CN105008529A

CN105008529A - 一个棉花半胱氨酸蛋白酶cysp1-1及其编码基因与应用

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Publication number: CN105008529A
Application number: CN201380074529.1A
Authority: CN
Inventors: 陈文华; 孙超; 崔洪志
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-04-23
Also published as: CN105008529B; WO2014172840A1

Abstract

本发明涉及一个来源于棉花的半胱氨酸蛋白酶cysp1-1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

一个棉花半胱氨酸蛋白酶 cyspl-1及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及半胱氨酸蛋白酶及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的半胱氨酸蛋白酶 cyspl-1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。技术背景非生物胁迫，如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失，其中干旱对作物产量的影响,在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干早、半干旱地区占陆地面积的 34%; 我国干早、半干旱地区约占国土面积的 52%，年受旱面积达 200 270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 300亿立方米，因缺水而少收粮食 350 400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大，培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来，随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为 3类：（1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；（2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物； (3) 与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来，通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解（Liu Q.1998. Two transcription factors,DREB 1 and DREB2,with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought and low temperature responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391-1406； KANGJY.2002. Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress responsive abscisic acid signaling。 Plant Cell, 14: 343- 357； ABEH.2003.Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2(MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78. ) 。

半胱氨酸蛋白酶作为一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的各种生理过程。许多研究表明在环境胁迫如低温、干旱和盐胁迫条件下半胱氨酸蛋白酶 mRNA会累积，其负责逆境条件下受损或变性蛋白的降解，为新蛋白的合成提供肽段或游离的氨基酸。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的研究提供重要的基础。发明内容本发明人利用 SSH (抑制差减杂交）与 RACE ( cDNA末端快速扩增）相结合的方法克隆了棉花的一个半胱氨酸蛋白酶（本文命名为 cyspl-1 )的编码基因。并发现将其导入受体植物后，可明显改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个半胱氨酸蛋白酶 cyspl-1的编码基因（本文命名为 Ghcyspl-1 )，其序列为 SEQ ID N0:2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因，其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得的，优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300;并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述重组表达载体为附图 2 所示的 rd29A-Ghcyspl-l-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因或本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述基因编码的氨基酸序列，如 SEQ ID NO: 1所示。附图说明图 1是 Ghcysp 1的植物表达载体 (rd29 A-Ghcy sp 1-1-2300)的构建流程（图 la-lb ) 。

图 2是 (¾ς) ψ -1的植物表达载体 (rd29A-Ghcysp l-l-2300;)的质粒图。

图 3是 (¾ς) ψ -1转基因烟草 T_Q代植株（图中， T_QA_{5 ;} 右， ToAn )和作为对照的非转基因烟草植株（图左， CK) 的耐旱模拟实验结果。

图 4是利用反转录 PCR对 T_Q代转基因烟草植株和非转基因对照植株中 G/zqy^ -l基因的转录水平进行分子水平检测的结果。 Μ为标示物 DNA Ladder Marker (DL2000 ) ， 1-5为非转基因的对照烟草植株， 6-18为耐旱效果显著的转基因烟草 To代植株， 19-24耐旱效果不显著的转基因烟草 T_Q代植株。具体实施方式实施例

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

下面实施例中提到的限制性内切酶均购自 New England Biolabs公司。实施例 1、干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

按照 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以生长过程中干旱处理的棉花幼苗叶子的 mRNA作为样本（tester) ,以未处理的棉花幼苗叶子的 mRNA 作为对照（driver) 。具体步骤如下： ( 1 ) 供试材料：

冀棉 14 (国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-30270) 播种到灭菌的蛭石上，在 25 °C、光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（9.39mM KNO₃，0.625mM KH₂PO₄， 10.3mM H₄N0₃, 0.75mM MgS0₄， 1.5mM CaCl₂， 50μΜ ΚΙ， 100μΜ Η₃ΒΟ₃， 100 M MnSO₄， 30 M ZnSO₄， 1μΜ Να₂Μο0₄, O. ^M CoCl₂, ΙΟΟμΜ Na₂EDTA, 100 M FeSO₄) —次。当苗株高达 25-30cm时用于实验。

(2) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4盆，每盆 1株。第一组为对照组，在 25 °C、光照培养，正常用 1/2MS浇灌；第二组为干旱处理组，在 25 °C、光周期 16小时光照 /8小时黑暗条件下培养，停止浇灌， 10天后及时剪取两组幼苗顶端 1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子 0.5g，用植物 RNA 提取试剂盒 (Invitrogen) 提取棉花的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001 测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD260/OD280比值为 1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S 条带的亮度约为 18S条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。

(4) 抑制差减杂交：

为了增加获得表达序列标签（Expressed sequence tag, EST) (unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区。本实验室按照差减试剂盒中记载的方案，由两组 mRNA分另 ij以弓 I物 01igo(dT)₁₈ (TTTTTTTTTTTTTTTTTT) 进行逆转录,并将所得 cDNA用 Rsal， Haelll进行消化，做两组抑制差减，其他步骤及方法按 Clontech公司的 PCR-select^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交，最后合并两组正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR 产物。

( 5 ) cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆及鉴定

将合并的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次 PCR产物（QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒)载体连接，依照 pGEM-T Easy试剂盒产品说明书所示方法，具体步骤如下：用 200 μΐ PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ1、 Τ4连接酶缓冲液 5 μ1、 pGEM-T Easy载体 1 μ1、 T4 DNA连接酶 1 μ1，于 4°C连接过夜。然后取 10 μL 连接反应产物，加入到 100 μL 感受态大肠杆菌 JM109(购自 TAKARA)中，冰浴 30 min,热休克 60 s，冰浴 2 min,另加 250 μL LB 液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（Tryptone, 购自 OXOID)、 0.5% 酵母提取物 ( Yeast Extract, 购自 OXOID )禾 P 1% NaCl (购自国药））后置于 37°C摇床中，以 225 r/min振荡培养 30 min, 然后从中取 200 μ 菌液种植于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 igl L X-gaK 24 g/mL IPTG (X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚- β -D-半乳糖苷）和 IPTG (异丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）购自 TAKARA) 的 LB (同上）固体培养平板上， 37°C培育 18 h。计数培养板中直径 > lmm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 300个白色菌落 (编号： Gh-C001至 Gh-C300)。将所挑取的白色菌落接种于 96孔细胞培养板 (CORNING)中的含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度 20% (体积比），于 -80°C 保存备用。对所培养的菌落克隆以巢式 PCR 弓 ^ Primer 1和 Primer 2R (来自 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒）进行菌液 PCR扩增验证，得到 243个阳性克隆，将所有阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后，共得到 167条表达序列标签（Expressed sequence tag, EST) (unigene)。经 BlastN发现其中 82条 unigene 在 GenBank 中有同源序列（蛋白同源性 50%以上）， 23条 EST功能未知或者为假定蛋白，另有 35条未获得同源匹配，推测可能是处于 3 '、 5 ' 末端非翻译区的较短序列。实施例 2 棉花半胱氨酸蛋白酶编码基因（¾ς) -1的克隆

将实施例 1获得的有效克隆子之一 Gh-C192的测序结果去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID NO: 3，序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列与已知半胱氨酸蛋白酶序列有较高同源性，本文将克隆子 Gh-C192 编码的全长基因命名为 Ghcyspl- 1，对应的蛋白命名为 cysp 1 - 1。

SEQ ID NO:3

1 AAACTTGGGT TGAACAAGTT CGCTGATTTA ACTAACCAGG AGTACCGTTC CATGTTTTTG 61 GGTACAAAGA GTGACCCTAA ACGTCGAGTC ATGAAGTCCA AAAACCCCAG CCAACGCTAT 121 GCTTCCCGCG CCGGCGACAG GTTGCCGGAA TCTTTTGACT GGAGAGATCA TGGAGCCGTT 181 ACTCCAGTGA AGGATCAAGG GCGTTGCGGA AGTTGCTGGG CATTTTCAAC GATTGAAGCT 241 GTTGAAGGCA TAAATAAAAT CGCCACCGGC GAACTAATCT CTTTGTCAGA GCAAGAGCTA 301 GTAGATTGTG ACCGATCCTA CGACGCTGGT TGCGATGGAG GCCTAATGGA TTATGCCTTC 361 CAATTCATTA TTGACAACGG TGGCATTGAC TCTGAACAAG ACTATCCTTA CCTTGGTGCT 421 GATAATAACC AATGCGATCC AACGAGGAAG AATGCTAAGG TTGTCAGCAT TGATGGGTAC 481 GAGGATGTTG TTCAATATGA TGAGAAGGCA TTGAAGAAGG CTGTATCACA TCAACCTGTG 541 AGTGTCGCCA TTGAAGCTAG TGGCAGAGCT TTCCAACTCT ACGAATCGGG AGTTTTCAGC 601 GGTGAATGCG GGTCAGCATT AGACCACGGC GTGATTGTCA TCGGATATGG CATGGATGAG 661 AACGGTCAGG AATATTGGAC AGTGAGGAAC TCATGGGGCA GCGGTTGGGG TGAAGATGGA 721 TACATAAGGA TGGAGCGTAA CGTTGATGAC CGTGCTGGCA AGTGTGGCAT TGCGATGGAG 781 GCTTCATATC CTGTTAAGAA TGGGACAAAC ATCATCAAAC CTTACTGGAC TAATGAAGAC 841 ACTCAGAAAA TTAGCAGTGC CTGAGAGTTA AAGATGTGTG CCAGCTGCTG TTTTGGGCCA 901 TGGGAGAAGA GGTGTGCCAT GAGTTA

Ghcyspl- 1全长基因的克隆

已经获得的 Ghcyspl -I基因片段（ SEQ ID NO:3 ), 已经有终止密码子 TGA，只需要做 5 ' RACE。

根据已经获得的 G/zc ^ -l基因片段（SEQ ID NO:3 )，设计三条特异性引物，作为反转录引物及 5'RACE的 3 '端特异性引物。

Ghcyspl- 1 GSP 1： SEQ ID NO: 4：

GTGGCGATTTTATTTATG

Ghcyspl- 1 GSP2： SEQ ID NO: 5：

GAGTAACGGCTCCATGATC

Ghcyspl- 1 GSP3： SEQ ID NO: 6：

GACGTTTAGGGTCACTCTTTG

实验步骤按试剂盒说明书操作（5' RACE System for Rapid Amplification of cDNAEnds试剂盒购自 Invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO:5与 5'通用引物 AAP (试剂盒自带），以干旱处理组棉花叶子提取的 mRNA反转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO:4) 为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下： Ex Taq购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA， 1.0 μΐ Ex Taq, 10 μΜ 的引物 SEQ ID NO: 5和 AAP各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件：

94°C预变性 5 min， 94 变性 30 s， 55 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μΐ作为模板，用 SEQ ID NO: 6与 3'端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：

50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ稀释的第一轮 PCR产物， l .O l Ex Taq, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 6和 AUAP各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 V 变性 30 s， 58 °C 退火 30 s， 72V 延伸 2 min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。第二次 PCR产物回收片段约为 600bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM-T Easy载体，转化到 JM109(具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 6与 3'端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 3个阳性克隆，送英潍捷基 (上海）贸易有限公司测序，获得该基因的 cDNA的 5'端。

所得的 5'RACE产物克隆测序后，与克隆子 Gh-C192测序结果拼接，获得

SEQ ID NO: 17：

1 TCCTTTCTCT TCACCAAACC ACTCCCTCCA ATAACCATAA CAACCCTTGT CATTTCTCCC

61 ATGGCAACCA CAGTAACACC CATTTCCACC CTCTTTTTCC TCTTCTTCAC CTTATCCTGG 121 GCAACCAGCT TCAGCCAAAA TCACTGGAGG AGCGATGATG AAGTGATGAG CTTGTACCAA 181 GCTTGGCTCA TTAAACATGG CAAACAATAC AACGGTATAG GGGAGGAAGA AAACCGGTTC 241 GATATCTTTA AGGATAACTT GAAATTTATC GACCAACATA ACTCCAAAAA CACCACATAC 301 AAACTTGGGT TGAACAAGTT CGCTGATTTA ACTAACCAGG AGTACCGTTC CATGTTTTTG 361 GGTACAAAGA GTGACCCTAA ACGTCGAGTC ATGAAGTCCA AAAACCCCAG CCAACGCTAT 421 GCTTCCCGCG CCGGCGACAG GTTGCCGGAA TCTTTTGACT GGAGAGATCA TGGAGCCGTT 481 ACTCCAGTGA AGGATCAAGG GCGTTGCGGA AGTTGCTGGG CATTTTCAAC GATTGAAGCT 541 GTTGAAGGCA TAAATAAAAT CGCCACCGGC GAACTAATCT CTTTGTCAGA GCAAGAGCTA 601 GTAGATTGTG ACCGATCCTA CGACGCTGGT TGCGATGGAG GCCTAATGGA TTATGCCTTC 661 CAATTCATTA TTGACAACGG TGGCATTGAC TCTGAACAAG ACTATCCTTA CCTTGGTGCT 721 GATAATAACC AATGCGATCC AACGAGGAAG AATGCTAAGG TTGTCAGCAT TGATGGGTAC 781 GAGGATGTTG TTCAATATGA TGAGAAGGCA TTGAAGAAGG CTGTATCACA TCAACCTGTG 841 AGTGTCGCCA TTGAAGCTAG TGGCAGAGCT TTCCAACTCT ACGAATCGGG AGTTTTCAGC 901 GGTGAATGCG GGTCAGCATT AGACCACGGC GTGATTGTCA TCGGATATGG CATGGATGAG 961 AACGGTCAGG AATATTGGAC AGTGAGGAAC TCATGGGGCA GCGGTTGGGG TGAAGATGGA 1021 TACATAAGGA TGGAGCGTAA CGTTGATGAC CGTGCTGGCA AGTGTGGCAT TGCGATGGAG 1081 GCTTCATATC CTGTTAAGAA TGGGACAAAC ATCATCAAAC CTTACTGGAC TAATGAAGAC 1141 ACTCAGAAAA TTAGCAGTGC CTGAGAGTTA AAGATGTGTG CCAGCTGCTG TTTTGGGCCA 1201 TGGGAGAAGA GGTGTGCCAT GAGTTA

根据 SEQ ID NO: 17序列设计一对引物如下：

Ghcyspl-ΓΡ: SEQ ID NO: 7：

ATGGCAACCACAGTAACAC

Ghcyspl-1K: SEQ ID NO: 8：

TCAGGCACTGCTAATTTTC

通过 SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO: 8来克隆 Ghcyspl-l全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以干旱处理组棉花叶子提取的 mRNA反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1，以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 变性 30 s， 55 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72 °C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10 分钟，离心，去上清，晾干，用 21 μΐ双蒸水溶解，加入 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 0.5 μ1 5 ιηΜ的 dATP ， 2.5 μΐ ΙΟχΕχ Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到约 1100 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒），连接至 pGEM T-easy载体上，转化 JM109(方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓度 20% (体积比）， -80°C保存备用。用 SEQ ID NO: 7与 SEQ ID NO: 8进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO: 2。根据该核苷酸序列，可知该基因编码的 PP2AC-2 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO: l所示。

cyspl-1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

MATTVTPIST LFFLFFTLSW

ATSFSQNHWR SDDEVMSLYQ AWLIKHGKQY NGIGEEENRF DI FKDNLKFI DQHNSKNTTY KLGLNKFADL TNQEYRSMFL GTKSDPKRRV MKSKNPSQRY ASRAGDRLPE SFDWRDHGAV

TPVKDQGRCG SCWAFSTIEA 161 VEGINKIATG ELISLSEQEL

181 VDCDRSYDAG CDGGLMDYAF

201 QFI IDNGGID SEQDYPYLGA

221 DNNQCDPTRK NAKWS IDGY

241 EDWQYDEKA LKKAVSHQPV

261 SVAIEASGRA FQLYESGVFS

281 GECGSALDHG VIVIGYGMDE

301 NGQEYWTVRN SWGSGWGEDG

321 YIRMERNVDD RAGKCGIAME

341 ASYPVKNGTN I IKPYWTNED

361 TQKISSA*

GhcyspJ-l 基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGGCAACCA CAGTAACACC CATTTCCACC CTCTTTTTCC TCTTCTTCAC CTTATCCTGG

61 GCAACCAGCT TCAGCCAAAA TCACTGGAGG AGCGATGATG AAGTGATGAG CTTGTACCAA 121 GCTTGGCTCA TTAAACATGG CAAACAATAC AACGGTATAG GGGAGGAAGA AAACCGGTTC

181 GATATCTTTA AGGATAACTT GAAATTTATC GACCAACATA ACTCCAAAAA CACCACATAC

241 AAACTTGGGT TGAACAAGTT CGCTGATTTA ACTAACCAGG AGTACCGTTC CATGTTTTTG

301 GGTACAAAGA GTGACCCTAA ACGTCGAGTC ATGAAGTCCA AAAACCCCAG CCAACGCTAT

361 GCTTCCCGCG CCGGCGACAG GTTGCCGGAA TCTTTTGACT GGAGAGATCA TGGAGCCGTT 421 ACTCCAGTGA AGGATCAAGG GCGTTGCGGA AGTTGCTGGG CATTTTCAAC GATTGAAGCT

481 GTTGAAGGCA TAAATAAAAT CGCCACCGGC GAACTAATCT CTTTGTCAGA GCAAGAGCTA

541 GTAGATTGTG ACCGATCCTA CGACGCTGGT TGCGATGGAG GCCTAATGGA TTATGCCTTC

601 CAATTCATTA TTGACAACGG TGGCATTGAC TCTGAACAAG ACTATCCTTA CCTTGGTGCT

661 GATAATAACC AATGCGATCC AACGAGGAAG AATGCTAAGG TTGTCAGCAT TGATGGGTAC 721 GAGGATGTTG TTCAATATGA TGAGAAGGCA TTGAAGAAGG CTGTATCACA TCAACCTGTG

781 AGTGTCGCCA TTGAAGCTAG TGGCAGAGCT TTCCAACTCT ACGAATCGGG AGTTTTCAGC

841 GGTGAATGCG GGTCAGCATT AGACCACGGC GTGATTGTCA TCGGATATGG CATGGATGAG

901 AACGGTCAGG AATATTGGAC AGTGAGGAAC TCATGGGGCA GCGGTTGGGG TGAAGATGGA

961 TACATAAGGA TGGAGCGTAA CGTTGATGAC CGTGCTGGCA AGTGTGGCAT TGCGATGGAG 1021 GCTTCATATC CTGTTAAGAA TGGGACAAAC ATCATCAAAC CTTACTGGAC TAATGAAGAC

1081 ACTCAGAAAA TTAGCAGTGC CTGA 实施例 3 GhcyspJ-l基因的植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΡΤΠ基因含双增强子的 35S 启动子，以降低 ΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子 rd29A及终止子 Tnos作为 GhcyspJ-l基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 10，以植物表达载体 pBI121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos,采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ pBI121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO:9和 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 EcoRI、 Bglll酶切将所得的 PCR产物按试剂盒说明 (Promega, T4连接酶试剂盒)连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 9 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 10：

ATCCAGATC AGATCCGGTGCAGATTATTTG SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12核苷酸片段为引物，以 pBI121为模板扩增

Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ pBI121 , 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72V 延伸 30 s， 33 个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 Sacl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产物按试剂盒说明（Promega， T4 连接酶试剂盒）连接到 pCAMBIA2300-l 获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 11：

AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 12：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

以 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14为引物，以拟南芥（哥伦比亚型，购自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心（www.arabidopsis.org) ) DNA为模板扩增拟南芥 rd29A启动子（参考 Zeng J., et L. 2002, Preparation of total DNA from"recalcit rant plant taxa", Acta Bot. Sin., 44(6): 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA) ₀采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 1.0 μΐ拟南芥 DNA， 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ 的引物 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14各 2.0 μ1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5 min， 94V 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72V 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Pstl酶切连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3。

SEQ ID NO: 13：

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA SEQ ID NO: 14：

TGACTGCAGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16扩增 Ghcysp \ (模板是实施例 2所获得 Ghcyspl- , 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM 的 dNTP， 1.0 μΐ Ghcyspl-l-pGEM, 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16各 2.0 μ1，以及 31 μΐ 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72V 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 Pstl、 Sacl酶切连接到 (连接方法同上） pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体 rd29A- Ghcyspl-l-2300。

SEQ ID NO: 15：

TGACTGCAGATGGCAACCACAGTAACAC SEQ ID NO: 16：

AAGGAGCT TCAGGCACTGCTAATTTTC 实施例 4 rd29A-Ghcyspl-l-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab,Inc)感受态制备：提前 1-2天将农杆菌 LBA4404在含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ_§/ιη1利福平和 50 μ_§/ιη1链霉素的 LB 液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12-16 小时)至 OD600值为 0.4，形成种子菌液。取 5 ml培养活化后的菌液（1 :20的比例）接种于 100 ml含 50 g/ml利福平和 50 g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2.5小时至 OD600=0.8。冰浴菌液 10 min，每隔 3 min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液；加入一定量预冷 10%甘油（体积比）重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀；用 10% 甘油（体积比）重复洗 3-4次；加入适量冰预冷的 10%甘油（体积比）重新悬浮细菌沉淀，即制得 LBA4404感受态细胞，以 40 μΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，向 40 μΐ的感受态细胞中加入 1 μΐ实施例 3获得的 rd29A- Ghcyspl-1-2300质粒，混匀后冰浴约 10 min。将感受态和 DNA的混合物用微量移液器转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯（购自 bio-rad) 放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0.1cm的电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr"，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用微量移液器将感受态细胞打匀。将悬浮液转入 1.5 ml 的离心管，在 28°C，以 225 rpm培养 1小时。取 100〜200 μΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ_§/ιη1利福平、 50 g/ml链霉素、 50 μ_§/ιη1卡那霉素）， 28°C培养。实施例 5 利用农杆菌介导的叶盘转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号 I5A00660) 30 s, 用灭菌双蒸水洗两次。再用 0.1%升汞浸泡 8 min，用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于 MS ( 18.78 mM KN0₃, 1.25 mM KH₂P0₄， 20.6 mM H4NO3, 1.5 mM MgS0₄， 3.0 mM CaCl₂， 50 μΜ ΚΙ, 100 μΜ Η₃ΒΟ₃， 100 M MnSO₄， 30 M ZnSO₄， 1 μΜ Να₂Μο0₄, 0.1 M CoCl₂， 100 μΜ Να₂ΕϋΤΑ, 100 M FeSO₄， 7.4 g/L琼脂，蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成 5 mmx5 mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体 rd29A-Ghcyspl-l-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养 2天 (MS培养基）。将叶片转到分化培养基 (MS+1 mg/L细胞分裂素（BA) +0.1 mg/L萘乙酸（NAA) +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L 头孢霉素）上，光照条件 (6小时光照 /8小时黑暗（光强 3000— 4000 Lx) )下培养 45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基（MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）中培养 30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有 500 mg/L 头孢霉素的 MS培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法），用 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8 ( 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟ Εχ Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 9 禾口 SEQ ID NO: 10各 2.0 μ1，以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 变性 30 s， 58 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min)， PCR鉴定，保存阳性植株进行编号 ΤοΑ^ΤοΑ^ ο 实施例 6 过表达 Ghcysp l转基因烟草 T_Q的耐旱模拟实验及功能鉴定将灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T„A1-T„A20及对照烟草组培苗分别移栽至蛭石上。 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环，每 5天浇一次 1/2MS , 壮苗培养 15天之后，进行干旱胁迫实验，转基因烟草、对照烟草干旱 14天 (不浇水）， 25 °C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T_Q代转基因植株的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 T₀A₅、 T₀A6、 T₀A₁₀、 T₀A_U、 T₀A₁₄、 T₀A₁₅、 T₀A_2Q七个株系共 30棵烟草中有 21棵能够正常生长，显现出显著的耐旱性（参见图 3，以 T₀A₅、 T₀A_U为例， T₀A6、 T₀A₁₀、 T₀A₁₄、 T₀A₁₅、 T₀A₂。的结果与 T。A₅、 T。A_U类似，在此未示出）。实施例 7 在转录水平上验证 Ghcyspl-l基因表达

分别取对照烟草、耐旱不显著转基因烟草 T_Q代植株、耐旱显著转基因烟草 To代植株（生长状况良好）干旱 14天的叶子 0.05g，用植物 RNA提取试剂盒 ( Invitrogen) 提取总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值，计算各个 RNA浓度。依照 Invitrogen反转录试齐 LI盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录 (.2\ag总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO: 8)。通过 SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO: 8 扩增 G/zq -l，检测 cyspl-1蛋白相对表达情况。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5 xPS Buffer, 3 μΐ 2.5 mM的 dNTP, 2.0 μΐ cDNA, 1.0 μΐ PrimeSTAR, 10 μΜ 的引物 SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO: 8各 2.0 μ1，以及 30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94°C变性 30 s， 55 °C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin， 29 个循环后， 72°C 延伸 10 min。产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000, 购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1-5为对照烟草， 6-18为耐旱显著转基因烟草 T_Q代植株， 19-24为耐旱不显著转基因烟草 T_Q代植株。图中所示条带大小与 GhcyspJ-l 的大小一致（约 1.1 Kbp)。结果表明对照烟草中没有 Ghcyspl-l的 mRNA，耐旱显著转基因烟草 T_Q代植株中外源基因（¾ς)ψ -1的转录较强，耐旱不显著转基因烟草 T_Q代植株中 G/z_C^ -l的转录很弱或没有转录。

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个半胱氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1所示
2. 编码权利要求 1 所述半胱氨酸蛋白酶的基因，其核苷酸序列为 SEQ ID NO:2。
3. 一种重组表达载体，其是通过将权利要求 2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，优选地，所述表达载体是 pCAMBIA2300。
4. 权利要求 3 所述的重组表达载体，其为 pCAMBIA2300 附图 2所示的 rd29A-Ghcyspl-l-2300载体。
5. 一种重组细胞，其含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
6. 一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达;优选地，所述植物是烟草。
7. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 2所述的基因或者权利要求 3或 4所述的重组表达载体的植物或植物组织。
8. 权利要求 7所述的方法，其中所述植物是烟草。
9. 权利要求 2所述的基因、权利要求 3或 4所述的重组表达载体或者权利要求 5所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。
10. 权利要求 9所述的用途，其中所述植物是烟草。