기에서 서열번호 13의 fsACP-2F 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 14의 fsACP-2R 프라이머는 역방향 프라이머이다.
따라서 면화의 내재유전자 fiber specific Acyl Carrier Protein 유전자의 검출을 위한 PCR 프라이머 세트는 서열번호 13의 fsACP-2F 프라이머 1종과 서열번호 14의 fsACP-2R 1종으로 구성된 프라이머 세트를 사용한다.
또한 본 발명에 의하면 상기 각 프라이머는 염기의 일부가 변형된 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 변형 서열은 염기서열에 의거한 변이가 염기서열의 일부결실, 과잉의 염기 또는 염기서열의 부가, 또는 염기 서열 중의 염기 또는 부분서열의 다른 염기서열로의 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 나타날 수 있다. 어느 것이나, 이러한 염기서열의 변형은 fiber specific Acyl Carrier Protein 유전자의 일부를 특이적으로 인지하는 특성을 변형시키지 않는 범위내에서 실험적, 경험적으로 결정되어질 수 있다.
fsACP-2F: 5'-CAA ACA AGA GAC CGT GGA TAA GGT A-3' (25mers, 서열번호13)
fsACP-2R: 5'-CAA GAG AAT CAG CTC CAA GAT CAA G-3' (25mers, 서열번호14)
2. 프로브
(1) 해충저항성 유전자변형 면화 BG 531 계통
본 발명은 해충저항성 유전자변형 면화 BG531을 정량적으로 검정할 수 있는 서열번호 5의 CC7S-3 프로브를 제공한다. CC7S-3 프로브는 해충저항성 유전자변형 면화 BG531의 Cry1Ac와 7S 유전자 연결부위를 특이적으로 인지한다.
본 발명에 따른 상기 프로브의 서열은 하기에 나타낸 바와 같으며, 유전자에서의 결합위치는 도 1에 제시된 바와 같다.
CC7S-3: 5'-FAM-TGA TGG AGG AAT AAT GAG ATC TAG AGG CCT GAA-TAMRA-3' (33mers, 서열번호5)
(2) 제초제내성 유전자변형 면화 RR 1445 계통
본 발명은 제초제내성 유전자변형 면화 RR1445를 정량적으로 검정할 수 있는 서열번호 9의 EPE9-3 프로브를 제공한다. EPE9-3 프로브는 제초제내성 유전자변형 면화 RR1445의 CP4 EPSPS와 E9 유전자 연결부위를 특이적으로 인지한다.
본 발명에 따른 상기 프로브의 서열은 하기에 나타낸 바와 같으며, 유전자에서의 결합위치는 도 2에 제시된 바와 같다.
EPE9-3: 5'-FAM-AGC TTT CGT TCG TAT CAT CGG TTT CGA CA-TAMRA-3' (29mers, 서열번호9)
(3) 해충저항성 유전자변형 면화 BGⅡ 15985 계통
본 발명은 해충저항성 유전자변형 면화 BGⅡ15985를 정량적으로 검정할 수 있는 서열번호 12의 CTCR-3 프로브를 제공한다. CTCR-3 프로브는 해충저항성 유전자변형 면화 BGⅡ15985의 CTP2와 Cry2Ab 유전자 연결부위를 특이적으로 인지한다.
본 발명에 따른 상기 프로브의 서열은 하기에 나타낸 바와 같으며, 유전자에서의 결합위치는 도 3에 제시된 바와 같다.
CTCR-3: 5'-FAM-CGG CGT GCA TGC TTG CCA TG-TAMRA-3' (20mers, 서열번호12)
(4) 면화의 내재유전자
본 발명은 면화에 있어서 고유의 내재유전자 fiber specific Acyl Carrier Protein 유전자를 정량적으로 검정할 수 있는 서열번호 15의 fsACP-3 프로브를 제공한다. fsACP-3 프로브는 면화의 내재유전자 fiber specific Acyl Carrier Protein 유전자 부위를 특이적으로 인지한다.
본 발명에 따른 상기 프로브의 서열은 하기에 나타낸 바와 같으며, 유전자에서의 결합위치는 도 4에 제시된 바와 같다.
fsACP-3: 5'-FAM-TTA GCT TTA GAC AAT GAC AAA CCA ATC ACC GG-TAMRA-3' (32mers, 서열번호15)
본 발명은 상기 제시된 각 프라이머 및 프로브 서열을 이용하여 PCR 분석을 통해 유전자 변형체의 정성분석 내지는 정량분석을 수행하는 방법을 제공한다.
유전자 변형체의 정성분석은 해당 시료내에 유전자 변형체(원료 및 가공물 등)의 혼입여부를 판정하는 방법으로 유전자 증폭방법인 PCR(Polymerase Chain Reaction; 중합효소연쇄반응)을 이용하여 외래에서 도입된 유전자를 확인하며, 내재 유전자 및 외래 도입유전자에 대한 PCR산물의 DNA 밴드 유무에 따라 검출, 불검출로 구분한다. 즉, 내재 유전자와 외래 도입유전자의 PCR 산물이 모두 확인된 경우를 검출로 보며, 내재 유전자의 PCR 산물은 검출되나 도입 특이 유전자의 PCR 산물이 검출되지 않는 경우를 불검출로 볼 수 있다.
또한, 분석용 시료 2점에 대한 검정결과에서 PCR 분석결과를 종합하여 양성, 음성으로 판정할 수 있으며, 병행 분석한 2점 중 1점 이상에서 검출로 판정된 경우를 양성으로, 병행 분석한 2점 모두 불검출인 경우를 음성으로 판정할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 변형체의 정성분석은 상기 본 발명에 따른 서열번호 1, 2, 6, 7, 10, 11, 13 및 14 기재의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되어지는 어느 하나의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하며, 다음과 같은 단계들을 포함한다.
1) 유전자 변형체로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계
2) 상기 단계 1)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 PCR 프라이머 세트를 이용하여 유전자 변형체의 외래 도입유전자의 일부를 증폭하는 단계
3) 증폭된 외래 도입유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계
상기 과정에 의하면 적어도 외래 도입유전자 중 Cry1Ac:7S, CP4EPSPS:E9 및 CTP2:Cry2Ab 유전자를 포함하는 어떠한 유전자 변형체를 정성적으로 검정하는 것이 가능하며, 특히 이들 유전자를 함유하는 BG 531, RR1445, BGⅡ 15985에 대하여 특이적으로 반응한다.
유전자 변형체의 정량분석은 시료에서 DNA를 추출한 후 이를 실시간(Real Time) PCR 장치를 이용하여 여러 개의 양성표준시료 및 음성표준시료와 동시에 실시간 PCR을 실행하여 분석한다. 현재 많이 사용되고 있는 기종은 어플라이드 바이오시스템사의 ABI 프리즘 7000, 7700, 7900 시퀀스 검출기와 코벳 리서치사의 로터진 2000, 로슈사의 라이트사이클러 등이 있다. 실시간 PCR은 일반 PCR과는 달리 형 광프로브를 이용하며 이의 원리는 다음과 같다.
실시간 PCR(RT-PCR)은 일반 PCR과 같이 2개의 프라이머을 이용하는 원리는 동일하지만 형광물질이 화학적으로 결합하여 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 점에서 차이가 있다. 상기 프로브는 PCR 과정에서 두 개의 프라이머와 같이 검체대상의 DNA에 있는 상보서열에 결합한다. 프로브의 위치는 프라이머와는 약간의 거리를 두고 이격되며, DNA 폴리머라제에 의해 프라이머에 DNA가 합성되면서 이 효소는 프로브를 만나게 되고 이를 분해한다. 이는 DNA 폴리머라제는 중합반응 기능 외에도 DNA 듀플렉스를 분해하는 뉴클레아제 기능이 있기 때문이다.
통상적으로 사용되는 프로브는 양끝에 리포터(reporter:FAM)와 퀀쳐(quencher:TAMRA)라는 형광물질이 붙어 있는 형태를 가진다. 이는 거리상 근접하여 존재하면 형광을 서로 상쇄하여 리포터의 형광이 감지되지 않으나 증폭이 진행됨에 따라 폴리머라제에 의해 리포터가 퀀쳐로부터 떨어져 나가게 되면 형광이 감지되는 원리를 이용한다. 형광의 강도는 증폭사이클이 증가함에 따라 점점 증가하며, 여러 기지농도의 유전자 변형체의 표준시료와 미지시료를 대상으로 동시에 RT-PCR을 실시하여 기지시료로부터 표준 곡선을 도출하고 이 곡선으로부터 미지 시료의 유전자 변형체의 함량을 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 변형체의 정량분석은 유전자 변형체 검정용 PCR 프라이머 세트, 프로브와 본 발명에 따른 표준 플라스미드가 이용되며, 다음 단계에 따라 수행되어질 수 있다.
1) 표준 플라스미드를 농도별로 희석하여 준비하는 단계
2) 농도별로 희석한 표준 플라스미드와 유전자 변형체의 게놈 DNA를 각각 주형으로 하여 외래 도입유전자에 특이적인 상기 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하고, 얻어진 분석치를 이용하여 표준정량곡선을 작성하는 단계
3) 상기 얻어진 표준정량곡선 대비 유전자 변형체의 게놈 DNA에 대한 증폭산물의 양을 환산하여 외래 도입유전자의 혼입율(％)을 산출하는 단계
또한 본 발명에 따른 표준 플라스미드는 다음과 같은 과정에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 표준 플라스미드는 하기 표 1 및 도 5에 도시된 바와 같은 pC3 플라스미드로서, ACP-2F와 ACP-2R 프라이머, CC7S-2F와 CC7S-2R 프라이머, EPE9-2F와 EPE9-2R 프라이머 및 CTCR-2F와 CTCR-2R 프라이머에 의해 증폭된 산물들을 pCR2.1 (Invitrogen) 벡터에 연결, 삽입하여 제조할 수 있으며, 실시간 PCR을 위한 표준 플라스미드로 사용된다.
<표 1>
플라스미드 구조 증폭산물 크기
pC3 35S프로모터유전자 -ACP내재유전자-BG531유전자-RR1445유전자-BGⅡ15985유전자/pCR2.1 벡터 570bp
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
<실시예 1> 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브의 제작
모든 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 프로브는 프라이머 익스프레스 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 이용하여 디자인하였다. 상기 프라이머들은 제노텍사(대전, 한국)에 의해 합성되어졌고, PAGE 컬럼상에서 정제되어졌다. 프로브 또한 제노텍사(대전, 한국)에 의해 합성되어졌다. 이들은 5'과 3' 말단에 각각 6-카르복시플루오레세인(FAM)과 6-카르복시테라메틸 로다민(TAMRA)으로 표지되어졌다.
<실시예 2> 정량분석용 표준 플라스미드의 제작
3계통의 GM 면화의 정량검정을 위하여, BG531-RR1445-BGⅡ15985의 도입유전자에 대한 PCR 산물을 연결하여 pCR2.1(인비트로젠사) 벡터에 삽입한 표준 플라스미드 pC3를 히데오 구리바라 등(Hideo Kuribara et al., Novel Reference Molecules for Quantitation of Genetically Modified Maze and Soybean, Journal of AOAC International Vol. 85, No.5, 2002)이 제시한 방법에 따라 제작하였다. 구체적으로, 상기 BG531-RR1445-BGⅡ15985의 도입유전자에 대한 PCR 산물은 CC7S-2F 프라이머(서열번호 3)와 CTCR-2R 프라이머(서열번호 11)를 이용하여 증폭하였다. 상기 증폭한 PCR 산물은 합성한 다른 PCR 산물과 연결, 재증폭하여 pCR2.1 벡터에 삽입하여 pC3를 제작하였다 (도 5). 상기 pC3에 삽입된 PCR 산물은 도 7에 나타난 바와 같이 확인되었다.
<실험예 1> 특이 프라이머를 이용한 GM 면화의 검출
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 각각의 특이성을 3계통의 GM 면화에 대하여 하기와 같이 확인하였다.
1) 식물의 게놈DNA 분리
먼저, 3계통의 GM 면화의 게놈 DNA를 각각 분리하였다. GM 면화는 몬산토사로부터 입수하여 1g을 50㎖ 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 및 정제하였으며, 수득한 게놈 DNA는 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280를 이용하여 정량하였다.
2) PCR 분석
상기에서 수득한 각 계통의 게놈 DNA 50ng을 주형으로 하여, 상기 제조된 프라이머 쌍인 CC7S-1F/1R, CC7S-2F/2R, EPE9-2F/1R, EPE9-2F/2R, CTCR-2F/2R, fsACP-2F/2R을 이용하여 PCR 실험을 수행한 결과에서 대조구인 GM 옥수수 8계통, GM콩 1계통, GM이 아닌 면화, 옥수수, 콩, 쌀 및 보리에서는 PCR 산물이 발견되지 않았다. 따라서, 고안된 3종의 프라이머 쌍이 3계통의 GM 면화에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다 (도 6: PCR 산물을 EtBr을 함유한 2％ 아가로스 겔상에서 전기영동으로 분석한 결과). 각 프라이머에 대한 PCR 반응조건은 하기 표 2에 나타내었다.
<표 2>
반응조건
94℃,10분→(94℃,30초→60℃,30초→72℃,30초), 40회→72℃, 7분
<실험예 2> 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드를 이용한 GM 면화의 정량적 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제작한 프라이머와 프로브 및 표준 플라스미드를 이용하여 GM 면화 3계통에 도입된 유전자의 혼입율을 정량적으로 분석하였다.
1) 식물의 게놈 DNA 분리 및 표준 플라스미드의 준비
먼저, GM 면화 3계통의 게놈 DNA를 분리하였다. 구체적으로, 상기 GM 면화 3계통에 대한 분말을 몬산토사로부터 입수하여 1g을 50㎖ 튜브에 넣고 DNeasy plant maxi kit(Qiagen 68163)를 이용하여 게놈 DNA를 분리 및 정제하였다. DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280를 이용하여 측정하여 DNA 농도를 정량하였다.
표준 플라스미드는 대장균(E.coli TOP10)에 형질전환하여 정제한 후 2㎍을 HindⅢ효소로 37℃에서 2시간 처리하여 절단한 후 2％ 아가로스 겔에 전기영동하였다. 상기 선형으로 절단된 플라스미드를 아가로스겔로부터 회수하여 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량한 후 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 카피/2.5㎕의 5단계로 각각 희석하여 표준곡선을 작성하는데 이용하였다.
2) 실시간 PCR 분석을 이용한 GM 면화 외래도입유전자의 혼입율 분석
상기에서 수득한 계통의 GM 면화 게놈 DNA 20ng과 각 5단계별 카피수로 희석한 표준플라스미드 20, 125, 1,500, 20,000, 250,000 카피/2.5㎕ 및 표준 플라스미드를 첨가하지 않은 NTC(no template control)를 각각 주형으로 하여, 상기 GM 면화 3계통에 대하여 각 계통에 특이적인 정량용 정방향 및 역방향 프라이머 각 1.25μM과 프로브 0.25μM를 첨가하여 실시간 PCR을 수행하였다. 각 프라이머와 프로브 에 대한 실시간 PCR 조건은 하기 표 3에 나타내었다.
<표 3>
(ABI 7900기종의 경우)
반응조건
50℃, 2분→95℃, 10분→(95℃, 30초→59℃, 1분), 45회
3) 표준 플라스미드를 이용한 정량성 확인
pC3 플라스미드를 5단계의 카피수로 희석한 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행한 결과, 상기의 pC3 플라스미드 카피수에 의하여 증폭되는 실시간 PCR의 상관계수가 0.990이상으로 나타나 정량분석을 표준플라스미드로 이용 가능함을 확인하였다 (도 8a, 8b).
또한, 상기 표준 플라스미드의 실시간 PCR 결과치를 이용하여 작성된 표준곡선에 따른 GM 면화 3계통의 외래 도입유전자의 도입된 카피수를 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 GM 면화 3계통에 도입된 외래유전자의 카피수 및 보정계수는 하기 표 4와 같다 (표 4).
<표 4>
GM면화 내재유전자(fsACP) 카피수 도입유전자 카피수 보정계수
BG531 46932.43 19891.20 0.42
RR1445 49488.07 59936.82 1.21
BG15985 48966.96 56917.29 1.16
결론적으로 본 발명에 의한 GM 면화 검정용 PCR 프라이머와 프로브 및 플라스미드는 GMO의 검사키트로 상업화할 수 있으며, 특히 유통중이거나 수입된 GM 면화의 간편하고 정확한 정성 및 정량분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 의하면 유전자 변형체(GMO)의 검정을 신속하면서 정확하게 수행할 수 있으며, 특히 Cry1Ac:7S, CP4EPSPS:E9 및 CTP2:Cry2Ab 유전자를 함유한 유전체의 검정에 매우 유용하여 유전자변형 면화 3계통을 특이적으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 현재 유통중이거나 수입되는 농산물, 사료 및 종자에 대하여 유전자변형 면화를 정성 및 정량적으로 분석하는 LMO 검정에 매우 유용하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
<110> Republic of Korea <120> Primer Set for Detection of Genetically Modified Organism, Detection Method, and Standard Plasmid used thereto <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC7S-1F <400> 1 tcggtgaaac cgagggaac 19 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC7S-1R <400> 2 cgatactttc ctcgctcact atgag 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC7S-2F <400> 3 gggaaccttc atcgtggaca 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC7S-2R <400> 4 attgaagaca aaggacggga tc 22 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC7S-3 <400> 5 tgatggagga ataatgagat ctagaggcct gaa 33 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPE9-2F <400> 6 tccgacacta aggctgcttg at 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPE9-1R <400> 7 gaaactgatg cattgaactt gacg 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPE9-2R <400> 8 atgcattgaa cttgacgaac gt 22 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EPE9-3 <400> 9 agctttcgtt cgtatcatcg gtttcgaca 29 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTCR-2F <400> 10 attgaagaag agtgggatga cgtta 25 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTCR-2R <400> 11 gaccagagtt caggacggag tt 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTCR-3 <400> 12 cggcgtgcat gcttgccatg 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fsACP-2F <400> 13 caaacaagag accgtggata aggta 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fsACP-2R <400> 14 caagagaatc agctccaaga tcaag 25 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fsACP-3 <400> 15 ttagctttag acaatgacaa accaatcacc gg 32

Claims (19)

  1. 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10 및 11의 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 1 또는 서열번호 3 기재의 프라이머 중 어느 하나와, 서열번호 2 또는 서열번호 4 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트.
  3. 제 2항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Bollgard 531임을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  4. 제 1항에 있어서, 서열번호 6과, 서열번호 7 또는 서열번호 8 기재의 프라이머 중 어느 하나를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트.
  5. 제 4항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Roundup Ready 1445임을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  6. 제 1항에 있어서, 서열번호 10과, 서열번호 11 기재의 프라이머를 포함하는 유전자 변형체의 검정을 위한 프라이머 세트.
  7. 제 6항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Bollgard Ⅱ 15985임을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  8. 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 및 11 기재의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되어지는 어느 하나의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 준비하는 단계; 상기 준비된 프라이머 세트를 이용하여 당해 유전자 변형체의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 수행 결과로부터 유전자 변형체의 정성 또는 정량 분석 결과를 얻는 단계를 포함하는 유전자 변형체의 검정방법.
  9. 제 8항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Bollgard 531이며, 정성분석은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  10. 제 8항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Roundup Ready 1445이며, 정성분석은 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  11. 제 8항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 BollgardⅡ 15985이며, 정성분석은 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  12. 제 8항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Bollgard 531이며, 정량분석은 서열 번호 3 및 서열번호 4 기재의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  13. 제 8항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Roundup Ready 1445이며, 정량분석은 서열번호 6 및 서열번호 8 기재의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  14. 제 8항에 있어서, 유전자 변형체는 면화 Ⅱ 15985이며, 정량분석은 서열번호 10 및 서열번호 11 기재의 프라이머가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  15. 제 12항에 있어서, 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 5 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  16. 제 13항에 있어서, 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 9 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  17. 제 14항에 있어서, 정량 분석은 실시간 PCR에 따르며, 이때 사용되는 프로브는 서열번호 12 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  18. 제 15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 정량분석에 내재유전자 fsACP유전자가 사용되며, 내재유전자의 정량 분석은 실시간 PCR에 따르고, 서열번호 13 및 서열번호 14기재의 프라이머와, 서열번호 15 기재의 프로브가 사용되어짐을 특징으로 하는 검정방법.
  19. 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 및 11 기재의 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되어지는 어느 하나의 프라이머를 이용하여 유전자 변형체의 게놈 DNA를 주형으로 하여 수행한 PCR 산물이 벡터의 소정 위치에 삽입된 유전자 변형체의 정량검정을 위한 표준 플라스미드.
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