CN104212880A - 基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法 - Google Patents

基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104212880A
CN104212880A CN201310313904.5A CN201310313904A CN104212880A CN 104212880 A CN104212880 A CN 104212880A CN 201310313904 A CN201310313904 A CN 201310313904A CN 104212880 A CN104212880 A CN 104212880A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
mon863
mediated isothermal
isothermal amplification
loop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310313904.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104212880B (zh
Inventor
黄昆仑
许文涛
闫兴华
翟百强
罗云波
徐瑗聪
商颖
董凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FUDEAN OF BEIJING TECHNOLOGY Co Ltd
China Agricultural University
Original Assignee
FUDEAN OF BEIJING TECHNOLOGY Co Ltd
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FUDEAN OF BEIJING TECHNOLOGY Co Ltd, China Agricultural University filed Critical FUDEAN OF BEIJING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201310313904.5A priority Critical patent/CN104212880B/zh
Publication of CN104212880A publication Critical patent/CN104212880A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104212880B publication Critical patent/CN104212880B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物检测试剂及方法，具体是指转基因玉米MON863的环介导等温扩增引物的设计及其环介导等温扩增检测试剂和方法。本发明针对MON863基因整合图谱中Cry3Bb1基因和tahsp17基因的连接区域设计一套引物，由两对引物构成，特异性好。检测方法包括基因组的提取、环介导等温扩增以及显色反应，操作简便、灵敏度高、反应快速、结果判定方便。另外本发明的试剂盒由引物、反应液、BstDNA聚合酶、显色剂等组成，利用该试剂盒检测MON863品系，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、肉眼判定结果等优点，为转基因植物检测提供了有效、快速的检测方法。

Description

基于LAMP的转基因玉米MON863基因快检试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测试剂及方法，基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,涉及一种转基因植物检测方法，具体涉及一种用于检测转基因玉米MON863特定基因Cry3Bb1和tahsp17的环介导等温扩增引物及其环介导等温扩增检测方法。
背景技术
MON863为孟山都公司产品，抗虫基因为Cry3Bb1，来自苏云金芽孢杆菌熊本亚种（B.thuringiensis subsp. Kumamotoensis）。Cry3Bb1蛋白对鳞翅目家族的昆虫具有抗性，由于公众对转基因食品安全性的质疑，各国设定了相应的限量标准。并且目前基于MON863品系的检测技术，主要集中在普通的定性及定量PCR方法和标准，尚无关于检测转基因玉米MON863品系特定位点的环介导等温检测技术。
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification method, LAMP）是Notomi等于2000年发明的一种新型的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件下（60-65℃）反应，在1h内即可完成核酸扩增反应，目的片段可以扩增109倍。该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增效率高、省时、操作简单等优点，在核酸检测方面具有明显优势。
本发明具有较高的检测灵敏度，最低检测限可达约4个单倍体基因组拷贝数，为转基因植物检测提供了一种快速的筛检方法。
发明内容
为了建立了一种针对于转基因玉米MON863的恒温检测方法，本发明的一个目的是提供了一套环介导等温扩增技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是建立了环介导等温扩增检测方法；根据检测方法实现了本发明的第三个目的，提供了使用上述检测用引物的试剂盒；本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异性好等特点，提供了一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MON863的检测方法。
本发明的第一个目的提供的用于MON863鉴定的环介导等温扩增的引物，包括两条外引物（MON863-F3/MON863-B3）、两条内引物（MON863-FIP/MON863-BIP）、两条环引物（MON863-LF/MON863-LB），该引物组对于检测MON863具有特异性。上述引物的核苷酸序列分别为：
MON863-F3：CCTACCAGACCTTCGACCTC
MON863-B3：GCTCCAACCTGAATGAGCA
MON863-FIP：TGGAGACGAAGGACTCAGCACCCCACCACGAACTCCAACAT
MON863-BIP：AGATCGAGTTCATCCCCGTCCACGTCCAAACGCATGCAGAA
MON863-LF：TCATTCTTGTCGCCCGAGAAGC
MON863-LB：GCTGTGATAGGAACTCTGATTGAA
本发明的第二个目的就是提供了一种转基因玉米MON863的检测方法，本发明采用以下技术方案：
1、样品的制备和模板的提取：将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB方法提取基因组。
2、环介导等温扩增：配置反应体系，加入DNA模板后，进行扩增反应。
3、环介导等温扩增产物的检测：
(1)电泳法：将LAMP扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳图呈现LAMP典型的阶梯状条带，则样品中有目的基因，若电泳图无任何条带则为阴性。
(2)染色法：加入SYBR Green I，观察颜色变化：在反应管中加入1μL SYBR Green I（1000X），混匀后观察颜色变化，若颜色变为绿色，则样品中有目的基因，若颜色仍保持SYBR Green I的橙色，则为阴性。
    本发明的第三个目的提供了快速诊断试剂盒，包括所述的引物组、上述检测方法的反应液、Bst DNA 聚合酶以及一张阳性定量标准曲线。
其中引物组由体积比为1:1:6:6:4:4的上下游外引物、上下游内引物与上下游环引物组成。反应液是由体积比为5:8:1:10的1x Thermopol buffer、1.4-2.0mM dNTP、2-8mM MgSO4、0.6-1.0M 甜菜碱组成。Bst DNA聚合酶每微升含3-10个活性单位。还有20X SYBR GREENⅠ荧光染料，稀释到1000X后可作为显色剂。另外还有一份定量标准曲线图，可以用来鉴定未知样品的浓度。
本发明所述的环介导等温扩增技术检测MON863具有以下优点：
1、反应快速，在加入环引物后，一般情况下在15-30min即可有大量的扩增产物生产，为了保证检测的准确度，本发明选择反应时长为40min，在此时间内即可将模板扩增109倍，该方法操作简便，适于转基因产品的快速检测。
2、特异性好，该技术对靶基因的6个区域设计引物，引物具有更高的特异性。
3、灵敏度高，该技术反应速度快，对于痕量目的基因可以达到很好的检测效果，灵敏度比PCR方法高一到两个数量级，该技术为转基因产品的监督检测提供了技术支持。
4、操作简单，适于基层使用。本发明设计了检测MON863的试剂盒，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层检测使用。
 
附图说明    
图1 引物特异性实验与引物酶切验证图，A从左至右分别为 DL2000 DNA marker, MON863, no template control (NTC), MON810, LY038, GA21, NK603, Bt176, Bt11, 3272, GTS-40-3-2 and MON863 non-GM parent
图2灵敏度实验加入SYBR Green I显色图，从左至右分别为105，104,103,102,10 pg基因组
图3灵敏度实验电泳图，从左至右分别为105，104,103,102,10 pg基因组
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 MON863检测方法的建立
（1）、通过日本荣岩株式会社环介导引物在线设计软件LAMP primer designing software primerexplorer V4.0 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html ) 针对MON863基因整合图谱中Cry3Bb1基因和tahsp17基因的连接区域设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成，将引物稀释为10μmol/L,转基因玉米粉MON863提取基因组,测定基因组的浓度并调整为105pg/μL,然后将此浓度的基因组10倍倍比稀释为104,103,102,10 pg/μL，制备成系列剃度浓度的标准DNA模板。
（2）、对影响环介导等温扩增技术的因素(dNTPs, 甜菜碱, 引物, Mg2+, Bst DNA聚合酶,温度, 反应时间)进行了优化，最终优化的LAMP扩增反应体系：1.4-2.0mM dNTP、2-8mM MgSO4、0.6-1.0M 甜菜碱，1.6μM外引物（MON863-F3,MON863-B3）、0.2μM 内引物（MON863-FIP,MON863-BIP），0.8μM 环引物（MON863-LF,MON863-LB）、3.2-8.0U Bst DNA聚合酶、1x Thermopol buffer(包含: 20mM Tris-HCl (pH 8.8  25℃), 10 mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100)。扩增反应程序：65℃反应40min，85℃放置3min，终止反应。
（3）、定量环介导等温扩增反应：制备了五个不同MON863基因组浓度（105，104，103，102，10pg/μL）的样品，以这些样品为模板进行扩增。
（4）结果检测：
4.1、电泳法：采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测LAMP产物，紫外下观察电泳条带。为为确定该引物扩增MON863的产物是正确的，将产物稀释后做酶切验证。在该套引物扩增的区域中含有EcoR I位点，经计算，酶切产物大小在226和162bp，酶切结果与预期相符（图1）。
4.2、染料法：反应结束后，直接向反应液中加入1μL 1000x SYBR Green I，混匀，肉眼观察颜色变化。有扩增反应的管颜色变为绿色，无扩增反应的管仍然保持SYBR Green I的橙色。由图2可见，与电泳图结果相符
4.3、定量测试的所有样品都可以被检测到（图3）
实施例2 MON863试剂盒的制备
本发明所提供的试剂盒由一套引物组、反应液、Bst DNA 聚合酶、显色剂以及一张阳性定量标准曲线等组成。
（1）其中所说的引物为：
MON863-F3：CCTACCAGACCTTCGACCTC
MON863-B3：GCTCCAACCTGAATGAGCA
MON863-FIP：TGGAGACGAAGGACTCAGCACCCCACCACGAACTCCAACAT
MON863-BIP：AGATCGAGTTCATCCCCGTCCACGTCCAAACGCATGCAGAA
MON863-LF：TCATTCTTGTCGCCCGAGAAGC
MON863-LB：GCTGTGATAGGAACTCTGATTGAA
（2）反应液是由体积比为5:8:1:10的1x Thermopol buffer、1.4-2.0mM dNTP、2-8mM MgSO4、0.6-1.0M 甜菜碱组成；其中1x Thermopol buffer含有20mM Tris-HCl (pH 8.8  25℃), 10 mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100
（3）Bst DNA聚合酶为Bst  DNA  polymerase ，每微升含3-10个活性单位；还有20X SYBR GREENⅠ荧光染料，稀释到1000X后可作为显色剂。
实施例3 试剂盒检测MON863
（1）、样品的制备和模板的提取：将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB方法提取基因组。
（2）、环介导等温扩增：在200μLPCR管中配置反应体系，引物混合物11μL，反应液12μL，Bst DNA聚合酶8U，DNA模板1μL，ddH2O1μL，盖紧管盖，65℃水浴锅中反应40min。
（3）、环介导等温扩增产物的检测：
3.1、电泳法：采用2%的琼脂糖凝胶电泳检测LAMP产物，紫外下观察电泳条带。
3.2、染料法：反应结束后，直接向反应液中加入1μL 1000x SYBR Green I，混匀，肉眼观察颜色变化。有扩增反应的管颜色变为绿色，无扩增反应的管仍然保持SYBR Green I的橙色。
（4）、环介导等温定量扩增：在200μLPCR管中配置反应体系，引物混合物11μL，反应液12μL，Bst DNA聚合酶8U，DNA模板1μL，20X SYBR Green I 1μL，盖紧管盖放于定量PCR中，65℃3min，50循环[65℃30s，65℃30s]。
（5）、环介导等温定量扩增产物的检测
将未知样品测得的Ct值代入在标准曲线方程中，算出样品的浓度。的根据2.725pg 的玉米基因组相当于1个单倍体基因组，算出样品中MON863D的拷贝数约为24个单倍体基因组拷贝数。

Claims (10)

1.转基因玉米MON863品系环介导等温扩增的检测用引物，其特征在于，所述引物为一套特征引物，一套引物由三对引物组成，一对引物为外引物，一对引物为内引物，一对引物为环引物，序列分别为： 
上游外引物，MON863-F3：CCTACCAGACCTTCGACCTC 
下游外引物，MON863-B3：GCTCCAACCTGAATGAGCA 
上游内引物，MON863-FIP：TGGAGACGAAGGACTCAGCA-CCCCACCACGAACTCCAACAT 
下游内引物，MON863-BIP：AGATCGAGTTCATCCCCGTCC-ACGTCCAAACGCATGCAGAA 
上游环引物，MON863-LF：TCATTCTTGTCGCCCGAGAAGC 
下游环引物，MON863-LB：GCTGTGATAGGAACTCTGATTGAA。 
2.一种转基因玉米MON863品系的检测方法，其特征在于，权利要求1的引物是以MON863的Cry3Bb1基因和tahsp17基因的连接片段为靶基因设计的，通过环介导等温扩增方法用权利要求1所述的检测引物对样品的DNA选择性扩增所述的靶基因片段，确认是否存在有扩增产物。 
3.根据权利要求2所述的转基因玉米MON863体系的检测方法，其特征在于，该检测方法具体为： 
（1）模板的提取：将样品磨成粉末，称100mg±10mg样品，用CTAB方法提取基因组。 
（2）环介导等温扩增体系包括：1.4-2.0mM dNTP、2-8mM MgSO4、0.6-1.0M甜菜碱，0.2-1.6μM外引物（MON863-F3,MON863-B3）、0.2μM内引物（MON863-FIP,MON863-BIP），0.8μM环引物（MON863-LF,MON863-LB）、 3.0-10.0U Bst DNA聚合酶、1x Thermopol buffer(包含:20mM Tris-HCl(pH8.825℃),10mM KCl,10mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,0.1%.Triton X-100)。 
（3）环介导等温反应产物的检测： 
利用电泳检测、荧光检测环介导反应产物是否有扩增产物。 
4.转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1所述的引物组、权利要求3所述的反应液、Bst DNA聚合酶以及一张阳性定量标准曲线。 
5.根据权利要求5所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，所述的引物组由体积比为1:1:6:6:4:4的上下游外引物、上下游内引物与上下游环引物组成。 
6.根据权利要求5所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，反应液是由体积比为5:8:1:10的1x Thermopol buffer、1.4-2.0mM dNTP、2-8mM MgSO4、0.6-1.0M甜菜碱组成。 
7.根据权利要求5所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，Bst DNA聚合酶每微升含3-10个活性单位。 
8.根据权利要求5所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括20X SYBR GREENⅠ荧光染料，稀释后可作为显色剂，以及一份定量标准曲线图。 
9.根据权利要求3所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速诊断试剂盒，其特征在于，普通定性环介导等温扩增反应程序：64℃反应40min。反应所使用的仪器为普通PCR，水浴锅以及恒温培养箱。 
10.根据权利要求3所述的转基因玉米MON863品系环介导等温扩增技术快速 诊断试剂盒，其特征在于，定量环介导等温扩增反应程序：64℃反应40min，85℃放置3min，终止反应。反应所使用的仪器为定量PCR。 
CN201310313904.5A 2013-07-24 2013-07-24 基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法 Expired - Fee Related CN104212880B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310313904.5A CN104212880B (zh) 2013-07-24 2013-07-24 基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310313904.5A CN104212880B (zh) 2013-07-24 2013-07-24 基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104212880A true CN104212880A (zh) 2014-12-17
CN104212880B CN104212880B (zh) 2016-06-08

Family

ID=52094784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310313904.5A Expired - Fee Related CN104212880B (zh) 2013-07-24 2013-07-24 基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104212880B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543363A (zh) * 2016-01-07 2016-05-04 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种Cry3Bb1实时荧光PCR检测方法及其试剂盒
CN106167831A (zh) * 2016-09-04 2016-11-30 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 检测枣疯病、槐树丛枝病或樱桃致死黄化植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用
CN110438203A (zh) * 2019-08-19 2019-11-12 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAN AH ET AL: "Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of MON863 maize based upon the 3"-transgene integration sequence", 《J CEREAL SCI》 *
兰青阔等: "环状等温扩增技术快速检测转基因玉米MON863的研究", 《玉米科学》 *
张隽等: "环介导等温扩增法检测转基因玉米MON89034", 《现代食品科技》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543363A (zh) * 2016-01-07 2016-05-04 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种Cry3Bb1实时荧光PCR检测方法及其试剂盒
CN106167831A (zh) * 2016-09-04 2016-11-30 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 检测枣疯病、槐树丛枝病或樱桃致死黄化植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用
CN110438203A (zh) * 2019-08-19 2019-11-12 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及应用
CN110438203B (zh) * 2019-08-19 2023-11-28 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种提高环介导等温扩增反应效率的方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104212880B (zh) 2016-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2015128103A (ru) Способы обнаружения днк для сайт-специфической нуклеазной активности
WO2011116313A1 (en) Methods, kits and compositions for detection of mrsa
Zahradnik et al. Detection of the 35S promoter in transgenic maize via various isothermal amplification techniques: a practical approach
CN105779611B (zh) 一种高通量的多重富集定量PCR(ME-qPCR)检测转基因作物元件及品系的方法
Huang et al. Development and application of a quantitative loop‐mediated isothermal amplification method for detecting genetically modified maize MON863
Wei et al. A high-throughput multiplex tandem PCR assay for the screening of genetically modified maize
CN104212880A (zh) 基于lamp的转基因玉米mon863基因快检试剂盒及检测方法
CN103773867B (zh) 转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
CN101343666A (zh) 一种抗虫转基因水稻多重pcr检测试剂盒及检测方法
CN104419708B (zh) 核酸和检测转基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
CN108456743A (zh) 与大豆开花期和成熟期相关的snp标记及其检测引物、方法与应用
CN104846081A (zh) 羽衣甘蓝红叶基因Re的SSR标记及应用
Zhai et al. Detection of two exogenous genes in transgenic cattle by loop-mediated isothermal amplification
Anandakumar et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for rapid diagnosis of Sugarcane yellow leaf virus in sugarcane
CN107988334B (zh) 口腔拭子直接pcr进行snp分型的方法
Akiyama et al. A screening method for the detection of the 35S promoter and the nopaline synthase terminator in genetically modified organisms in a real-time multiplex polymerase chain reaction using high-resolution melting-curve analysis
Porcar et al. A simple DNA extraction method suitable for PCR detection of genetically modified maize
Xiujie et al. Comparison of five endogenous reference genes for specific PCR detection and quantification of rice
CN107267503B (zh) 核酸和检测转基因水稻b1c893及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
CN103409414B (zh) 甘蔗基因组内标基因乙酰乳酸合酶基因pcr引物序列及扩增方法
CN112877460A (zh) 转基因成分高通量筛查方法、检测试剂盒及其应用
CN112029892A (zh) 一种快速鉴定转基因耐除草剂大豆zh10-6转化体特异性的方法
CN109957616A (zh) Y染色体微缺失检测的扩增组合物及试剂盒
CN109536633A (zh) 与玉米抗灰斑病主效QTL-qRgls2共分离的SNP标记及应用
CN104046701A (zh) 一种兔病毒性出血症病毒rt-lamp检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160608

Termination date: 20200724