CN104419708B - 核酸和检测转基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻EB7001S的旁侧序列的核酸。本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该方法包括：（1）使用针对如上所述的核酸的特异性引物对，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；（2）检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻EB7001S或者含有该核酸的衍生系。本发明还提供了一种试剂盒及该试剂盒的用途。通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻EB7001S或者含有该核酸的衍生系的检测。

Description

核酸和检测转基因水稻EB7001S及其衍生系的方法以及试剂 盒及其用途

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种核酸、一种检测转基因水稻的方法、一种试剂盒以及该试剂盒在检测转基因水稻中的应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa L.）作为世界上最重要的粮食作物之一，人们对其遗传转化和育种利用等方面进行了深入细致的研究。我国在水稻转基因研究领域取得了一系列重大成果，很多转基因水稻品种已被获准进行环境释放和生产性试验，2009年转Bt基因抗螟虫水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”获得生产应用安全证书，标志着我国转基因水稻具备了商业化生产的基本条件。为了平衡贸易利益、满足公众关切、控制潜在风险、加强工商监管，许多国家相继建立了转基因生物及其产品的安全评价和标识制度。我国现行对于农业转基因生物的管理依据的是国务院2001年5月23日颁布的《农业转基因生物安全管理条例》，以及农业部2002年1月5日发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》3个配套规章。为了实现对转基因生物及其产品的标识管理，保障转基因产品的有效监管和转基因产业的健康发展，对转基因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格要求。

国际农业生物技术应用服务组织（International Service for theAcquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA）统计报告显示，2012年全球28个国家种植转基因作物，种植面积达到1.703亿公顷，比2011年的1.6亿公顷增长了6%。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，自第1批转基因水稻植株1988年问世以来，含有各种优良性状，如抗虫、抗除草剂、抗菌、抗病毒或营养改良的转基因水稻相继研发成功。但各国对转基因水稻的商业化生产态度谨慎，1999年美国批准了2个抗除草剂转基因水稻品种LL62和LL06的商业化种植，2004年伊朗开始规模化种植抗虫转基因水稻，2009年中国农业部批准了华中农业大学的转Bt基因抗虫水稻华恢1号和Bt汕优63的生产应用安全证书，但至今还没有获得品种审定，即商业化生产许可。

转基因植物中外源基因在染色体上插入位置的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，是区别不同转化事件的唯一性标识，是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。如：王恒波等（转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测[J].基因组学与应用生物学,2010,(06):1177-83）建立了抗草甘膦转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性PCR检测方法。翟志芳等（转基因玉米LY038转化事件的特异性检测[J].农业生物技术学报,2011,(03):577-82.）采用修饰接头连接PCR获得了转基因玉米LY038的外源基因与玉米基因组之间的5'端侧翼序列，据此建立了转基因玉米LY038转化事件特异性定性检测方法。就水稻而言，目前国内获得了转基因水稻克螟稻（转Xa21基因水稻抗优97特异性检测方法的建立;中国植物病理学会2006年学术年会,中国湖南长沙,F,2006[C]）、Bt汕优63（CN101824411A）、科丰6号（转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立[D];中国农业科学院,2008）、两系早稻恢复系B2A68（201310068126.8：核酸和检测转基因水稻B2A68及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途）等的外源插入片段的旁侧序列，并建立了品系特异性的检测方法。

利用密码子优化的Epsps^#基因和Bar基因共同转化水稻，可以获得抗两种除草剂的水稻（参考专利申请201110270905.7，CN102994526A）。既抗除草剂草甘膦，又抗除草剂草铵膦的转基因水稻不育系不仅能方便除草，而且有利于实现机械化制种，还可以实现除草剂的交替使用、有效降低由于长期使用一种除草剂而导致杂草产生抗性的风险。本发明的发明人通过密码子优化的Epsps^#基因和Bar基因转化水稻，获得了一个转基因水稻新品系EB7001S。由于农杆菌转化水稻外源基因的插入具有随机性，转基因水稻品系EB7001S的外源基因在基因组中插入位置并不清楚，因此，难以实现对转基因水稻品系EB7001S的特异性检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸及检测含有该核酸的转基因水稻品系的方法。

转基因水稻新品系EB7001S已经在专利文献（CN102994526A）中公开，可以通过向中国科学院亚热带农业生态研究所来函索取的方式获得，中国科学院亚热带农业生态研究所保证从本发明的申请日起二十年内按照国家法规要求向公众发放转基因水稻新品系EB7001S。

由于外源基因的插入具有随机性，导致不同转化事件中，外源基因几乎没有机会在水稻基因组的同一位置插入，因此，每个独立的转化事件都具有唯一性，所以外源基因序列与水稻基因组序列拼接而成的旁侧序列也具有唯一性。因此，旁侧序列的核酸是一种全新的核酸分子，本发明的发明人得到了转基因水稻品系EB7001S外源基因旁侧序列的具体序列信息，由此建立的检测方法是检测转基因水稻品系EB7001S及含有该核酸衍生水稻系的特异性方法。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻EB7001S的旁侧序列的核酸，所述转基因水稻EB7001S的旁侧序列为SEQ ID No.1或SEQ IDNo.1的片段，SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的片段；其中，SEQ ID No.1的片段至少包括SEQID No.1的第149-190位的序列，优选至少包括SEQ ID No.1的第139-200位的序列，更优选至少包括SEQ ID No.1的第129-210位的序列；SEQ ID No.6的片段至少包括SEQ ID No.6的第1889-1930位的序列，优选至少包括SEQ ID No.6的第1879-1940位的序列，更优选至少包括SEQ ID No.6的第1869-1950位的序列。

另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系，该方法包括：

（1）使用针对如上所述的核酸的特异性引物，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；

（2）检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对扩增产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻EB7001S或者由EB7001S杂交产生的含有如上所述的核酸片段的衍生系。

另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物对和/或左侧特异性引物对，其中，所述右侧特异性引物对包括SEQ ID No.9所示的核酸和SEQ IDNo.10所示的核酸；所述左侧特异性引物对包括SEQ ID No.11所示的核酸和SEQ ID No.12所示的核酸。

另一方面，本发明还提供了如上所述的试剂盒在检测转基因水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。

通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻EB7001S或者由EB7001S杂交产生的含有该核酸片段的衍生系的检测。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为转基因水稻EB7001S所用载体的T-DNA区域结构及引物位置示意图。

图2为转基因水稻EB7001S通过hiTail-PCR扩增得到的T-DNA右边界侧的旁侧序列片段电泳图。M：1Kb plus DNA marker；1：EB7001S的TAIL-PCR第2级扩增产物（引物对AC1/RB-1b）；2：EB7001S的TAIL-PCR第3级扩增产物（引物对AC1/RB-2b）；3：非转基因对照7001S的TAIL-PCR第2级扩增产物（引物对AC1/RB-1b）；4：非转基因对照7001S的TAIL-PCR第3级扩增产物（引物对AC1/RB-2b）。

图3为通过LD-PCR方法获得的转基因水稻EB7001S中T-DNA左边界旁侧序列片段回收后的电泳图。M：1Kb plus DNA marker；1：EB7001S基因组DNA的LD-PCR产物（引物对LB1-F/LB1-R）。

图4为外源基因在水稻染色体上的插入位点及其上下游基因分布图。

图5为转基因水稻EB7001S中T-DNA右边界侧的旁侧序列特异性引物对RB-F/RB-R检测电泳图。M：1Kb plus DNA marker；B：空白对照；1、3、5、7、9：转基因水稻EB7001S、CD083、B2A4008S、B2A68、B88S；2、4、6、8：非转基因对照7001S、吉梗88、4008S、D68。

图6为转基因水稻EB7001S中T-DNA左边界侧的旁侧序列特异性引物对LB2-F/LB2-R检测电泳图。M：150bp DNA Ladder；1、3、5、7、9：转基因水稻EB7001S、CD083、B2A4008S、B2A68、B88S；2、4、6、8、10：非转基因对照7001S、吉梗88、4008S、D68。P88S。

图7为右边界特异性引物对退火温度优化结果。M：1Kb plus DNA marker；1：51.0℃；2：51.3℃；3：52.1℃；4：53.2℃；5：54.5℃；6：55.8℃；7：57.2℃；8：58.5℃；9：59.8℃；10：60.9℃；11：61.7℃；12：62.0℃。

图8为左边界特异性引物对退火温度优化结果。M：1Kb plus DNA marker；1：51.0℃；2：51.3℃；3：52.1℃；4：53.2℃；5：54.5℃；6：55.8℃；7：57.2℃；8：58.5℃；9：59.8℃；10：60.9℃；11：61.7℃；12：62.0℃。

图9为右边界特异性引物对灵敏度检测结果。M：150bp DNA Ladder；CK：非转基因对照7001S基因组DNA；1,2,3：100%转基因水稻EB7001S基因组DNA；4,5,6：20%转基因水稻EB7001S基因组DNA；7,8,9：5%转基因水稻EB7001S基因组DNA；10,11,12：1%转基因水稻EB7001S基因组DNA；13,14,15：0.5%转基因水稻EB7001S基因组DNA；16,17,18：0.1%转基因水稻EB7001S基因组DNA。

图10为左边界特异性引物对灵敏度检测结果。M：150bp DNA Ladder；CK：非转基因对照7001S基因组DNA；1,2,3：100%转基因水稻EB7001S基因组DNA；4,5,6：20%转基因水稻EB7001S基因组DNA；7,8,9：5%转基因水稻EB7001S基因组DNA；10,11,12：1%转基因水稻EB7001S基因组DNA，13,14,15：0.5%转基因水稻EB7001S基因组DNA；16,17,18：0.1%转基因水稻EB7001S基因组DNA。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻EB7001S的旁侧序列的核酸，所述转基因水稻EB7001S的旁侧序列为SEQ ID No.1或SEQ IDNo.1的片段，SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的片段；其中，SEQ ID No.1的片段至少包括SEQID No.1的第149-190位的序列，优选至少包括SEQ ID No.1的第139-200位的序列，更优选至少包括SEQ ID No.1的第129-210位的序列；SEQ ID No.6的片段至少包括SEQ ID No.6的第1889-1930位的序列，优选至少包括SEQ ID No.6的第1879-1940位的序列，更优选至少包括SEQ ID No.6的第1869-1950位的序列。

另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系，该方法包括：

（1）使用针对如上所述的核酸的特异性引物对，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；

（2）检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对扩增产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻EB7001S或者由EB7001S杂交产生的含有如上所述的核酸片段的衍生系。

根据本发明的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No.1或SEQ IDNo.1的片段的特异性引物对。所述针对SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的片段的特异性引物对是指一条引物在SEQ ID No.1的1-169bp区域设计，另一条引物在170-2071bp区域设计，能够能扩增SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的片段所示的核酸、并产生特定大小目标条带的引物对，所述针对SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的片段的特异性引物对不能够扩增SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的片段所示的核酸以外的核酸或者扩增不能产生特定大小的目标条带。优选地，所述针对SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的片段的特异性引物对包括SEQ ID No.9所示的核酸和SEQ ID No.10所示的核酸；所述特异性引物对扩增产生的目的片段的长度为485bp。

根据本发明的方法，其中，当所述特异性引物对包括SEQ ID No.9所示的核酸和SEQ ID No.10所示的核酸时，优选情况下，PCR扩增的条件可以包括退火温度为56-61℃（图7）。

根据本发明的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No.6或SEQ IDNo.6的片段的特异性引物对。所述针对SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的片段的特异性引物对是指一条引物在SEQ ID No.6的1-1909bp区域设计、另一条引物在1910-2671bp区域设计，能够扩增SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的片段所示的核酸、并产生特定大小目标条带的引物对。所述针对SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的片段的特异性引物对不能够扩增SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的片段所示的核酸以外的核酸或者扩增不能产生特定大小的目标条带。优选地，所述特异性引物对包括SEQ ID No.11所示的核酸和SEQ ID No.12所示的核酸；所述特异性引物对扩增的目的片段的长度为629bp。

根据本发明的方法，其中，当所述特异性引物对包括SEQ ID No.11所示的核酸和SEQ ID No.12所示的核酸时，优选情况下，PCR扩增的条件包括退火温度为52-62℃（图8）。

当使用本发明提供的如上所述的特异性引物对对转基因水稻EB7001S及其衍生系进行检测时，所述特异性引物对对转基因EB7001S成分的最低检测限度可达到0.5%。因此，本发明提供的特异性引物对特别适用于对转基因水稻EB7001S及其衍生系的检测、监测及标识制度管理。

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物对和/或左侧特异性引物对，其中，所述右侧特异性引物对包括SEQ ID No.9所示的核酸和SEQ ID No.10所示的核酸；所述左侧特异性引物对包括SEQ ID No.11所示的核酸和SEQ ID No.12所示的核酸。

根据本发明的试剂盒，其中，优选地，所述试剂盒还包括阳性对照核酸，所述阳性对照核酸包括SEQ ID NO.1所示的核酸和/或SEQ ID NO.6所示的核酸。

根据本发明的试剂盒，其中，优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和耐高温DNA聚合酶。

本发明还提供了如上所述的试剂盒在检测转基因水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。

转基因水稻EB7001S所用载体的T-DNA区域结构及引物位置见图1，该载体由Epsps^#基因表达框和Bar基因表达框组成。本发明采用常规方法提取植物基因组DNA。利用hiTail-PCR和LD-PCR的方法，扩增、分离并延伸得到外源基因插入位点的右旁侧序列，如SEQ ID No.1所示，长度2071bp。利用LD-PCR方法分离得到的外源基因插入位点的左旁侧序列，如SEQ ID No.6所示，长度2671bp。

通过分析SEQ ID No.1发现，其中第1至第169位序列与所用载体右边界上游序列完全一致，说明是外源基因序列，第170至第2071位序列与已发表的水稻基因组第7号染色体上序列（NCBI【http://www.ncbi.nlm.nih.gov】登录号AP006451.3）的第88469至第90370位匹配，说明是受体水稻7001S自身的基因组序列。通过分析SEQ ID No.6发现，其第1至第1909位序列与水稻第7号染色体上的序列（AP006451.3）完全一致，说明该段序列来源于受体7001S的基因组序列，第1910至第2671位与载体左边界及CaMV35S终止子、Bar基因序列及35S启动子部分序列完全相同，说明该段序列来自外源基因。

根据T-DNA右旁侧序列（SEQ ID No.1）设计特异性引物对，其中一条引物根据SEQID No.1中第1至第169位序列设计，即是按照T-DNA右边界上游区域序列设计，另一条引物根据第170至第2071位序列设计，即按照插入位点处的水稻基因组序列设计。即该引物对能够特异性的扩增出具有部分外源基因序列和水稻基因组第7号染色体上序列的特异序列。优选的，本发明采用的正向引物为RB-F，序列如SEQ ID No.9所示，反向引物为RB-R，序列如SEQ ID No.10所示，利用该引物对进行PCR检测，只有转基因水稻EB7001S能获得长度为485bp的特异条带（图5）。引物对RB-F/RB-R对样品中转基因水稻EB7001S的成分的检测限度达到0.5%（图9）。

根据T-DNA左旁侧序列（SEQ ID No.6）设计特异性引物对，其中一条引物根据SEQID No.6中第1至第1909位序列设计，即参照插入位点旁边的水稻基因组序列设计，另一条引物根据第1910至第2671位序列设计，即按照T-DNA左边界上游序列设计。优选的，本发明采用的正向引物为LB2-F，序列如SEQ ID No.11所示，反向引物为LB2-R，序列如SEQ IDNo.12所示，利用该引物对进行PCR检测，只有转基因水稻EB7001S能获得长度为629bp的特异条带（图6）。引物对LB2-F/LB2-R对样品中转基因水稻EB7001S的成分的检测限度达到0.5%（图10）。

本发明首次获得了转基因水稻品系EB7001S的插入外源基因的左、右旁侧序列（外源基因在水稻染色体上的插入位点及其上下游基因分布如图4所示），并且利用这两个旁侧序列建立了灵敏高、特异性强的转基因水稻EB7001S的品系特异性定性PCR检测方法。本发明所建立的转基因水稻EB7001S特异性PCR检测方法可以进一步应用于特异性检测试剂盒的开发，以对转基因活体（植株、种子）、产品、提取物进行转基因成分的定性检测，通过标准含量样品的设置，还可实现定量检测和定量检测试剂盒的开发。

本发明可以采用如下技术方案：

1）获得右旁侧序列

转基因水稻EB7001S的外源基因在水稻染色体插入位置的右旁侧序列，所述T-DNA右边界侧的右旁侧序列如SEQ ID NO.1所示。

首先，通过hiTail-PCR扩增得到转基因水稻EB7001S右旁侧部分序列，如SEQ IDNo.2所示，全长1515bp。hiTail-PCR所用特异性嵌套引物依据植物表达载体pC3300-Epsps的T-DNA序列右边界（RB）上游lacZ基因序列设计。植物表达载体pC3300-Epsps的资料参考专利（201110270905.7）。hiTail-PCR方法参考文献（Liu et al.,2007,BioTechniques,43(5):649-456），其中：所述引物包括长随机引物LAD1-LAD4，通用引物AC1，特异性嵌套引物Rb-0b、Rb-1b和Rb-2b（引物序列见表1）。hiTail-PCR扩增获得1515bp长的片断。

通过BLAST分析发现其中第1至第169位核苷酸序列与所用载体右边界序列完全一致；第170至第1515位序列与水稻基因组第7号染色体上（AP006451.3）的序列的第88469至第89820位高度匹配。

其次，根据获得的水稻基因组序列信息（AP006451.3）设计引物对RBG-F/RBG-R，序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，利用RBG-F和RBG-R引物对进行PCR扩增得到647bp的转基因水稻EB7001S的基因组序列，如SEQ ID No.5所示，该段序列多次测序结果均与NCBI数据库所公布的水稻基因组序列（AP006451.3）完全一致。

分析SEQ ID No.2和SEQ ID No.5序列发现二者有91bp的序列重叠，将两次扩增获得的两个序列SEQ ID No.2和SEQ ID No.5拼接得到右旁侧序列SEQ ID No.1，该序列全长2071bp，包含第1至第169位的外源基因序列（载体序列）与第170至第2071位的水稻基因组序列。

2）获得左旁侧序列

在本发明中，还提供了转基因水稻EB7001S的外源基因在水稻染色体插入位置的左旁侧序列，所述T-DNA左边界侧的左旁侧序列如SEQ ID No.6所示。

所述左旁侧序列，如SEQ ID No.6所示，它通过LD-PCR扩增得到，全长2671bp。具体方法为：根据测序所得的右边界序列以及已公布的水稻第7号染色体上的序列设计正向引物LB1-F，序列如SEQ ID No.7所示，根据载体pC3300-Epsps序列设计反向引物LB1-R，序列如SEQ ID No.8所示，用该引物对扩增获得转基因水稻EB7001S的左旁侧序列，如SEQ IDNo.6所示，长度为2671bp。通过分析SEQ ID No.6发现，获得的序列第1至第1909位与水稻基因组第7号染色体上部分序列（NCBI登录号AP006451.3上88465-90374位）完全匹配，第1910位至第2671位与载体pC3300-Epsps的CaMV35S终止子部分序列完全相同。接合处水稻基因组序列缺失3bp。

3）基于右旁侧序列的EB7001S转化事件特异性检测方法

转基因水稻品系EB7001S的外源插入片段的右旁侧序列的定性PCR检测方法，其中，所述PCR反应中的两条引物组合为T-DNA右边界的旁侧序列的特异性引物对：一条引物依据SEQ ID No.1中第1至第169位序列设计，另一条引物依据SEQ ID No.1中第170至第2071位序列设计。

优选地，所述特异性引物对如下：

正向引物RB-F，序列如SEQ ID No.9所示，依据SEQ ID No.1中第1至第169位序列设计；

反向引物RB-R，序列如SEQ ID No.10所示，依据SEQ ID No.1中第170至第2071位序列设计；

利用上述引物对进行PCR扩增，转基因水稻品系EB7001S能获得长度为485bp的目的片段，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得目的片断或不能获得大小相同的目的片断。

4）基于左旁侧序列的EB7001S转化事件特异性检测方法

转基因水稻品系EB7001S的外源插入片段的左旁侧序列的定性PCR检测方法，其中，所述PCR反应中的两条引物组合为外源基因插入位点处左旁侧序列的特异性引物对：一条引物依据SEQ ID No.6中第1至第1909位序列设计，即插入位点处水稻基因组序列；另一条引物依据SEQ ID No.6中第1910至第2671位序列设计，即外源基因序列。

优选地，所述特异性引物对如下：

正向引物LB2-F，序列如SEQ ID No.11所示，依据SEQ ID No.6中第1至第1909位序列设计；

反向引物LB2-R，序列如SEQ ID No.12所示，依据SEQ ID No.6第1910至第2671位序列设计；

利用上述引物对进行扩增，转基因水稻品系EB7001S能获得长度为629bp的目的片段，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得目的片断或不能获得大小相同的目的片断。

5）基于左、右旁侧序列的多重PCR检测方法

依据SEQ ID No.1中第1至第169位序列设计一条特异性引物，依据SEQ ID No.1中第170至第2071位序列设计一条特异性引物，获得右旁侧序列的特异性引物对；依据SEQ IDNo.6中第1至第1909位序列设计一条特异性引物，依据SEQ ID No.6中第1910至第2671位序列设计一条特异性引物，获得左旁侧序列的特异性引物对；以这两个特异性引物对同时扩增转基因水稻基因组DNA，同时获得左、右边界的两条目标特异带。

优选的，以特异性引物LB2-F、LB2-R、RB-F和RB-R对待测样品DNA进行PCR扩增，转基因水稻EB7001S扩增获得629bp和485bp的2条目的片段，其它所有水稻不会获得条带或者上述相同大小的目标条带。

以下，通过实施例进一步详细说明本发明，下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

实施例1：转基因水稻品系EB7001S右边界旁侧序列的扩增

1）DNA的提取

CTAB法（王关林等，植物基因工程，北京：科学出版社，2009）。取2.0μL的DNA，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用微量紫外分光光度计测定DNA浓度。

2）hiTail-PCR分离T-DNA右旁侧序列

参照Liu等(Liu et al.,2007,BioTechniques,43(5):649-456)的方法进行。hiTail-PCR第1级反应使用4条长随机引物（LAD1-LAD4）与特异性嵌套引物Rb-0b组合，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，非转基因水稻7001S作为对照。第1级PCR扩增反应产物稀释40倍用作第2级Tail-PCR反应的模板，第2级反应的引物组合为AC1/RB-1b。将第2级反应产物稀释10倍用作第3级反应的模板，引物组合为AC1/RB-2b。第二级和第三级反应的扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离。所用引物序列见表1，扩增程序见表2。

表1：hiTail-PCR所用引物

表2：hiTail-PCR扩增程序

3）右旁侧序列的延伸

利用hiTAIL-PCR扩增所获得的序列（SEQ ID No.2）设计引物RBG-F，序列如SEQ IDNo.3所示，参考水稻基因组序列（AP006451.3）设计引物RBG-R，序列如SEQ ID No.4所示，利用引物对RBG-F/RBG-R扩增转基因水稻EB7001S。扩增体系为：20μL PCR反应体系中包括1×PCR Buffer，200μM dNTPs，1μM正向引物RBG-F和1μM反向引物RBG-R，0.5U Taq DNA聚合酶和20ng DNA模板。PCR扩增程序为：95℃5min；34个循环（94℃45s，58℃30s，72℃1min）；72℃10min。

4）PCR产物的克隆和测序

用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离检测第二轮（图2泳道1和3）与第三轮（图2泳道2和4）PCR扩增产物，切下相应的特异性条带，用Takara凝胶回收试剂盒回收特异片段，并克隆到pMD19-T simple vector，挑选阳性克隆送华大基因公司测序。序列比较分析运用NCBI的Blast软件进行。

5）结果

根据T-DNA右边界的载体序列设计的3个嵌套的特异性引物（RB-0b、RB-1b和RB-2b）先后跟随机引物LAD2、LAD3和LAD4组合时，只在转基因水稻EB7001S中扩增出特异性条带（图2泳道1-2），而在非转基因水稻中不能扩增出条带（图2泳道3-4）。对随机引物LAD2扩增出的第三级PCR产物进行回收、克隆和测序得到1515bp的右边界融合序列，序列如SEQ IDNo.2所示。该序列的特征为：第1至第169位与载体序列完全匹配，第170至第1515位为水稻基因组第7号染色体上的序列。利用RBG-F/RBG-R引物对扩增得到647bp序列，序列如SEQ IDNo.5所示，多次测序结果均与NCBI数据库所公布的水稻基因组序列（AP006451.3）完全一致。分析SEQ ID No.2和SEQ ID No.5发现其中有91bp的序列重叠，将SEQ ID No.2和SEQ IDNo.5相拼接得到转基因水稻EB7001S右旁侧序列，序列如SEQ ID No.1所示；该序列的特征为：第1至第169位为插入水稻中的外源基因序列（载体序列），第170至第2071位为水稻基因组序列，与已公布的水稻第7号染色体上序列（AP006451.3）完全匹配。

实施例2：转基因水稻品系EB7001S左边界旁侧序列的扩增

1）DNA的提取

采用与实施例1相同的方法进行。

2）长链PCR（Long distance PCR,LD-PCR）

长链PCR用于扩增水稻基因组中的长片段。本实例中用于扩增转基因水稻EB7001S的外源插入载体的T-DNA左旁侧序列。引物序列见表3。LD-PCR扩增体系为：20μL PCR反应体系中包括1×PCR Buffer，200μM dNTPs，1μM正向引物LB1-F和1μM反向引物LB1-R，0.5U TaqDNA聚合酶和20ng DNA模板。LD-PCR扩增程序为：95℃5min；94℃变性45s，58℃30s，72℃2min，34个循环；72℃10min。扩增片段的电泳图如图3所示。

表3：用于LD-PCR的引物

3）PCR产物的克隆和测序

采用与实施例1相同的方法进行。

4）结果

利用引物对LB1-F/LB1-R进行PCR扩增，获得序列如SEQ ID No.6所示，长度2671bp。其中：第1至第1909位为水稻基因组序列，第1910位至第2671位为外源基因序列（载体序列）。

实施例3：基于转基因水稻EB7001S的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法

1）DNA的提取和检测

采用与实施例1相同的方法进行。

2）基于左、右旁侧序列的品系特异性PCR检测

根据实施例1和2中获得的转基因水稻的右旁侧序列和左旁侧序列，分别依据其水稻基因组序列部分和外源基因序列（载体序列）部分设计特异性引物，优选的，引物序列见表4。PCR反应体系为：20μL PCR反应体系中包括1×PCR Buffer，200μM dNTPs，1μM特异引物对，0.5U Taq DNA聚合酶和20ng DNA模板。扩增程序为：95℃5min；94℃30s，退火30s，72℃1min，34个循环；72℃10min。利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。

表4：转基因水稻品系EB7001S的T-DNA左右边界侧的事件特异性检测引物

3）PCR产物的克隆和测序

采用与实施例1相同的方法进行。

4）结果

利用引物对RB-F/RB-R进行PCR扩增，仅在转基因水稻EB7001S中得到485bp的目的片段，而在其他转基因水稻品系和对照品种中均未得到扩增产物（图5）；引物对RB-F/RB-R适宜的退火温度范围为56-61℃（图7）。利用引物对LB2-F/LB2-R进行PCR扩增，仅在转基因水稻EB7001S中得到长度为629bp的特异条带，而在其他转基因水稻品系和对照品种中均未得到扩增产物（图6）；引物对LB2-F/LB2-R适宜的退火温度范围为52-62℃（图8）。其中，转基因水稻品种EB7001S作为检测标准品，转基因对照材料为CD083、B2A4008S、B88S和B2A68，非转基因对照为7001S（安擞农业科学,1994,22(1):11-15）、吉梗88（吉林农业科学,2006,31(5):22-23）、4008S（安擞农业科学,1996,24(4):294-296）、P88S（种子,2008,27(11):123-125）和D68（杂交水稻,1998,13(3):6-7）。上述水稻均已经在各自的文献中公开，可以通过向中国科学院亚热带农业生态研究所来函索取的方式获得，中国科学院亚热带农业生态研究所保证从本发明的申请日起二十年内向公众发放上述水稻。

实施例4：基于转基因水稻EB7001S的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR灵敏度检测

1）DNA的提取和检测

采用与实施例1相同的方法进行。

2）基因组DNA的稀释与配比

将转基因水稻EB7001S基因组DNA与非转基因水稻7001S基因组DNA均稀释至100ng/μL，并按照不同的比例混合配成转基因水稻DNA相对含量为100%、20%、5%、1%、0.5%、0.1%的样品。

3）基于左、右旁侧序列的定性PCR灵敏度检测

根据实例3的方法，按优化后的退火温度（均为58℃）对样品进行PCR扩增，分别测定特异性引物对RB-F/RB-R和LB2-F/LB2-R的检测限度。

4）结果

利用引物对RB-F/RB-R和LB2-F/LB2-R进行PCR扩增，当转基因DNA成分为0.5%时特异性引物对仍能分别检测出485bp或629bp的特异性条带（图9，图10），说明转基因品系EB7001S特异性检测引物最低检测限度至少可达0.5%，完全能够满足欧盟要求转基因产品含量达到0.9%就要求标识的检测灵敏度要求。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (16)

1.一种核酸，该核酸为转基因水稻EB7001S的旁侧序列的核酸，所述转基因水稻EB7001S的旁侧序列包括右旁侧序列和左旁侧序列，其中，所述右旁侧序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的片段，所述左旁侧序列为SEQ ID No.6或SEQ ID No.6的片段；其中，SEQID No.1的片段至少包括SEQ ID No.1的第149-190位的序列；SEQ ID No.6的片段至少包括SEQ ID No.6的第1889-1930位的序列。

2.根据权利要求1所述的核酸，其中，SEQ ID No.1的片段至少包括SEQ ID No.1的第139-200位的序列。

3.根据权利要求1所述的核酸，其中，SEQ ID No.1的片段至少包括SEQ ID No.1的第129-210位的序列。

4.根据权利要求1所述的核酸，其中，SEQ ID No.6的片段至少包括SEQ ID No.6的第1879-1940位的序列。

5.根据权利要求1所述的核酸，其中，SEQ ID No.6的片段至少包括SEQ ID No.6的第1869-1950位的序列。

6.一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因水稻EB7001S或者含有权利要求1-5中任意一项所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生水稻，该方法包括：

(1)使用针对权利要求1-5中任意一项所述的核酸的特异性引物对，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；

(2)检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对扩增产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻EB7001S或者含有权利要求1-5中任意一项所述的核酸的衍生系；

其中，所述特异性目的片段为权利要求1-5中任意一项所述的核酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No.1或SEQID No.1的片段的特异性引物对，该引物对中的一条引物在SEQ ID No.1的1-169bp区域设计、另一条引物在SEQ ID No.1的170-2071bp区域设计。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述特异性引物对为SEQ ID No.9所示的核酸和SEQ ID No.10所示的核酸；所述特异性引物对扩增产生的目的片段的长度为458bp。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，PCR扩增的条件包括，退火温度为56-61℃。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No.6或SEQID No.6的片段的特异性引物对，该引物对中的一条引物在SEQ ID No.6的1-1909bp区域设计、另一条引物在1910-2671bp区域设计。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述特异性引物对为SEQ ID No.11所示的核酸和SEQ ID No.12所示的核酸；所述特异性引物对扩增产生的目的片段的长度为629bp。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，PCR扩增的条件包括，退火温度为52-62℃。

13.一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物对和/或左侧特异性引物对，其中，所述右侧特异性引物对为SEQ ID No.9所示的核酸和SEQ ID No.10所示的核酸；所述左侧特异性引物对为SEQ ID No.11所示的核酸和SEQ ID No.12所示的核酸。

14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性对照核酸，所述阳性对照核酸包括SEQ ID No.1所示的核酸和/或SEQ ID No.6所示的核酸。

15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和耐高温DNA聚合酶。

16.权利要求13-15中任意一项所述的试剂盒在检测转基因水稻EB7001S或者含有权利要求1-5中任意一项所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。