KR102098873B1 - 종자용 유전자변형생물체를 검출하기 위한 다중검출 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
유전자 변형 유채(oilseed rape) 이벤트를 검출하기 위한 다중 증폭용 프라이머 세트에 관한 것으로, 국내 자연환경 모니터링 사업을 통해 얻어진 LMO 의심시료를 보다 효율적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라 다중검출을 통해 LMO 의심 작물의 분석에 소요되는 시간, 인력 및 비용을 절감할 수 있다.
Description
종자용 유전자변형생물체를 검출하기 위한 다중검출 방법 및 키트에 관한 것이다.
유전자변형생물체(Living modified organism, LMO) 작물은 인류가 직면한 식량부족, 환경변화, 대체에너지 개발 등 각종 문제점의 해결방안으로 고부가가치 창출이 가능하여 다양한 작물에 대하여 연구개발이 진행되어 왔다. 유전자변형 작물의 토마토가 처음으로 개발되어 상업화된 이후 다양한 작물에 대한 LMO가 개발되어 왔으며 현재는 의약품, 기능성 등의 가치를 지니는 LMO 개발로 확대되고 있다. 세계 LMO 안전성 심사 승인된 품목은 2018년 4월 ISAAA 기준으로 30 개의 작물, 503 개의 품목이며 단일형질과 최대 6개 단일형질로 구성된 후대교배종(복합형질)이 있다. 현재 대부분이 우대교배종의 LMO가 개발되고 있다.
2007년 ‘유전자변형생물체의 국가간 이동에 관한 법률(LMO법)’이 시행됨에 따라 LMO 수입의 용도별 수입승인이 소관부처별로 의무화되고 국가차원에서 사후관리 등의 조치를 취하고 있다. 또한, LMO 원료 및 생산물의 안전성 확보화 소비자의 알 권리 제공의 일환으로 환경위해성 및 인체안전성 평가를 의무화하고 있다. 최근 미승인 LMO의 환경방출로 인하여 국가적인 이슈가 되고 있는 상황에서 종자용 LMO 작물의 재배 및 유통관리와 소비자의 안전성 확보를 위하여 신속하고 효율적인 LMO 검출 기법에 대한 개발이 요구되고 있다. 특히 최근 개발되는 대부분의 LMO는 후대 교배종으로 이에 대한 신속한 검출방법의 필요성 또한 증가되고 있다. 현재 LMO를 검출할 수 있는 방법으로는 단백질의 항원항체반응을 이용한 스트립(strip) 및 ELISA 분석법이 있으며, 보다 정확하고 안정적으로 검출할 수 있는 PCR 분석법이 있다. LMO 검출을 위한 모듈로서 텍손(texon), 컨스트럭트(construct), 이벤트(event) 또는 구성인자(element)가 있다. 이중에서도 유전자변형생물체의 발현을 위하여 사용되는 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator) 모듈은 유전자변형생물체의 존재 유무 검출을 위한 스크리닝에 많이 사용되고 있다.
한편, LMO의 모니터링을 위해서는 다양한 이벤트에 대한 검출 여부를 확인해야 한다. 이때 각 도입 유전자별 분석을 수행하여야 하나, 후대교배종 LMO의 경우 2 내지 5개의 유전자가 집적되어 있어, 이들 유전자의 개별적 분석을 해야 하는 불편함이 있다. 또한, 비의도적 환경방출이 우려되는 상황에서 알려져 있지 않는 수많은 LMO 이벤트들을 모두 검출하기에는 많은 시간과 비용이 소모되므로 LMO 도입여부의 스크리닝을 위하여 공통유전자인 구성인자 특이 모듈에 대한 다중 검출시스템의 개발이 필요하다.
일 양상은 주요 종자용 유전자변형생물체의 이벤트를 검출하기 위한 다중 증폭용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 종자용 유전자변형생물체의 이벤트를 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 유채를 포함하는 시료로부터 유채의 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 종자용 유전자변형생물체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 주요 종자용 유전자변형생물체의 이벤트를 검출하기 위한 다중 증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 유채, 면화, 콩 및/또는 옥수수의 유전자변형생물체를 검출하기 위한 것으로서, 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 유전자변형생물체의 공통적인 이벤트를 검출할 수 있다.
유전자변형생물체의 유전자는 개시인자, 목적인자 및 종결인자로 구성되며, 유전자변형생물체를 검출하는 방법은 하기의 3가지 방법이 존재한다. 먼저, 개시인자를 인식하여 유전자변형생물체를 검출하는 방법을 구성인자 특이적(Element specific) 분석법이라고 하며, 목적인자와 개시인자 또는 종결인자가 결합한 부위를 인식하는 방법을 컨스트럭트 특이적(Construct specific) 분석법이라고 한다. 또한, 개시인자 및 종결인자와 호스트 작물과 결합한 부위를 인식하는 방법을 이벤트 특이적(Event specific) 분석법이라고 한다, 구성인자 특이적 분석법은 다양한 유전자변행생물체에 대하여 검출이 가능하나, 이벤트명을 특정할 수 없기 때문에 스크리닝을 위한 방법으로 많이 사용되며, 이벤트 특이적 분석법은 개별 이벤트를 특정할 수 있으며 가장 정확한 분석법으로 알려져 있다.
본 명세서 내 용어, "이벤트"는 이종성(heterozygote) DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 형질전환체의 자손을 의미하며 또한, 게놈/트랜스진 DNA를 포함하는 또 다른 품종과 형질전환체 간의 유성 이종교배에 의해 생산된 자손을 의미한다. 즉, 이벤트란 상기의 형질전환 등에 의해 DNA가 유전체에 도입된 재조합체 또는 이를 도입한 생물체 및 이의 자손을 의미한다.
본 명세서 내 용어,"프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건(4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로 작용하는 것을 의미한다. 상기 프라이머의 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어 10 내지 60 nt, 15 내지 50 nt, 또는 15 내지 40 nt인 것일 수 있다. 상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만, 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제6 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제7 프라이머 세트로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 프라이머 세트는 E9-Ter 프라이머 세트; 제2 프라이머 세트는 NPT Ⅱ 세트; 제3 프라이머 세트는 T-nos 프라이머 세트; 제4 프라이머 세트는 P-nos 프라이머 세트; 제5 프라이머 세트는 P-35S 프라이머 세트; 제6 프라이머 세트는 P-FMV 프라이머 세트; 및 제7 프라이머 세트는 T-35S 프라이머 세트인 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 유채 7종의 유전자 변형 이벤트에 대해서 높은 특이성 및 선택성을 가지도록 제작된 것으로서, 상기 7종을 포함하여 공지된 유채 9종의 유전자 변형 이벤트뿐만 아니라 면화, 콩 또는 옥수수의 유전자 변형 이벤트를 검출할 수 있다. 즉, 상기 프라이머 세트는 유채 9종의 T45, GT73/Rt73, Ms8, Rf1, Rf2, Rf3, Topas19/2, MON88302, 73496 또는 이의 조합의 유전자 변형 이벤트; 면화 5종의 MON1445, LL25Cotton, GHB119, T304-40, COT102 또는 이의 조합의 유전자 변형 이벤트; 콩 4종의 RRS, A5547-127, MON87769, MON87708 또는 이의 조합의 유전자 변형 이벤트; 및/또는 옥수수 11종의 MON810, Bt176, Bt11, GA21, NK603, TC1507, MON863, MIR604(23), MON89034, MON87460, MON87427 또는 이의 조합의 유전자 변형 이벤트에 대해 높은 특이성 및 선택성을 가진다. 따라서, 상기 프라이머 세트는 유채, 면화, 콩 및/또는 옥수수의 유전자 변형 이벤트를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
상기 프라이머 세트를 구성하는 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 표지될 수 있다. 상기 형광 표지 물질은 VIC, NED, FAM, PET, 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 유전자변형생물체의 이벤트를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 프라이머 세트의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 DNA 중합효소는 예를 들면, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소인 것일 수 있다. 상기 PCR 완충 용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유하는 것일 수 있다. 또한, PCR, 구체적으로 AS-PCR, 또는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다. 상기 키트는 안내서를 포함하는 것일 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
다른 양상은 유채를 포함하는 시료로부터 유전자변형생물체의 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 유전자변형생물체의 이벤트를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 프라이머 세트의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 스크리닝하는 방법은 유전자변형생물체 이벤트의 존재 또는 부존재를 검출하는 것일 수 있다. 구체적으로 유전자변형생물체의 선별은 도입된 유전자의 일부 서열과 유전자변형생물체의 주변 염기서열을 이용하는 방법으로서 환경 중 LMO 추정 시료를 확정 판단하기 위한 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법에 의해 유전자변형생물체의 시료 내에 존재하는 유전자변형생물체를 선별할 수 있다. 상기 유전자변형생물체는 주요 종자용 유전자변형생물체인 것일 수 있으며 예를 들어, 유채, 면화, 콩 또는 옥수수인 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 유채를 포함하는 시료로부터 유전자변형생물체의 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 유전자변형생물체의 게놈 DNA를 분리하는 방법은 이 기술 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 CTAB 방법 또는 상업화된 키트를 이용하여 분리하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 일 양상에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행함으로써 표적 핵산을 증폭할 수 있다. 상기 표적 핵산을 증폭하는 방법은 예를 들어, 중합효소연쇄반응(PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기 증폭된 표적 서열은 선별 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 상기 증폭 산물의 선별하거나 또는 증폭 산물의 크기를 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다.
상기한 바와 같이, 일 양상에 따른 방법은 상기 유전자변형생물체의 이벤트를 검출하기 위한 다중 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 것으로서, 상기 프라이머 세트는 7 종의 유채 이벤트를 포함한 9종의 유채 유전자 변형 이벤트, 5종의 면화 유전자 변형 이벤트, 4종의 콩 유전자 변형 이벤트 및/또는 11종의 옥수수 유전자 변형 이벤트에 대하여 높은 특이성 및 선택성을 가짐으로써 주요 종자용 유전자변형생물체 29개의 이벤트를 동시에 검출할 수 있다.
일 양상에 따른 프라이머 세트를 이용하면 국내 및/또는 외국에서 개발된 주요 종자용 유전자변형생물체의 이벤트를 검출할 수 있으므로 승인 및 미승인 LMO의 검출로 인한 안전한 식품관리, 종자유통관리 등과 같은 분야에 이용될 수 있다. 또한, 주요 종자용 LMO 29개의 이벤트를 동시에 검출할 수 있으므로 LMO 의심 작물의 분석에 소요되는 시간, 인력 및 비용을 절감할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 유전자변형생물체의 유전자를 구성하고 있는 모듈(개시인자, 목적유전자 및 종결인자)을 나타낸 모식도이다.
도 2는 단일 유채 이벤트 각각의 유전 정보 및 프라이머 정보를 나타낸 모식도이다.
도 3은 유채의 내재유전자 및 이벤트 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 단일중합효소 연쇄반응을 통해 DNA의 확인한 사진이다.
도 4a는 유채의 내재유전자인 BnCl-E3의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4b는 유채의 단일 이벤트인 E9-Ter의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4c는 유채의 단일 이벤트인 NTPⅡ의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4d는 유채의 단일 이벤트인 T-nos의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4e는 유채의 단일 이벤트인 P-nos의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4f는 유채의 단일 이벤트인 P-35S의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4g는 유채의 단일 이벤트인 P-FMV의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4h는 유채의 단일 이벤트인 T-35S의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 5는 다중 유채 이벤트 각각의 증폭산물 크기를 확인한 사진이다.
도 6은 일 구체예에 따른 프라이머 세트의 다중검출 PCR 최적 조건 확인을 확인한 사진이다.
도 2는 단일 유채 이벤트 각각의 유전 정보 및 프라이머 정보를 나타낸 모식도이다.
도 3은 유채의 내재유전자 및 이벤트 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 단일중합효소 연쇄반응을 통해 DNA의 확인한 사진이다.
도 4a는 유채의 내재유전자인 BnCl-E3의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4b는 유채의 단일 이벤트인 E9-Ter의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4c는 유채의 단일 이벤트인 NTPⅡ의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4d는 유채의 단일 이벤트인 T-nos의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4e는 유채의 단일 이벤트인 P-nos의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4f는 유채의 단일 이벤트인 P-35S의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4g는 유채의 단일 이벤트인 P-FMV의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 4h는 유채의 단일 이벤트인 T-35S의 정방향 및 역방향 프라이머 서열을 나타낸 모식도이다.
도 5는 다중 유채 이벤트 각각의 증폭산물 크기를 확인한 사진이다.
도 6은 일 구체예에 따른 프라이머 세트의 다중검출 PCR 최적 조건 확인을 확인한 사진이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예
1. 유전자변형생물체(
LMO
)의 분석을 위한 표준물질의 준비 및 게놈 DNA의 분리
1-1. 유전자변형생물체(LMO) 다중 스크리닝용 표준물질 및 유전자의 확보
동시검출기법 개발에 사용된 LM 유채(oilseed rape) T45, Ms8, Rf1, Rf2, Rf3, Topas19/2 이벤트(DNA 형태)와 GR73/RT73, MON88302 표준물질(분말형태)은 미국유지화학협회(American Oil Chemists’ Society, AOCS, USA)로부터 구입하여 사용하였다. LMO 다중분석법 개발을 위한 스크리닝용 프라이머는 유전자 도입시 주로 사용이 되는 프로모터, 터미네이터, 선발마커를 선별하여 사용하였다(표 1).
| 스크리닝 유전자군 | 세부 유전자 내용 |
| 프로모터(3종) | 35S(Cauliflower mosaic virus) |
| FMV(Figworth mosaic virus) | |
| NOS(Agrobacterium tumefaciens) | |
| 터미네이터(3종) | NOS(Agrobacterium tumefaciens) |
| 35S(Cauliflower mosaic virus) | |
| E9(Pisum sativum) | |
| 선발마커(1종) | NPTⅡ(Escheerichia coli) |
1-2. 게놈 DNA의 분리
DNA 형태의 T45, Ms8, Rf1, Rf2, Rf3, Topas19/2 이벤트는 멸균된 3차 증류수를 이용하여 20 ng/㎕가 되도록 희석한 후 사용 전까지 -20℃에 100 μL씩 분주하여 보관하였다. 분말형태의 표준물질 GR73/RT73, MON88302는 저울을 이용하여 각각 1g 이상씩 정량한 후 1.5 mL 튜브에 소분하였다. 이후, steal bead를 주입하고 TissueLyserll (Qiagen, United States)을 이용하여 균질화 하였다. DNA 정제는 추출 키트인 NucleoSpoin Plant Ⅱ Genomic DNA from plant (Macherey-nagel, Germany)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 균질화된 LM 유채 표준물질에서 steal bead를 제거한 뒤, 튜브당 400 μL PL1 버퍼를 첨가하고 볼텍싱(voltexing) 하였다. 이후, RNase A 10 μL 를 추가하여 잘 혼합한 후 약 65℃의 배양기에 20분 동안 인큐베이션 을 수행하였다. 이후, 11,000 x g로 5분 동안 원심분리한 뒤 깨끗한 상층액을 새로운 보라색 링이 있는 NuleoSpin Filter 튜브에 최대 700 μL씩 주입하였고, 이용해 11,000 x g로 2분 동안 추가로 원심분리 하였다. 보라색 링이 있는 NuleoSpin 필터를 제거하고, 필터를 통과한 용액에 450 μL PC 버퍼를 피펫팅(pipetting)하여 완전히 혼합시킨 뒤 새로운 녹색 링이 있는 NuleoSpin Plant Ⅱ Column 튜브로 최대 700 μL씩 주입하였다. 이후, 11,000 x g로 1분 동안 원심분리 하였다. Column을 통과한 여과액은 제거하고, PC 버퍼까지 반응시킨 용액이 남아있는 경우 Column 여과 과정을 다시 반복해서 수행하였다. 여과과정을 거친 Column에 잔존해 있는 핵산을 제외한 불순문을 제거하기 위해 PW1, PW2 buffer를 이용하여 세척과정을 수행하였다. 이후, PW1 버퍼 400μL를 주입한 뒤 11,000 x g로 1분 동안 원심분리를 수행하고 통과된 여과액은 제거하였다. PW2 버퍼 650 μL를 주입한 뒤 11,000 x g로 1분 동안 원심분리를 수행하고 통과된 여과액은 제거하였다. 추가로 PW2 버퍼 200 μL를 주입한 뒤 11,000 x g로 2분 동안 원심분리하여 여과액을 완전히 제거하였다. 새로운 1.5 mL 튜브로 세척된 컬럼을 이동시킨 후 미리 65℃에서 데워진 멸균수 75 μL를 주입하여 65℃에서 5분 동안 인큐베이션한 다음 11,000 x g로 1분 동안 원심분리하여 컬럼을 제거하였다. 동일한 이벤트로부터 추출된 DNA를 혼합한 후, 각각의 이벤트로부터 정제한 게놈 DNA를 3.0% 아가로즈 젤에 전기영동하여 확인하였으며, 극미량분광광도계 (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 정량하였다. 이후, 멸균된 3차 증류수를 이용하여 20 ng/㎕가 되도록 희석하여 100 μL씩 분주한 후 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.
실시예 2. 내재유전자 및 이벤트 특이적인 다중 PCR 프라이머의 제작
유채의 내재유전자(endogenous gene)는 Cruciferin A (Cru A, GenBank Accession no. X59294) 유전자의 염기서열을 기초로 하여 400bp의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 프라이머 설계용 프로그램(예를 들어, PRIMER3, VectorNTI 프로그램)을 사용하여 하기의 프라이머 세트를 하였다:
BnCl-E3-F: 5'-CAACCCACAAGGCCAAGTATGGA-3'
BnCl-E3-R: 5'- TTGACGGATAGATCCACGGAGGG-3'.
한편, 8개의 이벤트를 동시에 분석하기 위한 PCR 분석용 프라이머는 특정 이벤트를 검출할 수 있도록 염기서열을 기반으로 한쪽은 도입유전자가 위치한 좌위(locus)에 다른 한쪽은 고유 식물 유전제에 위치한 좌위에 위치시켜 제작하였다. 구체적으로, 유럽위원회 공동연구센터(Joint Research Centre-European Commission, JRC-EC)와 LM 환경위해성센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)에 등록된 검출 프라이머를 바탕으로 각각의 이벤트 별로 단일검출 PCR로 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 확인한 후 PCR 증폭산물의 사이즈에 따라 다중 PCR에 사용하기 위한 프라이머를 재 디자인하여 선별하였다(표 2).
| 프라이머 이름 | 염기서열(5'→3') | 증폭산물 크기(bp) |
| E9-Ter-F2 | TTTCGACAACGTTCGTCAAGTTC | 339 |
| E9-Ter-R2 | CCTCGGTCATTAGAGGCCACGAT | |
| NPT II-F2 | TGGCGATGCCTGCTTGCCGAATA | 250 |
| NPT II-R2 | GAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAA | |
| T-nos-F2 | GTTGCCGGTCTTGCGATGATTAT | 206 |
| T-nos-R2 | TCTAGTAACATAGATGACACCGC | |
| P-nos-F2 | TTATGGAACGTCAGTGGAGCATT | 180 |
| P-nos-R2 | GTTTTACGTTTGGAACTGACAGA | |
| P-35S-F2 | ATTCAAGATGCCTCTGCCGACAG | 149 |
| P-35S-R2 | TGGGATTGTGCGTCATCCCTTAC | |
| P-FMV-F2 | CAGTCCAAAGCCTCAACAAGGTC | 119 |
| P-FMV-R2 | CATGATGCATGTGCTGGAACAGT | |
| T-35S-F2 | GTACTGGATTTTGGTTTTAGGAA | 100 |
| T-35S-R2 | GCTCATGTGTTGAGCATATAAGA |
실시예 3. 다중 PCR 프라이머의 단일 PCR에서의 작동 유무 확인
상기 실시예 2에서 제작한 프라이머가 동시검출기법에 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 대상 LMO 이벤트에서 단일 PCR을 수행하였다. 구체적으로, LM 유채 표준시료의 DNA는 주형 농도에 의한 편차를 없애기 위해 20 ng/㎕의 동일한 농도로 희석하여 진행하였다. 동시검출기법 개발을 위한 각각의 이벤트 단일 검출 PCR의 조건은 genomic DNA 1 ㎕(20 ng)를 주형으로 사용하였으며, 각각의 element 특이적 프라이머 1 ㎕ (10pmole), 2 x Multliplex PCR Master Mix with dye (Misogene, Republic of Korea)10 ㎕ 및 멸균된 증류수를 넣어 각 PCR 튜브당 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 혼합한 후 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 15분간 변성시킨 후, 95℃ 20초, 60℃ 30초, 60℃ 30초, 35 cycle을 결합 및 신장 반응시킨 뒤 72℃에서 3분간 신장한 후 4℃에서 PCR 반응을 중지시켰다 (Simplyamp PCR system, Applied Biosystems, USA). 증폭된 PCR 산물은 100bp DNA ladder (Solgent, Korea)와 함께 3% 아가로즈 겔 상에서 250V로 전기영동한 후 Universal hood ll (Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기영동 결과를 확인하였다.
도 3은 유채의 이벤트 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 단일중합효소 연쇄반응을 통해 DNA의 확인한 사진이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 다중 분석용 프라이머 세트를 활용하여 유채의 이벤트별 단일 PCR 반응에서도 정확하게 작동하는 것을 확인할 수 있었으며, 다중 PCR 조건의 프라이머 세트에서도 단일 PCR 반응 결과와 동일한 결과를 확인할 수 있었다.
실시예 4. 다중검출(multiplex-PCR)의 최적 조건 확인
상기 실시예 2에서 동기검출기법 대상 LM 유채 6개 이벤트와 관련된 염기서열 정보를 근거로 제작된 이벤트 특이적 프라이머를 활용하여 6개 이벤트를 한번의 PCR로 확인 가능한 multiplex-PCR 조건을 확립하였다. 구체적으로, LM 유채 표준시료의 DNA는 주형 농도에 의한 편차를 없애기 위해 20 ng/㎕의 동일한 농도로 희석하여 진행하였다. 동시다중검출기법 개발을 위한 각각의 이벤트를 genomic DNA 20 ㎕ (20 ng/μL)씩 혼합한 후 혼합된 genomic DNA를 1㎕ (20 ng)를 주형으로 사용하였다. 각각의 element 특이적 프라이머 1 ㎕ (10 pmol), 2 x Multliplex PCR Master Mix with dye (Misogene, Republic of Korea) 10 ㎕, 및 멸균된 증류수를 넣어 각 PCR 튜브당 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 혼합하여 상기 실시예 3과 동일한 조건으로 PCR을 수행한 후 전기영동 결과를 확인하였다. 이후, 상기 실시예 3의 단일 이벤트 검출에서 증폭된 PCR 증폭 산물의 크기가 전기영동 상에서 구분되는지 확인한 후 Multiplex PCR 세트 별로 2~3쌍의 프라이머 농도를 조절하여 최적의 Multiplex PCR 조건을 확립하였다.
| 프라이머 이름 | 프라이머 농도(pmole) |
| E9-Ter | 1.5 |
| NPT II | 2.5 |
| T-nos | 2 |
| P-nos | 4 |
| P-35S | 10 |
| P-FMV | 10 |
| T-35S | 10 |
도 5는 다중 유채 이벤트 각각의 증폭산물 크기를 확인한 사진이다. 본 발병의 다중 분석 조건하에서 기본적으로 사용한 유채 7종, positive control, negative control을 사용한 다중 PCR분석 결과이다. 각각의 element(개시 유전자, 조결 유전자, 선발마커)분석결과 유전자변형생물체의 유전자 구성과 동일한 검출 결과를 보여 주었으며, 내재 유전자, positive control 및 negative control에서도 정확히 증폭됨을 알 수 있었다.즉, 7종의 유채를 동시에 검출할 수 있음을 확인하였으며 나머지 2종의 유채 이벤트와 면화, 콩, 옥수수 이벤트를 포함한 총 29종의 LMO 이벤트에 대한 다중분석이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예
5. 동시검출(multiplex-
PCR
)법의 효율성 입증
일반적으로 현장에서 채집되는 시료는 strip test와 유전적 분석을 동시에 진행하기에 충분하지 않은 경우가 많고, 매우 열악한 환경에서 발견되기 때문에 분석에 용이한 좋은 상태의 genomic DNA를 얻기가 쉽지 않다. 또한, 소량의 LMO가 함유되어 있는 시료를 명확하게 판단해 내기 위해서 검출율이 높아야 하므로 상기 실시예 4에서 확립한 동시검출기법의 효용성을 확인함으로써 실제 적용 여부뿐만 아니라 어느 정도의 검출 민감도를 갖는지 파악하고자 하였다. 구체적으로, LM 유채 DNA는 각각의 이벤트를 genomic DNA 20 ㎕ (20 ng/㎕)씩 혼합한 후 혼합된 genomic DNA를 단계별로 희석하여 희석된 산물의 1㎕를 주형으로 사용하였다. 각각의 element 특이적 프라이머 1 ㎕(10 pmole), 2 x Multliplex PCR Master Mix with dye (Misogene, Republic of Korea) 10 ㎕, 및 멸균된 증류수를 넣어 각 PCR 튜브당 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 혼합한 후 상기 실시예 3과 동일한 조건으로 PCR을 수행한 후 전기영동 결과를 확인하였다. 이후, gel document(Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기영동 결과 밴드가 검출되는 농도를 선정하였다.
도 5는 일 구체예에 따른 프라이머 세트의 다중검출 PCR 최적 조건 확인을 확인한 사진이다. 일반적으로 유전자변형생물체의 검출 한계는 정성분석에서 0.1%로 알려져 있다. 일 양상에 따른 다중분석법의 검출 한계를 확인하기 위하여 유전자 복제수(copy number)를 희석 비율에 따라 100,000, 10,000, 1,000, 100, 10, 1 개로 하여 다중 분석을 실시한 결과 복제수 100개의 유전자(0.01%)까지 검출됨을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 유전자변형생물체를 검출하기 위한 7종의 다중 프라이머 세트를 사용할 경우, 유전자변형생물체가 시료 내 극 소량(0.01%)으로 함유되어 있음에도 불구하고 일반적인 검출 한계보다 정밀도가 높은바 정확한 검출이 가능하다.
실시예
6. 주요 종자용
LMO의
이벤트
구성인자에
대한 작물의 구조 정보 및 PCR 분석 결과 일치 여부 확인
상기 실시예 4에서 확인한 다중검출 최적 조건을 이용하여 주요 종자용 LMO의 이벤트 구성인자와 작물의 구조 정보 및 PCR 분석 결과가 일치하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 유채의 T45 이벤트의 경우 유럽위원회 공동연구센터 (Joint Research Centre-European Commission, JRC-EC)와 LM 환경위해성센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)의 정보를 바탕으로 LMO 제작시 사용된 개시인자, 종결인자 및 선발마커 7종 중에 P35S, T35S가 사용되었음을 알 수 있었고, 다중 PCR조건에서 validation을 한 결과 동일한 결과를 얻을 수 있었으며 그 결과를 하기 표 4에 나타냈었다. 또한, 각 작물의 유전자 이벤트에 따른 생물학적 특성 및 목적 유전자에 대한 정보를 하기 표 5에 나타냈었다.
| 작물 | 이벤트명 | 생물학적 특성 | 목적유전자 |
| 유채 | T45 | 제초제 저항성 | Pat |
| GT73/Rt73 | 제초제 저항성 | CP4EPSPS | |
| Ms8 | 제초제 저항성 | Bar | |
| Rf1 | 제초제 저항성 | Bar | |
| Rf2 | 제초제 저항성 | Bar | |
| Rf3 | 제초제 저항성 | Bar | |
| Topas19/2 | 제초제 저항성 | Bar | |
| MON88302 | 제초제 저항성 | CP4EPSPS | |
| 73496 | 제초제 저항성 | Bar | |
| 면화 | MON1445 | 제초제 저항성 | CP4EPSPS |
| LL25Cotton | 제초제 저항성 | Bar | |
| GHB119 | 해충/제초제 저항성 | Bar, cry2Ae | |
| T304-40 | 해충/제초제 저항성 | cry1Ab, bar | |
| COT102 | 해충저항성 | vip3A, aph4 | |
| 콩 | RRS | 제초제 저항성 | CP4EPSPS |
| A5547-127 | 제초제 저항성 | Pat | |
| MON87769 | 지방산조성변화 | Pj.D6D, Nc.Fad3 | |
| MON87708 | 제초제 저항성 | dmo | |
| 옥수수 | MON810 | 해충저항성 | Cry1Ab |
| Bt176 | 해충/제초제 저항성 | cry1Ab, bar | |
| Bt11 | 해충/제초제 저항성 | Cry1Ab, Pat | |
| GA21 | 제초제 저항성 | mEPSPS | |
| NK603 | 제초제 저항성 | CP4EPSPS | |
| TC1507 | 해충/제초제 저항성 | cry1F, pat | |
| MON863 | 해충저항성 | Cry3Bb1 | |
| MIR604(23) | 해충저항성 | Cry3A | |
| MON89034 | 해충저항성 | cry1A.105, cry2Ab2 | |
| MON87460 | 해뭄저항성 | cspB, nptII | |
| MON87427 | 제초제 저항성 | cp4epsps |
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 유채 9종(T45, GT73/Rt73, Ms8, Rf1, Rf2, Rf3, Topas19/2, MON8302, 73496), 면화 5종(MON1445, LL25Cotton, GHB119, T304-40, COT102), 콩 4종(RRS, A5547-127, MON87769, MON87708) 및 옥수수 11종(MON810, Bt176, Bt11, GA21, NK603, TC1507, MON863, MIR604(23), MON89034, MON87460, MON87427) 등 주요 종자용 LMO 이벤트 29종에 대하여, 개발된 다중 PCR조건에 대한 validation을 실시한 결과. LMO 제작시 삽입된 개시인자, 종결인자 및 선발마커의 정보와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 따라서, 일 양상에 따른 프라이머 세트는 LMO 정밀 분석에 유용하게 사용이 가능한 바 안전한 식품관리, 종자유통관리 등과 같은 분야에 이용될 수 있다.
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tttcgacaac gttcgtcaag ttc 23
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cctcggtcat tagaggccac gat 23
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<212> DNA
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tggcgatgcc tgcttgccga ata 23
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gaaccccaga gtcccgctca gaa 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T-35S-R2
<400> 14
gctcatgtgt tgagcatata aga 23
Claims (9)
- 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제5 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제6 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제7 프라이머 세트를 포함하는, 유전자변형생물체의 이벤트를 검출하기 위한 다중 증폭용 프라이머 세트로서,
상기 유전자변형생물체는 유채, 면화, 콩 및 옥수수로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자변형생물체이며,
상기 유전자변형생물체의 이벤트는 T45, GT73/Rt73, Ms8, Rf1, Rf2, Rf3, Topas19/2, MON88302, 73496, MON1445, LL25Cotton, GHB119, T304-40, COT102, RRS, A5547-127, MON87769, MON87708, MON810, Bt176, Bt11, GA21, NK603, TC1507, MON863, MIR604(23), MON89034, MON87460, 및 MON87427로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 이벤트인,
다중 증폭용 프라이머 세트. - 청구항 1에 있어서, 제1 프라이머 세트는 E9-Ter 프라이머 세트; 제2 프라이머 세트는 NPT Ⅱ 세트; 제3 프라이머 세트는 T-nos 프라이머 세트; 제4 프라이머 세트는 P-nos 프라이머 세트; 제5 프라이머 세트는 P-35S 프라이머 세트; 제6 프라이머 세트는 P-FMV 프라이머 세트; 및 제7 프라이머 세트는 T-35S 프라이머 세트인 것인 프라이머 세트.
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 제1 프라이머 세트의 프라이머 농도는 각각 1.5 pmol이고; 상기 제2 프라이머 세트의 프라이머 농도는 각각 2.5 pmol 이고; 상기 제3 프라이머 세트의 프라이머 농도는 각각 2 pmol이고; 상기 제4 프라이머 세트의 프라이머 농도는 각각 4 pmol이고; 상기 제5 프라이머 세트의 프라이머 농도는 각각 10 pmol이고; 상기 제6 프라이머 세트의 프라이머 농도는 각각 10 poml이고; 상기 제7 프라이머 세트의 프라이머 농도는 각각 10 pmol인 것인 프라이머 세트.
- 청구항 1에 따른 다중 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 유전자변형생물체의 이벤트를 검출하기 위한 키트.
- 유전자변형생물체를 포함하는 시료로부터 유전자변형생물체의 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 청구항 1에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 유전자변형생물체의 이벤트를 스크리닝하는 방법. - 청구항 7에 있어서, 상기 다중 증폭 산물의 크기를 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 스크리닝하는 방법은 유전자변형생물체 이벤트의 존재 또는 부존재를 검출하는 것인 방법.
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| KR20230141206A (ko) | 2022-03-31 | 2023-10-10 | 대한민국 (식품의약품안전처장) | 유전자변형 옥수수 검출용 실시간 pcr 프라이머 및 이의 용도 |
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