CN1740322A - 玉米品系mon863的外源插入载体的旁邻基因序列 - Google Patents

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CN1740322A CN 200510027952 CN200510027952A CN1740322A CN 1740322 A CN1740322 A CN 1740322A CN 200510027952 CN200510027952 CN 200510027952 CN 200510027952 A CN200510027952 A CN 200510027952A CN 1740322 A CN1740322 A CN 1740322A
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张大兵
杨立桃
潘爱虎
梁婉琪
尹长松
许诵辞
章可为
武爱波
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Abstract

一种玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，本发明的MON863玉米外源插入载体的旁邻基因序列，包括：编码玉米NADH脱氢酶亚单位1和2的部分的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1－253位的核苷酸序列完全相同或SEQ ID NO.2中从核苷酸第138－411位的核苷酸序列完全相同；编码烟草花椰病毒的35S启动子的部分序列，其来源于外源插入载体PV－ZMIR13，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第254－456位的核苷酸序列完全相同；编码小麦tahsp 17 3’终止子的部分序列，其来源于外源插入载体PV－ZMIR13，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1－137位的核苷酸序列完全相同。本发明可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。

Description

玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的基因序列。具体的说，涉及一种玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列。
背景技术
随着植物遗传转化技术在基础研究和应用研究中的广泛应用，已生产出了多种转基因植物。转基因植物的外源插入载体的旁邻基因序列是转基因品系的一个重要生物学特征，因此，外源插入载体的旁邻基因序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要试验依据。
目前已经有部分专利和文献分析了转基因植物外源插入载体旁邻基因序列，例如：Holck A等人于2002年利用TAIL-PCR方法分析了MON810玉米的旁邻基因序列，为转基因MON810玉米的品系特异性检测方法的建立提供了序列依据；Ronning S等人利用反向PCR方法于2003年分析了Bt11玉米的旁邻基因序列，为转基因Bt11玉米的品系特异性检测方法的建立提供了序列依据。然而，在对现有专利和文献的分析中发现，还没有任何关于MON863玉米品系的外源插入载体旁邻基因序列分析的文章和专利报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列。本发明公布了与玉米MON863的外源插入载体PV-ZMIR13两端邻接的玉米基因组中的玉米NADH脱氢酶基因的部分序列，编码NADH脱氢酶亚单位1和2，本发明可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明分离出一种DNA分子，该分子含有MON863玉米外源插入载体的旁邻基因序列，包括：编码玉米NADH脱氢酶亚单位1和2的部分的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同或SEQ ID NO.2中从核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；编码烟草花椰病毒的35S启动子的部分序列，其来源于外源插入载体PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第254-456位的核苷酸序列完全相同；编码小麦tahsp 173’终止子的部分序列，其来源于外源插入载体PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
所述的分离，是指，用TAIL-PCR方法从玉米基因组中扩增出特异DNA分子。
所述的MON863外源插入载体PV-ZMIR13，指的是：用来转化生产MON863玉米的重组质粒，其由NPTII抗性基因表达盒和cry3Bb1基因表达盒组成。
所述的MON863外源插入载体PV-ZMIR13的通用元件，指的是：CaMV35S启动子和小麦tahsp 173’终止子，其分别来源于烟草花椰病毒和小麦基因组。
所述的MON863外源插入载体与植物基因组的邻接区的DNA序列，指的是：一段由玉米基因组序列和外源插入载体序列组成的DNA序列。
其中，MON863玉米品系5’端旁邻基因序列为456bp，该序列包括：编码玉米NADH脱氢酶亚单位1和2的部分的核苷酸序列，长度为253bp，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同；编码小麦tahsp 173’终止子的部分序列，长度为203bp，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
其中，MON863玉米品系3’端旁邻基因序列为411bp，该序列包括：编码玉米NADH脱氢酶亚单位1和2的部分的核苷酸序列，长度为274bp，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；编码编码小麦tahsp 173’终止子的部分序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
本发明的优越性在于，首次克隆了MON863玉米外源基因的旁邻序列，并且明确了MON863玉米品系的外源插入载体的旁邻序列可以用作目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的玉米MON863的品系特异性定性、定量PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入载体PV-ZMIR13的旁邻序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法，这种方法较转基因筛选检测、基因特异性检测和构建特异性检测方法更加特异的检测方法，符合国际上转基因的检测方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
MON863玉米外源插入载体旁邻序列的克隆
一.实验材料
1、植物材料
遗传改良玉米：MON863玉米、Mon810玉米、Bt11玉米、Bt176玉米、TC1507玉米、GA21玉米等。
常规玉米
2、酶与试剂
植物基因组DNA提取试剂盒为上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的食品DNA抽提试剂盒。
dNTPs、Taq DNA聚合酶及其缓冲液、DL2000 Marker购自大连宝生物工程有限公司。随机引物、TaqMan探针及引物由上海博亚生物工程有限公司合成。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
3.实验仪器
DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)
PTC-100型PCR扩增仪(MJ Research Inc.)
Rotor-Gene 2000定量PCR仪(Corbett Research，Australia)
BECKMAN公司的DUR 640核酸和蛋白分析仪
DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)
DNA电泳分析系统包括暗箱、数码照相机、计算机、扫描仪、喷墨打印机、光敏打印机、Tanon UV-2000紫外分析仪、Gis凝胶图象分析软件(上海天能公司)
其他仪器包括：离心机，恒温水浴锅，培养箱，天平等。
二、实验方法与过程
1、外源插入载体的插入情况
通过查阅MON863玉米转基因安全性评价相关的资料，我们发现MON863玉米是通过将外源质粒PV-ZMIR13转化到玉米基因组上获得的。质粒PV-ZMIR13以一个完整的拷贝插入到玉米基因组中，其中包括一个完整的Cry3Bb1基因的表达盒和一个完整的NptII基因的表达盒。
2、外源插入载体各元件来源
转化到MON863玉米基因组中的PV-ZMIR13质粒主要包含两个完整的基因表达盒，一个是Cry3Bb1基因的表达盒，另一个是NptII基因的表达盒。在Cry3Bb1基因的表达盒中，含有4-AS1启动子、wt CAB前导序列、水稻Actin基因5’端部分序列、Cry3Bb1基因和tahsp 173’终止子；NptII基因的表达盒包含CaMV35S启动子、NptII基因和NOS 3’终止子。外源插入质粒PV-ZMIR13各元件的来源详见表1。
表1.质粒PV-ZMIR13L及遗传元件表
  遗传元件   大小(kb)   序列来源
  cry3Bb1基因表达盒
  4-AS1   0.22   Lam and Chua，1990；Odell et al.，1985
  wt CAB   0.06   Lamppa et al.，1985
  ractl intron   0.49   McElroy et al.，1990
  cry3Bb1   1.96   English et al.，2000
  tahsp 17 3’   0.23   McElwain and Spiker，1989
  NptII基因表达盒
  35S   0.35   Odell et al.，1985
  NptII   0.97   Beck et al.，1982
  NOS 3’   0.26   Fraley，et al.，1983
3、植物基因组DNA提取与检测
3.1 植物DNA提取
a)取适量的玉米样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约70mg-100mg磨碎的样品转入1.5ml的Eppendorf管中；
b)视材料量的多少，加入600-700μl已预热的Buffer A，轻轻混匀后，65℃水浴保温1小时，期间间或振荡混匀；
c)在管中加入等体积酚/氯仿(600-700μl)，上下颠倒充分混匀，静置抽提10min；
d)12000rpm离心10分钟，吸取上清到一新的Eppendorf管中；
e)加入与上清等体积的异丙醇(约600μl)，混匀，常温放置10min后，12000rpm离心10min，去上清，保留沉淀；
f)在沉淀中加入60μl TER，37℃放置2min后用枪头将其充分混匀后，于37℃放置约1小时；
g)取出后补加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混匀，静置片刻；
h)12000rpm离心5min，取上清(约180μl)，加入1/10体积3M NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；
i)12000rpm离心10min，去上清，加75％乙醇200μl，12000rpm离心5min，弃上清，室温晾干，溶于50μl无菌ddH2O中。
3.2 DNA检测
取3ul提取的DNA溶液，以1％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和扩散程度来判断DNA的质量。
利用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度与纯度。
4、TAIL-PCR引物设计
根据获得的MON86玉米3的外源插入载体的插入拷贝数、插入方式以及插入载体PV-ZMIR13质粒的各遗传元件的序列，分别针对外源插入载体的5’端序列(M863TL1，M863TL2，M863TL3)和3’端序列用primer 5.0软件各设计三条引物(M863TR1，M863TR2，M863TR3)，分别与六条随机引物配对，进行TAIL-PCR扩增。随机引物和设计的六条单向特异性引物序列见表2。
表2.用于TAIL-PCR扩增的随机引物和特异性引物
  引物   名称   序列(5’-3’)
  随机引物   AD1   NTCGASTWTSGWGTT
 AD2   NGTCGASWGANAWGAA
 AD3   WGTGNAGWANCANAGA
 AD10   TTGIAGNACIANAGG
 AD20   TCTTICGNACITNGGA
 W4   AGWGNAGWANCANAGA
特异性引物(5’端)  M863TL1   5’-CACATCAATCCACTTGCTTTGAAG-3’
 M863TL2   5’-CCATCTTTGGGACCACTGTCG-3’
 M863TL3   5’-GCATCTTGAACGATAGCCTTTC-3’
特异性引物(3’端)  M863TR1   5’-GGAGCCAATTTGGTTGATGTGTG-3’
 M863TR2   5’-GCGAGTTCTTGCGAGTCTGATG-3’
 M863TR3   5’-GTAATCGGCTAATCGCCAACAG-3’
5、外源插入载体旁邻序列的TAIL-PCR扩增
根据刘耀光等的报道，TAIL-PCR一般由三轮普通PCR扩增组成，第1轮PCR扩增反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、10次较低特异性反应和12次热不对称的超级循环构成，反应体系为50μL。第2轮扩增反应则将第一级反应的产物稀释50-1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量，反应体系为100μL。第3轮扩增反应又将第2次反应的产物稀释50-1000倍作为模板，一般设置为普通的PCR反应或热不对称的超级循环，反应体系为100μL。通过上述3轮PCR扩增反应获得与已知序列邻近的目标序列。
TAIL-PCR的反应程序和条件见表3。
表3. TAIL-PCR反应程序和条件
  反应   步骤   循环数   PCR条件
  第一轮   1   1   93℃(1min)，95℃(1min)
  2   5   94℃(1min)，62℃(1min)，72℃(3min)
3 1   94℃(1min)，25℃(3min)，ramping to94℃ over 3min，72℃(3min)
  4   15   94℃(30s)，68℃(1min)，72℃(3min)
  94℃(30s)，68℃(1min)，72℃(3min)
  94℃(30s)，44℃(1min)，72℃(3min)
  5   1   72℃(5min)
第二轮 6 12   94℃(30s)，64℃(1min)，72℃(3min)94℃(30s)，64℃(1min)，72℃(3min)94℃(30s)，44℃(1min)，72℃(3min)
  5   1   72℃(5min)
第三轮   7   20   94℃(30s)，44℃(1min)，72℃(3min)
  5   1   72℃(5min)
6、特异性扩增片段克隆
6.1 特异性片段电泳回收
用2％琼脂糖凝胶(含10ng/ml EB)电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒回收，PCR产物最终溶于25-30μl的Eluent Buffer中。
6.2 特异性片段DNA连接
在无菌Eppendorf管中加入：1μl 10×T4DNA ligase Buffer，8μl回收的PCR产物，0.25μl pMD18-T载体，1μl T4 DNA连接酶，总体积为10μl。将各组分混匀，4℃中连接16h。当PCR产物与载体DNA片段通过酶切形成的互补粘端相连时，两者之间的质量比为5∶1。
6.3 感受态细胞制备
在LB平板上划线接种大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。用接种环挑取10-12个单菌落(2-3mm直径)，接种于250mL的SOB培养液中。振荡培养(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置于冰上10min。离心(4℃，3000rpm，10min)，收集细胞。用80ml预冷的TB溶液重悬细胞，冰浴10min。离心(4℃，3000rpm，10min)，收集细胞。用20ml预冷的TB轻轻地重悬细胞，加入DMSO至终浓度7％，轻轻混匀，置于冰上。10min后，按每管500μl分装细胞悬液于无菌的eppendorf管中。用液氮快速冷冻，储存于-70℃。
6.4 转化
在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受态细胞与10μl的DNA连接产物，手指轻弹管壁，混匀混合物。冰浴30min。42℃，温育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培养液，37℃，剧烈振荡混合液1h。将混合液涂布在选择性培养基上，37℃培养过夜。
6.5 测序
采用ABI377型测序仪(购自美国ABI公司)测定DNA序列，用PCGENE软件分析序列，由上海博亚生物公司完成。
7、外源插入载体旁邻序列分析
将测序获得的序列在网上进行BLAST，生物信息学分析，最终确定所扩增获得的特异序列是否为外源插入载体的旁邻序列。
三、实验结果
1、TAIL-PCR扩增获得特异性片段
根据TAIL-PCR扩增方法，单向特异性的PCR引物和随机引物的组合，经过三轮PCR扩增，在对第二、三轮扩增产物的电泳分析结果表明获得了特异性的MON863玉米品系外源插入载体的旁邻基因片段。
2、特异性片段测序结果分析
2.1MON863玉米品系的5’端玉米基因组和外源插入载体的邻接区序列
TAIL-PCR方法扩增获得的单一MON863玉米品系的5’端玉米基因组和外源插入载体的邻接区DNA片段，经过DNA序列分析和生物信息学分析，邻接区的序列长度为411bp，其中含有274bp玉米基因组的序列，137bp外源插入载体的CaMV35S启动子的5’端序列，具体的MON863玉米品系的5’端玉米基因组和外源插入载体的邻接区DNA的序列信息见Seq No.1。
2.2MON863玉米品系的3’端外源插入载体和玉米基因组的邻接区序列
TAIL-PCR方法扩增获得的单一的MON863玉米品系的3’端玉米基因组和外源插入载体的邻接区DNA片段，经过DNA序列分析和生物信息学分析，邻接区的序列长度为456bp，其中含有253bp玉米基因组的序列，203bp外源插入载体的tahsp 173’终止子的5’端序列，具体的MON863玉米品系的5’端玉米基因组和外源插入载体的邻接区DNA的序列信息见Seq No.2。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)名称：上海交通大学
(B)地址：上海市东川路800号
(C)国家：中国
(D)邮编：200240
(E)电话：(021)34201073
(F)传真：(021)34201073
(ii)发明名称：遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法
(iii)序列数：2
(2)SEQ ID No.1的信息：
(i)序列特征
(A)长度：411碱基
(B)类型：核苷酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)其他信息描述：MON863玉米的5’端插入的旁邻基因序列
(iv)序列描述：SEQ ID No.1
GCACTCAAAG ACCTGGCGAA TGAGGGCCCA CCCAAGAGCG CTTATGTCAT ATGGGAACTC      60
TTGGCTGGAA ACAATCCTTA TGGTTTTTAT ATCCGGTTAG AATAATAAGA AAGAATCAAA     120
GTCCAGGTTG GTTGGTGAGC CTAGTGATAG GAGACTATCT AGCTTGGTTC GGAGAGCACT     180
TGTTGGGTTT AAGATTAGTT TTTTGCTAAA TGTTACGGCC TAAATGCTGA ACTATTGACC     240
CTACTTGTTC GGATGGGTGT TCACCCCAAA GTGTACCAAG CTTTCCGATC CTACCTGTCA     300
CTTCATCAAA AGGACAGTAG AAAAGGAAGG TGGCACCTAC AAATGCCATC ATTGCGATAA     360
AGGAAAGGCT ATCATTCAAG ATGCCTCTGC CGACAGTGGT CCCAAAGATG G              411
(3)SEQ ID No.2的信息：
(i)序列特征
(A)长度：456碱基
(B)类型：核苷酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(iii)其他信息描述：MON863玉米的3’端插入的旁邻基因序列
(iv)序列描述：SEQ ID No.2
GCGAGTTCTT GCGAGTCTGA TGAGACATCT CTGTATTGTG TTTCTTTCCC CAGTGTTTTC           60
TGTACTTGTG TAATCGGCTA ATCGCCAACA GATTCGGCGA TGAATAAATG AGAAATAAAT          120
TGTTCTGATT TTGAGTGCAA AAAAAAAGGA ATTAGATCTG TGTGTGTTTT TTGGATCCCC          180
GGGGCGGCCG CGGGGAATTC GGTCTCCCTA TAGAGCAGAG CATAGTGACA AAAGTTCCAT          240
TTAGATATGG TTGTATCATA TGTATATAAA GAATGTACTC GCAATGAACT GGCTAAGTCC          300
AACCAACCAT GATGGCAGCC TGCCCCCCTA TAGCCAAAGC AAGCGATAGC AAATAGTGAT          360
TTTATGGAGT AAGCTTCGCT CCGCGCCAAT TAGAAAAAAG TGAAAAGACT CTATGCTCTG          420
CTCATATAGA TATGGGATTC CTACTGGGGT TCATGA                                    456

Claims (7)

1、一种玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，其特征在于，分离出一种的DNA分子，该分子含有MON863玉米外源插入载体的旁邻基因序列，包括：编码玉米NADH脱氢酶亚单位1和2的部分的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同或SEQ IDNO.2中从核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；编码烟草花椰病毒的35S启动子的部分序列，其来源于外源插入载体PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第254-456位的核苷酸序列完全相同；编码小麦tahsp173’终止子的部分序列，其来源于外源插入载体PV-ZMIR13，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
2、根据权利要求1所述的玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，其特征是，所述的分离，是指，用TAIL-PCR方法从玉米基因组中扩增出特异DNA分子。
3、根据权利要求1所述的玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，其特征是，所述的MON863外源插入载体PV-ZMIR13，指的是：用来转化生产MON863玉米的重组质粒，其由NPTII抗性基因表达盒和cry3Bb1基因表达盒组成。
4、根据权利要求3所述的玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，其特征是，所述的MON863外源插入载体PV-ZMIR13，其通用元件，指的是：CaMV35S启动子和小麦tahsp 17 3’终止子，其分别来源于烟草花椰病毒和小麦基因组。
5、根据权利要求1或3或4所述的玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，其特征是，所述的MON863外源插入载体，其与植物基因组的邻接区的DNA序列，指的是：一段由玉米基因组序列和外源插入载体序列组成的DNA序列，其中，MON863玉米品系5’端旁邻基因序列为456bp，MON863玉米品系3’端旁邻基因序列为411bp。
6、根据权利要求5所述的玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，其特征是，所述的玉米基因组序列和外源插入载体序列，包括：编码玉米NADH脱氢酶亚单位1和2的部分的核苷酸序列，长度为253bp，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-253位的核苷酸序列完全相同；编码小麦tahsp 17 3’终止子的部分序列，长度为203bp，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
7、根据权利要求5所述的玉米品系MON863的外源插入载体的旁邻基因序列，其特征是，所述的MON863玉米品系3’端旁邻基因序列，包括：编码玉米NADH脱氢酶亚单位1和2的部分的核苷酸序列，长度为274bp，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从核苷酸第138-411位的核苷酸序列完全相同；编码编码小麦tahsp 17 3’终止子的部分序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ IDNO.2中从核苷酸第1-137位的核苷酸序列完全相同。
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CN 200510027952 Pending CN1740322A (zh) 2005-07-21 2005-07-21 玉米品系mon863的外源插入载体的旁邻基因序列

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101240279B (zh) * 2007-02-09 2010-06-23 中国农业科学院植物保护研究所 转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列
CN101240278B (zh) * 2007-02-09 2011-07-06 中国农业科学院植物保护研究所 转基因水稻品系克螟稻1的pcr检测方法
CN101240277B (zh) * 2007-02-09 2011-07-20 中国农业科学院植物保护研究所 转基因水稻品系Bt汕优63的PCR检测方法
CN102409093A (zh) * 2011-11-17 2012-04-11 四川省农业科学院分析测试中心 转基因玉米mon863品系特异定量pcr检测方法

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