JP6962593B2 - コシヒカリの判別方法 - Google Patents

Description

本発明は、コシヒカリの判別方法などに関する。

コシヒカリは昭和５４年以降４０年にわたりコメの作付面積１位を続け、現在でも全作付面積の約３分の１を占めるブランド品種である。そのため、表示義務のある精米・玄米にとどまらず、様々な加工食品等においても原材料として強調表示されており、その信頼性を担保するための品種判別技術が求められている。

これまでに開発されたイネの品種識別法としては、用いる分析技術の名称ごとに、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ法（特許文献１および２）、ＳＮＰ法（特許文献３および４）、ＳＳＲ法（特許文献５〜８）などが挙げられる。

一方、コメの品種判別方法については、ｍＰｉｎｇの挿入部位を利用する方法も報告されている（特許文献９および１０、非特許文献１）。ｍＰｉｎｇは、数あるトランスポゾンの一種である。通常、ｍＰｉｎｇは、４３０ｂｐのポリヌクレオチドであり、ゲノム中の挿入部位のＴＡＡ若しくはＴＴＡを複製してその挿入部位の両端に持つため、挿入がある場合には（４３０ｂｐ＋３）ｂｐ長くなることが知られている（下記を参照）。

特開２００１−０９５５８９号公報 特開２００５−０７３６５５号公報 特開２００４−２４８６３５号公報 特開２００９−２１９４９８号公報 特開平１０−０５７０７３号公報 特開２００４−０６５２５１号公報 特開２００７−０３７４６８号公報 特開２０１２−０５５２５３号公報 特開２０１４−２３０５２６号公報 特開２０１５−１３９４２５号公報

岸根雅宏・奥西智哉 ２０１４年、育種学研究、ｖｏｌ．１６、１３９−１４６

従来の品種識別法（特許文献１〜８）はいずれも、数個から数十のＤＮＡマーカーを用いて試料を解析し、得られた個々のＤＮＡ型を予め取得しておいた基準品種のＤＮＡ型に照合することで品種の特定を行っている。そのため、分析試料ごとに数個から数十のＤＮＡマーカー解析を行う必要があり、多大な時間・労力を要するなどの課題がある。

また、ｍＰｉｎｇの挿入部位を利用するコメの品種判別方法（特許文献９および１０、非特許文献１）は、コシヒカリを判別対象としていない。

日本のイネ品種はいずれも近縁な関係に有る。特に、コシヒカリは、その近縁品種と極めて近縁な関係に有り、コシヒカリをその近縁品種と識別できるマーカーの同定は困難とされている。

このような背景の下、本発明は、コシヒカリをその近縁品種と判別可能なマーカーを利用するコシヒカリの判別方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、コシヒカリをその近縁品種と識別するためにはｍＰｉｎｇ挿入多型の挿入の有無の利用が有益であり、３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型の特定の組合せを利用することで、コシヒカリをその近縁品種から高度に判別可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。ｍＰｉｎｇの挿入部位を利用するコメの品種判別方法として、このような３箇所のｍＰｉｎｇ挿入部位の特定の組合せを利用する方法は報告されていない。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕被験試料について下記３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を分析することを含む、コシヒカリの判別方法：
（１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）；
（２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）；および
（３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）。
〔２〕ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘが、配列番号１の塩基配列において、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位に対応するものであり、
ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙが、配列番号２の塩基配列において、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位に対応するものであり、
ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚが、配列番号３の塩基配列において、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位に対応するものである、〔１〕の方法。
〔３〕被験試料が単一品種の試料であり、かつ、以下のように判別される方法である、〔１〕または〔２〕の方法：
（ｉ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認された場合
被験試料は、コシヒカリ由来である可能性が高いと判別され；
（ｉｉ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺのうちの少なくとも１箇所においてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認されなかった場合
被験試料は、コシヒカリ由来ではないと判別される。
〔４〕被験試料が複数品種の混合物を含む疑いのある試料であり、かつ、以下のように判別される方法である、〔１〕または〔２〕の方法：
（ａ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認された場合
（ａ１）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入無しが確認されなかったとき、被験試料は、コシヒカリにのみ由来する可能性が高いと判別され、
（ａ２）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺのうちの少なくとも１箇所においてｍＰｉｎｇ挿入無しが確認されたとき、被験試料は、コシヒカリとコシヒカリ以外の他品種の混合物またはコシヒカリ以外の他品種同士の混合物に由来する可能性が高いと判別され；
（ｂ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺのうちの少なくとも１箇所においてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認されなかった場合
被験試料は、コシヒカリ以外の他品種またはコシヒカリ以外の他品種同士の混合物に由来する可能性が高いと判別される。
〔５〕下記３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットを含む、コシヒカリの判別用キット：
（１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー；
（２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー；および
（３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー。
〔６〕プライマーセットがＰＣＲ用プライマーセットである、〔５〕の判別用キット。
〔７〕プライマーセットが下記プライマーを含む、〔５〕または〔６〕の判別用キット：
（１’）配列番号４の塩基配列からなるプライマー、および配列番号５の塩基配列からなるプライマー；
（２’）配列番号６の塩基配列からなるプライマー、および配列番号７の塩基配列からなるプライマー；ならびに
（３’）配列番号８の塩基配列からなるプライマー、および配列番号９の塩基配列からなるプライマー。

本発明によれば、迅速かつ簡便に、コシヒカリを他のコシヒカリ近縁品種を含む多品種から判別可能である。

図１は、ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）について、コシヒカリのｍＰｉｎｇ挿入部位（配列番号１の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示す図である。 図２は、ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）について、コシヒカリのｍＰｉｎｇ挿入部位（配列番号２の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示す図である。 図３は、ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）について、コシヒカリのｍＰｉｎｇ挿入部位（配列番号３の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示す図である。 図４は、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出するための２以上のプライマーの概要を示す図である。 図５は、農産物検査数量（注）上位１６品種の分析例を示す図である。（注）平成２９年産米確定値（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｆｆ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ／ｓｅｉｓａｎ／ｓｙｏｒｙｕ／ｋｅｎｓａ／ｋｏｍｅ／） 図６は、コシヒカリへの他品種混入試料の分析例を示す図である。コシヒカリのＤＮＡに７品種のＤＮＡを２５％混合し、分析した。

本発明は、コシヒカリの判別方法を提供する。本発明の方法は、被験試料について下記３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を分析することを含む。
（１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）；
（２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）；および
（３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）。
本明細書では、ｍＰｉｎｇ挿入部位ＸＹＺの上記位置は、日本米の基準品種である日本晴（全ゲノム配列が解読され公開済）における位置を参照して特定するものとする。

（１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）
ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘは、日本米の基準品種である日本晴には存在しないものの、日本米の基準品種である日本晴を基準とした場合に、第２染色体の２８，９４８，５３４位と２８，９４８，５３５位のヌクレオチド残基との間に存在するｍＰｉｎｇ挿入多型である。図１に示される配列番号１の塩基配列は、日本晴におけるｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）（配列番号１の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示すものであるが、日本晴がコシヒカリを始めとする日本米の基準品種であることに照らすと、コシヒカリにおけるｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘの周辺塩基配列情報として活用することができる。

（２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）
ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙは、日本米の基準品種である日本晴には存在しないものの、日本米の基準品種である日本晴を基準とした場合に、第４染色体の３１，９９７，４２０位と３１，９９７，４２１位のヌクレオチド残基との間に存在するｍＰｉｎｇ挿入多型である。図２に示される配列番号２の塩基配列は、日本晴におけるｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第４染色体３１，９９７，４２０位）（配列番号２の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示すものであるが、日本晴がコシヒカリを始めとする日本米の基準品種であることに照らすと、コシヒカリにおけるｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘの周辺塩基配列情報として活用することができる。

（３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）
ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚは、日本米の基準品種である日本晴には存在しないものの、日本米の基準品種である日本晴を基準とした場合に、第１０染色体の２０，９１８，１８８位と２０，９１８，１８９位のヌクレオチド残基との間に存在するｍＰｉｎｇ挿入多型である。図３に示される配列番号３の塩基配列は、日本晴におけるｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）（配列番号３の塩基配列中、下線を付した１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位）およびその隣接部位（それぞれ１ｋｂ）を示すものであるが、日本晴がコシヒカリを始めとする日本米の基準品種であることに照らすと、コシヒカリにおけるｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘの周辺塩基配列情報として活用することができる。

本発明の方法で用いられる被験試料は、コメまたはその加工品由来のゲノムＤＮＡを含む、または含む可能性があるサンプルである。コメは、玄米または精米のいずれであってもよい。コメはまた、国産米または外国産米のいずれであってもよい。コメの加工品としては、例えば、炊飯米、加工米飯、みそ、米菓、米穀粉、包装もち、ビーフン、玄米茶、米粉パン、米粉麺、日本酒、ビールが挙げられる。被験試料はまた、単一品種の試料（例えば、コメ一粒単位の試料）、または複数品種の混合物を含む疑いのある試料（例えば、コメ複数粒単位の試料、コメの加工品）であってもよい。

ｍＰｉｎｇ挿入の有無の分析は、ＤＮＡの増幅反応、またはＤＮＡシーケンシングにより行うことができるが、簡便かつ迅速な分析のためには、ＤＮＡの増幅反応により分析することが好ましい。ＤＮＡの増幅反応としては、２以上のプライマーを用いたＤＮＡの増幅による検査が可能である限り特に限定されないが、例えば、非等温条件下での増幅反応、および等温条件下での増幅反応が挙げられる。非等温条件下での増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ法が挙げられる。等温条件下での増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）法、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。本発明では、ＤＮＡの増幅反応としては、ＰＣＲが好ましい。

一実施形態では、本発明の方法は、単一品種の試料を被験試料とすることができる。この場合、以下のように判別することができる。
（ｉ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認された場合
被験試料は、コシヒカリ由来である可能性が高いと判別され、
（ｉｉ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺのうちの少なくとも１箇所においてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認されなかった場合
被験試料は、コシヒカリ由来ではないと判別される。

別の実施形態では、本発明の方法は、複数品種の混合物を含む疑いのある試料を被験試料とすることができる。この場合、以下のように判別することができる。
（ａ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認された場合
（ａ１）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入無しが確認されなかったとき、被験試料は、コシヒカリにのみ由来する可能性が高いと判別され、
（ａ２）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺのうちの少なくとも１箇所においてｍＰｉｎｇ挿入無しが確認されたとき、被験試料は、コシヒカリとコシヒカリ以外の他品種の混合物またはコシヒカリ以外の他品種同士の混合物に由来する可能性が高いと判別され、
（ｂ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺのうちの少なくとも１箇所においてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認されなかった場合
被験試料は、コシヒカリ以外の他品種またはコシヒカリ以外の他品種同士の混合物に由来する可能性が高いと判別される。

上記別の実施形態について補足説明する。複数品種の混合物を含む試料の分析を前提にすると、１つのマーカーからは、「挿入有り」、「挿入無し」、「挿入有り無し両方」の３通りの結果が得られるため、３マーカーの組み合わせについては２７通りの結果が得られることになる。ここで、「挿入有り」とは、同時に挿入無しが検出されないことも意味する（「挿入無し」の場合も同様）。この場合、複数品種の混合物を含む疑いのある試料におけるｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺと判別結果との関係は、下表のとおりとなる。

ＤＮＡの増幅反応に用いられるプライマーセットは、以下を含むことができる：
（１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー；
（２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー；および
（３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー。

各ｍＰｉｎｇ挿入多型に対応するプライマーの個数は、採用されるＤＮＡの増幅反応により変動するが、例えば、２〜６個である（例えば、ＰＣＲでは２個である）。複数のプライマーは、予め混合されて、１個の容器に格納された形態にあってもよいが、予め混合されておらず、別個の容器に格納された形態にあってもよい。

プライマーを構成するヌクレオチド残基（標的部位にアニーリングする相補部分のヌクレオチド残基）の数は、プライマーが標的部位にアニーリングして、目的産物を特異的に増幅できる限り特に限定されず、例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、または２０個以上であってもよい。また、プライマーを構成するヌクレオチド残基の数は、例えば、５０個以下、４０個以下、または３０個以下であってもよい。

プライマーは、増幅産物の検出を容易に行うため、蛍光物質等の物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴが挙げられる。勿論、プライマーは、必ずしもこのような物質で標識される必要はない。例えば、ゲル電気泳動で増幅産物のサイズの差異を確認してもよい。また、ＬＡＭＰ法による検出では、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁を目視で確認することにより、増幅の有無を確認できる。このような場合、蛍光物質等の物質によるプライマーの標識は不要である。

以下、本発明の方法で好適に用いられる特定のプライマーセットについて詳述する。

（１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー
配列番号１の塩基配列において、ｍＰｉｎｇ挿入多型ＸにおけるｍＰｉｎｇ挿入領域は、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる領域である（図１）。したがって、ｍＰｉｎｇ挿入多型ＸにおけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（ｍＰｉｎｇの挿入の有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる（図４を参照）。

具体的には、ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘに対するプライマーセットとしては、以下のプライマー対を少なくとも含むプライマーの組合せ（例、ＰＣＲ用プライマー）が挙げられる：
１ａ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｂ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｃ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｄ）配列番号１の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｅ）配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｆ）配列番号１の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。

（２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー
配列番号２の塩基配列において、ｍＰｉｎｇ挿入多型ＹにおけるｍＰｉｎｇ挿入領域は、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる領域である（図２）。したがって、ｍＰｉｎｇ挿入多型ＹにおけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（ｍＰｉｎｇの挿入の有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる（図４を参照）。

具体的には、ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙに対するプライマーセットとしては、以下のプライマー対を少なくとも含むプライマーの組合せ（例、ＰＣＲ用プライマー）が挙げられる：
１ａ）配列番号２の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｂ）配列番号２の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｃ）配列番号２の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｄ）配列番号２の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｅ）配列番号２の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｆ）配列番号２の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。

（３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー
配列番号３の塩基配列において、ｍＰｉｎｇ挿入多型ＺにおけるｍＰｉｎｇ挿入領域は、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる領域である（図３）。したがって、ｍＰｉｎｇ挿入多型ＺにおけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（ｍＰｉｎｇの挿入の有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、ｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇの挿入の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる（図４を参照）。

具体的には、ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚに対するプライマーセットとしては、以下のプライマー対を少なくとも含むプライマーの組合せ（例、ＰＣＲ用プライマー）が挙げられる：
１ａ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｂ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｃ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｄ）配列番号３の塩基配列における１〜１０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｅ）配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｆ）配列番号３の塩基配列における１００１〜１４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号３の塩基配列における１４３１〜２４３０番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。

上述したプライマーセットを構成する各種プライマーにおける用語「均等な塩基配列」とは、イネの品種、特に、コシヒカリと日本晴における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列であることを意味する。したがって、所定の塩基配列に均等な塩基配列は、当該所定の塩基配列において数個（例えば１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１、２、３、４または５個）の塩基の修飾（例、置換、欠失、挿入、付加）を含む塩基配列であり得る。このような均等な塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、イネの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、あるいはイネの品種における上記標的ｍＰｉｎｇの挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、決定できる。

本発明はまた、本発明の方法で用いられる上述した各種プライマーセット、およびこのような各種プライマーセットを含むキットに関する。

本発明のキットは、増幅反応で用いられるタンパク質をさらに含んでいてもよい。このようなタンパク質としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例、ＬＡＭＰでは、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ）、制限酵素、リボヌクレアーゼＨ、ライゲース、ヘリカーゼおよびリコンビナーゼが挙げられる。本発明のキットはまた、蛍光試薬、ｄＮＴＰｓ等の基質、ＡＴＰ等の補酵素を含んでいてもよい。本発明のキットはさらに、コントロールとして用いることができるハウスキーピング遺伝子（例、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１）をコードするコントロールＤＮＡ、およびこのようなコントロールＤＮＡに対する２以上のプライマーを含んでいてもよい。本発明のキットはまた、ポジティブコントロール（例、コシヒカリのゲノムＤＮＡ）および／またはネガティブコントロール（例、コシヒカリ以外の品種のゲノムＤＮＡ、多品種のゲノムＤＮＡ）を含んでいてもよい。本発明のキットは、個々の容器（例、チューブ）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

１．ゲノム解析によるイネの国産品種のｍＰｉｎｇ挿入多型の同定
イネの国内品種（全１８６品種）のゲノムにおけるｍＰｉｎｇ挿入多型（全２２４箇所）を網羅的に解析したところ、全２２４箇所のうち３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型（ＸＹＺ）の全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入を確認することにより、１８６品種中５品種を除いて、いずれもコシヒカリと判別可能であることが明らかとなった（表１−１、１−２）。特に、うるち米の約８７％を占める上位２５品種（平成２９年産米検査数量）では、コシヒカリと同じ多型となる品種は存在しなかった（表１−１、１−２）。

ｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの情報は、以下のとおりである。
（１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ：第２染色体２８，９４８，５３４位におけるｍＰｉｎｇ挿入多型
（２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ：第４染色体３１，９９７，４２０位におけるｍＰｉｎｇ挿入多型
（３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ：第１０染色体２０，９１８，１８８位におけるｍＰｉｎｇ挿入多型
なお、上記位置は、日本米の基準品種である日本晴（全ゲノム配列が解読され公開済）における位置を参照して特定した。
ｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺ以外の２２１箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型の情報は、本発明で用いられないものであるため記載を省略する。

２．農産物検査数量上位１６品種の分析
農産物検査数量（注）上位１６品種について、ＰＣＲにより分析した。農産物検査数量上位１６品種は、コシヒカリ、ひとめぼれ、あきたこまち、ななつぼし、ヒノヒカリ、はえぬき、まっしぐら、ゆめぴりか、こしいぶき、つや姫、あさひの夢、きぬむすめ、きらら３９７、キヌヒカリ、つがるロマン、ふさこがね、である。
（注）平成２９年産米確定値（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｆｆ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ／ｓｅｉｓａｎ／ｓｙｏｒｙｕ／ｋｅｎｓａ／ｋｏｍｅ／）

ＰＣＲ条件は、以下である。

ＰＣＲに用いられたプライマーのヌクレオチド配列は、表３のとおりであった（３箇所の多型ＸＹＺの解析に用いられたプライマーのヌクレオチド配列のみ示す）。

その結果、コシヒカリを他の品種と判別することができた（図２）。

３．ＤＮＡ混入試料の分析
コシヒカリのＤＮＡに、７品種のＤＮＡを２５％混入させたＤＮＡ混入試料について、実施例２と同様にしてＰＣＲにより分析した。ここで用いた７品種は、はえぬき、ふさこがね、まっしぐら、ひとめぼれ、ゆめぴりか、ななつぼし、あきたこまち、であった。
その結果、全てのＤＮＡ混入試料において他品種のＤＮＡの混入を検出することができた（図３）。

本発明は、コシヒカリの判別に有用である。

Claims (5)

1. 被験試料（ただし、ミルキークイーン、てんこもり、フクヒカリ、きらりん、およびヤマヒカリからなる群より選ばれる１以上の品種を含む試料を除く）について下記３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を分析することを含む、コシヒカリの判別方法：
   （１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）；
   （２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）；および
   （３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）。
2. ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘが、配列番号１の塩基配列において、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位に対応するものであり、
   ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙが、配列番号２の塩基配列において、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位に対応するものであり、
   ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚが、配列番号３の塩基配列において、１００１〜１４３０番目のヌクレオチド残基からなる部位に対応するものである、請求項１記載の方法。
3. 被験試料が単一品種の試料であり、かつ、以下のように判別される方法である、請求項１または２記載の方法：
   （ｉ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺの全てにおいてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認された場合
   被験試料は、コシヒカリ由来である可能性が高いと判別され；
   （ｉｉ）３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型ＸＹＺのうちの少なくとも１箇所においてｍＰｉｎｇ挿入有りが確認されなかった場合
   被験試料は、コシヒカリ由来ではないと判別される。
4. 被験試料（ただし、ミルキークイーン、てんこもり、フクヒカリ、きらりん、およびヤマヒカリからなる群より選ばれる１以上の品種を含む試料を除く）について下記３箇所のｍＰｉｎｇ挿入多型におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマーから構成されるプライマーセットを含む、コシヒカリの判別用キット：
   （１）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｘ（第２染色体２８，９４８，５３４位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー；
   （２）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｙ（第４染色体３１，９９７，４２０位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー；および
   （３）ｍＰｉｎｇ挿入多型Ｚ（第１０染色体２０，９１８，１８８位）におけるｍＰｉｎｇ挿入の有無を検出し得る２以上のプライマー;であって
   プライマーセットが下記プライマーを含む：
   （１’）配列番号４の塩基配列からなるプライマー、および配列番号５の塩基配列からなるプライマー；
   （２’）配列番号６の塩基配列からなるプライマー、および配列番号７の塩基配列からなるプライマー；ならびに
   （３’）配列番号８の塩基配列からなるプライマー、および配列番号９の塩基配列からなるプライマー。
5. プライマーセットがＰＣＲ用プライマーセットである、請求項４記載の判別用キット。

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