CN1215079C - 偃麦草钠离子反向转运蛋白基因及其克隆方法与应用 - Google Patents
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- CN1215079C CN1215079C CNB021355452A CN02135545A CN1215079C CN 1215079 C CN1215079 C CN 1215079C CN B021355452 A CNB021355452 A CN B021355452A CN 02135545 A CN02135545 A CN 02135545A CN 1215079 C CN1215079 C CN 1215079C
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Abstract
本发明涉及偃麦草中Na+反向转运蛋白ENHX1基因的克隆、重组及耐盐性功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。从偃麦草根中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na+反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对兼并引物，进行常规聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA。进一步构建正义表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥具较高的耐盐性。因此，该基因转化小麦、水稻、玉米等作物，将会提高这些植物的耐盐性，将使得这些植物可以在盐碱地上种植，具有非常重要的经济效益和社会效益。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及偃麦草中Na+反向转运蛋白ENHX1基因的克隆、重组及耐盐性功能的分析及应用，属于分子生物学和生物技术领域。
(二)背景技术：
盐胁迫能引起离子渗透胁迫，产生活性氧，破坏植物的渗透势及离子分配的均衡，结果导致植物伤害，特别是影响农作物的产量。因此，提高作物的耐盐性愈来愈受到人们的重视。在高盐下，植物通过产生胁迫蛋白和可溶性渗透调节物质来减轻盐胁迫造成的毒害。早期的耐盐基因工程主要集中在清除自由基和增加渗透调节物质两个方面，转基因植株的耐盐能力有所提高，但效果不太明显。最近，定位在质膜和液泡膜上的Na+反向转运蛋白从许多植物中分离出来。研究结果表明质膜上的Na+反向转运蛋白负责Na+的外排，从而保持植物细胞内低Na+水平。而液泡膜上的Na+反向转运蛋白则负责区隔Na+进入液泡，维持细胞内的离子均衡。这大大促进了耐盐基因工程方面的研究工作并取得突破性进展。Blumwald等利用基因工程手段在番茄和油菜中过量表达Na+反向转运蛋白基因，得到了世界上第一批真正意义上的耐盐植株，参见于张虹霞等人于2001年《自然工程》中的转基因抗盐番茄植株叶中积累盐而果实中不积累盐，19：765-768(Hong-Xia Zhang，Eduardo Blumwald，2001，Nature biotechnology，19：765-768)。
由于Na+反向转运蛋白基因在耐盐过程中所起的作用，本发明人从耐盐植物偃麦草中分离编码Na+反向转运蛋白的基因。根据其它植物中发表的Na+反向转运蛋白的氨基酸序列，设计引物，利用反转录-聚合酶链式反应，从耐盐植物偃麦草中分离出编码质膜上的Na+反向转运蛋白基因。进一步构建正义表达载体，转化模式植物拟南芥，转基因植株具有较高的耐盐性，耐盐性可达200mM。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
(三)发明内容：
本发明首次从耐盐植物偃麦草中分离出编码Na+反向转运蛋白的全长的cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，获得的转基因植株耐盐性高达200mM。
从偃麦草根中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na+反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对兼并引物：
正向引物：5′-CA(CT)TA(CT)AC(CT)TGGCA(CT)AA(CT)GT-3′
反向引物：5′-CAT(GC)AG(ACT)CC(AGT)GCCCACCA(AGT)AT-3′进行常规聚合酶链式反应(PCR)，取2μl PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA。具体的PCR试剂与条件为：
10×反应缓冲液 5μl
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl
正向引物(5μM) 4μl
反向引物(5μM) 4μl
模板cDNA 4μl
Taq DNA聚合酶 0.5μl
总体积 50μl
PCR反应条件为：94℃ 3分钟，然后进入下列循环：94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果扩增到一个DNA片段。取2μl PCR产物连接到pGEM-T载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取菌斑，提取质粒DNA，用于序列测定。
经过3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA为1955bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1638bp，由此推得具546个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，表明与已发表的小麦、水稻和拟南芥的Na+反向转运蛋白相比，氨基酸同源性分别为87％、60％和58％，表明经过上述克隆步骤得到了编码Na+反向转运蛋白的基因。该基因序列如下：序列表
(1)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征
*长度：1955碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：偃麦草
(f)序列描述：SEQ IN NO.1
1 ATCCGCCGAG GTGGCGACCG GCATGGGGCT CGATTTGGGA GCCATCGCTC TCAAGTACAC-60
61 GGGGCTGGCG GTGTCGGACC ACGGCTCCAT CGTCGCCATC AACATCTTCA TCGCGCTGCT-120
121 CTGCGGCTGC ATTGTCTTCG GCCACCTGCT CGAGGGGAAC CGCTGGGTCA ATGAGTCCAC-180
181 CACCGCGCTT GTCCTGGGGC TCATCACCGG TGGTGTGATT CTGATCTGCT CCAAAGGGGT-240
241 GAATTCGCGC ATCCTTATCT TCAGCGAGGA TATTTTCTTC ATCTACTTGC TCCCGCCCAT-300
301 CATTTTTAAC GCCGGGTTTC AAGTAAAGAA AAAGCAATTC TTCCGCAACT TTGCGACAAT-360
361 TATTTTATTT GGTGCTGCTG GAACATTGAT ATCCTTTGTA ATAATCACGT TCGGTGCTAT-420
421 GGGATTGTTC AGCAAACTTG GTGTTGGTCC ACTCGAGCTT GGGGACTATC TTGCAATTGG-480
481 GGCTATCTTC TCAGCAACAG ATTCTGTTTG CACCTTACGG GTGCTTAACC AGGATGAAGC-540
541 ACCCCTACTC TATAGTCTAG TTTTTGGTGA AGGTGTTGTT AATGATGCTA CATCAGTTGT-600
601 GCTCTTCAAT GCAATTCAAA ACATTGATAT TAATCATTTT GATGTCTTTG TTCTACTACA-660
661 ATTCATTGGA AAATTCCTCT ACCTATTCTT CACCAGCACC GTTCTTGGAG TAGCTGCTGG-720
721 GTTGCTTAGT GCATACATTA TTAAGAAACT TTGTTCTGCA AGACACTCAA CTGACAGAGA-780
781 AGTTGCTATC ATGATACTCA TGGCATACCT TTCGTATATG CTGTCAATGT TGCTGGATCT-840
841 GAGTGGCATT CTAACTGTGT TCTTCTGTGG AATAGTAATG TCACATTACA CTTGGCATAA-900
901 TGTCACAGAA AGCTCAAGGG TTACTACCAA GCATACTTTT GCAACTTTAT CACTTATTGC-960
961 TGAGATTTTT CTTTTTCTCT ATGTCGGGAT GGATGCATTG GACATTGATA AATGGAAATT-1020
1021 AGCTAGTAGC AGTCCTAAGA AACCAATTGC TTTAAGCGCT GTTATATTGG GTTTGGTTAT-1080
1081 GGTTGGAAGA GCAGCATTCG TATTCCCTTT ATCTTTTCTA TCGAACTTAA GTAAAAAGGA-1140
1141 GTCACACCCA AAGATTTCCT TCAACCAACA GGTTATCATC TGGTGGGCAG GTCTCATGAG-1200
1201 AGGAGCAGTT TCAATTGCAC TTGCTTATAA CAAGTTTACA ACATCTGGTC ATACTGCCGT-1260
1261 GCGAGTTAAT GCTGTCATGA TCACGAGCAC AATCATTGTT GTTCTGTTCA GCACAATGGT-1320
1321 TTTCGGCTTG CTGACTAAGC CTCTGATTAA TCTCCTCATC CCACCAAGAC CTGGCACTGC-1380
1381 AGCTGATATC TCGAGCCAGT CATTCCTAGA CCCACTTACG GCGAGCTTGT TGGGATCGGA-1440
1441 CTTCGATGTA GGCCAGCTCA CCCCTCAAAC AAACCTTCAG TATCTTCTCA CCATGCCAAC-1500
1501 TCGCTCGGTT CATCGTGTAT GGCGCAAGTT CGATGATAAG TTCATGCGCC CAATGTTTGG-1560
1561 GGGAAGAGGC TTCGTCCCAT TTGTGCCTGG TTCACCCATA GAGAGGAGCG TCCATGGGCC-1620
1621 TGGCTTGTTG GGCACTGTGA CGGAGGCAGA AGACCGTAGT TAAGTTGAAG CCCAGAAGGT-1680
1681 GCAAGTGTAT TTCTGTAAAT GCTCAGATAT CACTCAGTTT TGCTCTTGGG ATTCTTTCGG-1740
1741 TGTATTATCG CTATTTGTTG GTGTATATTG TGCAGATAGT TTCTACAGGA CCATGTACGC-1800
1801 TGTGTAGAGT TTTGGGAGCC ATTCAAGATG TACAATTAAT CTGTAAATTA ATTTCGTTCT-1860
1861 TGTTCAGACA GAACAATCAG ATGCTGGATA TTAGCATTCA TGTATAAAAG GAACTCAGGT-1920
1921 GGATAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA-1955
(2)SEQ INNO.2的信息
(a)序列特征
*长度：546氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述
1 MGLDLGAIAL KYTGLAVSDH GSIVAINIFI ALLCGCIVFG HLLEGNRWVN ESTTALVLGL 60
61 ITGGVILICS KGVNSRILIF SEDIFFIYLL PPIIFNAGFQ VKKKQFFRNF ATIILFGAAG 120
121 TLISFVIITF GAMGLFSKLG VGPLELGDYL AIGAIFSATD SVCTLRVLNQ DEAPLLYSLV 180
181 FGEGVVNDAT SVVLFNAIQN IDINHFDVFV LLQFIGKFLY LFFTSTVLGV AAGLLSAYII 240
241 KKLCSARHST DREVAIMILM AYLSYMLSML LDLSGILTVF FCGIVMSHYT WHNVTESSRV 300
301 TTKHTFATLS LIAEIFLFLY VGMDALDIDK WKLASSSPKK PIALSAVILG LVMVGRAAFV 360
361 FPLSFLSNLS KKESHPKISF NQQVIIWWAG LMRGAVSIAL AYNKFTTSGH TAVRVNAVMI 420
421 TSTIIVVLFS TMVFGLLTKP LINLLIPPRP GTAADISSQS FLDPLTASLL GSDFDVGQLT 480
481 PQTNLQYLLT MPTRSVHRVW RKFDDKFMRP MFGGRGFVPF VPGSPIERSV HGPGLLGTVT 540
541 EAEDRS 546
根据上述序列，设计构建表达载体的引物：
正向引物：5′-TATTCTAGACGAGGTGGCGACCGGCATGG-3′
反向引物：5′-GACGAGCTCCTTAACTACGGTCTTCTGC-3′
以根的总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增出含全长编码框的序列，先连接到pGEM-T载体上，进行测序鉴定。然后用XbaI和SacI切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌EHA105。
利用渗透法转化拟南芥，收获的种子在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在10mM，100mM和200mM氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能正常生长，具较高的耐盐能力。
根据上述技术，从偃麦草分离出编码Na+反向转运蛋白的基因ENHX1，该基因过量表达能导致转基因拟南芥具较高的耐盐性。偃麦草为单子叶禾本科植物，让该基因在与偃麦草亲源关系较近的小麦，水稻，玉米等植物中表达，将会提高这些植物的耐盐性，将使得这些植物可以在盐碱地上种植，具有非常重要的经济效益和社会效益。
(四)具体发明实施方式：
实施方式1：偃麦草Na+反向转运蛋白基因的克隆方法
1.总RNA的提取：采用一步法或RNA kit提取总RNA
2.cDNA第一条链的合成：取2微克总RNA，加入5×反应缓冲液4μl，10mM脱氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反转录酶(10u/μl)2μl，42℃反应60分钟，85℃分钟终止反应，稀释至200μl。
3.PCR反应：聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为：
首先将下列试剂混在一起：
10×反应缓冲液 5μl
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl
正向引物(5μM) 4μl
反向引物(5μM) 4μl
模板cDNA 4μl
TaqDNA聚合酶 0.5μl
总体积 50μl
PCR反应条件为：94℃ 3分钟，然后进入下列循环：94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
4.基因克隆：取2μl PCR与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T and pGEM-Teasy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
5.质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。
6.序列测定：本工作在大连宝生物工程公司进行。
7. 3′和5′序列的分离：按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行
8.同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。
实施方式2：偃麦草Na+反向转运蛋白基因ENHX1，如下序列：
(1)SEQ ID NO 1的信息
(a)序列特征
*长度：1955碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：偃麦草
(f)序列描述：SEQ IN NO.1
1 ATCCGCCGAG GTGGCGACCG GCATGGGGCT CGATTTGGGA GCCATCGCTC TCAAGTACAC-60
61 GGGGCTGGCG GTGTCGGACC ACGGCTCCAT CGTCGCCATC AACATCTTCA TCGCGCTGCT-120
121 CTGCGGCTGC ATTGTCTTCG GCCACCTGCT CGAGGGGAAC CGCTGGGTCA ATGAGTCCAC-180
181 CACCGCGCTT GTCCTGGGGC TCATCACCGG TGGTGTGATT CTGATCTGCT CCAAAGGGGT-240
241 GAATTCGCGC ATCCTTATCT TCAGCGAGGA TATTTTCTTC ATCTACTTGC TCCCGCCCAT-300
301 CATTTTTAAC GCCGGGTTTC AAGTAAAGAA AAAGCAATTC TTCCGCAACT TTGCGACAAT-360
361 TATTTTATTT GGTGCTGCTG GAACATTGAT ATCCTTTGTA ATAATCACGT TCGGTGCTAT-420
421 GGGATTGTTC AGCAAACTTG GTGTTGGTCC ACTCGAGCTT GGGGACTATC TTGCAATTGG-480
481 GGCTATCTTC TCAGCAACAG ATTCTGTTTG CACCTTACGG GTGCTTAACC AGGATGAAGC-540
541 ACCCCTACTC TATAGTCTAG TTTTTGGTGA AGGTGTTGTT AATGATGCTA CATCAGTTGT-600
601 GCTCTTCAAT GCAATTCAAA ACATTGATAT TAATCATTTT GATGTCTTTG TTCTACTACA-660
661 ATTCATTGGA AAATTCCTCT ACCTATTCTT CACCAGCACC GTTCTTGGAG TAGCTGCTGG-720
721 GTTGCTTAGT GCATACATTA TTAAGAAACT TTGTTCTGCA AGACACTCAA CTGACAGAGA-780
781 AGTTGCTATC ATGATACTCA TGGCATACCT TTCGTATATG CTGTCAATGT TGCTGGATCT-840
841 GAGTGGCATT CTAACTGTGT TCTTCTGTGG AATAGTAATG TCACATTACA CTTGGCATAA-900
901 TGTCACAGAA AGCTCAAGGG TTACTACCAA GCATACTTTT GCAACTTTAT CACTTATTGC-960
961 TGAGATTTTT CTTTTTCTCT ATGTCGGGAT GGATGCATTG GACATTGATA AATGGAAATT-1020
1021 AGCTAGTAGC AGTCCTAAGA AACCAATTGC TTTAAGCGCT GTTATATTGG GTTTGGTTAT-1080
1081 GGTTGGAAGA GCAGCATTCG TATTCCCTTT ATCTTTTCTA TCGAACTTAA GTAAAAAGGA-1140
1141 GTCACACCCA AAGATTTCCT TCAACCAACA GGTTATCATC TGGTGGGCAG GTCTCATGAG-1200
1201 AGGAGCAGTT TCAATTGCAC TTGCTTATAA CAAGTTTACA ACATCTGGTC ATACTGCCGT-1260
1261 GCGAGTTAAT GCTGTCATGA TCACGAGCAC AATCATTGTT GTTCTGTTCA GCACAATGGT-1320
1321 TTTCGGCTTG CTGACTAAGC CTCTGATTAA TCTCCTCATC CCACCAAGAC CTGGCACTGC-1380
1381 AGCTGATATC TCGAGCCAGT CATTCCTAGA CCCACTTACG GCGAGCTTGT TGGGATCGGA-1440
1441 CTTCGATGTA GGCCAGCTCA CCCCTCAAAC AAACCTTCAG TATCTTCTCA CCATGCCAAC-1500
1501 TCGCTCGGTT CATCGTGTAT GGCGCAAGTT CGATGATAAG TTCATGCGCC CAATGTTTGG-1560
1561 GGGAAGAGGC TTCGTCCCAT TTGTGCCTGG TTCACCCATA GAGAGGAGCG TCCATGGGCC-1620
1621 TGGCTTGTTG GGCACTGTGA CGGAGGCAGA AGACCGTAGT TAAGTTGAAG CCCAGAAGGT-1680
1681 GCAAGTGTAT TTCTGTAAAT GCTCAGATAT CACTCAGTTT TGCTCTTGGG ATTCTTTCGG-1740
1741 TGTATTATCG CTATTTGTTG GTGTATATTG TGCAGATAGT TTCTACAGGA CCATGTACGC-1800
1801 TGTGTAGAGT TTTGGGAGCC ATTCAAGATG TACAATTAAT CTGTAAATTA ATTTCGTTCT-1860
1861 TGTTCAGACA GAACAATCAG ATGCTGGATA TTAGCATTCA TGTATAAAAG GAACTCAGGT-1920
1921 GGATAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA-1955
(3)SEQ IN NO.2的信息
(a)序列特征
*长度：546氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述
1 MGLDLGAIAL KYTGLAVSDH GSIVAINIFI ALLCGCIVFG HLLEGNRWVN ESTTALVLGL 60
61 ITGGVILICS KGVNSRILIF SEDIFFIYLL PPIIFNAGFQ VKKKQFFRNF ATIILFGAAG 120
121 TLISFVIITF GAMGLFSKLG VGPLELGDYL AIGAIFSATD SVCTLRVLNQ DEAPLLYSLV 180
181 FGEGVVNDAT SVVLFNAIQN IDINHFDVFV LLQFIGKFLY LFFTSTVLGV AAGLLSAYII 240
241 KKLCSARHST DREVAIMILM AYLSYMLSML LDLSGILTVF FCGIVMSHYT WHNVTESSRV 300
301 TTKHTFATLS LIAEIFLFLY VGMDALDIDK WKLASSSPKK PIALSAVILG LVMVGRAAFV 360
361 FPLSFLSNLS KKESHPKISF NQQVIIWWAG LMRGAVSIAL AYNKFTTSGH TAVRVNAVMI 420
421 TSTIIVVLFS TMVFGLLTKP LINLLIPPRP GTAADISSQS FLDPLTASLL GSDFDVGQLT 480
481 PQTNLQYLLT MPTRSVHRVW RKFDDKFMRP MFGGRGFVPF VPGSPIERSV HGPGLLGTVT 540
541 EAEDRS 546
实施方式3：表达载体的构建
1.根据分离出的Na+反向转运蛋白基因的核苷酸序列，设计引物：
正向引物：5′-TATTCTAGACGAGGTGGCGACCGGCATGG-3′
反向引物：5′-GACGAGCTCCTTAACTACGGTCTTCTGC-3′
以根的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应.
2.取2μl PCR与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T and pGEM-T easyVector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
3.用XabI和SacI两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
4.将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。
实施方式4：基因耐盐性分析
1.种植拟南芥。
2.挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
3.离心，农杆菌沉淀用渗透培养基(5％蔗糖，0.1M MgCl2，0.5％ Silwet L-77)悬浮，菌液OD600在0.8左右。
4.将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。
5.收获的种子在筛选培养基(1×MS盐，1％蔗糖，pH5.7，0.8％琼脂，卡那霉素30毫克/升)筛选，得到抗性植株。
6.将T3代纯合株系种子种于10mM，100mM，200mM氯化钠培养基上培养，7天后统计萌发率。
序列表
<110>山东农业大学
<120>偃麦草钠离子反向转运蛋白基因及其克隆方法与应用
<160>1
<170>patent In 3.1
<210>1
<211>1955
<212>cDNA
<213>偃麦草(agropyron elongatum)
<221>1-1955
<400>1
atccgccgag gtggcgaccg gcatggggct cgatttggga gccatcgctc tcaagtacac 60
ggggctggcg gtgtcggacc acggctccat cgtcgccatc aacatcttca tcgcgctgct 120
ctgcggctgc attgtcttcg gccacctgct cgaggggaac cgctgggtca atgagtccac 180
caccgcgctt gtcctggggc tcatcaccgg tggtgtgatt ctgatctgct ccaaaggggt 240
gaattcgcgc atccttatct tcagcgagga tattttcttc atctacttgc tcccgcccat 300
catttttaac gccgggtttc aagtaaagaa aaagcaattc ttccgcaact ttgcgacaat 360
tattttattt ggtgctgctg gaacattgat atcctttgta ataatcacgt tcggtgctat 420
gggattgttc agcaaacttg gtgttggtcc actcgagctt ggggactatc ttgcaattgg 480
ggctatcttc tcagcaacag attctgtttg caccttacgg gtgcttaacc aggatgaagc 540
acccctactc tatagtctag tttttggtga aggtgttgtt aatgatgcta catcagttgt 600
gctcttcaat gcaattcaaa acattgatat taatcatttt gatgtctttg ttctactaca 660
attcattgga aaattcctct acctattctt caccagcacc gttcttggag tagctgctgg 720
gttgcttagt gcatacatta ttaagaaact ttgttctgca agacactcaa ctgacagaga 780
agttgctatc atgatactca tggcatacct ttcgtatatg ctgtcaatgt tgctggatct 840
gagtggcatt ctaactgtgt tcttctgtgg aatagtaatg tcacattaca cttggcataa 900
tgtcacagaa agctcaaggg ttactaccaa gcatactttt gcaactttat cacttattgc 960
tgagattttt ctttttctct atgtcgggat ggatgcattg gacattgata aatggaaatt 1020
agctagtagc agtcctaaga aaccaattgc tttaagcgct gttatattgg gtttggttat 1080
ggttggaaga gcagcattcg tattcccttt atcttttcta tcgaacttaa gtaaaaagga 1140
gtcacaccca aagatttcct tcaaccaaca ggttatcatc tggtgggcag gtctcatgag 1200
aggagcagtt tcaattgcac ttgcttataa caagtttaca acatctggtc atactgccgt 1260
gcgagttaat gctgtcatga tcacgagcac aatcattgtt gttctgttca gcacaatggt 1320
tttcggcttg ctgactaagc ctctgattaa tctcctcatc ccaccaagac ctggcactgc 1380
agctgatatc tcgagccagt cattcctaga cccacttacg gcgagcttgt tgggatcgga 1440
cttcgatgta ggccagctca cccctcaaac aaaccttcag tatcttctca ccatgccaac 1500
tcgctcggtt catcgtgtat ggcgcaagtt cgatgataag ttcatgcgcc caatgtttgg 1560
gggaagaggc tcgtcccatt ttgtgcctgg ttcacccata gagaggagcg tccatgggcc 1620
tggcttgttg ggcactgtga cggaggcaga agaccgtagt taagttgaag cccagaaggt 1680
gcaagtgtat ttctgtaaat gctcagatat cactcagttt tgctcttggg attctttcgg 1740
tgtattatcg ctatttgttg gtgtatattg tgcagatagt ttctacagga ccatgtacgc 1800
tgtgtagagt tttgggagcc attcaagatg tacaattaat ctgtaaatta atttcgttct 1860
tgttcagaca gaacaatcag atgctggata ttagcattca tgtataaaag gaactcaggt 1920
ggataactaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1933
Claims (2)
1.一种克隆的偃麦草钠离子反向转运蛋白基因ENHX1，其特征在于它具有下述所示的序列：
1 ATCCGCCGAG GTGGCGACCG GCATGGGGCT CGATTTGGGA GCCATCGCTC TCAAGTACAC-60
61 GGGGCTGGCG GTGTCGGACC ACGGCTCCAT CGTCGCCATC AACATCTTCA TCGCGCTGCT-120
121 CTGCGGCTGC ATTGTCTTCG GCCACCTGCT CGAGGGGAAC CGCTGGGTCA ATGAGTCCAC-180
181 CACCGCGCTT GTCCTGGGGC TCATCACCGG TGGTGTGATT CTGATCTGCT CCAAAGGGGT-240
241 GAATTCGCGC ATCCTTATCT TCAGCGAGGA TATTTTCTTC ATCTACTTGC TCCCGCCCAT-300
301 CATTTTTAAC GCCGGGTTTC AAGTAAAGAA AAAGCAATTC TTCCGCAACT TTGCGACAAT-360
361 TATTTTATTT GGTGCTGCTG GAACATTGAT ATCCTTTGTA ATAATCACGT TCGGTGCTAT-420
421 GGGATTGTTC AGCAAACTTG GTGTTGGTCC ACTCGAGCTT GGGGACTATC TTGCAATTGG-480
481 GGCTATCTTC TCAGCAACAG ATTCTGTTTG CACCTTACGG GTGCTTAACC AGGATGAAGC-540
541 ACCCCTACTC TATAGTCTAG TTTTTGGTGA AGGTGTTGTT AATGATGCTA CATCAGTTGT-600
601 GCTCTTCAAT GCAATTCAAA ACATTGATAT TAATCATTTT GATGTCTTTG TTCTACTACA-660
661 ATTCATTGGA AAATTCCTCT ACCTATTCTT CACCAGCACC GTTCTTGGAG TAGCTGCTGG-720
721 GTTGCTTAGT GCATACATTA TTAAGAAACT TTGTTCTGCA AGACACTCAA CTGACAGAGA-780
781 AGTTGCTATC ATGATACTCA TGGCATACCT TTCGTATATG CTGTCAATGT TGCTGGATCT-840
841 GAGTGGCATT CTAACTGTGT TCTTCTGTGG AATAGTAATG TCACATTACA CTTGGCATAA-900
901 TGTCACAGAA AGCTCAAGGG TTACTACCAA GCATACTTTT GCAACTTTAT CACTTATTGC-960
961 TGAGATTTTT CTTTTTCTCT ATGTCGGGAT GGATGCATTG GACATTGATA AATGGAAATT-1020
1021 AGCTAGTAGC AGTCCTAAGA AACCAATTGC TTTAAGCGCT GTTATATTGG GTTTGGTTAT-1080
1081 GGTTGGAAGA GCAGCATTCG TATTCCCTTT ATCTTTTCTA TCGAACTTAA GTAAAAAGGA-1140
1141 GTCACACCCA AAGATTTCCT TCAACCAACA GGTTATCATC TGGTGGGCAG GTCTCATGAG-1200
1201 AGGAGCAGTT TCAATTGCAC TTGCTTATAA CAAGTTTACA ACATCTGGTC ATACTGCCGT-1260
1261 GCGAGTTAAT GCTGTCATGA TCACGAGCAC AATCATTGTT GTTCTGTTCA GCACAATGGT-1320
1321 TTTCGGCTTG CTGACTAAGC CTCTGATTAA TCTCCTCATC CCACCAAGAC CTGGCACTGC-1380
1381 AGCTGATATC TCGAGCCAGT CATTCCTAGA CCCACTTACG GCGAGCTTGT TGGGATCGGA-1440
1441 CTTCGATGTA GGCCAGCTCA CCCCTCAAAC AAACCTTCAG TATCTTCTCA CCATGCCAAC-1500
1501 TCGCTCGGTT CATCGTGTAT GGCGCAAGTT CGATGATAAG TTCATGCGCC CAATGTTTGG-1560
1561 GGGAAGAGGC TTCGTCCCAT TTGTGCCTGG TTCACCCATA GAGAGGAGCG TCCATGGGCC-1620
1621 TGGCTTGTTG GGCACTGTGA CGGAGGCAGA AGACCGTAGT TAAGTTGAAG CCCAGAAGGT-1680
1681 GCAAGTGTAT TTCTGTAAAT GCTCAGATAT CACTCAGTTT TGCTCTTGGG ATTCTTTCGG-1740
1741 TGTATTATCG CTATTTGTTG GTGTATATTG TGCAGATAGT TTCTACAGGA CCATGTACGC-1800
1801 TGTGTAGAGT TTTGGGAGCC ATTCAAGATG TACAATTAAT CTGTAAATTA ATTTCGTTCT-1860
1861 TGTTCAGACA GAACAATCAG ATGCTGGATA TTAGCATTCA TGTATAAAAG GAACTCAGGT-1920
1921 GGATAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA-1955。
2.根据权利要求1所述的一种克隆的偃麦草钠离子反向转运蛋白基因的用途，其特征在于该基因在拟南芥中过量表达，表现出显著的耐盐能力。
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