CN1609209A

CN1609209A - 小麦半胱氨酸蛋白酶基因及其应用

Info

Publication number: CN1609209A
Application number: CN 200410088515
Authority: CN
Inventors: 景蕊莲; 臧庆伟; 郭志爱; 昌小平
Original assignee: INST OF CROP VARIETY RESOURCE
Current assignee: INST OF CROP VARIETY RESOURCE
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2005-04-27

Abstract

本发明通过对小麦cDNA文库的筛选，获得抗旱相关候选EST，利用RACE和RT－PCR技术克隆了一个抗旱相关基因半胱氨酸蛋白酶基因TaCP(Triticum aestivum cysteine proteinase)。另外，本发明还涉及小麦半胱氨酸蛋白酶TaCP及编码它的基因TaCP的应用。该基因受各种外界胁迫因子，如干旱、低温、盐碱、伤害、乙烯等的诱导而表达，可促进细胞凋亡，从而起到防御的作用。该基因的克隆对于利用转基因方法培育小麦抗旱节水新品种及小麦抗旱分子生物学研究具有重要的现实意义。

Description

小麦半胱氨酸蛋白酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，本发明涉及小麦抗旱相关蛋白，即小麦半胱氨酸蛋白酶TaCP，及编码它的基因TaCP；另外，本发明还涉及小麦半胱氨酸蛋白酶TaCP及编码它的基因TaCP的应用。

背景技术

干旱缺水是全球农业生产面临的严重问题，也是制约我国粮食生产发展的重要因素。小麦是人类的主要粮食作物，全世界发展中国家至少有6000万公顷小麦栽培在雨养耕地，产量水平只有灌溉条件下的10％-50％。我国平均每生产1吨小麦的需水量约为500-700m³。有证据表明，种植抗旱节水品种可明显提高作物的水分利用效率。因此，培育抗旱节水品种是缓解水资源短缺矛盾的一种最经济有效的途径。

改良作物抗旱性对于提高农业生产力具有重大意义，受到世界各国的高度重视。其中，研究抗旱机理、克隆抗旱基因、通过植物基因工程改良作物抗旱性是一条有效途径。由于抗旱性遗传基础的复杂性，克隆转化抗旱基因的难度较大，但是，已经有一些成功的例子。在转基因方面，Cheng等[Molecular Breeding.2002，10(1-2)：71-82]已经把小麦的LEA蛋白基因导入水稻，提高了转基因植株对旱、盐的耐性；WU等[Chinese Science Bulletin.2003，48(23)：2594-2600]将拟南芥的6-OAT基因转入水稻使其过量表达，分析表明在叶和根中脯氨酸含量明显增加，增强了植株对旱和盐的抗性。Dubouzet等(Plant J.2003，33：751-763)把水稻编码转录激活蛋白基因OsDRE1A导入拟南芥后，转化植株表现了强抗旱、抗盐和耐寒特性。

目前，已克隆的抗旱相关基因主要包含以下几种类型：(1)在转录因子上主要包括在拟南芥中发现的DREB1 A-C、DREB2 A-B、CBF1-3、Hs和AtGluR2等[曾华宗等。植物遗传资源学报，2003，4(3)：270-273]；(2)在编码氨基酸合成方面以脯氨酸(Pro)合成酶基因为主，包括吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS及PVAB2，吡咯琳-5-羧酸还原酶基因P5CR及PproC1和榆钱菠菜脯氨酸转运蛋白基因AhProT1等；(3)在功能蛋白方面以晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)为主，包括棉花的D19、B19.1D11、D29，拟南芥的COR15a和PrabaT1，小麦的LEA蛋白基因；(4)半胱氨酸蛋白酶基因也已经在几种作物中得到克隆，包括，在大麦中克隆的HvSF42基因(Christian等。Physiologia Plantarum，2003，118：278-288)及在陆地棉中克隆的GhCP基因[蒋建雄等，作物学报，2004，30(5)：512-515]。

上述(4)的半胱氨酸蛋白酶和核酸内切酶是在植物细胞程序性死亡(PCD)发生过程中两种普遍存在且具有催化活性的相关蛋白，其中，半胱氨酸蛋白酶的作用类似于动物PCD中的ICE族(木瓜蛋白酶家族)蛋白酶，其在植物中很可能参与死亡细胞的胞质降解与清除。半胱氨酸蛋白酶受外界胁迫因子，如盐碱、干旱、低温、伤害、乙烯等的诱导而表达，与叶、子房、根瘤和花等的发育、衰老生理相关。然而，迄今为止，还未有关于编码小麦抗旱相关基因半胱氨酸蛋白酶的基因的报道。

发明内容

针对上述研究背景，本发明人通过对小麦水分胁迫诱导表达cDNA文库的筛选，获得特异的EST(表达序列标签)，利用RACE(rapidamplification of cDNA ends，快速扩增cDNA末端)和RT-PCR(reversetranscription-PCR，反转录聚合酶链式反应)技术成功地克隆了小麦半胱氨酸蛋白酶基因的全长cDNA序列，命名为TaCP(Triticum aestivumcysteine proteinase)，将其编码的半胱氨酸蛋白酶命名为TaCP，从而完成了本发明。

应当指出，包括自然发生的多态变异，例如由获得蛋白质的生物的物种、个体等的差异导致；由通过定点诱变法、随机诱变法等人工诱变处理引起的小麦半胱氨酸蛋白酶TaCP的氨基酸缺失、替换和插入后得到的氨基酸序列也属于本发明要求保护的范围内。

因此，本发明的一个目的是提供一种半胱氨酸蛋白酶，其具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有半胱氨酸蛋白酶功能的功能类似物。优选该小麦半胱氨酸蛋白酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明另一目的是提供一种核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的仍具有半胱氨酸蛋白酶功能的功能类似物。优选该核苷酸序列为小麦半胱氨酸蛋白酶基因TaCP，具有SEQ ID NO：1所示序列。

本发明还有一个目的是提供上述半胱氨酸蛋白酶基因TaCP在植物基因工程中的应用，其特征在于在植物中表达TaCP。在一个优选实施方案中，将TaCP用于植物抗旱基因工程；在另一个优选实施方案中，将TaCP用于植物抗盐和耐寒基因工程。

TaCP基因为首次在小麦中克隆的直接通过水分胁迫方法而诱导表达的基因，由于半胱氨酸蛋白酶与外界胁迫因子，如盐碱、干旱、低温、伤害、乙烯等相关，并在植物发育和衰老中起重要作用，从小麦中克隆该基因对于利用转基因方法培育抗旱节水、抗盐或耐寒新品种具有重要的现实意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。

附图1.TaCP基因的核酸及氨基酸序列。该图为TaCP基因的全长核苷酸序列及氨基酸序列图。该基因ORF区1134bp，编码377个氨基酸，包括93bp的5’UTR和280bp的3’UTR，以及18bp的多聚(A)尾巴。其中P1为RT-PCR的5’引物，P2为其3’引物，中间含有一个5’RACE引物和一个3’RACE引物。在基因ORF中的5’端第一个起始密码子ATG，上游分别含有一个同框的终止密码子TGA和TAG，在3’端第1225位也存在一个终止密码子TAG，如图中粗体所示。

附图2.EST1、EST2及EST新的核苷酸序列

具体实施方式

为了达到上述目的，本发明的一种优选实施方式如下所示。

我们以小麦(Triticum aestivum)抗旱品种为实验材料，通过对已经构建的水分胁迫24h和48h诱导表达的SSH(suppression subtractivehybridization)cDNA文库的筛选，获得了一些重要的小麦抗旱相关基因的EST；利用电子拼接、RACE(Rapid amplification of cDNA ends)和RT-PCR基因克隆技术，在小麦中成功地克隆了半胱氨酸蛋白酶基因的全长cDNA序列，命名为TaCP(Triticum aestivum cysteineproteinase)。

我们以小麦(Triticum aestivum)抗旱品种旱选10号(中国农业科学院作物品种资源研究所提供种子)为实验材料，通过对已经构建的水分胁迫24h和48h诱导表达的SSH(suppression subtractivehybridization)cDNA文库的筛选{水分胁迫48h的SSH cDNA文库由本课题组王转于2002年构建[已发表，王转等，遗传学报，2004，31(8)：842-849]，胁迫24h的SSH cDNA文库由本课题组高婷于2003年构建(未发表)}，获得了一些重要的小麦抗旱相关基因的EST；利用电子拼接(DNAStar软件中的SeqMan程序)、RACE(Rapid amplification ofcDNA ends)和RT-PCR基因克隆技术(RACE试剂盒为Invitrogen公司的GeneRacer^TM Kit，反转录采用Invitrogen公司的M-MLV反转录试剂盒，所用PCR仪为Biometra公司的Thermocycler PCR仪，使用Promega公司的pfu DNA聚合酶，扩增Tm：60℃，35个循环)，在小麦中成功地克隆了半胱氨酸蛋白酶基因的全长cDNA序列，命名为TaCP(Triticumaestivum cysteine proteinase)(如附图1)。

实施例

我们以小麦(Triticum aestivum)抗旱品种旱选10号(中国农业科学院作物品种资源研究所提供种子)为实验材料，通过对已经构建的水分胁迫24h和48h诱导表达的SSH(suppression subtractivehybridization)cDNA文库的筛选{水分胁迫48h的SSH cDNA文库由本课题组王转于2002年构建[已发表，王转等，遗传学报，2004，31(8)：842-849]，胁迫24h的SSH cDNA文库由本课题组高婷于2003年构建(未发表)，中国农业科学院作物品种资源研究所}，采用反向Northern[方法参照：王转等，小麦幼苗水分胁迫所诱导基因表达谱的初步分析，遗传学报，2004，31(8)：842-849]和Northern方法{杂交用缓冲液为church缓冲液：[1％BSA，1mM EDTA(pH8.0)，0.5M NaHPO₄缓冲液(pH7.2)，7％SDS]，标记探针用Promega公司的Prime-α-geneLabeling System，采用同位素α-³²P-dCTP标记探针}成功地筛选了这两个cDNA表达文库，获得了一些重要的小麦抗旱相关基因的EST(见附图2：EST1，EST2)；通过将序列在GenBank中进行Blast比较发现，其中多条EST的功能与半胱氨酸蛋白酶基因相关[EST1与大麦半胱氨酸蛋白酶基因sf42(登录号：gi41019550)的同源性为445/489(91％)，EST2与sf42基因的同源性为373/417(89％)]。于是，我们以这些EST为初始模板，利用电子拼接的方法获得了一个新的EST序列(见附图2：EST新)，并进行了RT-PCR验证(反转录采用Invitrogen公司的M-MLV反转录试剂盒，PCR退火温度为60℃，扩增循环次数为35个循环)。根据电子拼接得到的EST序列，我们分别设计了一个3’RACE和一个5’RACE引物，采用RACE(快速扩增cDNA末端)基因克隆技术，利用Invitrogen公司的GeneRacer^TM Kit分别获得了该基因的5’和3’端序列(如附图1)，利用DNAStar软件中的Seqman程序对5’RACE和3’RACE所获得的cDNA序列进行电子拼接，获得了该半胱氨酸蛋白酶基因的全长cDNA序列，并根据该序列编码区的两端序列设计RT-PCR引物，以cDNA为模板进行PCR扩增(所用PCR仪为Biometra公司的Thermocycler PCR仪，使用Promega公司的pfu DNA聚合酶，扩增Tm：60℃，循环次数为35个循环)，得到了约1.3kb的PCR产物，根据“Sambrook，J.，Frisch，E.F.，和Maniatis，T.，Molecular Cloning第二版，冷泉港出版社”所述常规分子生物学方法将产物经载体连接、转化、质粒的PCR和酶切鉴定、序列测定(克隆载体为Promega公司pGM-T Easy载体，采用T4 DNA连接酶，转化大肠杆菌，用EcoR I酶切鉴定，测序仪为ABI公司的373测序仪)，从而克隆了半胱氨酸蛋白酶基因，命名为TaCP，如附图1。通过在GenBank中进行Blastn比较发现，TaCP基因同大麦半胱氨酸蛋白酶基因(sf42)同源性达到93％(1348/1435)，同小麦半胱氨酸蛋白酶mRNA克隆同源性为96％(880/910)。该基因全长1134bp，编码377个氨基酸，其蛋白理论分子量为MW＝40.988kD，等电点PI＝5.53。

注：5’RACE引物：

5’GGTCGAGGTGCCTGCCGCAGATGT 3’

3’RACE引物：

5’CGCTGGCCATCGGTATCAAC 3’

全长RT-PCR引物：

P1 5’ACTGGAGCACGAGGACACTGACAT 3’

P2 5’CTAGCGATACACCGAAACCAAGAT 3’

应当理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。

序列表

<110>中国农业科学院作物品种资源研究所

<120>小麦半胱氨酸蛋白酶基因及其应用

<130>I040579

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1134

<212>DNA

<213>小麦

<400>1

atggatcatc gcctcgtggc cgctctcctc gtcctcctgg gcctcctcct ctccccggcg 60

ccggcagcgg cggccgcggg ggacgaggag cccctgatcc ggcaggtcgt cggcggcgcc 120

gaccccctcg acaacgacct ggagctcgac tcgcagctcc tcggcttcgt gcagcggttc 180

gggaagacct acagggacgc ggaggagcac gcgcaccggc tctccgtctt caaggccaac 240

ctccgccgcg cgcgccggca ccagatgctc gacccgtccg ccgagcacgg ggtcaccaag 300

ttctccgacc tcaccccggc cgagttccgc cggaccttcc tgggcctcaa gacgacccgg 360

cggtcgttcc tgcgggagat ggccgggtcg gcgcacgacg cgcccgtcct ccccaccgac 420

ggcctccccg aggacttcga ctggagggac cacggcgccg tcggccccgt caagaaccag 480

ggttcgtgct ggtcgtgctg gtcgttcagc gcgtccgggg cgttggaggg agccaactac 540

ctggccacgg gcaagatgga ggtgctctcc gagcagcagc tggtcgactg cgaccatgag 600

tgcgacccag cagaacctga ttcatgcgat gctggatgca atggtgggtt gatgacttca 660

gcctttagct atctgttgaa atctggtggc cttgagagag aaaaggatta cccttacacc 720

gggaaggacg gtacctgcaa atttgagaag tccaagattg ctgcttcagt tcaaaacttc 780

agcgttgtcg ctgttgatga agaacagatt gctgctggcc ttgtggaata tggaccgctg 840

gccatcggta tcaacgctgc atacatgcag acatacatcg gcggagtgtc atgcccatac 900

atatgcggca ggcacctcga ccacggtgtc cttctcgtcg gctacggggc gtccggcttc 960

gcgccttccc gcttcaagga gaagccctac tggatcatca agaactcatg gggcgagaac 1020

tggggggaca agggttacta caagatctgc aggggctcca acgtgcgaaa caagtgcggc 1080

gtcgactcca tggtctccac ggtgtccgcc acgcacgcct cgaaggagga gtag 1134

<210>2

<211>377

<212>PRT

<213>小麦

<400>2

Met Asp His Arg Leu Val Ala Ala Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ser Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Glu Glu Pro Leu

20 25 30

Ile Arg Gln Val Val Gly Gly Ala Asp Pro Leu Asp Asn Asp Leu Glu

35 40 45

Leu Asp Ser Gln Leu Leu Gly Phe Val Gln Arg Phe Gly Lys Thr Tyr

50 55 60

Arg Asp Ala Glu Glu His Ala His Arg Leu Ser Val Phe Lys Ala Asn

65 70 75 80

Leu Arg Arg Ala Arg Arg His Gln Met Leu Asp Pro Ser Ala Glu His

85 90 95

Gly Val Thr Lys Phe Ser Asp Leu Thr Pro Ala Glu Phe Arg Arg Thr

100 105 110

Phe Leu Gly Leu Lys Thr Thr Arg Arg Ser Phe Leu Arg Glu Met Ala

115 120 125

Gly Ser Ala His Asp Ala Pro Val Leu Pro Thr Asp Gly Leu Pro Glu

130 135 140

Asp Phe Asp Trp Arg Asp His Gly Ala Val Gly Pro Val Lys Asn Gln

145 150 155 160

Gly Ser Cys Trp Ser Cys Trp Ser Phe Ser Ala Ser Gly Ala Leu Glu

165 170 175

Gly Ala Asn Tyr Leu Ala Thr Gly Lys Met Glu Val Leu Ser Glu Gln

180 185 190

Gln Leu Val Asp Cys Asp His Glu Cys Asp Pro Ala Glu Pro Asp Ser

195 200 205

Cys Asp Ala Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Thr Ser Ala Phe Ser Tyr

210 215 220

Leu Leu Lys Ser Gly Gly Leu Glu Arg Glu Lys Asp Tyr Pro Tyr Thr

225 230 235 240

Gly Lys Asp Gly Thr Cys Lys Phe Glu Lys Ser Lys Ile Ala Ala Ser

245 250 255

Val Gln Asn Phe Ser Val Val Ala Val Asp Glu Glu Gln Ile Ala Ala

260 265 270

Asn Leu Val Glu Tyr Gly Pro Leu Ala Ile Gly Ile Asn Ala Ala Tyr

275 280 285

Met Gln Thr Tyr Ile Gly Gly Val Ser Cys Pro Tyr Ile Cys Gly Arg

290 295 300

His Leu Asp His Gly Val Leu Leu Val Gly Tyr Gly Ala Ser Gly Phe

305 310 315 320

Ala Pro Ser Arg Phe Lys Glu Lys Pro Tyr Trp Ile Ile Lys Asn Ser

325 330 335

Trp Gly Glu Asn Trp Gly Asp Lys Gly Tyr Tyr Lys Ile Cys Arg Gly

340 345 350

Ser Asn Val Arg Asn Lys Cys Gly Val Asp Ser Met Val Ser Thr Val

355 360 365

Ser Ala Thr His Ala Ser Lys Glu Glu

370 375

<210>3

<211>481

<212>DNA

<213>小麦EST1

<400>3

acctgcaaat ttgagaagtc caaggttgct gcttcagttc aaaacttcag cgttgtcgct 60

gttgatggag aacagattgc tgctaacctt gtgaaatacg gaccgctggc catcggtatc 120

aacgccgcat acatgcagac atacattggc ggagtgtcat gcccatacat ctgcggcagg 180

cacctcgacc acggcgtcct cctcgttggc tacggggcgt ccgggttcgc accttcccgc 240

ttcaaggaga agccctactg gatcatcaag aactcatggg gcgagaactg gggggacaag 300

ggttactaca agatctgcag gggctccaac gtgcgcaaca agtgcggcgt cgactccatg 360

gtctccacgg tgtccgccat gcacgcctcg aaggaggagt aggctctgtt ctggtctgat 420

cgtcagccct cgtggagtcg atcttggttt cggtgtatcg ctagaaagaa acttcaatag 480

t 481

<210>4

<211>404

<212>DNA

<213>小麦EST2

<400>4

ggagaagccc tactggatca tcaagaactc atggggcgag aactgggggg acaagggtta 60

ctacaagatc tgcaggggct ccaacgtgcg aaacaagtgc ggcgtcgact ccatggtctc 120

cacggtgtcc gccacgcacg cctcgaagga ggagtaggct ctgttctgat gtgatcggca 180

gccctcctgg agtcgatctt ggtttcggtg tatcgctaga aagaaacttt aataccgtag 240

tagtcggcta ggctccatcg tcgttgtggt atcagcagcg aagatgcgaa gccgcaacag 300

aaaatgcttg ctgtataact tatgcatttg ctaaatttgc tacgccatgc atgtctgcca 360

cacgctattt ggatgtggct aaagaactcc tgaataattc ttgt 404

<210>5

<211>649

<212>DNA

<213>小麦EST新

<400>5

acctgcaaat ttgagaagtc caaggttgct gcttcagttc aaaacttcag cgttgtcgct 60

gttgatggag aacagattgc tgctaacctt gtgaaatacg gaccgctggc catcggtatc 120

aacgccgcat acatgcagac atacattggc ggagtgtcat gcccatacat ctgcggcagg 180

cacctcgacc acggcgtcct cctcgttggc tacggggcgt ccgggttcgc accttcccgc 240

ttcaaggaga agccctactg gatcatcaag aactcatggg gcgagaactg gggggacaag 300

ggttactaca agatctgcag gggctccaac gtgcgmaaca agtgcggcgt cgactccatg 360

gtctccacgg tgtccgccay gcacgcctcg aaggaggagt aggctctgtt ctgrtstgat 420

cgkcagccct cstggagtcg atcttggttt cggtgtatcg ctagaaagaa acttyaatac 480

cgtagtagtc ggctaggctc catcgtcgtt gtggtatcag cagcgaagat gcgaagccgc 540

aacagaaaat gcttgctgta taacttatgc atttgctaaa tttgctacgc catgcatgtc 600

tgccacacgc tatttggatg tggctaaaga actcctgaat aattcttgt 649

Claims

1.一种小麦半胱氨酸蛋白酶，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有半胱氨酸蛋白酶功能的功能类似物。

2.根据权利要求1的小麦半胱氨酸蛋白酶，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者该氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入而获得的，仍具有半胱氨酸蛋白酶功能的功能类似物。

4.根据权利要求3的核苷酸序列，其为小麦半胱氨酸蛋白酶基因TaCP(SEQ ID NO：1)。

5.小麦半胱氨酸蛋白酶基因TaCP在植物基因工程中的应用，其特征在于在植物中表达TaCP。

6.根据权利要求5的应用，其中将小麦半胱氨酸蛋白酶基因TaCP用于植物抗旱基因工程。

7.根据权利要求5的应用，其中将小麦半胱氨酸蛋白酶基因TaCP用于植物抗盐和耐寒基因工程。