KR20180002310A - 유전자 변형 면화의 검출을 위한 다중-ｐｃｒ용 이벤트 특이 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

유전자 변형 면화의 검출을 위한 다중-ｐｃｒ용 이벤트 특이 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 국내 수입승인 유전자 변형(genetically modified, GM) 면화의 검정용 이벤트 특이 프라이머 및 이를 이용한 다중-PCR 검정방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 이용한 다중-PCR은 국내유통 중인 유전자 변형 면화 7종을 동시에 효과적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 이벤트 특이 프라이머 쌍으로 개발되었으므로, 다른 계통들 또는 작물들이 혼합된 상태에서도 특이적으로 해당 품목을 검출할 수 있다.

Description

유전자 변형 면화의 검출을 위한 다중-ＰＣＲ용 이벤트 특이 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트{Event-specific Multiplex-PCR Primer Set for Detecting the Commercialized Genetically Modified Cotton and Kit comprising the same}
본 발명은 국내 GMO(Genetically Modified Organism) 환경위해성 안전관리에 적용할 수 있는, 국내 수입승인 유전자 변형(genetically modified, GM) 면화의 검정용 이벤트 특이 프라이머 및 이를 이용한 다중-PCR 검정방법에 관한 것이다.
면화는 세계적으로 2014년 37.0백만ha가 재배되었고, 유전자 변형(genetically modified, GM) 면화가 전체의 70% 정도를 차지하고 있다. 최근까지 유전자 변형 면화의 재배면적은 ‘10년에 21.0 백만ha, ‘12년에 24.3 백만ha 및 ‘14년에 25.1 백만ha로 증가세에 있고, 유전자 변형 이벤트 승인 수는 2014년 기준 총 52건이었다. 이들의 주요 재배국은 미국, 인도, 중국, 브라질, 아르헨티나, 파키스탄, 파라과이, 남아공, 멕시코, 호주 등이다(비특허문헌 1).
국내에서는 전지면실이 대부분 농업용 또는 사료용으로 181천 톤 수입되었으며, 주요 수입국은 미국, 호주, 중국 및 인도 순이었다(한국바이오안전성정보센터(KBCH) 데이터베이스). 전지면실은 섬유질배합사료(total mixed ration, TMR)로 이용되고 있고, 가축 사료용으로는 일반적으로 착유하고 남은 면실박이 배합사료 조제에 첨가되어 가공되고 있다.
유전자 변형 작물(Genetically Modified Crops)은 20년 동안 상업화되어 이용되어 왔고, 수입 허가 및 재배를 각국의 규정에 따라 강하게 규제하고 있으나 여전히 잠재적인 인체 및 환경위해성에 대한 대중적인 논란이 지속되고 있다. 국내에서는 유전자 변형 작물을 수입하기 전에 환경위해성 평가를 완료해야 하고, “유전자 변형생물체(GMO)의 국가 간 이동 등에 관한 통합고시”를 통해 환경 및 국민건강에 대한 잠재적인 위해 효과를 사전에 방지하도록 하며(KBCH, 2007), 농업용유전자 변형생물체의 취급관리 기준에는 이의 목적 이행을 위해서 유통 및 이용 중 유전자 변형작물이 비의도적으로 환경에 방출되지 않도록 규정하여 관리하고 있다(농림축산식품부 고시 제2007-8호).
유전자 변형 작물에 대한 환경위해성 평가 심사는 사례별(case-by-case)로 다루어지고 있다. 환경위해성 심사에는 도입 유전자에 대한 분자생물학적 분석, 도입 유전자의 검출 및 발현의 확인, 유전자 변형 산물에 대한 검정방법 등을 명시하도록 하고 있다. 특히, 검출 또는 검정법은 유전자 변형 작물의 비의도적 환경 방출에 따른 안전성 확보를 위해서 사후 환경모니터링 기술로 적용할 수 있다(비특허문헌 2). 또한 보다 효율적인 사후 모니터링 기술의 개발은 국가 유전자 변형 작물의 유통에 따른 안전관리를 보다 효과적으로 수행하기 위해서 중요사안이라 할 수 있을 것이다.
유전자 변형 작물의 주요 검정방법으로는 도입유전자의 DNA를 검출하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이 국제 표준분석법으로 추천되고 있으며, 정성 분석법으로 도입된 T-DNA 상의 유전자를 검출하는 스크리닝(screening), 유전자 특이(gene specific) 및 구조 특이(construct specific) 방법과 T-DNA가 삽입된 게놈 내의 인접서열과 운반체의 염기서열을 바탕으로 특이 마커를 작성하여 분석하는 이벤트 특이(event specific) 또는 계통 특이 방법으로 구분되고 있다(비특허문헌 3).
국내에서도 최근 몇 년 동안 농업 및 식품용 유전자 변형 작물의 수입이 증가하고 있고, 다양한 용도로 이용되고 있다. 이들 유전자 변형 작물은 하역, 운송, 보관 및 유통 중 비의도적인 방출로 일반 환경에 노출될 가능성을 부인할 수 없을 것이다. 따라서 유전자 변형 작물의 안전한 이용과 생태계로의 확산을 방지하기 위해서는 지속적인 환경 모니터링 및 안전관리 대책이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 국내 유통되는 유전자 변형 면화를 효율적으로 검출하기 위해 수입 승인된 유전자 변형 면화 단일품목을 최대한 동시에 검출할 수 있는 다중-PCR 분석법을 개발하였다. 또한, 유전자 변형 면화의 사후 이력 추적이 가능할 수 있도록 각 품목별로 도입유전자와 삽입인접 염기서열을 바탕으로 하여 이벤트 특이 프라이머 쌍을 개발하였다.
James Clive, 2014. Global status of commercialized biotech/GM crops:2014. ISAAA Brief NO.49. ISAAA: Ithaca, NY, USA JK Rho et al., Qualitative and Quantitative PCR Methods for Detection of Three Lines of Genetically Modified Potatoes, J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp 3269-3274 N Marmiroli et al,. Methods for detection of GMOs in food and feed, Analytical and Bioanalytical Chemistry, October 2008, 392:369
본 발명의 목적은 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 변형 작물의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍; 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14으로 구성되는 프라이머 쌍; 그리고 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍;을 모두 포함하는 것일 수 있다.
용어 유전자 변형 작물(Genetically Modified Organism) 또는 유전자 조작 농산물이란, 유전자 변형 기술에 의해 자연에는 없는 새로운 성질을 부여한, 특히, 생산성이 향상되고 상품의 질을 강화한 작물이다. GMO(Genetically Modified Organism)는 '유전자 변형 생물체'의 약자이나 주로 농작물을 대상으로 하기 때문에 통상적으로 '유전자 변형 작물'이라고 명명한다. 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 잘 물러지지 않는 토마토를 처음으로 상업화했고 1996년에는 몬산톤사가 대두를, 노바티스사가 옥수수를 각각 상품화했다. 유전자 변형 작물은 일반 소비시장에 첫선을 보이기 시작한 이후 5년 만에 미국의 수수, 대두(콩), 면화의 50% 이상을 차지하였다. 해충 및 질병에 강하고 소출량이 많아 식량난을 해소할 수 있다는 장점이 있으나 장기간 섭취할 경우에도 인간에 무해하다는 점이 분명하게 검증된 바가 없으며, GMO 품종으로 인해 생태계가 교란되는 등 환경재앙이 발생할 수도 있다는 위험성을 안고 있다.
용어 프라이머란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응효소(즉, DNA 폴리머레이즈) 및 중합반응을 위한 시약의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 크기, Tm값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내의 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지 등을 충분히 고려하고, 유전자 변형 작물 검출의 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 어덟 쌍의 프라이머 쌍은, 각각 특정 유전자 조각만을 증폭시키고, 각각의 유전자 조각의 증폭이 다음 단계의 분석에 충분할 만큼 이루어지며, PCR 반응 시 프라이머 간의 방해가 없이 각 유전자 부위를 동시에 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 유전자 변형 작물 게놈 내의 외래 도입유전자와 삽입인접염기서열을 바탕으로 작성한 "계통 특이(event-specific) 프라이머"이다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 계통을 쉽게 구분할 수 있고, 후대교배종에 대한 모본 파악이 용이하다.
상기 유전자 변형 작물은 유전자 변형 면화일 수 있다.
상기 유전자 변형 면화는 Mon1445, LLcotton25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event 3006-210-23 및 Event 281-24-236로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 유전자 변형 작물 검출용 키트를 제공한다.
상기 유전자 변형 작물 검출용 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍; 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 프라이머 세트가 포함되는 것일 수 있다.
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있으며, 상기 시약은 이 기술 분야에서 널리 공지된 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라아제, dNTPs, 및 버퍼일 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 a) 유전자 변형 작물의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 게놈 DNA를 주형으로 제 1항의 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 이용하여 다중-PCR(Multiplex-PCR)을 수행함으로써 유전자 변형 작물의 외래 도입유전자를 증폭하는 단계; 및
c) 증폭된 외래 도입유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 유전자 변형 작물의 검출 방법을 제공한다.
용어 PCR(중합효소연쇄반응)이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있다.
PCR 방법은 정성적인 방법과 정량적인 방법으로 나눌 수 있고, 정성적인 PCR 방법은 구체적으로 스크리닝(screening), 유전자 특이적(gene-specific), 구조 특이적(construct-specific) 및 계통 특이적(event-specific) PCR 방법으로 구분된다. 스크리닝 PCR법은 유전자 변형 작물의 개발 시기부터 현재까지 보편적으로 이용되어진 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터와 같은 유전자를 검지하여 확인하는 방법이고, 유전자 특이적 및 구조 특이적 PCR 방법은 도입된 목적 유전자의 특정 부분을 증폭시켜 검지하는 PCR 방법이다. 유전자 특이적 및 구조 특이적 PCR 방법은 변형된 유전자 및 구조가 같은 형질전환 운반체가 이용됐을 때, 유전자 변형체의 계통 간의 구별에 어려움이 있다는 단점을 가지고 있다(Taverniers et al. 2005; Pan et al. 2006). 이러한 단점을 해결하기 위해 최근에는 계통 특이적 PCR 방법이 이용되고 있으며, 이는 식물 게놈 내 도입유전자가 삽입된 부위의 인접부위의 염기서열을 바탕으로 상보적인 프라이머를 작성하여 유전자 변형 작물을 동정하는 방법으로, 식물체 내 삽입된 인접서열의 분석 및 도입유전자의 카피수의 확인이 선행되어야 하는 번거로움이 있으나, 검사하고자 하는 계통의 특정 염기부위를 이용하기 때문에 동일한 형질전환 운반체를 갖는 계통이더라도 상보적 염기서열을 갖는 계통만을 특이적으로 구분하여 검출할 수 있다. 이는 동일 운반체로 형질전환이 이루어져도 식물체 게놈 내에 삽입되는 위치가 달라지기 때문에 특이 프라이머에 의한 비목적 계통은 PCR 증폭이 이루어지지 않는다는 점을 이용한 것이다. 따라서 이 방법은 유전자 변형 개체의 후대 교배로 다형질을 갖는 개체에서 모본 계통을 쉽게 파악할 수 있고, 유전자 변형 농산물을 비교적 안정적으로 검정할 수 있는 장점을 가지고 있다(Berdal and Holst-Jensen 2001; Pan et al. 2006). 상기 정성 PCR법은 단백질 검출 방법과는 달리 도입유전자를 특이적으로 증폭하는 기술을 바탕으로 하기 때문에 원료 농산물뿐만 아니라 가공품에서도 안정적으로 검출이 가능하다.
유전자 변형 농산물의 정량 분석법으로 최근 실질적으로 이용되고 있는 검출법은 실시간 PCR(real-time PCR)법을 들 수 있다. 실시간 PCR법은 특이 프라이머와
형광물질이 연결된 프로브를 이용하여 PCR 증폭 시 프로브로부터 형광체가 해리되어 형광 발색의 양을 측정하는 원리이다. 실시간 PCR법은 정성 PCR법과 같이 도입유전자의 특정 DNA를 검출하는 점은 동일하나, 식물의 내재유전자를 바탕으로 검출 유전자의 비를 측정하기 때문에 정량적으로 도입유전자의 양을 분석할 수 있는 장점이 있다. 실질적으로 실시간 PCR법은 유전자 변형 농산물의 혼입률 및 식품 가공품의 유전자 변형체의 정량 검정에 이용되고 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 어덟 쌍의 프라이머 쌍은 공통의 PCR 조건을 갖고 있어 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하는 것이 가능하다. 구체적인 PCR 조건으로는 90~95℃에서 5~20분간 열처리하여 초기 변성시킨 후, 90~95℃에서 10초~2분간 변성 단계(denaturation); 56~62℃에서 10초~2분간 어닐링 단계(annealing); 70~75℃에서 10초~2분간 합성 단계(extension)를 총 10~40회 반복하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 상기 반응 온도 및 반응 시간 조건은 당업자가 적절하게 변형하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 95℃에서 10분간 열처리하여 초기 변성시킨 후, 95℃에서 30초간 변성 단계; 56~61℃에서 40초간 어닐링 단계; 72℃에서 1분간 합성 단계를 총 35회 반복하고 72℃에서 5분 반응시킬 수 있다.
다중-PCR 증폭 산물의 크기의 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 여덟 쌍의 프라이머 쌍은 서로 다른 크기의 PCR 증폭 산물을 형성하므로, 유전자 변형 작물 유무를 보다 용이하게 확인할 수 있다.
염기서열 분석 방법으로는 당업계에 공지된 염기서열 분석방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 그 서열 부분을 직접 결정하는 방법으로서 자동염기서열분석기를 사용하거나 생거법(sanger sequencing) 또는 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유전자 변형 면화를 검정하는 단계에서, 상기 검정은 유전자 변형을 위해 도입된 유전자의 계통을 확인하는 것일 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트는 "계통 특이 프라이머"이므로, 교배에 이용된 유전자 변형 모본과 동일한 유전자로 형질전환된 계통들로부터 후대 교배종을 정확하게 구분할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 8에 기재한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 유전자 변형 면화를 계통 특이적으로 검출할 수 있다.
상기 유전자 변형 작물을 검출하는 방법은 작물 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 이 기술 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 PCR 방법이 바람직하다. 앞서 설명한 바와 같이, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다.
상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 P 또는 S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
상기 증폭 산물을 검출하는 방법은 이 기술 분야에 널리 알려져 있다. 상기
증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측
정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 내재유전자란 특정 작물의 게놈에 자연적으로 존재하고 전체 게놈 중에 단일 카피(single copy)로 존재하여 특정작물의 유전자 분석에서 특정 작물의 존재를 알려주는 양성 대조구로 이용될 수 있는 유전자이며, 또한 여타 근연종에 존재하지 않는 종특이적 유전자로써 음성 대조구로 사용될 수 있는 유전자를 말한다.
본 발명에서는 이에 제한되지는 않으나, 내재유전자로 sadI 유전자를 이용하는 것이 바람직하다.
현재 국내 수입 승인된 식품 및 사료용 GM면화 품목은 2015년 현재 총 25종으로 단일품목 또는 단일품목들의 후대교배종(staked GM) 면화로 이루어져 있고, 단일품목에는 MON88701, Cot102, Mon88913, Mon531, Mon1445, Event 281, Event 3006, LLcotton25, Mon15985, GHB614, GHB119, T304-40, C67B로 13종이 있다. 본 발명에서는 이들 단일품목 중 최대한 많은 품목을 이벤트 특이적으로 동시에 검출하는 다중-PCR 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 도 1과 같이 총 7종(Mon1445, LL25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event3006 및 Event281)에 대하여 도입유전자와 삽입부위 게놈염기 사이의 검출이 가능하도록 프라이머 쌍을 제작하였으며 면화 작물 확인을 위해서 내재유전자인 sadI에 대한 검출 프라이머 쌍을 선발함으로써, 총 여덟 쌍의 프라이머 쌍을 선발하여 8중 다중(octaplex)-PCR 분석이 가능하도록 개발하였다.
이후, 본 발명의 프라이머 세트를 구성하는 여덟 쌍의 프라이머 쌍에 대한 검출 특이성을 분석하여 사용 가능성을 확인하였으며, 다중-PCR 조건에서 검출 특이 프라이머의 검출한계(LOD)를 측정한 결과, 0.1% 이상의 농도에서 반응 산물을 나타냄을 확인하였다(도 7).
일반적으로 전 세계의 표시제 농도는 국내는 3%로 하고 있으며 유럽연합이 가장 낮은 0.9%로 하고 있다. 본 발명에 따른 유전자 변형 면화 검출 다중-PCR은 표시제 범위보다 현저히 낮은 농도의 유전자 변형 작물 DNA 시료를 확인할 수 있어 유전자 변형 작물을 무난하게 검출할 수 있으므로, 유전자 변형 면화의 사후 환경 모니터링의 안전관리에 효과적으로 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 이용한 다중-PCR은 국내 수입 승인된 단일품목의 과반수를 동시에 검출할 수 있으므로, GM작물 환경 모니터링 기술로써 효과적으로 적용이 가능하다.
본 발명에 따른 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 이용한 다중-PCR은 국내유통 중인 유전자 변형 면화 7종을 동시에 효과적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 이벤트 특이 프라이머 쌍으로 개발되었으므로, 다른 계통들 또는 작물들이 혼합된 상태에서도 특이적으로 해당 품목을 검출할 수 있다. 따라서, 유전자 변형 면화의 비의도적인 환경 방출에 따른 모니터링 및 사후 이력 추적에 적용이 가능하며, 국내 수입 유전자 변형체의 환경위해성 안전관리를 효과적으로 수행할 수 있다.
도 1은 국내에 수입 승인된 7종의 유전자 변형 면화 품목에 대한 다중-PCR 프라이머 검출 위치를 나타낸 도이다.
도 2는 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍의 PCR 및 다중-PCR 결과이다; M: 1Kb DNA marker, B: blank, 1: 10Mon14-1 및 10Mon14-2 프라이머 쌍, 2: LL25L02-1 및 LL25L01-2 프라이머 쌍, 3: 25Mon53-1 및 25Mon53-2 프라이머 쌍, 4: 36Mon15-1 및 36Mon15-2 프라이머 쌍, 5: 45Mon89-1 및 45Mon89-2 프라이머 쌍, 6: 36event05-1 및 36event05-2 프라이머 쌍, 7: 28event01-1 및 28event01-2 프라이머 쌍, 8: cotSad03-1 및 cotSad04-2 프라이머 쌍, P: 8종의 프라이머 쌍 혼합액(10Mon14-1, 10Mon14-2, LL25L02-1, LL25L01-2, 25Mon53-1, 25Mon53-2, 36Mon15-1, 36Mon15-2, 45Mon89-1, 45Mon89-2, 36event05-1, 36event05-2, 28event01-1, 28event01-2, cotSad03-1 및 cotSad04-2 프라이머).
도 3은 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍을 이용한 PCR의 증폭 산물에 대한 염기서열 분석결과이다; 왼쪽부터 세로로 Mon1445, LLcotton25, Mon531, Mon15985, sadI.
도 4는 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍을 이용한 PCR의 증폭 산물에 대한 염기서열 분석결과이다; 왼쪽부터 세로로 Mon88913, Event 3006-210-23, Event 281-24-236.
도 5는 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍의 작물에 대한 검출 특이성 결과이다; M: 1Kb DNA marker, ①: 벼, ②: 옥수수, ③: 콩, ④: 캐놀라, ⑤: 면화, ⑥: 밀, 1: 10Mon14-1 및 10Mon14-2 프라이머 쌍, 2: LL25L02-1 및 LL25L01-2 프라이머 쌍, 3: 25Mon53-1 및 25Mon53-2 프라이머 쌍, 4: 36Mon15-1 및 36Mon15-2 프라이머 쌍, 5: 45Mon89-1 및 45Mon89-2 프라이머 쌍, 6: 36event05-1 및 36event05-2 프라이머 쌍, 7: 28event01-1 및 28event01-2 프라이머 쌍, 8: cotSad03-1 및 cotSad04-2 프라이머 쌍.
도 6은 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍의 온도별 다중-PCR 특이성 결과이다; M: 1Kb DNA marker, B: 1: 56℃, 2: 58℃, 3: 59℃, 4: 60℃, 5: 61℃, 6: 62℃. 8종의 프라이머 쌍 혼합액(10Mon14-1, 10Mon14-2, LL25L02-1, LL25L01-2, 25Mon53-1, 25Mon53-2, 36Mon15-1, 36Mon15-2, 45Mon89-1, 45Mon89-2, 36event05-1, 36event05-2, 28event01-1, 28event01-2, cotSad03-1 및 cotSad04-2 프라이머)에 대한 다중-PCR 결과.
도 7은 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍 혼합액에 대한 작물의 검출 특이성 결과이다; M: 1Kb DNA marker, B: blank, P: positive control (10Mon14-1, 10Mon14-2, LL25L02-1, LL25L01-2, 25Mon53-1, 25Mon53-2, 36Mon15-1, 36Mon15-2, 45Mon89-1, 45Mon89-2, 36event05-1, 36event05-2, 28event01-1, 28event01-2, cotSad03-1 및 cotSad04-2 프라이머 혼합액), ①: 벼, ②: 옥수수, ③: 콩, ④: 캐놀라, ⑤: 면화, ⑥: 밀.
도 8은 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머를 이용한 다중-PCR의 검출한계를 분석한 도이다; M: 1Kb DNA marker, B: blank, 1: 10%, 2: 5%, 3: 3%, 4: 1%, 5: 0.5%, 6: 0.1%, 7: 0.05%, 8: non-GM cotton.
도 9는 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머를 이용한 다중-PCR을 사료 내 유전자 변형 면화 검정 결과이다; M: 1Kb DNA marker, B: blank, N: negative control(non-GM cotton), P positive control(GM cotton mixtures), 1-8: TMR cotton samples(전지면실).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 식물 재료 준비 및 DNA 추출
유전자 변형 면화를 검정하기 위하여, 유전자 변형 면화 단일품목 중 7종(Mon1445, LL25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event3006 및 Event281)의 표준물질(Certified Reference Material, CRM)(AOCS, 미국)을 구입하여 사용하였고, 대조구인 비유전자 변형(non-GM) 작물로 벼, 옥수수, 콩, 캐놀라, 면화 및 밀의 DNA를 이용하였다. 또한, 실제 검출방법으로의 적용 여부를 확인하기 위해서 섬유질배합사료에 이용되는 수입 전지면실을 분석하였다. 각 시료의 DNA 농도는 50 ng/㎕로 맞추어 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.
각 시료의 게놈 DNA는 각 분말 시료 100mg을 수득하여 DNA 추출키트(DNeasy Plant Mini Kit, Quiagen, 독일)에 포함된 시약과 키트의 방법에 따라 추출하였다.
< 실시예 2> 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 제작
국내에 수입승인된 유전자 변형 면화 단일품목 중 Mon1445, LL25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event3006 및 Event281에 대한 공지된 유전자정보를 수집하고, 이의 도입유전자와 삽입부위 게놈염기 사이의 검출이 가능하도록 이벤트 특이 프라이머 쌍을 제작하였다(도 1). 또한, 면화 작물임을 확인하기 위해서 면화 내재유전자인 sadI(GenBank AJ132636 서열)에 대한 특이 프라이머 쌍을 제작하였다.
이에, 유전자 변형 면화 유전자 7종에 대한 이벤트 특이 프라이머 쌍 및 면화 내재유전자에 대한 특이 프라이머 쌍을 포함하는 총 8종의 프라이머 쌍이 제작되었다(표 1).
프라이머 명 염기서열(5'-3') 크기(bp) 검출 품목 농도(μM)
10Mon14-1 GAAACCCTTGCAAATGCTG (서열번호 1) 100
 Mon1445 0.7
10Mon14-2 TGCATCATTTCTCAGCCAAG (서열번호 2)
LL25L02-1 GGCATGCAAGCTTAGATCCAT (서열번호 3) 161 LLcotton25
 0.5
LL25L01-2 TGTAGATCAAGATGCGAGCAA (서열번호 4)
25Mon53-1 CCAAAGAGAAACCCCAATCA (서열번호 5) 255 Mon531
 0.5
25Mon53-2 TGCTGTGCACACGTTTGTCT (서열번호 6)
36Mon15-1 GTTTTATGCCATGCGTAGCC (서열번호 7) 363 Mon15985
 0.3
36Mon15-2 CAACGATGGCCTTTCCTTTA (서열번호 8)
45Mon89-1 TTAGCTGAAAATGGCCTCCA (서열번호 9) 454 Mon88913
 0.5
45Mon89-2 GCTTTTGGCTAATGGTTTGG (서열번호 10)
36event05-1 TGTCGTTTTGTTCCGGTCAT (서열번호 11) 597 Event
3006-210-23		 0.5
36event05-2 CCTTCATGCATAGCACCTCA (서열번호 12)
28event 01-1 CATGCACTGGATTTTCATCG (서열번호 13) 728 Event
281-24-236		 0.5
28event 01-2 GCACTTCAAACAAGTGTGACAA (서열번호 14)
cotSad03-1 AGCTTAGGGAAAGGGCAAAG (서열번호 15) 995 sadI
 0.3
cotSad04-2 TCCAACTGAATGGGACACTG (서열번호 16)
< 실시예 3> 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머를 이용한 PCR 및 다중(multiplex)-PCR 분석
실시에 2에서 제작한 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 변형 면화 7종(Mon1445, LL25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event3006-210-23 및 Event281-24-236)에 대한 PCR을 수행하였다. PCR 수행 시 다중 PCT 프리믹스(Multiplex PCR PreMix; Hotstart Top DNA polymerase, Reaction buffer, 및 dNTPs 포함, Bioneer, 한국)를 사용하여 시료를 제조하였다. 시험구로 단일 프라이머 쌍 각각에 대한 8종의 시료를 제조하기 위해 시료당 반응액(Reaction buffer) 총 20μL에 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머 쌍 각각 10 μM와 실시예 1에서 추출한 주형 DNA 50 ng/μL를 첨가하였다. 양성 대조구로 다중-PCR(8중(octaplex)-PCR)을 위한 프라이머 쌍 혼합 시료를 제조하기 위해 동일한 양의 반응액 및 동일한 농도의 주형 DNA에 8종의 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머 쌍은 각각 표 1에 표기한 농도로 혼합하였다. 시료의 PCR 반응은 유전자증폭기(TProfessional hermocycler, Biometra, 독일)를 이용하여, 초기 95℃에서 10분간 실시한 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 40초, 72℃에서 1분으로 총 35회(cycle) 반복하였으며 마지막 단계는 72℃에서 5분간 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동 장치를 이용하여 2% 아가로스 겔(agarose gel) 상에 전개한 후 자외선(UV) 하에서 확인하였다.
또한, PCR 결과 증폭 산물이 유전자 변형 면화 검출 품목의 유전자 위치로부터 형성되었는지 확인하기 위해 증폭 산물에 대한 염기서열 분석(sequencing)을 수행하였다.
그 결과, 각 유전자 변형 면화 검출 품목별로 예상되는 유전자 위치에서 PCR 증폭 산물이 형성되었음을 확인하였다(도 2). Mon1445 품목에 대한 10Mon14-1(서열번호 1) 및 10Mon14-2(서열번호 2) 프라이머 쌍은 100bp, LLcotton25 품목에 대한 LL25L02-1(서열번호 3) 및 LL25L01-2(서열번호 4) 프라이머 쌍은 161bp, Mon531에 대한 25Mon53-1(서열번호 5) 및 25Mon53-2(서열번호 6) 프라이머 쌍은 255bp, Mon15985에 대한 36Mon15-1(서열번호 7) 및 36Mon15-2(서열번호 8) 프라이머 쌍은 363bp, Mon88913에 대한 45Mon89-1(서열번호 9) 및 45Mon89-2(서열번호 10) 프라이머 쌍은 454bp, Event 3006-210-23에 대한 36event05-1(서열번호 11) 및 36event05-2(서열번호 12) 프라이머 쌍은 597bp, Event 281-24-236에 대한 28event01-1(서열번호 13) 및 28event01-2(서열번호 14) 프라이머 쌍은 728bp 및 내재유전자인 sadI에 대한 cotSad03-1(서열번호 15) 및 cotSad04-2(서열번호 16) 프라이머 쌍은 995bp에서 정확하게 증폭 산물을 형성하였다. 각 프라이머 쌍들을 혼합하여 다중-PCR을 수행한 양성 대조구에서는 목적한 각 증폭 산물이 겹치지 않고 사다리꼴로 뚜렷하게 형성되는 것을 확인하였다.
또한, PCR 증폭 산물에 대한 염기서열 분석 결과, 모든 증폭 산물이 목적유전자 부위와 동일한 염기서열인 것으로 분석되어, 각 목적 염기서열로부터 증폭되었음을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4).
따라서, 본 발명의 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍은 각 검출 품목에 대한 검출이 가능함을 확인하였으며, 특히, 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종은 프라이머 제작 의도대로 각 검출 품목의 이벤트 특이적인 부위를 정확하게 검출함을 확인하였다.
< 실시예 4> 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머를 이용한 PCR 의 반응 특이성 검정
실시에 2에서 제작한 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍의 반응 특이성을 확인하기 위해, 사료 원료로 많이 이용되는 벼, 옥수수, 콩, 캐놀라, 면화 및 밀의 총 6종 작물에 대해 단일 프라이머 쌍 각각을 이용하여 실시예 3의 시험구 조건과 동일하게 PCR을 수행하였다. 주형 DNA는 실시예 1에서 추출한 50 ng/μL의 DNA를 이용하였다.
그 결과, 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종은 각 작물에 대하여 어떠한 유사 밴드도 형성하지 않는 것으로 나타났으며, 면화 내재유전자의 검출 프라이머 쌍인 cotSad03-1(서열번호 15) 및 cotSad04-2(서열번호 16) 프라이머 쌍만 면화 작물의 목적 사이즈인 1kb에서 뚜렷한 밴드를 형성하였다(도 5).
따라서, 본 발명의 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍을 개별적으로 이용하여 사료 등과 같이 여러 작물들이 혼합된 시료 내 목적유전자를 검출할 경우, 유사 증폭 산물을 형성하지 않음을 확인하였다.
< 실시예 5> 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머를 이용한 다중- PCR 의 반응 온도 검정
실시에 2에서 제작한 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍을 혼합하여 다중-PCR 수행을 통해 유전자 변형 면화 7종(Mon1445, LL25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event3006-210-23 및 Event281-24-236)에 대한 다중-PCR을 수행하였다. 다중-PCR은 실시예 3의 양성 대조구 조건과 동일하게 수행하였으며, 주형 DNA는 실시예 1에서 추출한 50 ng/μL의 DNA를 이용하였다. PCR 온도 조건은 초기 95℃에서 10분간, 이후 95℃에서 30초간 수행까지는 동일하고, 어닐링(annealing) 단계를 각각 다른 온도에서(56, 58, 59, 60, 61 및 62℃)에서 40초간 수행한 후, 다시 72℃에서 1분으로 총 35회(cycle) 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 단계를 수행하는 것은 동일하였다.
그 결과, PCR 어닐링(annealing) 단계의 가장 일반적인 온도 범위대인 56~61℃에서 각각의 목적유전자를 뚜렷하게 검출하는 것으로 나타났으나, 62℃ 조건에서는 Mon531 검출 반응이 약간의 감도 감소를 나타내었다(도 6).
따라서, 본 발명의 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍을 혼합하여 다중-PCR을 수행 시 온도 조건을 달리하는 경우에도, 이에 따른 영향을 받지 않고 목적유전자를 정확하게 검출함을 확인하였다.
< 실시예 6> 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머를 이용한 다중- PCR 의 반응 특이성 및 반응 온도 검정
실시에 2에서 제작한 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍을 혼합하여 다중-PCR 수행을 통해 벼, 옥수수, 콩, 캐놀라, 면화 및 밀의 총 6종 작물에 대한 반응 특이성을 확인하고, 동시에 PCR 온도 조건을 달리하였을 때의 반응을 확인하였다. 다중-PCR은 실시예 3의 양성 대조구 조건과 동일하게 수행하였으며, 주형 DNA는 실시예 1에서 추출한 50 ng/μL의 DNA를 이용하였다. PCR 온도 조건은 초기 95℃에서 10분간, 이후 95℃에서 30초간 수행까지는 동일하고, 어닐링(annealing) 단계를 각각 다른 온도에서(56, 58, 60 및 61℃)에서 40초간 수행한 후, 다시 72℃에서 1분으로 총 35회(cycle) 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 단계를 수행하는 것은 동일하였다.
그 결과, 실시예 3에서 단일 프라이머 쌍(시험구)에 대한 PCR 수행 결과와 동일하게 각 작물에 대하여 어떠한 유사 밴드도 형성하지 않는 것으로 나타났으며, PCR 어닐링(annealing) 단계의 가장 일반적인 온도 범위인 56~61℃로 온도 조건을 달리하였을 때도 온도에 따른 차이 없이 동일하게 유사 검출이 없었다(도 7).
따라서, 본 발명의 유전자 변형 면화 이벤트 특이 프라이머 쌍 7종 및 면화 내재유전자 sadI 특이 프라이머 쌍을 혼합하여 다중-PCR을 수행 시 온도 조건을 달리하는 경우에도, 큰 차이 없이 재현성 있게 여러 작물들이 혼합된 시료 내 목적유전자를 검출하며 유사 증폭 산물을 형성하지 않음을 확인하였다.
< 실시예 7> 다중- PCR 의 검출한계(limit of detection, LOD ) 측정
유전자 변형 작물 검정에 있어서 비의도적으로 시료 내 DNA가 미량으로 존재할 경우 검출에 어려움이 발생할 수 있으므로, 실제 검출가능한 농도 범위를 확인하고자 검출한계(LOD)를 확인하였다. 유전자 변형 면화 7종(Mon1445, LL25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event3006-210-23 및 Event281-24-236)에 대한 다중-PCR은 실시예 3의 양성 대조구 조건과 동일하게 수행하였으며, 주형 DNA는 실시예 1에서 추출한 50 ng/μL의 DNA를 이용하였다. 각 검출 품목 표준물질의 DNA 농도는 각각 10, 5, 3, 1, 0.5, 0.1, 0.05%로 달리하여 분석하였다.
그 결과, 0.5% DNA 농도에서 모든 목적유전자가 뚜렷하게 검출되었고 0.1% DNA 농도에서도 큰 차이 없이 목적유전자들의 증폭 산물을 확인하였으므로, 0.1% DNA 농도가 검출한계임을 확인하였다(도 8).
< 실시예 8> 다중- PCR 을 이용한 가축 사료 내 유전자 변형 면화 검정
본 발명에 따른 다중-PCR 기술의 실제적인 적용을 위해서, 국내에서 유통되고 있는 사료의 원료 혼합물인 수입 전지면실 시료에 대한 다중-PCR 검정을 수행하였다. 다중-PCR은 실시예 3의 양성 대조구 조건과 동일하게 수행하였으며, 주형 DNA는 실시예 1에서 추출한 50 ng/μL의 DNA를 이용하였다.
그 결과, 전지면실 시료 중에 포함된 검출 품목은 대부분 Mon531을 포함하고 있었으며, 이외에 Mon1445, Mon15985 및 Mon88913이 단일 또는 동시에 검출되어 단일품목 또는 후대교배종 품목의 유전자 변형 면화가 포함되어 있는 것으로 파악되었다(도 9).
본 발명에 따른 유전자 변형 면화 검출 다중-PCR은 다양한 유전자 변형 면화를 동시에 특이적으로 검출할 수 있고 낮은 농도의 시료에서도 유전자 변형 면화의 확인이 가능함을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 유전자 변형 면화 검출 다중-PCR은 유전자 변형 면화의 비의도적 환경 방출에 따른 환경 내 자생 유전자 변형 작물의 검출, 농업용 유전자 변형 작물 처리 사업장 및 사료 이용 농가의 주변 환경에 대한 확인, 유전자 변형 작물의 이력 추적 등에 효과적으로 이용될 수 있어, 환경 모니터링의 안전관리 기술로 적용가능하다.
<110> Republic of Korea <120> Event-specific Multiplex-PCR Primer Set for Detecting the Commercialized Genetically Modified Cotton and Kit comprising the same <130> P16R12D0618 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> primer_10Mon14-1 <400> 1 gaaacccttg caaatgctg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> primer_10Mon14-2 <400> 2 tgcatcattt ctcagccaag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> primer_LL25L02-1 <400> 3 ggcatgcaag cttagatcca t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> primer_LL25L01-2 <400> 4 tgtagatcaa gatgcgagca a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> primer_25Mon53-1 <400> 5 ccaaagagaa accccaatca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> primer_25Mon53-2 <400> 6 tgctgtgcac acgtttgtct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> primer_36Mon15-1 <400> 7 gttttatgcc atgcgtagcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> primer_36Mon15-2 <400> 8 caacgatggc ctttccttta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> primer_45Mon89-1 <400> 9 ttagctgaaa atggcctcca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> primer_45Mon89-2 <400> 10 gcttttggct aatggtttgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> primer_36event05-1 <400> 11 tgtcgttttg ttccggtcat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> primer_36event05-2 <400> 12 ccttcatgca tagcacctca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> primer_28event 01-1 <400> 13 catgcactgg attttcatcg 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> primer_28event 01-2 <400> 14 gcacttcaaa caagtgtgac aa 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> primer_cotSad03-1 <400> 15 agcttaggga aagggcaaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> primer_cotSad04-2 <400> 16 tccaactgaa tgggacactg 20

Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 서열번호 8으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 서열번호 12으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 서열번호 14으로 구성되는 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 쌍; 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 변형 작물은 유전자 변형 면화인 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 유전자 변형 면화는 Mon1445, LLcotton25, Mon531, Mon15985, Mon88913, Event 3006-210-23 및 Event 281-24-236로 이루어진 군에서 선택되는 것인 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트.
  4. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 유전자 변형 작물 검출용 키트.
  5. a) 유전자 변형 작물의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하는 단계;
    b) 상기 단계 a)의 게놈 DNA를 주형으로 제 1항의 유전자 변형 작물 검출용 프라이머 세트를 이용하여 다중-PCR(Multiplex-PCR)을 수행함으로써 유전자 변형 작물의 외래 도입유전자를 증폭하는 단계; 및
    c) 증폭된 외래 도입유전자의 일부를 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 유전자 변형 작물의 검출 방법.

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