CN1760364A - 编码棉花半胱氨酸蛋白酶的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、重组及功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。以棉花衰老叶片的cDNA为模板，根据其它植物中已经克隆半胱氨酸蛋白酶基因中氨基酸的保守序列，设计兼并引物，进行聚合酶链反应，将扩增的DNA片段回收后，与pGEM－T载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选重组子，进行序列分析。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长cDNA，进一步，构建反义表达载体，转化拟南芥。与野生型相比较，转基因拟南芥的衰老延缓。因此，该基因可以转入棉花、小麦和玉米等农作物中，以克服这些农作物早衰的现象，提高农作物的产量和品质，具有重要的应用前景。

Description

编码棉花半胱氨酸蛋白酶的基因及其应用

【技术领域】

本发明涉及棉花半胱氨酸蛋白酶基因(Ghcysp)的克隆、重组及功能分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

【背景技术】

在棉花生产中，棉花叶片早衰普遍存在，棉田叶片早衰一般导致产量损失10％左右，严重早衰的棉田产量损失达20％以上。棉花叶片的早衰不仅影响棉花的产量，而且导致棉花纤维强度降低、长度变短、整齐度下降，从而降低棉纤维的成纱质量，因此，棉花生产迫切需要延缓棉花早衰的技术和方法。

细胞程序性死亡是遗传控制、高度有序的细胞自杀过程，可使生物清除衰老的细胞，是多细胞真核生物在生长发育过程中保持体内环境的稳定所必须的，大量实验证明动物的一些疾病是由于细胞程序性死亡发生异常造成的(Polverini，P.J.，and Nr，J.E.Apoptosis andpredisposition to oral cancer.Crit.Rev.Oral Biol.Med.1999，10：139-152.。Wang，T.H.，and Wang，H.S.Apoptosis：(2)Characteristics ofapoptosis.J.Formos.Med.Assoc.1999，98：531-542.)。植物的早衰(pre-mature)是否也与植物细胞程序性死亡发生异常有关？目前还没有实验验证。在动物的细胞程序性死亡中，Caspases(cysteineaspartases)蛋白酶起着重要的作用(Vaux and Korsme，The molecularbiology of leaf senesence.Journal of Experiment Botany，1997，48(307)：181-199。Hengartner，The biochemistry of apoptosis.Nature，2000，407：770-776。)，Caspase蛋白酶的命名是根据它的酶活性位点是Cys，水解蛋白质酶切位点在天冬氨基酸后，它是一类半胱氨基酸蛋白酶，它在动物细胞程序性死亡中既是水解蛋白质的参与者，也是细胞程序性死亡的启动因素。在植物衰老过程中，细胞程序性死亡广泛存在(Bleecker，A.B.，and Patterson，S.E.Last exit：Senescence，abscission，andmeristem arrest in Arabidopsis.Plant Cell，1997，9：1169-1179。Schmid，M.，Simpson，D.，Sarioglu，H.，Lottspeich，F.，and Gietl，C.Thericinosomes of senescing plant tissue bud from the endoplasmic reticulum.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，98：5353-5358)，目前，已经从拟南芥(Eason，J.R.，Ryan，D.J.，Pinkney，T.T.，and O′Donoghue，E.M.Programmed cell death during flower senescence：Isolation andcharacterization of cysteine proteinases from Sandersonia aurantiaca.Funct.Plant Biol，2002，29：1055-1064.)、番茄(Draham R，John I，FarrellA，Cooper W，Schunch W，Grierson D，Isolation and analysis of cDNAsencoding tomato cysteine proteases expressed during leaf senescence，Plant Molecular Biology，1996，30：755-767.)、胡萝卜和玉米(Smart etal.The timing of maize leaf senesence and characterisation ofsenesence-related cDNAs.Phsiology Plantrum，1995，93(1)：673-682)中分离得到了类似动物Caspases蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶基因，在植物发育早期半胱氨酸蛋白酶基因的表达量比较低，在衰老的植物器官表达量增加。但是，在棉花中目前还没有克隆到该基因。

本发明的目的是克隆棉花的半胱氨酸蛋白酶基因，通过构建反义表达载体，抑制该基因的表达，以延缓棉花及其它植物的早衰。

【发明内容】

本发明以辽棉9号衰老叶片的cDNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术，克隆了棉花半胱氨酸蛋白酶基因，通过构建反义表达载体，利用农杆菌侵染转化拟南芥，转基因植株的衰老比野生型延迟9-10天。

辽棉9号吐絮后，叶片变黄进入衰老时期时，提取衰老叶片的总RNA，取2微克RNA进行反转录合成cDNA。利用Blast软件，对Genebank中已经克隆的不同植物半胱氨酸蛋白酶的进行同源性比较，结果发现半胱氨酸蛋白酶的羧基端有两段比较保守的氨基酸序列，根据这两段保守序列的氨基酸顺序，设计了1对兼并引物，分别为C-A[5’TG(C/T)TGGGC(G/A/T)TT(T/C)TC(A/C)GC(A/G)GT(T/G)GC3’]和C-B{5’TG(A/G)AA(G/C)AC(T/A)CC(C/A/T)GA(A/T)GA(G/A)TA(A/G)AA(C/T)TG 3’}。以衰老叶片的cDNA为模板，利用这一对兼并引物进行RT-PCR进行扩增，扩增反应条件为：

PCR反应体积为50μl，包括以下成分：

10×反应缓冲液                5μl

2.5mMdNTP                     4μl

5′端引物(5μM)               4μl

3′端引物(5μM)           4μl

反转录产物                4μl

Tap酶(2.5u)               0.5μl

反应条件为：

取2μl PCR产物，与pGEM-T载体(Promega公司产品)进行连接，转化大肠杆菌(Promega公司产品)，筛选重组子，然后进行序列分析。

根据已经克隆的DNA序列设计特异引物，以衰老叶片的cDNA为模板，进行3′RACE分离其3′序列，进行5′RACE扩增，以分离5′序列，然后，将它们与保守片段进行拼接成一个完整的cDNA序列。根据该cDNA的5’和3′的核苷酸序列，设计一对特异引物：

Ghc-1 5’AAAACC CCA CTT CAAAAC CC  3’

Ghc-2 5’GCA CAC GAT TCA TTC ATAAC 3’

利用这一对特异引物，以衰老叶片的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，按照同上扩增条件，结果分离的得到一段1300bp左右的片段，对该片段进行序列分析表明：其基因序列的长度为1368bp，将该cDNA命名为Ghcysp，它包含一个1034bp的开放阅读框，起始于序列的99位，终止于1133位，编码344个氨基酸，5′端非编码区的长度为98bp，3’端非编码区的长度为235bp。在Poly A上游75bp处有典型的真核生物基因Poly A的信号序列-AATAAA，起始密码子ATG附近具有5’-CACAATGG序列结构，与其他真核生物中普遍存在的高效转录起始序列5’-CA/GNNATGG一致。Ghcysp基因与其它动、植物编码半胱氨酸蛋白酶的核苷酸序列的同源性为46％-66％，Ghcysp基因与其它动、植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸同源性为67％--82％。这表明通过以上操作得到了编码棉花半胱氨酸蛋白酶的基因。

序列表：

(1)SEQ.ID.NO 1的信息

序列特征

长度：1368碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

分子类型：cDNA

假设：否

反义：否

最初来源：棉花

序列描述：SEQ.ID.NO 1

  1 ATTACCAATA CACATCAAAC TTTTTCACTA TAAAACCCCA CTTCAAAACC CTTTTGGAGT

 61 AATCAAATTA GGATCTAATC CTTCAACTTT CTAAACCAAT GGCTTTGCTG CAAATTTTTC

121 TCTTCGTTGC TCTGGTTCTA TCATTCTGTT TTTCCATCCA ACTTGCTGGA CTGTCTCGTC

 181 CACTCTTGGA TGAAGACTCC ATGAGGCATG AGGAGTGGAT GAGTCAACAT GGCCGTGTTT

 241 ACGCGGATGA GCAGGAGGAC CATAAGAACA AGCGCTTCAA TGTGTTTAAA GAGAACGTCG

 301 AACGAATTGA AGAGTTTAAT GACGGAAAAA CTTTCAAACT TGCGATAAAT CAGTTTGCTG

 361 ACTTAACCAA TGAGGAATTT CGTGCCAGTT ACAATGGTTT CAAAGGTCCC ATGGTATTAT

 421 CTAGTCAAAT AACTAAACCG ACGCCGTTTA GGTACGAAAA CGTTTCTTCT GCTTTGCCTG

 481 TTTCAGTTGA TTGGAGGAAG AAAGGAGCTG TTACTCCTGT TAAAAATCAA GGCCAATGCG

 541 GATGTTGTTG GGCGTTTTCA GCGGTTGCGG CTATTGAAGG TATTACTCAA ATTAGTACTG

 601 GGAAACTTAT ATCTTTGTCA GAACAAGAGC TTGTTGATTG CGACACAAAG GGTATTGACC

 661 ATGGCTGCGA AGGCGGTTTA ATGGATACTG CGTTTGAGTT TATTATTAAC AATGGCGGCT

 721 TGACAACTGA GTCAAATTAT CCTTACAAAG GCGAAGATGG AACTTGCAAC TTTAACAAGA

 781 CCAATCCAAT TGCTGTGTCT ATTACAGGTT ATGAGGATGT CCCGGCTAAT GATGAGCAAG

 841 CACTGATGAA GGCAGTGGCA CACCAACCGG TTAGCGTTGC TATTGAAGCG GGTGGTAGTG

 901 ATTTCCAATT CTATTCGTCT GGTGTGTTCA CTGGAGAGTG CGGAACGGAA CTTGATCATG

 961 CAGTTACTGC TGTCGGATAC GGCGAATCTG AAGACGGATC AAAGTATTGG ATCGTTAAGA

1021 ATTCATGGGG AACAAAATGG GGAGAAAGTG GATATATTGA AATGCAAAAA GATATCAAGG

1081 TTAAACAAGG ACTATGTGGT ATTGCCATGC AAGCTTCTTA CCCAACTGCT TAACGGTTCA

1141 GTAATATGCG ATGTAATGCA AAAGATTTCA AAACCGTGTT AATGTATTTA GTAAGCTTAT

1201 GAGGATTGAT TGTAATGTAA TGCTTCATGG TGTGTATTAT CCTATGTATG CATCTCCTAA

1261 ATCACAAAGA AATAATATAG ACCGACCCGC AATAGGTGCA TGTCGGTTGG CGCTGTATGC

1321 TACTGTTATG AATGAATCGT GTGCTTTTAC AAAAAAAAAA AAAAAAAA

(2)SEQ.ID.NO 2的信息

(a)序列特征

长度：344氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO 2

1   MALLQIFLFV ALVLSFCFSI QLAGLSRPLL DEDSMRHEEW MSQHGRVYAD EQEDHKNKRF

61  NVFKENVERI EEFNDGKTFK LAINQFADLT NEEFRASYNG FKGPMVLSSQ ITKPTPFRYE

121 NVSSALPVSV DWRKKGAVTP VKNQGQCGCC WAFSAVAAIE GITQISTGKL ISLSEQELVD

181 CDTKGIDQGC EGGLMDTAFE FIINNGGLTT ESNYPYKGED GTCNFNKTNP IAVSITGYED

241 VPANDEQALM KAVANQPVSV AIEAGGSDFQ FYSSGVFTGE CGTELDHGVT AVGYGESEDG

301 SKYWIVKNSW GTKWGESGYI EMQKDIKAKE GLCGIAMQAS YPTA

根据以上序列，设计构建表达载体引物：

正向引物：5’AAAACC CCA CTT CAAAAC CC  3’

反向引物：5’GCA CAC GAT TCA TTC ATAAC 3’

以衰老叶片的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，得到PCR产物，先与pGEM-T载体(Promega公司产品)进行连接，转化大肠杆菌(购自上海生工生物工程公司)，筛选重组子，进行序列分析。然后，利用限制性内切酶将该片段切下，反向插入植物表达载体pBI121中35S启动子下游，将构建的表达载体转入农杆菌EHA105(promeag公司)中。

利用渗透法转化拟南芥，收获转化拟南芥的种子，在含有卡那霉素的LB固体培养基上进行筛选，将筛选到的抗性苗进行PCR扩增验证，选择纯合的T3代植株，与野生型拟南芥相比较，转基因拟南芥的衰老延迟9-10天。

通过上述技术，从棉花衰老叶片中克隆了编码棉花半胱氨酸蛋白酶的基因，抑制该基因的表达，能够延缓植物的早衰。如果将该基因的反义链与特异的启动子连接，转化棉花抑制该基因的表达，可以延缓棉花的早衰。

【具体实施方式】

实施例1：编码棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆方法：

1总RNA的提取

提取RNA的溶液要经过DEPC处理，配制母液用的双蒸馏水加入0.1％的DEPC，搅拌混合过夜，高压灭菌待用，乙醇和异丙醇开后立即用。全部玻璃器皿在2000C烘烤6小时，塑料制品用0.1％的DEPC溶液浸泡30分钟，高压灭菌，抑制核酸酶的活性后，方可使用。

(1)将12毫升提取液(200mmol L-1 Tis-HCL，Ph 8.5，300mmol L-1，10mmol L-1EDTA，1.5％脱氧胆酸钠，

1.5％Nonidep-40)与120微升巯基乙醇和1％的PVP(W/V)混和均匀，加入离心管中，利用冰水浴中冷却。

(2)取大约1克材料，利用液氮研磨至粉末状，移入离心管中，混和均匀，在冰水浴中放置片刻。

(3)加2M醋酸钠溶液(PH4.0)1.2ml，上下颠倒离心管5次。加入苯酚/氯仿/异戊醇12ml，旋涡混合器上震荡10秒钟，然后水浴中放置15分钟。

(4)离心，10000×g(9200rpm)，20分钟，4℃。将上清夜转移到另一离心管中，注意不要吸到水相和有机相之间的分界层，防止DNA和蛋白质污染。然后加入等体积的异丙醇。混匀后于-20℃放置0.5-3小时。

(5)离心，10000×g(9200rpm)，20分钟，4℃，丢弃上清夜。将离心管倒置于滤纸上片刻。用适量的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的重蒸水(ddH2O)溶解沉淀，并转移到1.5ml eppendorf管中(300μl/管)，然后加入0.4倍体积的5M醋酸铵120μl，2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置0.5-3小时。

(6)离心，13500rpm，4℃，20分钟，弃上清夜。加入1ml70％乙醇，4℃，离心5分钟。37℃干燥15分钟。

(7)用100μl DEPC处理的ddH2O溶解沉淀。

(8)测定OD值。取2-4μg的总RNA进行甲醛变性胶电泳，鉴定RNA是否降解。

2反转录

(1)电泳检测RNA是否降解，并用RNA/DNA calculator测定OD值，计算RNA浓度。

(2)取10μl RNase-free DNase I(promega)在37℃消化15分钟，苯酚氯仿提取，然后用乙醇沉淀。

(3)取2μg总RNA，加DEPC处理的ddH2O至10.5μl。

(4)70℃变性5分钟，冰浴中放置5分钟，然后稍微离心。

(5)依次加入下列试剂：

5×反应缓冲液                          4μl

10mMdNTPmix                            2μl

核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)          0.5μl

引物B26或oligodT(1μg/μl)             1μl

反转录酶(10μ/μl)                     2μl

混均匀后在离心机上稍微离心一下。

(6)42℃水浴60分钟。

(7)85℃加热10分钟，灭活反转录酶(promeag公司)。

(8)加入180μlDEPC处理的ddH2O，稀释至200μl，-20℃保存。

3PCR扩增条件

PCR反应体积为50μl，包括以下成分：

10×反应缓冲液                   5μl

2.5mMdNTP                        4μl

5′端引物(5μM)                  4μl

3′端引物(5μM)                  4μl

反转录产物                       4μl

Tap酶(2.5u)                      0.5μl

反应条件为：

4基因克隆

取2μlPCR产物与pGEM-T Vector进行连接，方法按照Promega产品的说明进行，连接产物的转化DH5α细菌(购自上海生工生物工程公司)，转化菌在LB/ampicillin/IPTG/-Gal固体培养基培养，37℃倒置培养12-20小时，有的菌落为白色，有的变为蓝色。选取白色菌落，提取质粒DNA，进行酶切和PCR鉴定。

5质粒DNA的提取

煮沸法小量提取质粒DNA，碱裂解法提取大量DNA。

6序列分析

序列测定用测序仪ABIPRISM T M--377DNA Sequencer进行，反应试剂为BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit(PERKIN ELMER)。序列测定在大连宝生物公司进行。

7末端序列的克隆

cDNA的3′和5′末端的分离，是根据RACE PCR进行的。具体方法参照GIBCO BRL公司的Race System for Rapid Amplicationof cDNA Ends说明书进行。

8同源序列的比较

DNA和氨基酸的序列比较利用NCBI的BLASTP 2.2.8软件进行，比较数据库为NCBI的GENBANK和EMBL数据库。

实施例2：棉花半胱氨酸蛋白酶基因Ghcysp序列

克隆基因序列分析结果如下：

(1)SEQ.IN.NO 1的信息

(a)序列特征

长度：1368碱基对

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：棉花

(f)序列描述：SEQ.IN.NO 1

1    ATTACCAATA CACATCAAAC TTTTTCACTA TAAAACCCCA CTTCAAAACC CTTTTGGAGT

61   AATCAAATTA GGATCTAATC CTTCAACTTT CTAAACCAAT GGCTTTGCTG CAAATTTTTC

121  TCTTCGTTGC TCTGGTTCTA TCATTCTGTT TTTCCATCCA ACTTGCTGGA CTGTCTCGTC

181  CACTCTTGGA TGAAGACTCC ATGAGGCATG AGGAGTGGAT GAGTCAACAT GGCCGTGTTT

241  ACGCGGATGA GCAGGAGGAC CATAAGAACA AGCGCTTCAA TGTGTTTAAA GAGAACGTCG

301  AACGAATTGA AGAGTTTAAT GACGGAAAAA CTTTCAAACT TGCGATAAAT CAGTTTGCTG

361  ACTTAACCAA TGAGGAATTT CGTGCCAGTT ACAATGGTTT CAAAGGTCCC ATGGTATTAT

421  CTAGTCAAAT AACTAAACCG ACGCCGTTTA GGTACGAAAA CGTTTCTTCT GCTTTGCCTG

481  TTTCAGTTGA TTGGAGGAAG AAAGGAGCTG TTACTCCTGT TAAAAATCAA GGCCAATGCG

541  GATGTTGTTG GGCGTTTTCA GCGGTTGCGG CTATTGAAGG TATTACTCAA ATTAGTACTG

601  GGAAACTTAT ATCTTTGTCA GAACAAGAGC TTGTTGATTG CGACACAAAG GGTATTGACC

661  ATGGCTGCGA AGGCGGTTTA ATGGATACTG CGTTTGAGTT TATTATTAAC AATGGCGGCT

721  TGACAACTGA GTCAAATTAT CCTTACAAAG GCGAAGATGG AACTTGCAAC TTTAACAAGA

781  CCAATCCAAT TGCTGTGTCT ATTACAGGTT ATGAGGATGT CCCGGCTAAT GATGAGCAAG

841  CACTGATGAA GGCAGTGGCA CACCAACCGG TTAGCGTTGC TATTGAAGCG GGTGGTAGTG

901  ATTTCCAATT CTATTCGTCT GGTGTGTTCA CTGGAGAGTG CGGAACGGAA CTTGATCATG

961  CAGTTACTGC TGTCGGATAC GGCGAATCTG AAGACGGATC AAAGTATTGG ATCGTTAAGA

1021 ATTCATGGGG AACAAAATGG GGAGAAAGTG GATATATTGA AATGCAAAAA GATATCAAGG

1081 TTAAACAAGG ACTATGTGGT ATTGCCATGC AAGCTTCTTA CCCAACTGCT TAACGGTTCA

1141 GTAATATGCG ATGTAATGCA AAAGATTTCA AAACCGTGTT AATGTATTTA GTAAGCTTAT

1201 GAGGATTGAT TGTAATGTAA TGCTTCATGG TGTGTATTAT CCTATGTATG CATCTCCTAA

1261 ATCACAAAGA AATAATATAG ACCGACCCGC AATAGGTGCA TGTCGGTTGG CGCTGTATGC

1321 TACTGTTATG AATGAATCGT GTGCTTTTAC AAAAAAAAAA AAAAAAAA

(2)SEQ.IN.NO 2的信息

(d)序列特征

长度：344氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(e)分子类型：蛋白质

(f)序列描述：SEQ.IN.NO 2

1   MALLQIFLFV ALVLSFCFSI QLAGLSRPLL DEDSMRHEEW MSQHGRVYAD EQEDHKNKRF

61  NVFKENVERI EEFNDGKTFK LAINQFADLT NEEFRASYNG FKGPMVLSSQ ITKPTPFRYE

121 NVSSALPVSV DWRKKGAVTP VKNQGQCGCC WAFSAVAAIE GITQISTGKL ISLSEQELVD

181 CDTKGIDQGC EGGLMDTAFE FIINNGGLTT ESNYPYKGED GTCNFNKTNP IAVSITGYED

241 VPANDEQALM KAVANQPVSV AIEAGGSDFQ FYSSGVFTGE CGTELDHGVT AVGYGESEDG

301 SKYWIVKNSW GTKWGESGYI EMQKDIKAKE GLCGIAMQAS YPTA

实施例3：表达载体的构建

1根据编码棉花半胱氨酸蛋白酶基因Ghcysp序列，设计以下PCR引物：

正向引物：5’AAAACC CCA CTT CAA AAC CC 3’

反向引物：5’GCA CAC GAT TCA TTC ATAAC 3’

以衰老叶片的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，得到PCR产物。2取2μl PCR产物与pGEM-T Vector进行连接，方法按照Promega产品的说明进行，连接产物的转化DH5α细菌(购自上海生工生物工程公司)，转化菌在LB/ampicillin/IPTG/-Gal固体培养基培养，37℃倒置培养12-20小时，有的菌落为白色，有的变为蓝色。选取白色菌落，提取质粒DNA，进行酶切和PCR鉴定。

3利用限制性内切酶将该片段切下，反向插入植物表达载体pBI121中35S启动子下游，将构建的表达载体转入农杆菌LBA4404(promeag公司)中。

实施例4：转基因拟南芥的获得

1将拟南芥种子用70％乙醇浸泡5分钟，无菌水飘洗两遍，再用2.6％次氯酸钠浸泡10分钟，用无菌水飘洗四遍后，最后将种子洒在GM培养基上(1/2MS，1×B5Vitamins，1％蔗糖，0.8％琼脂，PH5.8，4℃下春化处理48小时。

2将含有已春化处理种子的平板转移到光照培养箱中培养。条件为：24℃，15hr光照/9hr黑暗，70-100microeinsteins/m2/sec light intensity。种子在三天后发芽，开花后进行转化。

3利用渗透法转化拟南芥，收获转化拟南芥的种子，在含有卡那霉素的LB固体培养基上进行筛选，将筛选到的抗性苗进行PCR扩增验证，选择纯合的T3代植株，与野生型拟南芥相比较，转基因拟南芥的衰老延迟9-10天。

       棉花半胱氨酸蛋白酶基因Ghcysp序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>编码棉花半胱氨酸蛋白酶基因及其应用

<130>1

<160>2

<170>Patent In Version 3.1

<210>1

<211>1368

<212>DNA

<213>棉花<Gossypium hirsutum>

<220>1

<221>CDS

<222>(99)..(1133)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(98)

<223>

<221>3’UTR<235>(1133)..(1368)<235>

<400>1

1   ATTACCAATACACATCAAACTTTTTCACTATAAAACCCCACTTCAAAACCCTTTTGGAGT

61  AATCAAATTAGGATCTAATCCTTCAACTTTCTAAACCAATGGCTTTGCTGCAAATTTTTC

                                          M  A  L  L  Q  I  F  L

121 TCTTCGTTGCTCTGGTTCTATCATTCTGTTTTTCCATCCAACTTGCTGGACTGTCTCGTC

      F  V  A  L  V  L  S  F  C  F  S  I  Q  L  A  G  L  S  R  P

181 CACTCTTGGATGAAGACTCCATGAGGCATGAGGAGTGGATGAGTCAACATGGCCGTGTTT

      L  L  D  E  D  S  M  R  H  E  E  W  M  S  Q  H  G  R  V  Y

241 ACGCGGATGAGCAGGAGGACCATAAGAACAAGCGCTTCAATGTGTTTAAAGAGAACGTCG

      A  D  E  Q  E  D  H  K  N  K  R  F  N  V  F  K  E  N  V  E

301 AACGAATTGAAGAGTTTAATGACGGAAAAACTTTCAAACTTGCGATAAATCAGTTTGCTG

      R  I  E  E  F  N  D  G  K  T  F  K  L  A  I  N  Q  F  A  D

361 ACTTAACCAATGAGGAATTTCGTGCCAGTTACAATGGTTTCAAAGGTCCCATGGTATTAT

      L  T  N  E  E  F  R  A  S  Y  N  G  F  K  G  P  M  V  L  S

421 CTAGTCAAATAACTAAACCGACGCCGTTTAGGTACGAAAACGTTTCTTCTGCTTTGCCTG

      S  Q  I  T  K  P  T  P  F  R  Y  E  N  V  S  S  A  L  P  V

481 TTTCAGTTGATTGGAGGAAGAAAGGAGCTGTTACTCCTGTTAAAAATCAAGGCCAATGCG

      S  V  D  W  R  K  K  G  A  V  T  P  V  K  N  Q  G  Q  C  G

541 GATGTTGTTGGGCGTTTTCAGCGGTTGCGGCTATTGAAGGTATTACTCAAATTAGTACTG

       C  C  W  A  F  S  A  V  A  A  I  E  G  I  T  Q  I  S  T  G

601  GGAAACTTATATCTTTGTCAGAACAAGAGCTTGTTGATTGCGACACAAAGGGTATTGACC

       K  L  I  S  L  S  E  Q  E  L  V  D  C  D  T  K  G  I  D  H

661  ATGGCTGCGAAGGCGGTTTAATGGATACTGCGTTTGAGTTTATTATTAACAATGGCGGCT

       G  C  E  G  G  L  M  D  T  A  F  E  F  I  I  N  N  G  G  L

721  TGACAACTGAGTCAAATTATCCTTACAAAGGCGAAGATGGAACTTGCAACTTTAACAAGA

       T  T  E  S  N  Y  P  Y  K  G  E  D  G  T  C  N  F  N  K  T

781  CCAATCCAATTGCTGTGTCTATTACAGGTTATGAGGATGTCCCGGCTAATGATGAGCAAG

       N  P  I  A  V  S  I  T  G  Y  E  D  V  P  A  N  D  E  Q  A

841  CACTGATGAAGGCAGTGGCACACCAACCGGTTAGCGTTGCTATTGAAGCGGGTGGTAGTG

       L  M  K  A  V  A  H  Q  P  V  S  V  A  I  E  A  G  G  S  D

901  ATTTCCAATTCTATTCGTCTGGTGTGTTCACTGGAGAGTGCGGAACGGAACTTGATCATG

       F  Q  F  Y  S  S  G  V  F  T  G  E  C  G  T  E  L  D  H  A

961  CAGTTACTGCTGTCGGATACGGCGAATCTGAAGACGGATCAAAGTATTGGATCGTTAAGA

       V  T  A  V  G  Y  G  E  S  E  D  G  S  K  Y  W  I  V  K  N

1021 ATTCATGGGGAACAAAATGGGGAGAAAGTGGATATATTGAAATGCAAAAAGATATCAAGG

       S  W  G  T  K  W  G  E  S  G  Y  I  E  M  Q  K  D  I  K  V

1081 TTAAACAAGGACTATGTGGTATTGCCATGCAAGCTTCTTACCCAACTGCTTAACGGTTCA

       K  Q  G  L  C  G  I  A  M  Q  A  S  Y  P  T  A  *

1141 GTAATATGCGATGTAATGCAAAAGATTTCAAAACCGTGTTAATGTATTTAGTAAGCTTAT

1201 GAGGATTGATTGTAATGTAATGCTTCATGGTGTGTATTATCCTATGTATGCATCTCCTAA

1261 ATCACAAAGAAATAATATAGACCGACCCGCAATAGGTGCATGTCGGTTGGCGCTGTATGC

1321 TACTGTTATGAATGAATCGTGTGCTTTTACAAAAAAAAAAAAAAAAAA

<210>2

<211>344

<212>PRT

<213>棉花<Gossypium hirsutuum>

<400>2

1   MALLQIFLFV ALVLSFCFSI QLAGLSRPLL DEDSMRHEEW MSQHGRVYAD EQEDHKNKRF

61  NVFKENVERI EEFNDGKTFK LAINQFADLT NEEFRASYNG FKGPMVLSSQ ITKPTPFRYE

121 NVSSALPVSV DWRKKGAVTP VKNQGQCGCC WAFSAVAAIE GITQISTGKL ISLSEQELVD

181 CDTKGIDQGC EGGLMDTAFE FIINNGGLTT ESNYPYKGED GTCNFNKTNP IAVSITGYED

241 VPANDEQALM KAVANQPVSV AIEAGGSDFQ FYSSGVFTGE CGTELDHGVT AVGYGESEDG

301 SKYWIVKNSW GTKWGESGYI EMQKDIKAKE GLCGIAMQAS YP

Claims (9)

1.一种编码半胱氨酸蛋白酶的核酸，其具有：

(a)序列SEQ ID No.1；

(b)基于密码子的兼并性与(a)编码相同蛋白酶的序列；或

(c)与(a)的同源性大于65.4％的核酸序列。

2.根据权利要求1的核酸，其特征在于来自棉花。

3.一种由权利要求1核酸编码的半胱氨酸蛋白酶，其特征在于具有如下序列：

a)氨基酸序列SEQ ID No.2；或

b)与SEQ ID No.2具有至少82％同源性的氨基酸序列。

4.一种克隆棉花半胱氨酸蛋白酶基因的方法，包括步骤：

(a)根据编码棉花半胱氨酸蛋白酶的基因，设计引物；

正向引物：5’AAA ACC CCA CTT CAA AAC CC 3’

反向引物：5’GCA CAC GAT TCA TTC ATA AC 3’

(b)以棉花衰老叶片的cDNA为模板，利用(a)中的引物对进行RT-PCR；

(c)将PCR产物与载体连接并转化DH5α细菌，倒置培养，选取白色菌落，提取质粒DNA；

(d)酶切和PCR鉴定，获得棉花半胱氨酸蛋白酶基因。

5.一种延缓植物早衰的方法，包括步骤：

(a)利用半胱氨酸蛋白酶基因，构建反义表达载体；

(b)将表达载体转入农杆菌；

(c)利用(b)中获得的转化子转化植物。

6.根据权利要求5延缓植物早衰的方法，其中的半胱氨酸蛋白酶基因具有序列：

(a)序列SEQ ID No.1；

(b)基于密码子的兼并性与(a)编码相同蛋白酶的序列；或

(c)与(a)的同源性大于65.4％的核酸序列。

7.根据权利要求5或6的延缓植物早衰的方法，其特征在于其中的植物为棉花、小麦或玉米。

8.权利要求1或2的编码半胱氨酸蛋白酶的核酸在延缓植物早衰中的应用。

9.根据权利要求8的核酸在延缓植物早衰中的应用，其特征在所述的植物为棉花、小麦或玉米。