CN101240278A - 转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及“一种转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列”，其特征在于：5’端旁侧序列如SEQ ID NO1所示，3’端旁侧序列如SEQ ID NO2所示。利用该旁侧序列作为目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的品系特异性定性、定量PCR检测。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列。具体的说，涉及一种转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。对转基因植物进行品系特异性的检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。而转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。
目前已经有部分专利和文献报道了转基因植物外源插入载体旁侧序列，例如：张大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。
发明内容
针对上述领域中的空白，提供了一种转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列。
进一步，本发明还提供该转基因品系特异性的PCR检测方法。
一种转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5’端旁侧序列，其特征在于：5’端旁侧序列如SEQ ID NO1所示。
一种转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，其特征在于：3’端旁侧序列如SEQ ID NO2所示。
5’端旁侧序列的制备方法，是通过TAIL-PCR扩增得到。
3’端旁侧序列的制备方法，是通过LD-PCR扩增得到。
转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物：一条引物为依据SEQ ID NO1中1-884位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO1的885-1544位序列设计的反向引物。
所述正向引物为Df1：5’-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3’，
所述反向引物为LB-P3：5’-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3’。
转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物：一条引物依据SEQ ID NO2中1-1311位序列设计的正向引物，另一条引物依据SEQ ID NO2的1312-1581位序列设计的反向引物。
所述正向序列为1145f：5’-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3’，
所述反向序列为Dr1：5’-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3’。
根据Wu等(wu et al，2002，Theor Appl Genet，104：727-734)报道的用于转化的载体pKUB的结构图，其中T-DNA区域结构见图1，由nptII抗性基因表达盒、cry1Ab基因表达盒、hpt抗性基因表达盒和gus基因表达盒组成。本发明采用常规方法，提取植物基因组DNA，利用TAIL-PCR分离法得到5’端旁侧序列1544bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。通过分析，该5’端旁侧序列包括：水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号：AP008208)的24707035-24707918位，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从1-884位的核苷酸序列完全相同；T-DNA左边界区域序列，来源于外源插入载体pKUB，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1中885-1544位的核苷酸序列完全相同。利用LD-PCR分离法得到3’端旁侧序列1581bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。通过分析，该3’端旁侧序列包括：玉米启动子Pubi的部分序列，来源于外源插入载体pKUB，其核苷酸序列与SEQ ID NO.2中的1-1311位的核苷酸序列完全相同；水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号：AP008208)的24707954-24708223位，其核苷酸序列与SEQ IDNO.2中从1312-1581位的核苷酸序列完全相同。
转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，可以5’端旁侧序列和/或3’端旁侧序列作为目的DNA扩增片段。根据5’端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据1-884位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列设计，位于水稻2号染色体(GenBank登记号：AP008208)的24707035-24707918位，反向引物可根据885-1544位的核苷酸序列设计，即是按照T-DNA左边界区域序列设计，本发明设计的正向引物为Df1：5’-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3’，反向引物为LB-P3：5’-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3’。根据3’端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据1-1311位的核苷酸序列设计，即是按照玉米启动子Pubi的部分序列设计，反向引物可根据1312-1581位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号：AP008208)的24707954-24708223位设计，本发明设计的正向序列为1145f：5’-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3’，反向序列为Dr1：5’-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3’。
本发明首次克隆了转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的品系特异性定性、定量PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。
附图说明
图1转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的转化载体pKUB的T-DNA区域结构示意图
图2通过TAIL-PCR方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5’端旁侧序列。
M：marker DL2000；泳道上方的编号代表使用的简并引物分别与第三级巢式引物组合的扩增结果。
图3通过LD-PCR方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3’端旁侧序列。
M：markerλ/HindIII；1：Dr1/cry1A-R引物扩增；2：Dr1/nos-R引物扩增
图4转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5’端旁侧序列特异性引物Df1/LB-P3检测
M：marker DL2000；1，2：转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)；3，4：对照秀水11
图5转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3’端旁侧序列特异性引物Dr1/1145f检测。
M：marker DL2000；1，2：转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)；3，4：对照秀水11
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的克隆
一、实验材料
1、植物材料
转基因水稻：转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)。
常规水稻：秀水11。
2、酶与试剂
分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和简并引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。
3、实验仪器
PCR扩增仪：Eppendorf Mastercycle gradient(Eppendorf co.)
核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)
DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)
DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)
其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
二、实验方法和过程
1、外源插入载体
Wu等(wu et al，2002)报道了用于转化的载体pKUB的结构图，其中T-DNA区域结构见图1，由nptII抗性基因表达盒、cry1Ab基因表达盒、hpt抗性基因表达盒和gus基因表达盒组成。
2、植物基因组DNA提取与检测
2.1、植物DNA提取
2.1.1、抽提液的配制
| 药品 | 终浓度 |
| 葡萄糖 | 0.35M |
| Tris-HCl，(pH7.5) | 0.1M |
| EDTA(pH8.0) | 0.005M |
| 聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP) | 2％(w/v) |
| DIECA(diethyldithiocarbamic acid) | 0.1％(w/v) |
| β-巯基乙醇(用时现加) | 0.2％ |
2.1.2、裂解液的配制
| 药品 | 终浓度 |
| NaCl(氯化钠) | 1.4M |
| Tris-HCl，(pH7.5) | 0.1M |
| EDTA(pH8.0) | 0.02M |
| 聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP) | 2％(w/v) |
| 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) | 2％(w/v) |
| DIECA(diethyldithiocarbamic acid) | 0.1％(w/v) |
| β-巯基乙醇(用时现加) | 0.2％ |
2.1.3、提取方法
a 称取200-400mg水稻叶片，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的1.5ml离心管中。
b 加入1ml预冷至4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13000r/min离心机，4℃离心15min，弃去上清液。
c 加入600μl预热到65℃的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65℃的水浴锅中裂解40min。
d 用13000r/min离心机室温离心10min，将上清液转至另一离心管中，加入5μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min。
e 分别用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次。
f 用13000r/min离心机室温离心10min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10体积3M乙酸钠(pH 5.6)，-20℃放置2-3h，充分沉淀DNA。
g 13000r/min，4℃离心15min，用70％乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50μl TE(pH8.0)溶解DNA。
h 把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/μl，储存于-20℃备用。
3、TAIL-PCR分离已知序列的旁侧序列
TAIL-PCR详细的描述见Liu等(Liu et al.，1995，The Plant Journal，8(3)：457-463)，用于扩增已知区域的侧翼序列。根据T-DNA左边界区域设计三个巢式特异性PCR引物LB-P1～LB-P3，依次与8个简并引物AD2-6、AD8、AD9、AD11分别组合进行三次PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应条件见表2。
表1用于TAIL-PCR扩增的简并引物和特异性引物
| primers | sequence |
| LB-P1 | 5’-TTCCTTTCTCGCCACGTTCG-3’ |
| LB-P2 | 5’-TTAGGGTTCCGATTTAGTGC-3’ |
| LB-P3 | 5’-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3’ |
| AD2 | 5’-AGTGNAGAANCAAAGG-3’ |
| AD3 | 5’-CATCGNCNGANACGAA-3’ |
| AD4 | 5’-TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3’ |
| AD5 | 5’-TCGTNCGNACNTAGGA-3’ |
| AD6 | 5’-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3’ |
| AD8 | 5’-(G/C)TTGNTA(G/C)TNCTNTGC-3’ |
| AD9 | 5’-(A/T)CAGNTG(A/T)TNGTNCTG-3’ |
| AD11 | 5’-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GGA-3’ |
表2TAIL-PCR反应程序和条件
4、长链PCR(long distance PCR，LD-PCR)
长链PCR用于扩增水稻基因组中的长片段。本实施例中用于扩增转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入载体的3’端旁侧序列。根据扩增得到的5’端旁侧序列中的水稻基因组，设计其下游区域的特异性引物Dr1，在转化载体pKUB右边界附近设计引物nos-R和cry1A-R。引物Dr1分别与nos-R和cry1A-R组合进行扩增，引物序列见表3。
表3用于LD-PCR的引物
| 引物 | 序列 |
| Dr1 | 5’-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3’ |
| nos-R | 5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 |
| cry1A-R | 5’GATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3’ |
LD-PCR扩增体系为：总体系50μL，Ex Taq(Takara co.，Dalian)，1.25U 10×Ex Taq Buffer5μL，dNTP(各2.5mM)4μL，水稻DNA 2μL(10ng/μL)，引物各2μL(25μM)。LD-PCR扩增程序：94℃4min；(98℃10s，68℃15min)，30cycles；72℃10min。
5、序列测定和分析
PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquick Gel Extraction kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABI PRISM 1300Genetic Analyzer进行序列测定。采用vectorNTI10.0(Invitrogen)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的水稻基因组序列。
三、实验结果
1、TAIL-PCR扩增和LD-PCR扩增分别获得了5’端和3’端外源插入片段的旁侧序列
根据转化载体T-DNA左边界区域设计的特异性引物与8个简并引物组合进行TAIL-PCR扩增，获得了5’端外源插入片段的旁侧序列(图2)。根据其中的水稻基因组序列，设计特异性的下游引物，与转化载体pKUB右边界附件的cry1Ab上的引物组合进行扩增，获得了3’端外源插入片段的旁侧序列(图3)。
2、5’端外源插入片段的旁侧序列分析
TAIL-PCR扩增方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5’端外源插入片段的旁侧序列，经DNA序列分析和核酸数据库中检索表明：5’端旁侧序列长度为1544bp，其中含有884bp的水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号：AP008208)的24707035-24707918位；660bp的T-DNA左边界区域序列，来源于外源插入载体pKUB。具体的转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5’端外源插入片段的旁侧序列的信息见SEQ ID NO 1。3、3’端外源插入片段的旁侧序列分析
采用LD-PCR扩增的方法获得转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3’端外源插入片段的旁侧序列，经DNA序列分析和核酸数据库中检索表明：3’端旁侧序列长度为1581bp，其中含有1311bp的玉米启动子Pubi的部分序列，来源于外源插入载体pKUB，270bp的水稻基因组序列，位于水稻2号染色体(GenBank登记号：AP008208)的24707954-24708223位。具体的转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的3’端外源插入片段的旁侧序列的信息见SEQ ID NO 2。
实施例2
基于转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法
一、实验材料
1、植物材料
转基因水稻：转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)。
常规水稻：秀水11。
2、酶与试剂
分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。
3、实验仪器
PCR扩增仪：Eppendorf Mastercycle gradient(Eppendorf co.)
核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)
DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)
其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。
二、实验方法和过程
1、植物基因组DNA提取与检测
见实施例1中的“植物基因组DNA提取与检测”
2、基于5’端和3’端旁侧序列的品系特异性PCR检测
根据实施例1中测定的5’端和3’端旁侧序列，分别在其水稻基因组序列部分和转化载体序列部分设计引物，见表4。PCR扩增结果表明，转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5’端和3’端扩增引物组合分别得到了预期的508bp和437bp的扩增片段，而对照秀水11均没有相应的扩增片段，见图4和图5。
表4转基因水稻品系克螟稻1(KMD1)的5’端和3’端品系特异性检测引物
附录：序列表
SEQ ID NO1：5’端序列：(1544bp)
1 ACGAACCAAC GCTCGAGCAC AGATGCAGGT GAGCTCGATC AGATTCAGAA CTGAATCACA
61 GGCAGCGAAC TCTTTTTTTC TGTACATTCT GATTTCTAAA TGAAGCTCAA CGTTACGATG
121 CGCCAAACTA GTGCTCAATG AGTACAATAT ACGACCTCCT CGGATCGCGT ACCCCTGACA
181 CCATGAAACG GTTGGCAGGT AATACGGTTT GAAATCGGAA ATACTCCGTT TCACATGATA
241 GTACAGTACA ATTGCGCTCG CGTTTCACAT GATAGGTCAC ACTATTCTGT CAGGAGCAAA
301 CAGCTAAAAC ATTTTCATAA GATTCAGCAA ATGAGGGGAG AGGCCAAATC CACTGTAAAC
361 TCAAAATACT ATAATCGGCA GCAGGACGGT GATGTCAGAC GAAAAACAGA GAGGAGAACA
421 CTTCCTTAAT CACAATCCAC AAGTCAACGG CAGATCCAGA CACCGCATAT GTGTTTCCGG
481 ACTCTGGATT CAGGCATAGT TTACTCGGGA GCAGCTCTTC GGGACACGGA AGATGCACAC
541 TGGATGGCAT GGAGGTCAGG GGGAATAATC GAACATGCGA AATGGAAATT GGCTAGTTGT
601 GGAGCGTCAA CTGGGAGCTT ATCTTATTAC TAATTAGTAT TACCATTGCC ATTACGTCTG
661 AAACAGACGG GGCTCCCATT TCTTTTTGAT GTCGTTAGTA CAGCCGGCTT CGTTTTTCTT
721 TTCTGGCTGT CTCGGCTGTC ACCTGTCAGT CTCGTCAGCA ACTGGGGTGT TCCGCCGACG
781 AGGGCGCCGT GGACTTCGCG GGCTCGCGGC GATGGCGATG CGCGCTCCAA CTGCGGCGGG
841 TCTCACCGGG CTGCGTGCGT ACGCCGATAT GCCTGCCCAT CTCGGGATAT ATTGTGGTGT
901 AAACAAATTG ACGCTTAGAC AACTTAATAA CACATTGCGG ACGTTTTTAA TGTACTGGGG
961 TGGTTTTTCT TTTCACCAGT GAGACGGGCA ACAGCTGATT GCCCTTCACC GCCTGGCCCT
1021 GAGAGAGTTG CAGCAAGCGG TCCACGCTGG TTTGCCCCAG CAGGCGAAAA TCCTGTTTGA
1081 TGGTGGTTCC GAAATCGGCA AAATCCCTTA TAAATCAAAA GAATAGCCCG AGATAGGGTT
1141 GAGTGTTGTT CCAGTTTGGA ACAAGAGTCC ACTATTAAAG AACGTGGACT CCAACGTCAA
1201 AGGGCGAAAA ACCGTCTATC AGGGCGATGG CCCACTACGT GAACCATCAC CCAAATCAAG
1261 TTTTTTGGGG TCGAGGTGCC GTAAAGCACT AAATCGGAAC CCTAAAGGGA GCCCCCGATT
1321 TAGAGCTTGA CGGGGAAAGC CGGCGAACGT GGCGAGAAAG GAAGGGAAGA AAGCGAAAGG
1381 AGCGGGCGCC ATTCAGGCTG CGCAACTGTT GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC
1441 TATTACGCCA GCTGGCGAAA GGGGGATGTG CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG GTAACGCCAG
1501 GGTTTTCCCA GTCACGACGT TGTAAAACGA CGGCCAGTGA ATTC
SEQ ID NO 2：3’端序列：(1581bp)
1 TCTAGAGTCG ACCTGCAGAA GTAACACCAA ACAACAGGGT GAGCATCGAC AAAAGAAACA
61 GTACCAAGCA AATAAATAGC GTATGAAGGC AGGGCTAAAA AAACCCACAT ATAGCTGCTG
121 CATATGCCAT CATCCAAGTA TATCAAGATC AAAATAATTA TAAAACATAC TTGTTTATTA
181 TAATAGATAG GTACTCAAGG TTAGAGCATA TGAATAGATG CTGCATATGC CATCATGTAT
241 ATGCATCAGT AAAACCCACA TCAACATGTA TACCTATCCT AGATCGATAT TTCCATCCAT
301 CTTAAACTCG TAACTATGAA GATGTATGAC ACACACATAC AGTTCCAAAA TTAATAAATA
361 CACCAGGTAG TTTGAAACAG TATTCTACTC CGATCTAGAA CGAATGAACG ACCGCCCAAC
421 CACACCACAT CATCACAACC AAGCGAACAA AAAGCATCTC TGTATATGCA TCAGTAAAAC
481 CCGCATCAAC ATGTATACCT ATCCTAGATC GATATTTCCA TCCATCATCT TCAATTCGTA
541 ACTATGAATA TGTATGGCAC ACACATACAG ATCCAAAATT AATAAATCCA CCAGGTAGTT
601 TGAAACAGAA TTCTACTCCG ATCTAGAACG ACCGCCCAAC CAGACCACAT CATCACAACC
661 AAGACAAAAA AAAGCATGAA AAGATGACCC GACAAACAAG TGCACGGCAT ATATTGAAAT
721 AAAGGAAAAG GGCAAACCAA ACCCTATGCA ACGAAACAAA AAAAATCATG AAATCGATCC
781 CGTCTGCGGA ACGGCTAGAG CCATCCCAGG ATTCCCCAAA GAGAAACACT GGCAAGTTAG
841 CAATCAGAAC GTGTCTGACG TACAGGTCGC ATCCGTGTAC GAACGCTAGC AGCACGGATC
901 TAACACAAAC ACGGATCTAA CACAAACATG AACAGAAGTA GAACTACCGG GCCCTAACCA
961 TGGACCGGAA CGCCGATCTA GAGAAGGTAG AGAGGGGGGG GGGGGGAGGA CGAGCGGCGT
1021 ACCTTGAAGC GGAGGTGCCG ACGGGTGGAT TTGGGGGAGA TCTGGTTGTG TGTGTGTGCG
1081 CTCCGAACAA CACGAGGTTG GGGAAAGAGG GTGTGGAGGG GGTGTCTATT TATTACGGCG
1141 GGCGAGGAAG GGAAAGCGAA GGAGCGGTGG GAAAGGAATC CCCCGTAGCT GCCGTGCCGT
1201 GAGAGGAGGA GGAGGCCGCC TGCCGTGCCG GCTCACGTCT GCCGCTCCGC CACGCAATTT
1261 CTGGATGCCG ACAGCGGAGC AAGTCCAACG GTGGAGCGGA ACTCTCGAGA GGGGTCGGCA
1321 CGATGGTCGC ATCGTCGTGC GTGAGCTGCC TATCGACAGG TGGTGTGCCA ATGAGGAGAT
1381 ACGTTGATCT GTGGTTTCCA AAAGTCCGGT GCAAAATGGG AGATAGCTGC GATGGCTTAT
1441 TTACTTGGGT GGTGCACACT TGTACAGGTT AGCTTGACAG TTAGAGAAGT ACGTACTCCT
1501 ATAAAAGATT TCCAGGAATT CTCGTGCTGG ACTCTTTCGC GAGCACCTGC ACTTTGAGCA
1561 TGAGGTGCAA CGGCTGATCT T
Claims (8)
1. 一种转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5’端旁侧序列，其特征在于：5’端旁侧序列如SEQ ID NO1所示。
2. 一种转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，其特征在于：3’端旁侧序列如SEQ ID NO2所示。
3. 权利要求1所述的旁侧序列的制备方法，是通过TAIL-PCR扩增得到。
4. 权利要求2所述的旁侧序列的制备方法，是通过LD-PCR扩增得到。
5. 转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物：一条引物为依据SEQID NO1中1-884位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQ ID NO1的885-1544位序列设计的反向引物。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，
所述正向引物为Df1：5’-TGTCAGTCTCGTCAGCAACTG-3’，
所述反向引物为LB-P3：5’-GGTGATGGTTCACGTAGTGG-3’。
7. 转基因水稻品系克螟稻1的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求2所述旁侧序列的特异性引物：一条引物依据SEQ IDNO2中1-1311位序列设计的正向引物，另一条引物依据SEQ ID NO2的1312-1581位序列设计的反向引物。
8. 根据权利要求5所述的检测方法，
所述正向序列为1145f：5’-AGGAAGGGAAAGCGAAGGAG-3’，
所述反向序列为Dr1：5’-AAGATCAGCCGTTGCACCTC-3’。
Priority Applications (1)
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Cited By (10)
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|---|---|---|---|---|
| CN101899513A (zh) * | 2010-07-19 | 2010-12-01 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 鉴别转基因抗虫棉南农6号的pcr检测方法及其应用 |
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| CN102952858A (zh) * | 2011-08-26 | 2013-03-06 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 转基因水稻品系克螟稻pcr-dhplc检测引物及检测方法 |
| CN103014136A (zh) * | 2011-09-21 | 2013-04-03 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻1的方法 |
| CN103014133A (zh) * | 2011-09-21 | 2013-04-03 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种用于鉴定纯合型转基因抗虫水稻克螟稻1的引物 |
| CN103361435A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-10-23 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物、探针及在实时荧光PCR检测中的应用 |
| CN103484455A (zh) * | 2012-08-29 | 2014-01-01 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列 |
| CN104031912A (zh) * | 2013-03-04 | 2014-09-10 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 核酸和检测转基因水稻b2a68及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途 |
| CN104419708A (zh) * | 2013-08-19 | 2015-03-18 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 核酸和检测转基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途 |
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Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101899513A (zh) * | 2010-07-19 | 2010-12-01 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 鉴别转基因抗虫棉南农6号的pcr检测方法及其应用 |
| CN101899513B (zh) * | 2010-07-19 | 2013-04-10 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 鉴别转基因抗虫棉南农6号的pcr检测方法及其应用 |
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| CN101974618A (zh) * | 2010-07-26 | 2011-02-16 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 转cry1C基因水稻品系T1c-19的转化体特异性PCR检测方法 |
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| CN103484455B (zh) * | 2012-08-29 | 2015-08-05 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列 |
| CN104031912A (zh) * | 2013-03-04 | 2014-09-10 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 核酸和检测转基因水稻b2a68及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途 |
| CN103361435A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-10-23 | 山东省农业科学院植物保护研究所 | 转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物、探针及在实时荧光PCR检测中的应用 |
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