CN100347305C - 一种增强小麦抗旱性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强小麦抗旱性的方法。本发明所提供的增强小麦抗旱性的方法，是将DREB转录因子的编码基因插入植物表达载体，得到含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入小麦中，得到抗旱性增强的小麦。本发明的方法能显著改良小麦的抗旱性。

Description

一种增强小麦抗旱性的方法

技术领域

本发明涉及一种增强小麦抗旱性的方法。

背景技术

干旱是严重影响作物生长和产量的主要环境限制因素之一，由于难以预测的特性，抗旱品种的选育要比其它抗性品种的选育困难得多。小麦和其它作物一样，虽然从基因的角度控制耐旱性在理论上来说是很容易的，可是在实际的育种工作中却困难重重。尽管传统的抗旱育种方法在过去取得了一定的成绩，但是大量的消耗了时间和人力，并且在全世界小麦的干旱产区中所取得的成效并不是很显著随着分子生物学的迅速发展，利用抗旱植物基因工程的方法来增加小麦对干旱的抵抗力，从而提高小麦产量的分子育种方式正在逐步成为今后育种工作的主体。

在干旱胁迫下，植物表达的基因分为两类：1.基因编码的产物为一些功能蛋白和酶类，如LEA，水通道蛋白，脯氨酸合成酶等；2.基因编码的产物为传递信号和调控基因表达的转录因子，如bZIP，MYC，DREB等。由于第一类基因的产物明确，研究的比较透彻，目前已经获得了一些耐旱转基因植物。对于第二类基因，鉴于这些基因的表达调控其下游一系列功能基因，目前已成为抗旱基因工程的重点。DREB(Dehydration Responsive Element Binding)蛋白(转录因子)是拟南芥菜中发现的一个顺式调控元件，DREB转录因子属于目前已发现的AP2/EREBP家族中的EREBP型转录因子，包括DREB1A～C和DREB2A～B等许多成员。氨基酸序列分析表明，DREB转录因子都含有C-末端的酸性转录激活区，N-末端碱性核定位信号区。它们的AP2/EREBP结构域由58个氨基酸残基组成，含有可形成3个β-折叠和1个α-螺旋的保守序列，两者都能与核心序列为PuCCGAC的DRE元件结合。拟南芥菜中DREB1A和DREB2A转录因子分别调控与低温和干旱高盐胁迫耐性相关的rd17，kin1，cor6.6，cor15a，erd10以及rd29A等多种基因，不仅上述基因在正常环境下表达，在干旱或低温处理条件下，它们的表达也较野生型显著增强，并能引起脯氨酸含量的提高，从而使植株多方面的抗逆性(抗旱、抗冻及抗盐)得到提高。

生物技术途径和基因工程使抗旱基因转入受体植株的小麦抗旱分子育种方式得以实现，但是抗旱基因能否成功转入，目的基因能否表达，受体植株能否表现出外源基因所控制的性状，还需要通过一系列的实验来鉴定。在小麦中，小麦抗旱性有苗期，后期和全生育期抗旱之分，苗期进行器官建成，并为产量奠定物质基础。苗期抗旱性成为初次筛选的必要途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强小麦抗旱性的方法。

本发明所提供的增强小麦抗旱性的方法，是将DREB转录因子的编码基因插入植物表达载体，得到含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入小麦中，得到抗旱性增强的小麦。

所述植物表达载体可为Ti类质粒载体或病毒载体或基因枪转化用常规载体。

所述DREB转录因子的编码基因可来源于拟南芥菜或小麦或水稻或玉米或大豆或油菜等。

所述DREB转录因子的编码基因优选为来源于拟南芥菜。

所述DREB转录因子的编码基因是具有Genbank Access No.AB013816的自5′端第612至1320位碱基的DNA片段。为了便于插入表达载体，可在5′设计加上BamHI位点，在3′端设计加上SacI位点，序列全长727bp，如序列表中的序列1，自5′端第1位至第6位脱氧核苷酸为BamHI识别位点，自5′端第722位至第727位脱氧核苷酸为SacI识别位点。

在所述重组质粒表达载体中，启动所述DREB转录因子的编码基因转录的启动子是拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子、拟南芥菜亲水蛋白RD29A基因的启动子或SAG12启动子等逆境诱导型；或玉米polyubiqutin基因启动子、花椰菜花叶病毒CaMV 35S等组成型启动子。

所述拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子，含Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位碱基的DNA片段。为了便于插入表达载体，可在5′设计加上HindIII位点，在3′端设计加上BamHI位点，序列全长1706bp，如序列表中的序列2，自5′端第1位至第6位脱氧核苷酸为HindIII识别位点，自5′端第1701位至第1706位脱氧核苷酸为BamHI识别位点。

所述含有RD29B启动子驱动的DREB转录因子的编码基因的重组表达载体为pBAC123(5102bp)；或为在pBAC123的HindIII位点插入CaMV 35S启动子驱动的bar基因和NOS终止子序列，得到的以bar基因作为选择标记的重组表达载体pBAC128F(7024bp)。

所述方法中，是以小麦幼穗或幼胚为外植体，将含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体导入小麦。

携带有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体可通过基因枪法、使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化小麦细胞或组织。

所述携带有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体优选通过基因枪法导入小麦。

所述基因枪转化体系，以非选择性除草剂PPT(Phosphinothricin，商品名Basta)，或bialaphos，或Glufosinate ammonium(草氨膦，Sigma)作为转化抗性的选择剂。本发明采用PPT作为选择剂。

本发明的增强小麦抗旱性的方法，特别适合于以下小麦品种：8901，5-98，99-92和保丰104。

本发明以冬小麦品种8901，5-98，99-92和104等品种的幼穗和幼胚为材料，用基因枪转化含逆境诱导转录因子DREB(由拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子驱动)和bar基因作为选择标记的重组表达载体pBAC128F(7024bp)；经筛选与植株再生，共获得70多个转基因小麦植株及其后代株系。转基因株系经PCR分析、RNA点杂交检测、和植株脯氨酸含量等生理指标分析，结果表明外源转录因子DREB基因已稳定整合到转基因植株及其后代株系中，并且在部分后代株系中获得了表达。叶片脯氨酸含量测定表明，有16个转基因株系的脯氨酸含量与非转基因对照相比，增加相当显著，其中10个株系的脯氨酸含量在1100μg/g以上，比对照提高了2倍多。室内抗旱模拟试验表明，转基因株系停止浇水15天后，叶片仍然表现绿色，而对照叶片则失绿、枯干；复水10天后，转基因株系恢复活力，对照则死亡。实验结果表明，利用逆境诱导型启动子(RD29B)来增强外源DREB基因的表达，能显著改良小麦的抗旱性。

附图说明

图1为植物表达载体pBAC128F的结构示意图

图2为T₀代转基因植株的PCR检测

图3为T₁代转基因植株的点杂交鉴定

图4为T₁代转基因植株的PCR检测

图5为非转基因植株和7个转基因植株T₁代株系的叶片总RNA电泳图谱

图6为干旱处理五天后部分转基因小麦的脯氨酸含量

图7A为停止浇水15天后非转基因植株的生长情况

图7B为停止浇水15天后部分转基因植株的生长情况

图7C为复水10天后非转基因植株的生长情况

图7D为复水10天后部分转基因植株的生长情况

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

T₀表示由小麦的愈伤组织得到的转基因植株，T₁表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株。

实施例1、增强小麦抗旱性

1、植物表达载体pBAC128F的构建

植物表达载体pBAC128F的物理图谱如图1所示，具体构建方法如下：

(1)DREB基因的克隆

根据已发表的拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)的DREB基因序列(GenbankAccess No.AB013816)，设计并合成该基因的特异引物：P1：上游引物5′-GGATCCTGATCAATGAACTCATTTTC，下游引物P2：5′-GAGCTCCCATTCTAAAAAAGGAAC，以拟南芥菜的基因组DNA为模板，利用PCR克隆出该基因。其中，PCR的温度条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增得到的约730bp DNA片段用凝胶回收试剂盒(北京天为时代科技有限公司)按供应商提供的方案回收该片段，用pGEM-Teasyvector系统(Promega公司，美国)按供应商提供的方案克隆该片段，测序(上海申友生物技术公司)，测序结果表明，该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。通过与DREB基因序列(Genbank Access No.AB013816)比较，证实克隆到具有Genbank Access No.AB013816的自5′端第632至1320位基因序列片段。

(2)DREB基因表达载体pBAC128F的构建

质粒pBAC128F的构建方法、过程及基因转化参照《分子克隆》第二版(SambrookJ，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning-A Laboratory Manual.2 nded.New York：Cold Spring Harbor laboratory Press，1989)。具体方法如下：

1)用SacI和EcoRI双酶切质粒pSP72(购自Promega公司)，插入约260bp的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS 3’终止子序列(从质粒载体pBARGUS，用SacI和EcoRI双酶切，Vasil，et al，Bio/technology，10：667-674，1992)。构建成的质粒定名为pBPC18。

2)由PCR克隆获得的约730bp DREB基因片段，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，经DNA测序验证正确后，用BamHI和SacI双酶切，插入pBPC18的BamHI和SacI位点。构建成的质粒定名为pBAC118。

3)由拟南芥菜的基因组DNA为模板，上游引物P1：5′-GCGGAAGCTTCATTTTCTGCTACAG，下游引物P2：5′-GGATCCTTTCCAAAGCTGTGTTTTCTCTTTTTC进行PCR克隆获得的1.7kb RD29B启动子片段(Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位碱基的DNA片段)，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，经DNA测序验证正确后，用HindIII和BamHI双酶切，插入pBAC118的HindIII与BamHI位点之间。构建成的质粒定名为pBAC123。

4)质粒pBAC123用HindIII酶切，插入两端为HindIII粘性末端的CaMV 35S启动子与玉米Adh1 intron驱动的bar基因以及以NOS 3’为终止子的片段(Vasil，et al，Bio/technology，10：667-674，1992)。构建的质粒正向插入定名为pBAC128F(图1)，反向插入定名为pBAC128R。

pBAC128F的目的基因DREB(DREB11B)以拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子(1.7kb)为驱动，即为逆境诱导表达类型。同时含有CaMV 35S启动子和玉米Adh1基因的Intronl驱动的bar基因作为选择标记。

2、植物表达载体pBAC128F转化小麦

以冬小麦8901，5-98，99-92和保丰104品种为受体品种，选取幼穗、幼胚为外植体，按照文献(张晓东，梁荣奇，陈绪清，等.优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析.科学通报，2003，48(5)：474-479)描述的方法，将pBAC128F用基因枪微弹轰击转化外植体，将转化的外植体在含除草剂PPT的培养基上进行选择，并进而经过分化再生培养获得72株T₀代转基因再生植株，其中保丰104(13株)，8901(31株)，5-98(26株)，99-92(2株)。

3、转基因植株的分子分析

(1)转基因植株的PCR检测和点杂交分析

(i)T₀代转基因植株的PCR检测

基因组DNA提取采用CTAB法。转基因植株的PCR检测，使用DREB基因上游引物P1和下游引物P2，以未转化植株为阴性对照，质粒pBAC128F为阳性对照。反应体系为：总体积为25μl，10×PCR缓冲液2.5μl，引物(10μM)各1μl，dNTPs 2μl，ddH₂O 13μl，Taq酶1U，MgCl₂2μl，模板DNA 1μg。其循环扩增程序为：先94℃预变性5min；然后94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR检测结果表明13株104品种转基因植株中有4株可扩增得到724bp左右的DREB基因的特异片段，31株8901品种转基因植株有6株可扩增得到724bp左右的DREB基因的特异片段，26株5-98品种转基因植株中有16株可扩增得到724bp左右的DREB基因的特异片段，2株99-92品种转基因植株中有1株可扩增得到724bp左右的DREB基因的特异片段。T₀代转基因植株的PCR检测结果如图2所示，表明所获得的部分转基因植株(泳道5，6，9，10等)与阳性对照质粒(泳道1)都能扩增出了724bp左右的DREB基因的特异片段，阴性对照(无模板DNA，泳道2)和非转基因植株(泳道3)没有扩增带，表明外源DREB基因已经进入了转基因植株。图2中，泳道1质粒pBAC128F；泳道2阴性对照(水)；泳道3非转基因植株；泳道4-19分别示104，5-98和8901转基因植株，其中，泳道4-8为104品种的转基因植株，泳道9-12为5-98品种的转基因植株，泳道13-19为8901品种的转基因植株。

(ii)T₁代转基因植株的DNA分子杂交检测

将经上述PCR检测得到724bp左右的DREB基因的特异片段的T₀代植株进行种植，获得T₁代转基因植株，分别提取叶片基因组DNA，用地高辛(DIG，Roche)标记724bp的DREB基因(该724bp的DREB基因是以拟南芥菜的基因组DNA为模板，利用引物P1和P2PCR扩增得到)作为探针，进行点杂交检测。该点杂交分析，使用Bio-Rad公司Bio-Dot Microfiltration点杂交仪进行点膜，按Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit进行杂交和检测，以PCR法对DREB基因进行DIG标记。点杂交结果如图3所示，表明大部分转基因植株中有杂交信号，其中有部分点为强信号，证明了外源基因已整合到了小麦的基因组中。不过，非转基因对照也可见杂交信号，这说明很可能在小麦的基因组中也存在类似的DREB转录因子或同源性较高的DNA序列。图中，“+”列示质粒pBAC128F；“CK”列示非转基因植株；其他列示转基因植株。

(iii)T₁代转基因植株的PCR检测

由于点杂交存在假阳性，因此有必要进一步验证。从点杂交的结果选取强信号的19个转基因株系进行PCR扩增，扩增方法同T₀代转基因植株，表明这19个株系中只有12个株系存在724bp的特异带，与点杂交结果相互验证，最终确认了这12个株系为转基因株系，即104品种中的104-20，104-25，104-79，104-18；8901品种中的8901-50，8901-51，8901-32；5-98品种中的5-98-69，5-98-70，5-98-73，5-98-76；99-92品种中的99-92-63。尽管可能在小麦的基因组中存在类似的DREB基因，但由于序列的差异未能在对照扩增出相同大小的DNA片段。其中18个转基因株系的PCR结果如图4所示，图4中，1示质粒pBAC128F；2示非转基因植株；3-20分别示转基因植株：104-20，104-25，8901-42，5-98-8，5-98-11，104-17，5-98-69，5-98-73，8901-38，8901-50，8901-51，104-79，104-78，8901-45，8901-32，104-18，8901-43，99-92-63。

(iv)T₁代转基因植株的RNA的分子杂交鉴定

T₁代转基因植株7株(104-20，104-25，5-98-69，104-18，8901-51，99-92-63和8901-32)和非转基因植株在生长至分蘖期时，干旱处理5天后，取样，提取叶片总RNA。植物总RNA的提取采用异硫氰酸胍法(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning-A Laboratory Manual.2 nd ed.New York：Cold Spring Harbor laboratory Press，1989)。提取的叶片总RNA用1.5％琼脂糖凝胶在1×TAE中进行电泳，电泳结果如图5所示，图中，1示非转基因植株总RNA，2-8示转基因植株总RNA。

RNA样品用6×SSC稀释至0.4mg/ml，样品置于65℃水浴中变性15min，置冰上骤冷，点膜，杂交和检测同DNA点杂交分析，其中，探针是用地高辛(DIG，Roche)标记的724bp的DREB基因，该724bp的DREB基因是以拟南芥菜的基因组DNA为模板，利用引物P1和P2 PCR扩增得到的。杂交结果表明，所选的7个转基因植株中外源基因能够正常转录。

4、小麦叶片游离脯氨酸含量的测定

脯氨酸作为一种渗透调节物质，有高湿性，是一种防脱水剂，与植物的抗旱性关系密切。一般来说，同一品种，脯氨酸含量越高，抗旱性越强。

将经步骤3的(1)的(i)PCR检测为阳性的T₀代植株种植培育至苗期，按照文献(徐晓峰，朱才.小麦叶中脯氨酸测定方法的研究，生物技术.1997，7(1)：40～42)的方法测定小麦叶片游离脯氨酸含量，具体方法如下：采用室内模拟干旱条件的方法，在小麦四叶期时停止浇水5天后，称取小麦叶片0.1g，剪碎后放入试管中，加5ml 3％磺基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10分钟，冷至室温。吸取浸提液2ml于另一试管中，加入2ml水，2ml冰乙酸和4ml 2.5％酸性茚三酮溶液(以3∶2的冰乙酸和6mol/L磷酸为溶剂进行配制)，至沸水浴中显色60分钟，冷却至室温。加入4ml甲苯，振荡，以萃取红色物质。静置后，吸取甲苯层于721型分光光度计520nm波长处比色，得OD值。标准曲线的制作：配制浓度为1～10μg/ml的十个系列脯氨酸标准溶液。取标准溶液2ml和2ml 3％磺基水杨酸溶液代替样品测定中的2ml浸提液和2ml水，按上述程序进行显色，萃取和比色(波长520nm)，最后绘制标准曲线。

根据测得的值计算小麦叶片游离脯氨酸的含量：脯氨酸含量(μg/g)＝C*2.5/W

式中：C-----以标准曲线获得的被测样品的脯氨酸含量(μg)

      W-----小麦叶片重量(g)

      2.5---提取脯氨酸时浸提液3％磺基水杨酸体积(5ml)与测定时所取样品液体积(2ml)比

T₁代转基因植株苗期叶片脯氨酸含量测定结果表明部分转基因株系比非转基因对照脯氨酸含量有明显提高，可提高2倍多。图6仅列出脯氨酸含量增幅明显的16株。其中8901-66，5-98-69，5-98-70，104-79等株系的脯氨酸含量在1100μg/g以上，相比对照提高了2倍以上。图中CK表示相应未转基因品种的对照。

5、转基因植株的抗旱效果鉴定

一个小麦品种能否抗旱，抗旱程度多大，虽然在相关生理指标可以进行鉴定，但其是否真正具有抗旱性，仍需要通过实际的检验。采用室内模拟干旱条件的方法，在104品种中的104-20，104-25，104-79，104-18；8901品种中的8901-50，8901-51，8901-32；5-98品种中的5-98-69，5-98-73，99-92品种中的99-92-63T₁代小麦四叶期时停止浇水15天，然后恢复浇水10天。结果表明这些转基因株系在停止浇水15天后，叶片仍然表现绿色，而对照叶片则失绿、枯干；复水10天后，转基因株系恢复活力，对照则死亡。图7A和图7B分别显示了停止浇水15天后非转基因植株和部分转基因植株的生长情况，图7C和图7D分别显示了复水10天后的非转基因植株和部分转基因植株的生长情况。

                            序列表

<160>2

<210>1

<211>727

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ggatcctgat caatgaactc attttcagct ttttctgaaa tgtttggctc cgattacgag    60

cctcaaggcg gagattattg tccgacgttg gccacgagtt gtccgaagaa accggcgggc    120

cgtaagaagt ttcgtgagac tcgtcaccca atttacagag gagttcgtca aagaaactcc    180

ggtaagtggg tttctgaagt gagagagcca aacaagaaaa ccaggatttg gctcgggact    240

ttccaaaccg ctgagatggc agctcgtgct cacgacgtcg ctgcattagc cctccgtggc    300

cgatcagcat gtctcaactt cgctgactcg gcttggcggc tacgaatccc ggagtcaaca    360

tgcgccaagg atatccaaaa agcggctgct gaagcggcgt tggcttttca agatgagacg    420

tgtgatacga cgaccacgga tcatggcctg gacatggagg agacgatggt ggaagctatt    480

tatacaccgg aacagagcga aggtgcgttt tatatggatg aggagacaat gtttgggatg    540

ccgactttgt tggataatat ggctgaaggc atgcttttac cgccgccgtc tgttcaatgg    600

aatcataatt atgacggcga aggagatggt gacgtgtcgc tttggagtta ctaatattcg    660

atagtcgttt ccatttttgt actatagttt gaaaatattc tagttccttt ttttagaatg    720

ggagctc                                                              727

<210>2

<211>1706

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aagcttcatt ttctgctaca gaagtgttgt tctctgtaaa gtaatcagaa ggaatgtaat    60

caacagaata aatctgctct tgaatgtcct ttgagttctg caggataata tctgacccct    120

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tcactcgtgc ataagagctt gttctcctgt atatcaaaag atgctttatc tcgcaatgaa    360

aaagaaaaag ctgaactagt tcaattagta caatgcttac acagcttgag caataccatc    420

tcaaaatcca actctggagt ctccaactca ataattttag gtgtagcttt atccgcaatg    480

gatctccgtc atccttcttc gaatagatca taacttcggt tttcaactcg gtattcgctt    540

aagcaccaaa atttccaacc caagtatgaa tataagatct aagcaacaat cagaaatgga    600

aactgagaaa acacaccaca aatttcgaaa aatctacaac caatctcact ataagaaaca    660

aaggaccgtt gacagaaaca gtcagcgaga ctcaggaaat tcgaaatttc acctccagga    720

actgataata tctagatcga aggaacttta cctcgtctga gtaataaact ccgagcgaag    780

agtcgtcgat ttcaaaaact cgatagtcca cactgacgcg gtcgggaacc acgtcggaaa    840

ggaacttcga caaagcagct tcaataggca aatttccgat agggatacta acattttcga    900

tcgagccaaa tcggagacgg tcttcttctc cgttgtagac gatgggtgcc gggaaattat    960

caggagccgg aagattgagg aagcctaggg tttcaaatac gtgagaaggt ggagtagaga    1020

agtaatcgat gttgagacat cgagttcgca tcgtaatttt ctagatccgt cttgggagct    1080

cagactgtat cagtgatgat gatgatgatg aagaagagaa cgaattttga aattggcggt    1140

tttgaatttt taagaaatta aaaaatatcc cccgtcgatt tcaagaggga gatggagata    1200

ccaaagcaac tctcgccact tgtcgtcttt taattttaat tgagtacgtt atgccgtttt    1260

aaatgttcaa aacagcacac agttgatagc tgaattgatt ttttcttttg ccgttttgtt    1320

atatttaaac aacacacagt gcatttgcca aataactaca tgatgggcca ataaacgtgg    1380

accgactaaa actaaataat agaagataca tcgataggct tctctaaaga tcggataaaa    1440

gataatgtcg catagccacg tagagagcaa ctggctgaga cgtggcagga cgaaacggac    1500

gcatcgtacg tgtcagaatc ctacagaagt aaagagacag aagccagaga gaggtggttc    1560

ggccatatgt catcgttctc tctataaact ttatggaact ttgttctgat tttctcagag    1620

acacgaaaag aaagaaaaca acactagaac aaagagggtt tgattgattc acttgaaaaa    1680

gagaaaacac agctttggaa ggatcc                                         1706

Claims (5)

1、一种增强小麦抗旱性的方法，是将由拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子启动的DREB转录因子的编码基因插入植物表达载体，得到含有DREB转录因子编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入小麦中，得到抗旱性增强的小麦；所述DREB转录因子的编码基因为Genbank Access No.AB013816的自5′端第612至1320位碱基的DNA片段。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述拟南芥菜亲水蛋白RD29B基因的启动子是Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位碱基的DNA片段。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，是以小麦幼穗或幼胚为外植体，将含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体导入小麦。

4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含有DREB转录因子的编码基因的重组表达载体通过基因枪法导入小麦。

5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述小麦选自以下品种：8901，5-98，99-92或保丰104。

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