CN102191267B

CN102191267B - 利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫rna干扰

Info

Publication number: CN102191267B
Application number: CN201110059536.7A
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 毛颖波; 薛学义; 林芝萍; 王凌健
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2031-03-11
Also published as: CN102191267A; WO2011110099A1

Abstract

本发明提供了利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法，该方法是将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。

Description

利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域。具体地说，本发明涉及一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法。

背景技术

在农业上，虫害问题一直是影响农作物产量的一个重要因素。人们每年要投入大量的人力、物力来抑制虫害，以提高作物产量。

随着农业害虫对农药的抗性增加，以及出于保护环境和可持续性发展的考虑，迫切需要新的抗虫方法的出台。转基因抗虫植物的出现缓解了这一矛盾，为农业的发展作出了重大贡献，如转基因抗虫大豆，Bt抗虫棉等。然而，目前已陆续有研究报道，随着时间的推移，各种转基因抗虫植物的抗性正在下降，以前大规模罕见的虫害现象又开始死灰复燃。因此，迫切需要找到新的方法，开发出新型的转基因抗虫植物，以有效地和/或特异性地对抗植物的病虫害。

发明人此前开发出了一种利用RNA干扰机制、以植物作为载体来抑制昆虫生长的方法(专利申请号：200610119029.7，该专利申请全文纳入本文作为参考)。该方法将包含正向和反向昆虫基因(或片段)序列导入到植物内，在植物中表达昆虫基因的dsRNA，当昆虫在取食了转基因植物后，体内的靶基因通过RNA干扰途径被抑制，从而使害虫的生长发育受到抑制。由于可以根据某种昆虫某个特定基因的序列设计专一的dsRNA，这一技术能够有选择地抑制昆虫特定基因的表达，从而为开发更有效和更安全的转基因抗虫植物开辟了新方向(Mao等人，2007)。RNA干扰效率和有效的靶基因是这一技术得以应用的关键。

然而，仍然需要进一步改进来提高昆虫对诸如dsRNA分子的吸收，从而提高RNA干扰的作用。

发明内容

针对以上问题，本发明人经过研究发现，植物半胱氨酸蛋白酶能够增强昆虫中肠对诸如dsRNA分子、棉酚等大分子的通透性。因此，其与植物介导的昆虫RNA干扰技术相结合能显著加强植物介导的昆虫RNA干扰作用。

本发明的第一个方面提供了一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法，所述植物的细胞内已转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物，所述方法包括将表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入所述植物的细胞、组织或器官中。

本发明提供了一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法，所述方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。

优选的，所述的植食性昆虫是鳞翅目昆虫。

本发明另一方面提供了一种提高植物抗虫性的方法，所述方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。

本发明另一方面提供了一种植物细胞，所述的植物细胞中含有表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物。

本发明还有一个方面提供了含有上述植物细胞的转基因植物、其组织或其后代。

本发明另一方面提供了一种生产转基因植物的方法以及用该方法获得的转基因植物，所述转基因植物具有改善的抗虫性，该方法包括使转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物的亲本植物与转入了表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物的亲本植物杂交，筛选并获得所述昆虫基因dsRNA和所述植物半胱氨酸蛋白酶共同表达的植物后代。

本发明另一方面提供了一种转基因植物、其组织或其后代，其含有权利要求9-11任一项所述的植物细胞。

本发明的另一方面提供了一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物具有改善的抗虫性，该方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，使所述植物细胞、组织或器官再生成植株。

本发明的其它优点可从下文的详细描述和实施例得知。

附图说明

图1显示了GhCP与CAB54307的序列一致性分析，结果显示GhCP与CAB54307在核苷酸和蛋白水平存在微小差异。图1A是GhCP与CAB54307在核苷酸水平上的比对(开放阅读框)。方框部分代表两者的差异部分。图1B表示GhCP与CAB54307在蛋白水平上的比对。标注有“*”代表两者的保守部分。

图2显示了GhCP和AtCP导入细菌中的表达。图2A是所用载体的示意图，其中利用T7启动子驱动Venues，GhCP或AtCP融合蛋白的表达。图2B是分别提取表达Venues，GhCP和AtCP的细菌总蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳的结果，其中Mark表示蛋白分子标记，单位KD为千道尔顿。

图3表明通过棉铃虫中肠中棉酚浓度的检测，发现GhCP和AtCP能够增强棉铃虫对棉酚的通透性。图3A：将表达Venus或GhCP的E.coli细胞分别与人工饲料混合，选取生长一致的3龄棉铃虫分成两组，分别喂以上述人工饲料。进食两天后，移至含有0.1％棉酚浓度的人工饲料，继续培养一天。用间苯三酚染色，检测中肠细胞内的棉酚含量。图3A中左侧柱表示Venus，右侧柱表示GhCP。图3B：将表达Venus或AtCP的E.coli细胞分别与人工饲料混合，进行与图3A中类似的昆虫饲喂试实验后，用间苯三酚染色，检测中肠细胞内的棉酚含量。图3B中左侧柱表示Venus，右侧柱表示AtCP。

图4是实时定量PCR检测GST1在棉铃虫中肠的转录本。图4A显示了昆虫饲喂实验示意图。图4B显示RT-PCR检测进食野生型拟南芥Col-0(浅色)或转基因拟南芥AtdsGST1(深色)两天后昆虫中肠GST1相对于内标ACT的表达量。图4C显示进食转基因拟南芥AtdsGST1相对于进食野生型拟南芥Col-0的幼虫中GST1的比例(进食转基因拟南芥AtdsGST1幼虫中GST1的表达量/进食野生型拟南芥Col-0幼虫中GST1的表达量)。图中：Venus：在饲喂拟南芥之前，先用表达Venus的E.coli细胞与人工饲料混合，喂养生长一致的3龄棉铃虫两天做预处理；GhCP：用表达GhCP代替Venus的E.coli细胞，进行预处理；AtCP：用表达AtCP代替Venus的E.coli细胞，进行预处理。

图5表示将GhCP导入拟南芥中表达。图5A是载体构建示意图；图5B是RT-PCR检测转基因拟南芥AtGhCP中GhCP的转录本，其中泳道5为阴性对照。

图6表示通过ATGhCP饲养的棉铃虫对棉酚的通透性增强；在进食dsGST，dsCYP6AE14植物组织后，RNAi的效果更加明显。图6A：选取生长一致的3龄棉铃虫分成两组，分别喂以野生型拟南芥(Col-0)或转基因拟南芥ATGhCP(ATGhCP)。两天后，移至含有0.1％棉酚浓度的人工饲料，继续培养一天。用间苯三酚染色，检测中肠细胞内的棉酚含量。图6B：RT-PCR检测进食野生型拟南芥Col-0或转基因拟南芥AtdsCYP6AE14两天后棉铃虫中肠CYP6AE14相对与内标ACT的表达量。WT：用Col-0喂养三龄生长一致的棉铃虫幼虫两天，分成两组，一组继续进食Col-0(浅色)，一组转移至AtdsCYP6AE14(深色)继续培养两天后CYP6AE14的表达。AtGhCP：用AtGhCP喂养三龄生长一致的棉铃虫幼虫两天后，分成两组，进行类似的饲喂实验后CYP6AE14的表达。图6C：用AtdsGST1代替AtdsCYP6AE14，进行图6B所述饲喂实验，RT-PCR分析棉铃虫中肠GST1的相对表达。

图7显示了35S::GhCP4与dsGIP转基因棉花杂交后代的鉴定。RT-PCR检测F1代中GhCP4，dsGIP，NPTII的表达水平，CK为R15。黑框显示为35S::GhCP4/dsGIP共表达。

图8显示dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP棉花对棉铃虫的抗性，其中A：二龄棉铃虫分四组，每组36头，分别饲喂R15，dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP棉叶，检测饲喂5天，8天后的体重。B：二龄棉铃虫分别进食R15，dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP棉叶5天。

图9显示幼虫对R15，dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP棉叶的消耗量，其中二龄幼虫在进食不同的棉叶5天，转移至相应的R15，dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP新鲜棉叶一天后，测定棉叶被消耗的量。

具体实施方式

本发明第一方面提供了一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法，其特征在于，所述方法包括将表达昆虫基因双链RNA(dsRNA)的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。

在一个优选的实施方案中，所述昆虫基因是昆虫生长必需的基因，或在特定条件下(如在有农药、或植物抗毒素等存在或诱导的情况下)能影响昆虫生长发育的基因。在一个更优选的技术方案中，所述昆虫基因是在昆虫的胃或肠中表达的基因。更佳地，所述昆虫基因是在昆虫的胃或肠中特异性表达或高表达的基因。

本发明对所采用的昆虫基因没有特别的限制。为了能够使昆虫在服食所述的植物后受到抑制，所述昆虫基因通常为昆虫生长必需的基因或在特定条件下能影响昆虫生长发育的基因。如本文所用，所述的“昆虫生长必需的基因”为在昆虫的生长、发育、代谢、繁殖过程中发挥重要作用的基因(也称为“昆虫生长的重要基因”)。所述基因的低表达或不表达将导致昆虫的生长、发育、代谢、繁殖等过程产生异常，甚至导致昆虫的死亡。在用于本发明时，所述的昆虫生长必需的基因是全长基因或基因片段。作为本发明的优选方式，本发明优选的昆虫基因的片段的长度至少为50bp，比如可以是60bp、80bp、100bp、200bp、500bp、1000bp。当然也可以采用全长基因。所述的特定条件比如在有农药或植物抗毒素存在等的情况下。由于昆虫通过口服植物来摄入所述的siRNA，因此，所述昆虫基因优选地为在昆虫的胃或肠中高表达的基因。选择在昆虫的胃或肠中高表达的基因可以一定程度地避免昆虫其它组织或器官的基因的siRNA在行使干扰作用时，受到昆虫体内各种屏障的影响(如被阻断或降解)。作为本发明的优选方式，所述的昆虫基因选自(但不局限于)：P450基因(GIP)、谷胱苷肽-S-转移酶基因(GST1)、CYP6AE14基因。

如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。术语“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。在本发明中，所述的RNA干扰的基本原理是：以植物作为媒介，通过转基因的方法让植物体内表达昆虫基因(全长或部分)的双链RNA(dsRNA)，在植物体内加工形成高丰度的siRNA，当昆虫取食这种转基因植物的同时也摄入了大量的siRNA，所述的siRNA在进入昆虫体内后能够抑制所述昆虫基因在昆虫体内的表达，干扰昆虫正常的生长发育甚至引起昆虫的死亡，从而降低昆虫对植物的取食。因此，本发明另一方面提供了一种提高植物抗虫性的方法，所述方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，从而在植物细胞、组织或器官中表达出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆虫基因的dsRNA。

在一个优选的技术方案中，所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I

式中，

Seq_正向为昆虫基因的正向序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；

Seq_反向为跟Seq_正向基本上互补的序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。所述构建物能在植物细胞、组织或器官中表达形成式II所示的昆虫基因的dsRNA，并在植物体内被加工成siRNA。

式II

式中，

Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的氢键(优选的，为双链RNA氢键)。

在上述技术方案中，所采用的间隔序列的长度没有特别的限制，只要在其与正向序列和反向序列形成构建物且被导入到体内后，能够形成式II所示的dsRNA即可。作为本发明的优选方式，所述间隔序列的长度为80-300bp；更佳地为100-250bp。

如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多7个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多6个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多5个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多4个不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG 3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT 3’)。

本领域的普通技术人员熟悉同源度或同一性的分析，例如利用不同的软件分析，如BLAST，GCG，CLUSTAL，FASTA，ENTREZ等。

“同源性”指参考序列和新序列的克隆插入物或其编码的氨基酸序列的至少一个片段之间的序列相似性。“同一性”或“相似性”指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性，而“同一性”的比较更加严格。

在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如200.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％以上，较好的60％以上，较好的至少70％以上，较好的至少80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO.2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明所述的植物半胱氨酸蛋白酶，可以来源于拟南芥、棉花、玉米、水稻、小麦等。优选的，参与抗虫等防御反映的半胱氨酸蛋白酶，如来自玉米的半胱氨酸蛋白酶Mir1-CP，。优选的，与棉花半胱氨酸蛋白酶(GhCP)和拟南芥半胱氨酸蛋白酶(AtCP)具有高度序列同源性且同样具有半胱氨酸蛋白酶相同生物活性(如本发明实施例中所述)的其它植物蛋白也涵盖在本发明的术语“植物半胱氨酸蛋白酶”的范围或等同范围内。例如，所述的植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列跟SEQ ID NO.1或SEQID NO.2的同源性或同一性至少约50％、52％、55％、58％或60％，优选的至少约62％、65％、68％、70％、72％或75％，更优选的至少约80％、82％、85％、88％或90％，最优选的至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高；在核苷酸水平上，序列的同源度或同一性至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％，更优选地，同源度或同一性至少约82％、85％、90％、95％或更高。这些蛋白酶例如，但不局限于，选自下列：NCBI登录号选自CAE54307.1、XP_002310708.1、XP_002524912.1、ABQ10200.1、XP_002283263.1、BAE80740.1、XP_002326950.1、ABG33750.1、ACU20623.1、AAX84673.1、ABK95110.1、XP_002284973.1、CAB17076.1、XP_002510170.1、CAA53377.1、CAB17074.1、CAB16317.1、AAB68374.1、CAN61026.1、XP_002313136.1、XP_002306486.1、ABQ10202.1、XP_002285299.1、XP_002518705.1、XP_002283282.1、AAK48495.1、ABD32628.1、AAK07730.1、BAG16377.1、BAD29954.1、BAC75923.1、BAG16371.1、CAB53515.1、AAL60580.1、ACB87490.1、CAA46863.1、AAD48496.1、ABQ10204.1、NP_568620.1、XP_002298740.1、AAQ62999.1、ABR19828.1、XP_002863697.1、AAK62661.1、BAD29958.1、XP_002894032.1、ABR19827.1、BAD95392.1、AAL60579.1、NP_564497.1、BAH20463.1、BAF46304.1、CAQ00105.1、BAD29960.1、ACU18666.1、NP_001149658.1、BAD29957.1、NP_195406.2、BAF02546.1、BAD29956.1、BAH11164.1、CAA57538.1、Q94B08.2、BAF00916.1、BAD16614.1、BAC75927.1、P25776.2、NP_001148706.1、EEE61807.1、EEC78138.1、AAL60578.1、NP_566633.1、XP_002868998.1、NP_001105993.1、BAA14402.1、NP_001104879.1、CAE04498.2、XP_002883178.1、ABK24233.1、AAP41847.1、CAJ86180.1、AAC49455.1、AAB23155.1、P25251.1、ABK24495.1、AAA79915.1、NP_001150266.1、ACR34204.1、NP_001150196.1、CBI40282.3、BAF93840.1、XP_002448736.1、BAF02547.1、ACI00280.1、CAQ00106.1、CBI19479.3、XP_002447300.1、NP_001054211.2、AAB41816.1、BAA14403.1、NP_567377.1、XP_002872576.1、XP_002872575.1、BAJ33895.1、NP_567376.1、AAM13065.1、NP_567686.2、NP_568620.1、AAL60580.1、XP_002863697.1、BAG16371.1、XP_002894032.1、AAK62661.1、NP_564497.1、BAD95392.1、BAG16377.1、CAA20473.1、XP_002867702.1、AAL60579.1、ABG33750.1、AAX84673.1、XP_002510170.1、CAN61026.1、BAE80740.1、XP_002284973.1、BAC75923.1、XP_002326950.1、XP_002518705.1、AAQ62999.1、ABQ10202.1、ACU18666.1、ABK95110.1、XP_002313136.1、ABD32628.1、CAB17076.1、ACB87490.1、XP_002524912.1、BAF46304.1、BAD29954.1、BAD16614.1、AAD48496.1、BAD29958.1、ABR19827.1、CAA46863.1、XP_002283263.1、CAB53515.1、XP_002285299.1、ABQ10200.1、NP_001104879.1、ABQ10204.1、NP_001148706.1、BAD29957.1、BAD29960.1、CAB17074.1、NP_001105993.1、AAB68374.1、NP_001149658.1、XP_002298740.1、BAH20463.1、BAC75927.1、XP_002310708.1、CAQ00105.1、CAA53377.1、AAK48495.1、CAB16317.1、ACU20623.1、AAA79915.1、CAE54307.1、ABK24495.1、ABR19828.1、ABQ10192.1、NP_566634.2、BAC43113.1、NP_001150266.1、ACR34204.1、BAF02546.1、XP_002989790.1、XP_002328138.1、BAH11164.1、CAQ00106.1、ACI00280.1、ABK24233.1、EEE61807.1、P25776.2、BAD29956.1、EEC78138.1、ACC91281.1、XP_002283282.1、AAK07730.1、ABQ10197.1、AAP41847.1、XP_002990132.1、BAF93840.1、NP_001054211.2、XP_002447300.1、CAJ86180.1、CAE04498.2、BAA14402.1、NP_566633.1、BAA14403.1、NM_001112101.1、NP_001105571.1的蛋白酶。在本发明的一个优选方案中，所述植物半胱氨酸蛋白酶优选棉花半胱氨酸蛋白酶(GhCP)和拟南芥半胱氨酸蛋白酶(AtCP)，更优选的是具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

通常，所述构建物位于表达载体上。本发明的所述构建物可以在相同的表达载体上，优选在不同的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因、以及任选的转录终止信号等。实现表达所需的或有帮助的其它因子也可使用。例如，表达载体还可包括编码信号肽或定位肽的核酸，这些肽能使表达的核酸或多肽转运到胞内细胞器或区室(例如叶绿体)或分泌通过膜。转录终止信号、增强子以及影响基因表达的其它核酸序列也可包括在所述表达载体内。本领域技术人员能够本领域熟知的方法构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。上述表达载体可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。

将本发明的构建物转入植物细胞(如具有再生能力的植物细胞)、组织或器官的方法也采用本领域的常规技术技术，如农杆菌转化。对于农杆菌转化而言，宜提供T DNA序列用于农杆菌介导的转移至植物染色体。当异源基因不易检测时，该构建物最好还具有一个适用于确定植物细胞是否已经转化的可选择标记基因。另外，也可将异源序列整合到植物基因组中的序列。这些序列可能包括用于同源重组的转座子序列以及允许将异源表达盒随机插入植物基因组中的Ti序列。合适的原核可选择标记包括抗生素(如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素)抗性标记。编码其它功能的其它DNA序列也可存在于载体中，这是本领域所知的。表达载体也可通过电穿孔导入植物细胞中。在该技术中，在含有基因构建物的质粒存在下电穿孔植物原生质体。高电场强度的电脉冲使生物膜可逆地被通透，从而允许导入质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁，分裂并形成植物愈伤组织。因此，本发明另一方面提供了一种植物细胞，所述的植物细胞中含有表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物。

本发明另一方面涉及一种含有上述植物细胞的转基因植物、其组织或其后代。所述转基因植物可以用本领域技术人员已知的常规手段来获得。例如，能分离出原生质体并能培育成全再生植物的所有植物。再生方式随各种植物而有所不同，但是通常是首先提供含有异源基因拷贝的转化的原生质体悬液。形成愈伤组织，从愈伤组织中诱生出枝条，随后是根。另外，从原生质体悬液可以诱生形成胚。这些胚象天然的胚那样发芽形成植物。培养基通常含有各种氨基酸和激素，如植物生长素和细胞分裂素。

本发明的表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物可以转入同一宿主植物细胞中使其共表达，也可以转入不同的植物细胞中并再生成植株，然后将分别转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物的植物与转入表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物的植物杂交，筛选出两者有共表达的植物后代。因此，本发明还提供了一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物具有改善的抗虫性，该方法包括使转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物的亲本植物与转入了表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物的亲本植物杂交，筛选并获得所述昆虫基因dsRNA和所述植物半胱氨酸蛋白酶共同表达的植物后代。

本发明所适用的昆虫没有特别的限制，所述昆虫可以是任何一种能以植物为食的植食性昆虫，比如其可以是弹尾目、等翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、直翅目、半翅目、缨翅目的昆虫或农业害虫，具体例如是长翅卷蛾属种、褐带卷蛾属、透翅蛾属、地老虎属、棉叶波纹夜蛾、黎豆夜蛾、黄卷蛾属、带卷蛾属、夜蛾属、玉米楷夜蛾、粉斑螟、桃蛀果蛾、螟属、色卷蛾属、葡萄果蠹蛾、卷叶螟属、云卷蛾属、鞘蛾属、苹果异型小卷蛾、卷叶蛾属、玉米螟属、展叶松夜蛾、金刚钻属、粉螟属、花小卷蛾属、黄毒蛾属、切根虫属、食心虫属、广翅小卷蛾、夜蛾属、菜螟、美国白蛾、番茄蠹蛾、旋纹潜叶蛾、细蛾属、毒蛾属、潜叶蛾属、天幕毛虫属、甘蓝夜蛾、烟草天蛾、尺蠖属、欧洲玉米螟、超小卷蛾属、小眼夜蛾、红铃虫、棉铃虫、马铃薯块茎蛾菜粉蝶、粉蝶属、小菜蛾、巢蛾属、白野螟属、大螟属、卷叶蛾属、粘虫属、透翅蛾属、带蛾属、卷蛾属、粉纹夜蛾、树巢蛾属、叩甲属、象甲属、甜菜隐食甲、甜菜茎跳甲、谷象属、实象属、皮蠹属、叶甲属、瓢虫属、马铃薯甲虫、稻象甲属、金龟属、谷盗属、耳喙象属、丽金龟属、跳甲属、蠹属、金龟子、米象属、麦蛾属、粉甲属、拟谷盗属、斑皮蠹属、非蠊属、蠊属、蝼蛄属、马得拉非蠊、飞蝗属、大蠊属、蚱蜢属、白蚁属、蓟马属、条蓟马属、单蓟马属、棕黄蓟马、棉蓟马、非洲桔硬蓟马。较佳的，所述的“昆虫”是鳞翅目的昆虫，更佳的，所述的“昆虫”是鳞翅目夜蛾科或螟蛾科的昆虫。更佳的，所述昆虫是指棉铃虫、玉米螟蛾和烟芽夜蛾。

本发明对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1棉花半胱氨酸蛋白酶(GhCP)和拟南芥半胱氨酸蛋白酶(AtCP)的分离

根据CAE54307序列信息，合成引物(FlGhCPF：ATGGAATTAACCCTTCTTTTC，FlGhCPR：GCAATGAATTCAAGCACTGC)，PCR扩增得到编码棉花半胱氨酸蛋白酶基因GhCP。将该序列与已知的棉花半胱氨酸蛋白酶CAE54307进行序列一致性(alignment)分析，结果发现GhCP和CAE54307在核苷酸和蛋白水平上存在一定的差异(图1)。

根据AT2G34080.1序列信息，合成引物(FlAtCPF：ATGGGTTATGCTAAATCAGC；FLAtCPR：TTAGGCAACCGAAACTTTATC)，PCR扩增得到编码拟南芥半胱氨酸蛋白酶基因AtCP，经序列一致性分析发现AtCP与AT2G34080.1一致。

GhCP的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

MELTLLFPLFFFTLSSATYISTLTLNQNHPSSSSWRSDDEVMGLYKSWVIQHGKAY

NGIGEEEKRFEIFKDNLRFIDEHNSNNNTTYKLGLNKFADLTNQEYRAKFLGTRT

DPRRRLMKSKIPSSRYAHRAGDNLPDSVDWRDHGAVSPVKDQGSCGSCWAFSTI

ATVEGINKIVSGELVSLSEQELVDCDRSYDAGCNGGLMDYAFQFIMDNGGIDTEK

DYPYLGFNNQCDPTKKNAKVVSIDGYEDVPNNENALKKAVAHQPVSIAIEAGGR

AFQLYES GVFNGECGLALDHGVVAVGYGTDDNGQDYWIVRNSWGSNWGENGY

IRMERNINANTGKCGIAMEASYPVKNGANIIQPYHNESTENISSA

AtCP的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

MGYAKSAMLIFLLALVIASCATAMDMSVVSSNDNHHVTAGPGRRQGIFDAEATL

MFESWMVKHGKVYDSVAEKERRLTIFEDNLRFITNRNAENLSYRLGLNRFADLS

LHEYGEICHGADPRPPRNHVFMTSSNRYKTSDGDVLPKSVDWRNEGAVTEVKD

QGLCRSCWAFSTVGAVEGLNKIVTGELVTLSEQDLINCNKENNGCGGGKVETAY

EFIMNNGGLGTDNDYPYKALNGVCEGRLKEDNKNVMIDGYENLPANDEAALM

KAVAHQPVTAVVDSSSREFQLYESGVFDGTCGTNLNHGVVVVGYGTENGRDYW

IVKNSRGDTWGEAGYMKMARNIANPRGLCGIAMRASYPLKNSFSTDKVSVA

实施例2在E.coli中表达GhCP和AtCP

在GhCP和AtCP的起始密码子和终止密码子前分别引入BamHI和SacI酶切位点，分别将GhCP和AtCP导入pET32a多克隆位点BamHI和SacI之间(图2A)，从而获得分别携带相应的目的片段的重组表达载体，称为pET32a/GhCP和pET32a/AtCP。

将pET32a/GhCP和pET32a/AtCP转化E.coli BL21(DE3)后，挑取阳性单菌落至3mL LB(含100μg/mL Amp)培养基中，37℃，220rpm培养至对数生长早期，加入IPTG到终浓度为1mM，继续28℃诱导培养2-3小时。取1mL菌液12,000g离心5分钟，沉淀悬浮于100μL PBS中，加入等体积2×SDS上样缓冲液，混合后置于沸水浴5分钟，12,000g离心10分钟，取上清，经10％SDS-PAGE电泳，用考马氏亮蓝染色观察表达情况。发现GhCP和AtCP在E.coli BL21(DE3)中高表达(图2B)。

用同样的手段，将Venus蛋白在E.coli BL21(DE3)中表达，作为后继实验的对照。

实施例3棉铃虫(Helicoverpa armigera)在进食表达GhCP或AtCP蛋白的E.coli细胞后对棉酚的通透性增强

选取生长一致的3龄棉铃虫分成两组，分别喂食混有表达Venus蛋白或GhCP的E.coli细胞的人工饲料(取250ml OD为1.0的菌液，离心，取沉淀，与25g人工饲料(人工饲料的配方和饲养方法见王延年等《昆虫人工饲料手册》)混合)。进食两天后，移至含有0.1％(mg/g)棉酚浓度的人工饲料，继续培养一天。用间苯三酚染色，检测中肠细胞内棉酚含量，发现用表达GhCP的E.coli细胞预处理后的幼虫，中肠细胞内的棉酚含量明显高于用表达Venus的E.coli细胞预处理的幼虫(对照组)(图3A)。类似的，还发现用表达AtCP的E.coli细胞预处理的幼虫，中肠细胞内的棉酚含量也明显高于对照组(图3B)。

实施例4GhCP和AtCP对植物介导的昆虫RNA干扰的影响

将表达Venus的E.coli细胞与人工饲料混合，喂养生长一致的3龄棉铃虫。两天后，分两组转移至拟南芥(Col-0)或表达与棉铃虫GST1序列同源dsRNA的转基因拟南芥(AtdsGST1)。继续培养2天。昆虫饲喂实验示意图见图4A。发现进食AtdsGST1的棉铃虫，中肠组织的GST1表达略低于进食Col-0的棉铃虫(对照组)。而用表达GhCP或AtCP的E.coli细胞代替表达Venus的E.coli细胞进行同样的饲喂实验，发现用GhCP或AtCP预处理后的棉铃虫，在进食AtdsGST1后，中肠组织的GST1表达明显低于对照组。这说明，GhCP和AtCP能够增强植物介导的昆虫RNA干扰作用。

实施例5表达GhCP的转基因拟南芥(AtGhCP)培育

(1)35S::GhCP表达载体构建

将构建好的pET32a/GhCP载体用BamHI和SacI进行双酶切，同时将pBI121(购自Clonetech公司)用BamHI和SacI进行双酶切，将酶切下来的GhCP片段取代pBI121上的GUS，插入到BamHI和SacI之间，从而获得携带GhCP目的片段的重组表达载体，称为35S::GhCP表达载体(图5A)。

(2)根癌农杆菌的转化

采用冻融法。农杆菌GV3101(购自Invitrogen公司)单菌落接至3ml LB培养基(含25μg/ml利福霉素(Rif)和100μg/ml庆大霉素(Gen))，28℃，220rpm，过夜培养。2ml菌液转接至50ml LB培养基(25μg/ml Rif和100μg/ml Gen)，28℃，220rpm，培养到OD600＝0.5(约6小时)。在冰上放置30分钟，4℃，5000g离心5分钟。重悬于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g离心5分钟。重悬于1ml 20mM CaCl₂，50μl/管分装，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。将混有含目的基因双元载体35S::GhCP的50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37℃水浴中5分钟使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4小时。取50～100μl涂LB培养基平板(25μg/ml Rif、100μg/ml Gen和50μg/ml卡那霉素(Kan))。

(3)拟南芥植物的转化

采用花芽浸泡法(floral dip)(Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743)拟南芥植物的转化。含双元载体35S::GhCP的单菌落GV3101，加入3ml LB培养基(25μg/ml Rif、100μg/ml Gen和50μg/ml Kan)，28℃，220rpm，培养12小时。取出1ml菌液加入50ml LB培养基，28℃，220rpm，培养12小时。取出5ml菌液加入250ml LB培养基(100μg/ml Gen和50μg/ml Kan)，28℃，220rpm，培养12小时。4200rpm(2900g)离心15分钟。菌体重悬于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株花芽部分在菌液中浸泡5秒钟，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24小时，然后温室生长至开花结籽。T₀代种子在4℃春化2～4天，用20％漂水(白猫公司，上海)处理15分钟，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的MS培养基(含50μg/ml Kan或Hygo)，22℃，连续光照，约一周后，绿色抗性苗(AtGhCP)移栽到营养土(泥炭∶蛭石∶珍珠岩＝1∶1∶1)中生长。

(4)转基因植物的RT-PCR检测

上述绿色抗性苗生长4周后，取叶片提取RNA，进行反转录，用RT-PCR分析转基因植物中GhCP的表达水平，发现9棵检测样本中除5号样本没有检测到信号，其他样本都有较强的信号(图5B)。选取4号和6号植株的种子，繁殖下一代，进行后续实验。

实施例6进食AtGhCP组织后，棉铃虫中肠对棉酚通透性的影响以及对植物介导的昆虫RNA干扰的影响。

用Col-0和表达GhCP的转基因植物AtGhCP分别喂养三龄生长一致的棉铃虫幼虫两天后，将幼虫转移至含0.1％棉酚浓度的人工饲料继续培养两天，提取中肠，用间苯三酚染色，检测中肠细胞内的棉酚含量，发现用AtGhCP预处理的棉铃虫中肠细胞内的棉酚含量明显高于用Col-0预处理的棉铃虫(图6A)。结果表明用AtGhCP预处理的棉铃虫对棉酚的通透性增加。

用Col-0喂养三龄生长一致的棉铃虫幼虫两天后，分成两组，一组继续进食Col-0，一组转移至表达与棉铃虫CYP6AE14序列同源dsRNA的转基因拟南芥AtdsCYP6AE14(方法参见CN200610119029.7，该专利申请全文纳入本文作为参考)继续培养两天后，分析棉铃虫中肠CYP6AE14的表达，发现喂食转基因植物AtdsCYP6AE14的棉铃虫CYP6AE14的表达相对于喂食Col-0的棉铃虫(对照组)有所降低。用AtGhCP喂养三龄生长一致的棉铃虫幼虫两天后，分成两组，进行同样的饲喂实验，发现用AtGhCP预处理的棉铃虫在进食AtdsCYP6AE14后CYP6AE14表达水平的降低变得更加明显。用AtdsGST1代替AtdsCYP6AE14，进行类似的饲喂实验，也发现用AtGhCP预处理的棉铃虫在进食AtdsGST1后GST1表达水平的降低变得更加明显(图6B，C)。以上结果说明AtGhCP的预处理能够增强植物介导的昆虫RNA干扰作用。

实施例7通过杂交生产抗虫性转基因棉花

将GhCP4导入棉花表达(35S::GhCP4)，发现进食转基因棉叶的幼虫体内棉酚积累增加，生长受到一定的抑制。为获得抗虫性得到改善的转基因棉花，将35S::GhCP4与dsGIP转基因棉花进行了杂交。得到了F1代植株。对22棵F1代植株进行了鉴定，发现以35S::GhCP4为母本dsGIP为父本的5棵杂交后代中，发现有3棵dsGIP和GhCP4共表达，在以dsGIP为母本35S::GhCP4为父本的17棵杂交后代中，发现有4棵dsGIP和GhCP4共表达，因此共得到7棵35S::GhCP4/dsGIP转基因杂交棉花(图7)。

二龄棉铃虫分四组，每组36头，分别饲喂R15，dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP棉叶，5天后检测体重，发现进食dsGIP和35S::GhCP4棉叶的棉铃虫体重增长为对照(进食R15棉叶的幼虫)的67％，而进食35S::GhCP4/dsGIP棉叶的棉铃虫生长受到了严重的抑制，体重增长仅为对照(进食R15棉叶的幼虫)的42％。8天后再次检测幼虫体重，发现进食dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP棉叶的幼虫生长较对照组缓慢，其中进食35S::GhCP4/dsGIP棉叶的幼虫生长受到严重抑制(图8)。二龄幼虫在进食不同的棉叶5天后转移至相应的R15，dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP新鲜棉叶又一天，发现幼虫对dsGIP，35S::GhCP4，35S::GhCP4/dsGIP棉叶的消耗降低，其中以对35S::GhCP4/dsGIP棉叶的损耗最低(图9)。

以上结果说明，在dsGIP棉花中过表达植物半胱氨酸蛋白酶能够提高棉花对棉铃虫的抗性。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

参考文献：

1.Mao YB，Cai WJ，Wang JW，Hong GJ，Tao XY，Wang LJ，Huang YP，Chen XY(2007).Nature Biotechnology，25：1307-1313.

2.Pechan T，Cohen A，Williams WP，Luthe DS(2002).PNAS，99：13319-13323.

Claims

1.一种利用半胱氨酸蛋白酶增强植物介导的昆虫RNA干扰的方法，所述植物的细胞内已转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物，其特征在于，所述方法包括将表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入所述植物的细胞、组织或器官中，其中所述昆虫是棉铃虫，所述植物是棉花或拟南芥，所述植物半胱氨酸蛋白酶选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆虫基因是昆虫生长必需的基因，或在特定条件下能影响昆虫生长发育的基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达昆虫基因dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有以下式I结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I

式中，

Seq_反向为跟Seq_正向基本上互补的序列或片段，其中所述片段的长度至少为50bp；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，其中所述昆虫基因为谷胱苷肽-S-转移酶基因或CYP6AE14基因。

4.如权利要求1所述的方法，该方法还包括使所述植物的细胞、组织或器官再生成植株。

5.一种提高植物抗虫性的方法，其特征在于，所述方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，其中所述昆虫是棉铃虫，所述植物是棉花或拟南芥，所述植物半胱氨酸蛋白酶选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

6.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物具有改善的抗虫性，该方法包括使转入了表达昆虫基因dsRNA的构建物的亲本植物与转入了表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物的亲本植物杂交，筛选并获得所述昆虫基因dsRNA和所述植物半胱氨酸蛋白酶共同表达的植物后代，其中所述昆虫是棉铃虫，所述植物是棉花或拟南芥，所述植物半胱氨酸蛋白酶选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

7.一种生产转基因植物的方法，所述转基因植物具有改善的抗虫性，该方法包括将表达昆虫基因dsRNA的构建物以及表达植物半胱氨酸蛋白酶的构建物转入植物细胞、组织或器官中，使所述植物细胞、组织或器官再生成植株，其中所述昆虫是棉铃虫，所述植物是棉花或拟南芥，所述植物半胱氨酸蛋白酶选自SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的氨基酸序列。