CN1154737C - 衰老特性被改变的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种遗传构建物，包含与一段编码蛋白质的DNA序列可操作地连接的SAG12启动子序列，该序列并非天然地与该启动子序列连接。较好的是，该SAG12启动子序列是序列2(SEQ ID NO.2)的开头602bp，而蛋白质编码序列编码的是异戊烯基转移酶。

Description

衰老特性被改变的转基因植物
发明领域
本发明主要涉及植物分子生物学领域。具体地说，本发明涉及被发育特异性启动子激活的插入基因的转基因植物。
技术背景
叶衰老是细胞发生特殊代谢和结构改变直至死亡的一个发育阶段(Nooden， 植物的 衰老和老化(Senescence and Aging in Plants)，(L.D.Nooden和A.C.Leopold，编)，pp.391-439，Academic Press，San Diego，CA，1988)。这是植物生活周期中的一个重要阶段，被认为通过将营养物质重新循环到生长活跃的区域而有益于植物的健康。叶衰老可能由许多外因诱导，例如避光、缺乏无机盐、干旱和病原体侵染(Thomas等， 植物生理 学年鉴(Ann.Rev.Plant Physical.)31：83-111，1980)，也可能是由种子的发育之类的发育过程(Nooden，1988， 同上)诱导的。没有上述因素时，在许多种植物中，叶衰老以年龄依赖型方式发生(Batt等， 实验植物学杂志(J.Exp.Bot.)26：569-579，1975；Hensel等， 植物细 胞(Plant Cell)5：553-564，1993；Jiang等， 植物生理学(Plant Physicol.)101：105-112.1993)。
生理学及遗传学研究显示，衰老是一个很有规律的过程(Nooden，1988. 同上；Thomas.1980. 同上)。叶衰老进程通过因叶绿素损失而导致枯黄表现出来，这是叶绿体分解的结果(Thomson等， 植物的衰老：其生物化学及生理学(Plant Senescence：Its Biochemistry and Physiology)pp.20-30，1987；Woolhouse， 加拿大植物学杂志(Can.J. Bot.)62：2934-2942，1984)。叶衰老涉及蛋白质、核酸及膜的降解，以及营养物质因这些降解而运输到植物的其它器官例如发育中的种子，叶或贮藏器官(Nooden 1988. 同上；Woolhouse.1984， 同上)。
分子研究显示，基因表达的改变与衰老程序有关。在衰老过程中，编码与光合作用相关的蛋白质的mRNA水平下降(Bate等， 实验植物学杂志(J.Exp.Bot.)42：801-811，1991；Hensel等， 植物细胞(Plant Cell)5：553-564，1993：Jiang等， 植物生理学(Plant Physicol.)101：105-112.1993)，而编码与衰老程序相关的蛋白质的基因的mRNA水平上升(Graham等，植物细胞(Plant Cell)4：349-357.1992.Hensel等， 植物细胞(Plant Cell)5：553-564.1993；Kamachi等， 植物生理学(Plant Physicol.)93：1323-1329.1992：Taylor等. 美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5118-5122.1993)。几种在营养物质的降解和代谢中起作用的酶的活性也被证实在衰老过程中有所上升(Blank等， 植物生理学 (Plant Physicol.)97：1409-1413，1991：Debellis等， 植物细胞生理学(Plant Cell Physicol.)32：1227-1235，1991：Friedrich等， 植物生理学(Plant Physicol.)65：1103-1107，1980：Pistelli等， 植物生理学杂志(J.Plant Physicol.)19：723-729，1992)。
虽然已经知道了衰老过程中的一般变化，但是有关营养物质的再转移如何发生的许多生化细节仍然不确定。而且，对于伴随衰老的基因表达的改变是如何调控的知之甚少。
在植物分子生物学领域需要有一种在植物发育的衰老阶段启动基因表达的启动子。
作为达到该目标的第一步，我们研究了拟南芥叶衰老阶段发生的大分子改变。拟南芥中叶衰老的开始由叶龄确定(Hensel等， 同上)。拟南芥中叶衰老的这种可预测性方便了在完整植株中对与自然发生的叶衰老有关的RNA、叶绿素、蛋白质和基因表达的改变所进行的整体研究。我们还使用该体系分离和鉴定了丰度增加和减少的mRNA在叶衰老过程中时序表达方式。这些衰老特异性mRNA使得我们能够如后文所述分离和鉴定新的衰老特异性启动子。
发明综述
本发明涉及一种遗传构建物，包含与一段编码蛋白质的DNA序列可操作地连接的SAG12启动子序列，该序列并非天然地与该启动子序列连接。较好的是，该SAG12启动子是SAG12-1序列。最好是，SAG12启动子是SEQ ID NO：2的开头602bp，所述蛋白质编码DNA序列并不天然与所述启动子序列相关联。该蛋白质编码序列可以编码，例如，异戊烯基转移酶。
本发明还涉及一种遗传构建物，它包含本发明所述的SAG12启动子，该启动子与编码催化细胞分裂素合成的酶的DNA序列可操作地连接。
本发明还涉及包含本发明所述的遗传构建物。
本发明还涉及一种制造转基因植物的方法，包括用本发明所述的构建物转化植物细胞。
本发明还涉及包含这种遗传构建物的细胞或植物。
本发明的目的之一是提供一种遗传构建物，它包含与蛋白质编码序列可操作地连接并启动衰老特异性基因表达的启动子序列。
本发明的目的之二是提供与一种酶的编码序列连接的衰老特异性启动子，该酶催化一种植物激素最好是细胞分裂素的合成。
本发明的目的之三是提供与异戊烯基转移酶序列连接的衰老特异性启动子。
本发明的目的之四是提供包含只在衰老组织中表达的转基因的转基因植物。
本发明的特征在于，基因表达可以特异性地定位于衰老组织，由此避免可能造成损伤的组成型表达。
阅读以下说明、附图和权利要求后，本发明的其它目的、优点和特征将是显而易见的。
附图说明
图1是一个二元载体中的SAG12-1启动子/GUS/MAS-ter构建物图.
图2是一个二元载体中的SAG12-1启动子/IPT/NOS-ter构建物图。
图3是SAG12-1启动子/IPT/NOS-ter构建物的核酸序列。“a”和“b”标记对应于图1和图2中的“a”和“b”。
本发明的说明
本发明内容之一是一种遗传构建物，它包含与一段外源性基因序列可操作地连接的衰老特异性启动子，该外源性基因序列非天然地与该启动子相关。本发明鉴定了一个有用的衰老特异性启动子，在本文中定义为SAG12。衰老特异性启动子的获得使得衰老形态学被改变例如延缓衰老的转基因植物的生成成为可能。这一发现提供了延长有用植物生长的机制。
后文对从拟南芥中分离特定的SAG12启动子SAG12-1进行了详细描述。简而言之，分离出与SAG12 cDNA对应的基因组克隆在一起的此处称为“SAG12”的衰老特异性cDNA。从该基因组材料中分离出SAG12-1启动子。“SAG”表示衰老相关基因。
SEQ ID NO：1和图3包含SAG12-1启动子的一种实施方式的序列。SEQ ID NO：2描述了该启动子的截短形式。两种形式的SAG12-1启动子都足以按衰老特异性方式启动基因表达。
后文还描述了一种以相似方法分离自拟南芥的第二种衰老特异性启动子。第二种启动子在此表示为“SAG13”。SAG13启动子也是从拟南芥基因组中分离的。SEQ IDNO：3包含SAG13启动子核苷酸序列，其中包括转录起始位点上游的1782碱基对。
利用“衰老特异性启动子”来表示SAG12-1启动子和SAG13启动子能够在植物组织中以发育调控方式优先启动基因表达，从而基本上只在植物组织衰老时表达3’蛋白质编码区。
较好的是，SAG12启动子包含与SEQ ID NO：2的开头602bp具有足够同源性的核苷酸，从而使该启动子能够较好地在衰老组织中表达基因。
较好的是，SAG13启动子包含后文SEQ ID NO：3中的某一部分。虽然该完整序列对衰老特异性启动子活性来说已足够，但较短的序列可能也已足够。截短SEQ IDNO：3，然后凭经验测试这些截短的衰老特异性启动子活性，由此可以方便地确定这种较短序列的边界。
后文中的实施例描述了来自拟南芥的衰老特异性cDNA克隆的产生、这些克隆的鉴定，以及使用这些cDNA克隆来获得特定的SAG12衰老特异性启动子SAG12-1和另一启动子SAG13。据信，适用于本发明的还有与SAG12-1或SAG13充分同源的其它衰老特异性启动子。利用以下所述的技术可以方便地得到这些同源启动子。
                          SAG12启动子的创建
在后文实施例中描述了使用SAG12 cDNA克隆来分离SAG12启动子。该cDNA克隆是由似乎仅在衰老过程中表达的RNA获得的。
已经使用SAG12 cDNA筛选拟南芥文库来获得SAG12基因。该基因原先被表示为SAG12-1，因为认为在拟南芥中有两个SAG12基因，但是现在认为只有一个。SAG12-1启动子是从SAG12-1基因组克隆获得的。SEQ ID NO：1和图3揭示了SAG12-1启动子的2073bp序列。此外，后文的研究还表明可以将SAG12-1启动子截短至602bp而仍然具有功能。SEQ ID NO：2描述与SAG12-1基因5’非翻译区连接的602bp。
有多条路径可以获得SAG12启动子。最简便的是根据SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2以及图3显示的序列合成一寡核苷酸探针，然后在拟南芥基因组文库中探测SAG12启动子的拷贝。
估计，少量的核苷酸增加、缺失和突变不影响SAG12启动子的功能。此外，由于正常的等位变异，在拟南芥种群中可能存在SAG12基因(或SAG13)及启动子序列中的变异。此外，很可能而且据估计，可以从其它植物中回收得到同源的序列。所以，合适的SAG启动子序列可能并不与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2完全一致。后文详细说明了一种测定方法，通过它可以确定一个候选基因组序列是否与衰老特异性SAG12-1启动子充分同源以适用于本发明。
此外，据估计，602bp的SEQ ID NO：1可以进一步截短而仍然产生合适的SAG12启动子。本领域的一般技术人员很容易理解，可以从该602bp序列进行5’或3’的截短，或内部缺失，并对这些截短片段的衰老特异性活性进行经验测试，以找出SAG12-1启动子较小的截短形式。
较好的是，将SAG12-1的5’非翻译区部分与启动子序列相加。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2显示了该序列。在图3中，5’非翻译区是标记+1和“Nco I”之间的区域。
                          SAG13启动子创建
用相同的方法分离和鉴定后文实施例中的SAG13启动子.同时考虑由等位变异等造成的SAG13序列中的变异。SAG12与SAG13并不明显同源。
                          候选启动子的测定
一旦分离出一个候选基因组序列，就可能希望确定该DNA序列是否是SAG12启动子或SAG13启动子。可以利用植物分子生物学中的常用方法来测序该DAN序列，以确定该序列是否与SEQ ID NO：1，2或3一致。如果候选序列与SEQ ID NO：1的开头2073bp、SEQ ID NO：2的开头602bp，或SEQ ID NO：3的开头1782bp一致或同源，那么该序列就是合适的SAG12启动子或SAG13启动子。
如果序列不一致但高度同源，即同源性超过95％，可能分离到的是等位SAG12或SAG13启动子。可能希望进行一次功能测试来确定该序列是否与SEQ ID NO：1的开头2073bp，SEQ ID NO：2的开头602bp，或SEQ ID NO：3的开头1782bp充分同源而适用于本发明。
“充分同源”指候选序列的核苷酸序列同源性至少为95％，而且其在衰老植物组织中优先启动基因表达的能力与SAG12-1启动子序列基本相当。以下说明的是确定候选序列是否适用的测定法。
-为了进行这种确定，可以根据以下所述的实施例将候选启动子与报道蛋白的编码序列例如编码β-葡糖醛酸酶的GUS序列连接。美国专利5,268,463公开了GUS基因的序列。用包括GUS基因在内的表达盒转化植物可以确定GUS报道序列是否只在衰老组织中表达，是否被组成型表达，或根本没有表达.只有显示报道序列仅在衰老组织而不在其它组织中表达的结果才表明是合适的启动子。
或者，如后文所述，可以将候选序列与异戊烯基转移酶序列连接后转化到烟草植株中。实施例的表2显示了用连接IPT基因的SAG12启动子转化的植株和包含SAG12启动子与GUS报道基因连接而成的构建物的转基因对照植株之间的具体差异。候选启动子必需表现出相当的功能才适用于本发明。
所以，候选启动子必需满足三条标准。第一，它必须可以用根据SEQ ID NO：1的开头2073bp，SEQ ID NO：2的开头602bp或SEQ ID NO：3的对应部分合成的寡核苷酸探针分离或杂交。第二，它必须与SEQ ID NO：1的开头2073bp、SEQ ID NO：2的开头602bp或SEQ ID NO：3的对应部分充分同源以启动报道基因例如GUS的衰老特异性表达。第三，它必须提供与实施例表2中所述的SAG12或SAG13启动子相当的衰老特异性表达。
                       创建遗传构建物
一旦获得了SAG12或SAG13启动子，创建的遗传构建物必须同时包含该启动子和一段蛋白质编码序列。“遗传构建物”用于描述一段可操作地连接的启动子和基因序列。通常，启动子序列是基因序列的5’端或“上游”。启动子应该能够启动以基因序列为模板的转录活性。
合适的外源性基因序列能够表达一种RNA分子。该RNA分子可以被翻译或不被翻译成成熟蛋白质。为了表达反义mRNA，“外源性基因序列”的可以是反义取向的。较好的是，外源性基因序列编码一种蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，外源性基因编码催化某种植物激素生物合成的酶，这种生物激素以细胞分裂素为佳。最好的是，酶是IPT(异戊烯基转移酶)。
可以利用标准分子生物学方法将克隆得到的启动子与蛋白质的编码序例如IPT序列连接。已经分离、测序并公开了多个编码IPT的基因。携有这些基因的菌株已经在ATCC保藏，并可以向其获取，同时包括已公开的序列信息，可以使用PCR及其它基因扩增和回收技术来分离IPT基因。IPT序列的实例(同时被称为tmr或tzs)存在于：Crespi等， 欧洲分子生物学协会杂志( EMBO J.)11：795-804(1992)；Goldberg等， 核酸研 究(Nucleic Acid.Res.)12：4665-4677(1984)；Heide Kamp等， 核酸研究(Nucleic Acid. Res.1：6211-6223(1983)；Strabala等， 分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)216：388-394(1989)。
可以利用质粒或病毒载体或分子生物学领域已知用于创建能够转化到植物细胞内的构建物的方法来创建遗传构建物。本文描述的是适合利用农杆菌属(Agrobacterium)系统转化的遗传构建物的创建。但是，还有转化植物和创建转基因植物的其它方法，例如粒子轰击和电穿孔，这些需要许多不同的载体系统。构建和将这些载体用到转化系统中的能力是本领域技术人员众所周知的。
                           植物衰老的改变
得到了有效的植物衰老特异性启动子就能够创建衰老特性被改变的转基因植物。可以将只在植物细胞进入衰老时才变得有效的遗传构建物插入植物。这种衰老特异性表达作用允许这样一类基因在植物中表达，即此类基因在植物发育的任何其它阶段的表达都会导致植物形态学或繁殖能力的衰退。例如，现在可以将编码细胞分裂素生物合成酶的基因插入在衰老特异性启动子的调控之下，使得植物组织不会在衰老前的生长阶段受到过量细胞分裂素的影响。然后，在衰老开始时，衰老特异性基因激活细胞分裂素的产生，从而改变植物中衰老的进程。具体地说，已经发现，衰老特异性启动子与细胞分裂素产生基因序列的组合创建了一种转基因植物，该植物从根本上延缓了衰老。与对应的非转基因植物相比，这类植物的营养性生长将更长，产生更多的花、种子或果实。估计，可以将影响植物成熟和衰老的其它区域置于衰老特异性启动子之后，并转化到植物中以产生改变了衰老特性的有用的转基因植物。
                       实施例
                      材料和方法
植物材料
拟南芥生态型Landsberg erecta种子在2.5％的氯化钠溶液中灭菌5分钟，然后用无菌水洗涤5次。灭菌后的种子于4℃在1mM的赤霉酸A3中浸泡5小时，然后播种在Somerville等在 叶绿体分子生物学中的方法(Methods in Chloroplast Moleculat Biolgy)，Elsevier Biomedical Press，New York，NY，pp.129-137，1982中所述的以拟南芥营养液饱和的泥炭藓、蛭石和珍珠岩(1∶1∶1)混合物上。植株的生长条件为，23℃，相对湿度60％，120μmol m-2 s-1的连续光，连续光来自冷白色荧光(80％)和白织灯泡(20％)的混合光，下灌溉以水。在这些条件下，植物营养性生长约3周，形成6-7片莲座叶，然后抽苔。在不同的时刻，收获完全舒展的第5和第6莲座叶。收获后立即将全部组织冷冻在液氮中并在-80℃保存。
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叶绿素和蛋白质的定量
将45cm2的新鲜叶在65℃于乙醇中浸泡2小时，利用分光光度法测定叶绿素的量(Wintermans等， 生物化学和生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta.)109：448-453(1965))。乙醇孵育并大致真空干燥后，将这些叶用于总蛋白提取。45cm2叶原料的边角料在液氮中粉碎，重悬在9ml pH8的10mM柠檬酸钠、1mM EDTA、1％SDS溶液中，在70℃搅拌孵育30分钟。离心分离可溶性成份和不溶性成份。将沉淀组分溶解在10ml 1N NaOH中，在30℃放置通宵。然后，根据Lowry等在 生物化学杂志(J.Biol. Chem.)193：265-275(1951)中所示的方法，和修改后的Pterson在 生物化学纪事(Aanl. Biochem.)83：346-356(1977)中和Larson等在 生物化学纪事(Aanl.Biochem.)155：243-248(1986)中所示的方法定量可溶性组分和沉淀组份中的蛋白质水平。对来自三批相互独立的拟南芥的三份复制样品进行了分析。
RNA分析
如Puissant等在 生物技术(Bio Techniques)8：148-149(1990)中所示抽提总RNA，并利用分光光度法定量(Sambrook等， 分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual).Cold Spring Harbor Press，NY，1989)。为了进行RNA凝胶印迹分析，在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳分离RNA样品，转移到聚砜薄膜(Gelman，Ann Arbor，MI)上，与随机引物法(John等， 细菌杂志(J.Bacteriol.)170：790-795，1988)制备的32P标记的探针杂交。将RAN按质量基础(每根泳道5μg RNA)和面积基础(每根泳道半片叶当量的RNA)上样。利用Betagen β颗粒扫描仪(IntelliGenetics，Inc.，Mountain View，CA)定量与RNA杂交的探针的量。分析了用相互独立的三批组织制备的RNA凝胶印迹的cDNA克隆。
cDNA文库的构建和筛选
如Crowell等在 美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)87：8815-8819(1990)中所述分离用于构建cDNA文库的Poly(A)+RNA。从S2叶和S3与S4叶的集合中分离的RNA用于构建两个cDNA文库。以寡聚(dT)17-Xba I为引物，利用SuperScriptTM RNaseH-逆转录酶合成cDNA第一链，根据制造商的建议(BRL，Gaithersberg，MD)，利用大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌连接酶和RNAse H合成第cDNA二链。双链cDNA在BioGel A 0.5m色谱柱(BioRad，Richmond，CA)上按大小分离以去除短于200bp的cDNA。EcoR I接头衔接子(Promega；Madison，WI)连接cDNA，然后用聚核苷酸激酶磷酸化cDNA的5’末端。利用琼脂糖凝胶电泳将cDNA按大小分离，电洗脱大于500bp的cDNA，将他们连接到用EcoR I切割并去磷酸化的pBluescript SKII(+)(Stratagene，LaJolla，CA)中。利用电穿孔法将连接产物引入大肠杆菌DH5α。S2和S3/4 cDNA文库都包含1×105个重组克隆。为了筛选文库，根据记载(Sambrook等1989，同上)制备文库的复制滤膜，并与用脱氧腺苷5-[α-32p]三磷酸进行的Poly(A)+RNA逆转录制备的cDNA探针杂交。为了进行交叉杂交分析，利用随机引物法制备对应于cDNA插入片段的探针，并与候选质粒的斑点印迹杂交(Sambrook等1989，同上)。
经历特定的表型和生物化学改变的拟南芥的叶衰老
我们根据表型外观将拟南芥的莲座叶分为S1至S5五个阶段，测定每个阶段的RNA、蛋白质和叶绿素的量。S1阶段的叶表现出最早的可见的衰老表征-叶端的叶绿素流失。随着叶的继续衰老，叶绿素继续流失。在S2、S3、S4和S5阶段的叶中，约25％、25-50％、50-75％和75％以上的叶面变黄。我们的目测评价对应于特定的叶绿素流失程度。在我们的培养条件下，在叶完全舒展后的3、5、7、9和10天，叶子分别到达S1、S2、S3、S4和S5阶段。
在衰老过程中，叶中RNA、蛋白质和叶绿素的量逐渐减少。RNA和蛋白质的减少开始于最早被察觉的叶绿素流失(S1阶段)之前，随着叶的衰老而继续。在叶绿素流失量和RNA及蛋白质的减少之间有一个高度可再现性关联。
衰老相关基因的分离
为了确定在衰老过程中拟南芥叶中丰度升高的mRNA，我们示差筛选了一个由衰老中的叶的mRNA构建的cDNA文库。具体地说，用分离自S2叶以及S3和S4叶混合物的模板RNA构建了两个cDNA文库。分别用分离自非衰老(NS)叶和S2或S3/S4叶的Poly(A)+RNA逆转录生成的cDNA探针示差筛选S2和S3/S4的cDNA文库。
示差筛选S3/S4的cDNA文库鉴定出在衰老过程中丰度升高的mRNA。从该文库中挑选出23个与S3/S4的cDNA探针的杂交强于与NS cDNA探针的cDNA克隆用于进一步的鉴定。我们称之为衰老相关性基因(SAGs).交叉杂交显示，该集合包括6种cDNA。随后对每一家族中最长的cDNA进行分析。表1列出了对应于SAG cDNA的mRNA的长度。
      表1.SAG核苷酸中的mRNA的大致长度
    SAG     大小     SAG     大小
    12     1360     15     4560
    13     1340     16     1150
-   14     1140     17     800
用NS和S2 cDNA探针示差筛选S2 cDNA文库显示，大多数差异表达的克隆与NS cDNA探针的杂交强于与S2 cDNA探针的杂交。这些cDNA克隆对应于在衰老过程中丰度降低的mRNA。在衰老过程中，叶的光合作用产量以及编码光合作用所需蛋白质的转录产物的水平下降(Hensel等，1993，同上)。所以，编码光合作用相关性蛋白的转录产物的对应cDNA可能存在于丰度随衰老下降的克隆组中。随机挑选了6种与NS杂交强于与S2 cDNA探针杂交的cDNA用于进一步研究，以提供SAG cDNA的对照。我们称之为衰老负调节基因(SDG)1至6。我们想要强调的是，SDG1至6对应于文库中很少量的丰度随衰老急剧下降的组分。
自然的叶衰老过程中的基因表达
在叶衰老过程中测定不同时刻对应于分离的cDNA克隆的稳态mRNA水平。按质量基础上的差异表达为基础分离出该cDNA集合。具体地说，用等质量(dpm)32p标记的cDNA筛选文库的复制滤膜，cDNA通过分离自NS或衰老叶的Poly(A)+RNA经逆转录来制备。由于在衰老过程中叶中的总RNA量下降，Poly(A)+RNA也可能相应地减少。如果Poly(A)+RNA水平随衰老过程下降，cDNA示差筛选可能选出的SAG克隆其对应信息如果按照单个细胞测定表达，则在衰老过程中保持恒定，而在将表达与RAN质量相关时，这些信息的丰度增加。例如，如果大多数mRNA减少，以单个细胞为基础保持恒定水平的SAG信息在质量基础的丰度上会表现为增加。
为了确定SAG mRNA水平在衰老过程中是否增加，我们在每个阶段检测了同时与质量和叶面积相关的这些信息的表达。同时按质量基础和面积基础检测时，对应于SAG基因的稳态mRNA水平上升。基于叶面积的上升表明SAG mRNA/细胞在衰老过程中上升。在质量基础上检测时，所有SAG mRNA水平在衰老的后期(S3-S5)最高。但是，在叶面积基础上检测时，某些SAG mRNA(例如13和15)再现性地在衰老前期表现出最高水平。SAG12表现出最高诱导水平之一，并且在检测手段的限制内，似乎只在衰老过程中表达。即使进行长时间的自显影或用β粒子收集器测定，在非衰老叶RNA的泳道中也没有可检知的SAG12信号。SAG12 mRNA水平在衰老的全过程中都增加，在衰老后期达到最大值。
在同时与RAN质量和叶面积相关联进行检测时，对应于6种负调节基因的稳态RNA水平随衰老下降。和预计的一样，这种下降在检测随面积的表达时比检测随质量的表达时大得多。如前所述，叶中大多数mRNA遵循这种方式，其中包括光合作用中涉及的例如叶绿素a/b结合蛋白(CAB)和二磷酸核酮糖羧基酶/加氧酶小亚基(Rubisco)(Hensel，等，1993，同上)的核编码基因的对应mRNA。我们还检测了我们所定义的衰老阶段的CAB mRNA水平。我们发现，在叶的衰老过程中，CAB mRAN以与SDG相近的速度下降。但是，交叉杂交分析显示6种SDG克隆都不是CAB或Rubisco基因家族的成员。
衰老特异性启动子的分离
我们用SAG12 cDNA筛选拟南芥基因组文库中含有SAG12的SAG12启动子区的克隆。该文库由明尼苏达大学的David Marks提供。
我们发现，在拟南芥基因组中有一个SAG12拷贝。图1是一个包含与GUS报道基因连接的2073bp的SAG12-1启动子和5’非翻译区的构建物图。图2是与SAG12-1的5’非翻译序列、异戊烯基转移酶基因和NOS终止序列连接的SAG12-1启动子的核苷酸序列图。
将SAG12-1启动子片段(开始于-2073bp的EcoR V位点，并通过一个由寡聚诱变在SAG12-1起始密码子位置人工生成的Nco I位点)克隆在pGEM5Zf(+)(Promega，Madison.WI)的EcoR V-Nco I位置。该构建物被命名为pSG499。将包含1.87kb的GUS和0.8kb的MAS终止子的一段2.6kb的Sal I-Sal I片段克隆在pUC18的Sal I位点。 植 物分子生物学(Plant Mol.Biol.)15：373-381(1990)中记述了MAS终止子。该构建物被命名为pSG486-2。将pSG499中Nco I到Pst I的2.2kb的SAG12-1启动子克隆到pSG486-2中的Nco I-Pst I位置。该构建物被命名为pSG506。然后将含有SAG12-1启动子：GUS：MAS终止子的Pst I-Xba I片段克隆到一个二元载体的Pst I-Xba I位置，形成图1所示的构建物。
将含有0.7kb IPT和0.3kb NOS终止子序列(Yi Li等， 生物学进展(Dev. Biol.)153：386-395(1992))的一段1kb的Nco I-Xba I片段克隆到pSG506的Nco I-Xba I位置，取代GUS：MAS终止子片段。这一新的构建物被命名为pSG516。然后将pSG516中含有SAG12-1启动子：IPT：NOS终止子片段的Spe I-Spe I片段克隆到一个二元载体的Xba I位置(Spe I和Xba I都具有相容的粘性限制性末端)，形成图2所示的构建物。
我们测绘了SAG12-1的转录起始位点(在图3中以+1示出)，并且融合了一段2180bp的片段，该片段包括位于该起始位点上游的2073bp和107bp的以下两个基因的SAG12-15’非翻译区(UTR)：报道基因葡糖醛酸酶(GUS)和异戊烯基转移酶(IPT)，后者是催化细胞分裂素生物合成中限速步骤的酶。启动子片段开始于图1，2和3中点“a”。SEQID NO：1是SAG12-1启动子的序列，IPT基因的序列和NOS-终止子的序列。
利用农杆菌介导的转化(Horsch等， 科学(Science)227：1229-1231，1985；Valvekens等， 美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：5536-5540，1988)将上述基因转导到拟南芥和烟草中。。固定形成的植株，并用比色法测定GUS基因的表达。转基因表达测定表明，与报道基因融合的SAG12-1基因组序列包含一个衰老特异性启动子。在拟南芥和烟草中，GUS报道基因都在衰老叶中表达，但不会在衰老前的叶中检测到。
在转基因烟草中，我们进行了更广泛的测定，并发现SAG12-1启动子在衰老过程中在花部分也很活跃。该结果并不出奇，因为花器官在发育和进化上与叶相关(即，花器官被认为是改性的叶)。
我们发现，与GUS基因融合的一段709bp片段(转录起始位点上游602bp；图1的“b”点)在转基因植物中的GUS表达方式与使用2180bp片段的相同。所以，这一较小的区域包含了衰老特异性调节所必需的全部调控信号。SEQ ID NO：2是SAG12-1基因转录起始位点上游的这602bp和107bp的5’非翻译区。
使用衰老特异性启动子延缓衰老
在包括单子叶植物和双子叶植物的许多植物中，细胞分裂素被认为能够在离体的和植株上正在自然衰老的叶中抑制叶衰老(参见Nooden， 植物的衰老和老化(Senscence and Ageing in Plant)pp.391-439，1988和Van Staden等， 植物的衰老和老化(Senscence and Ageing in Plant)pp.281-328，1988)。而且，细胞分裂素防止叶衰老还能够保持叶的光合作用活性。多项研究证明用细胞分裂素处理在防止叶绿体降解的同时刺激光合作用以及叶绿体和胞质蛋白的合成(Van Staden等，同上)。
虽然大多数关于细胞分裂素对衰老的作用的研究涉及使用外源性细胞分裂素，但是有证据表明，内源性细胞分裂素是天然的叶衰老调节剂。Nooden等(Nooden等， 植 物生理学(Plant Physiol.)93：33-39，1990)最近研究了在完整植株上正在自然衰老的黄豆叶中的细胞分裂素流量。在引起黄豆衰老的种子发育后期阶段，由根流向叶的细胞分裂素急剧减少。而且，去除豆荚逆转了衰老过程，恢复了细胞分裂素向叶的流动。转基因植物研究为此提供了进一步的支持。来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA的异戊烯基转移酶基因(IPT)催化细胞分裂素生物合成中的限速步骤。过量表达IPT基因的转基因植物通常表现出一定程度的叶衰老延缓(Li等， 生物学进展(Dev.Biol.)153：386-395，1992；Ooms等， 植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)17：727-743，，1991；Smart等， 植物细胞(The Plant Cell)3：647-656，1991)。但是，IPT在这些转基因植物中的表达并不是叶特异性的，所以表现出典型由细胞分裂素过量引起的发育异常，例如根发育迟缓和没有顶端优势。
本发明的目标是使得细胞分裂素以一定的水平仅在衰老的叶中产生，从而抑制衰老又不干扰植物其它方面的发育。
用图2所示的遗传构建物生成了8个转基因烟草系。表达SAG12-1/IPT融合体的8种转基因烟草表型都很正常(即没有分支、花的发育和根生长方面的改变)，但是转基因植物所有的叶在花和种子发育的全过程中都保持了高水平的叶绿素。没有转化的对照植株和用与SAG12-1/IPT融合体类似但以GUS基因取代IPT序列的构建物转化的植株在花和种子发育过程中表现为大量下部叶衰老。这样，在不干扰植物发育其它方面的同时达到的改变衰老的目的。
转基因植物具有显著提高的生物量和花及种子产量。以下表2所示，虽然叶的数量和开花时间相同，但和表达GUS的对照转基因植物相比，IPT转基因植物中的总生物量和开花数量明显增加。由于对照和IPT植株中每朵花中的种子产率相同，IPT转基因植物中的种子产量几乎增加一倍。在因虫害而终止实验后，IPT转基因植物仍继续生长(对照植株停止生长)，如果实验继续，产量的提高可能还要大。所以，该系统能够用于同时提高生物量和种子的产量，并促进观赏植物的开花。
我们还将图2所示的SAG12-IPT构建物引入拟南芥中并证明它在这种植物中也抑制叶衰老。
SAG12-1/IPT构建物是利用Yi Li提供的IPT构建物(Li等， 生物学进展(Dev. Biol.)153：386-395，1992)构建的。该IPT基因的有用特性是在转录起始位点引入了一个Nco I位点。IPT基因可以由我们以前的工作中方便地获得(参见例如Akiyoshi等， 美国 科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：5994-5998)，但是我们选用Li的构建物以省略克隆步骤。该构建物使用了一个胭脂氨酸合成酶基因(NOS)的终止子(在mRNA生成正确3’末端的序列)(Bevan等， 核酸研究(Nucleic Acids Research)11：369-385，1983)。
SAG13启动子的分离
在前文所述的mRNA文库中鉴定了23个与叶衰老相关的cDNA克隆。前文描述了其中之一SAG12的鉴定，使用相似的方法鉴定SAG13及其相关的启动子。
SAG13克隆包含一段1.24kb插入片段。该插入片段被用于制造筛选前文所述拟南芥基因组文库的探针。找到两个不同的基因组克隆(即，在拟南芥基因组中有两个SAG13拷贝)。这两个克隆包含一段3.53kb的EcoRI-SalI片段，该片段包含转录起始位点的上游区域。将这些DNA片段亚克隆在pBluescript II SK载体的EcoRI和SalI位点，然后测序。该片段包含全部SAG13 cDNA序列和上游启动子序列。后文SEQ ID NO：13显示SAG13上游启动子的序列。转录起始位点在第1782位核苷酸，翻译起始位点在第1957位核苷酸。两个序列基本一致，但在1009处，该基因的一个拷贝具有一个G残基，而另一个是A残基。
                                             表2
                        SAG12-IPT转基因及相关植株某些特性的比较
                           Wisconsin 38       SAG12-GUS          SAG12-GUS/         SAG12-IPT
                             (野生型)            植株           SAG12-IPT植株          植株叶绿素含量(μg cm-2叶#7)
  39天a                   19.911±0.642      21.627±1.893     22.117±1.944     25.638±1.877
  68天b                   1.239±0.719       1.797±1.575      16.905±1.551     18.527±2.855蛋白质含量(μg cm-2叶#7)
  39天a                   52.47±1.75        52.27±1.01       71.33±7.04       71.60±3.86
  68天b                   16.00±5.29        19.60±10.65      54.40±3.49       49.60±5.88
  花总数                   178.3±28.1        176.2±51.1       318.6±44.2       327.5±46.3
种子产量(g/株)             20.436±4.182      21.142±3.683     30.240±4.037     31.154 ±4.100
生物量(g/株)c             107.51±14.41      101.64±10.97     151.80±20.40     150.79±20.15
植株高度(cm)d             176.25±14.27      172.54±6.70      178.38±10.54     180.15±7.91
主干上的叶数               33.3±0.5          33.0±0.9         33.1±1.0         33.5±1.4
a)在出芽39天后，各种基因型植株的第7叶完全展开但并不衰老
b)在出芽68天后，野生型和SAG12-GUS植株的第7叶完全衰老
c)除种子之外，植株地上部分的干重
d)从地面至最高花柄
取样量：Wisconsin 38：8株；SAG12-GUS：13株；SAG12-GUS/SAG12-IPT：8株；SAG12-IPT：13株
                          序列表
(1)一般信息
  (i)申请人：Amasino，Richard M
             Gan，Sushang
  (ii)发明名称：衰老特性被改变的转基因植物
  (iii)序列数量：3
  (iv)通讯地址：
    (A)收件人：Quarles&Brady
    (B)街道：1 South Pinckney Street
    (C)城市：Madison
    (D)州：WI
    (E)国家：US
    (F)邮编：53703
  (v)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0 1.30版
  (vi)本申请资料：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类：
  (viii)律师/代理人信息：
    (A)姓名：Seay，Nichlas J
    (B)登记号：27,386
    (C)参考/案卷号：960296，92808
  (ix)电讯信息：
    (A)电话：608-251-5000
    (B)电传：608-251-9166
(2)SEQ ID NO：1的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：3183碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)说明：/desc＝“SAG12-1启动子DNA”
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
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GCGGCCAAGG CCAGAGTTAA GCAGATGTTG CACCCCGCTG CAGGCCATTC TATTATTCAA   2640
GAGTTGGTTT ATCTTTGGAA TGAACCTCGG CTGAGGCCCA TTCTGAAAGA GATCGATGGA   2700
TATCGATATG CCATGTTGTT TGCTAGCCAG AACCAGATCA CGGCAGATAT GCTATTGCAG   2760
CTTGACGCAA ATATGGAAGG TAAGTTGATT AATGGGATCG CTCAGGAGTA TTTCATCCAT   2820
GCGCGCCAAC AGGAACAGAA ATTCCCCCAA GTTAACGCAG CCGCTTTCGA CGGATTCGAA   2880
GGTCATCCGT TCGGAATGTA TTAGGTTACG CCAGCCCTGA GCTCGATCGT TCAAACATTT   2940
GGCAATAAAG TTTCTTAAGA TTGAATCCTG TTGCCGGTCT TGCGATGATT ATCATATAAT   3000
TTCTGTTGAA TTACGTTAAG CATGTAATAA TTAACATGTA ATGCATGACG TTATTTATGA   3060
GATGGGTTTT TATGATTAGA GTCCCGCAAT TATACATTTA ATACGCGATA GAAAACAAAA  3120
TATGGCGCGC AAACTGGGAT AAATTATCGC GCGCGGTGTC ATCTATGTTA CTAGATCGAA  3180
TTC                                                                3183
(2)SEQ ID NO：2的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：709碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：其它核酸
    (A)说明：/desc＝“SAG12-1启动子DNA(截短形式)”
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
AAGCTTTTAA CTTGCACGAA TGGTTCTCTT GTGAATAAAC AGAATCTTTG AATTCAAACT   60
ATTTGATTAG TGAAAAGACA AAAGAAGATT CCTTGTTTTT ATGTGATTAG TGATTTTGAT  120
GCATGAAAGG TACCTACGTA CTACAAGAAA AATAAACATG TACGTAACTA CGTATCAGCA  180
TGTAAAAGTA TTTTTTTCCA AATAATTTAT ACTCATGATA GATTTTTTTT TTTTGAAATG  240
TCAATTAAAA ATGCTTTCTT AAATATTAAT TTTAATTAAT TAAATAAGGA AATATATTTA  300
TGCAAAACAT CATCAACACA TATCCAACTT CGAAAATCTC TATAGTACAC AAGTAGAGAA  360
AATAAATTTT ACTAGATACA AACTTCCTAA TCATCAATTA TAAATGTTTA CAAAACTAAT  420
TAAACCCACC ACTAAAATTA ACTAAAAATC CGAGCAAAGT GAGTGAACAA GACTTGATTT  480
CAGGTTGATG TAGGACTAAA ATGGCTACGT ATCAAACATC AACGATCATT TAGTTATGTA  540
TGAATGAATG TAGTCATTAC TTGTAAAACA AAAATGCTTT GATTTGGATC AATCACTTCA  600
TGTGAACATT AGCAATTACA TCAACCTTAT TTTCACTATA AAACCCCATC TCAGTACCCT  660
TCTGAAGTAA TCAAATTAAG AGCAAAAGTC ATTTAACTTT CCTAAAACC              709
(2)SEQ ID NO：3的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：1974碱基对
    (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
  (A)说明：/desc＝“SAG13启动子DNA”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
GAATTCTCAG TGTTCTCTTA AATCAAATCT CTCACACTAT GAGTATATGA ACAAAATCAT   60
ATACATATCA CAATTCCATT ATGGATATCT CCCAATCTAT CTCTCATACA TGAAAATGTT  120
CTATTTCGAT CTTGTATTTA ATAATGTTAA TACTCTGTTT TAATTTGTGT ATCCTGATTT  180
TTTTTTCTTT TTGAAGTTCA ACAAATATAT CAAAATAACT CAGAACCATT ACTATTTTTT  240
CTTAGTTCAT CAATTCTTTA CTACACATAG AAACGTATTT ATCTTGTTTG ATCTACTTTG  300
ACTCTATATA TGTCATGTGG CATCTCTGGT CATTGCTAGT CACAGGTAAA AGTAAAAATT  360
GATCAAAGAT AAAGAGTCTT TCATGGTAAA AATTCTCTTG TAACTGGTGG AGATAGTAGA  420
TGTCAATTCG TTTGCAATAA CTTACATTTG CAATAACATG TCAGCCATAT TTATTTAAAT  480
TTCCATGCAT TTGATATTAT TTTCTCTCTA ATACATATAT GATGTGTTAC GGTCATTCTA  540
AAAATCCAGT TGACAGCATA ATGAAGCTGG TACACCATAC ATGCACTTGA TTATATATGG  600
ATGTTACTGC CATGATTGAT GTTTTGATGG AATTAGTGTT AAAGGATGGA CCCTCACTAA  660
CGCGGTTGGA AATTATGATC AAACTCTTCA ATGTCACTTA TCAAGAGAGC TAATGACTAG  720
CACGTTTAGT TGTTCTGTTG TTTCTTATGG CTGCTTAATG TCTCCATCAA ATATTTAGAC  780
ATTGTGGCTA GTAAAATGCC ATCTACCTTA ATCCTATATA TAAGTATAAC TAGATAATAA  840
TCCATATTTT TGCTGGGTTT AGTAGCTGAT ACGACGTTTA TGGTTGTTAT TGAGTTTGAA  900
TACAAAATAT AGAGTATTGT TGGAGTTATA TTGATTTTTG TTCATATTAG TTAACAAATA  960
ATAAAAAAAT TAAGAAAGGT TTTTGAAAAT GCATCTTCTA GAATATATRT ATATTCGAAA 1020
AAGTCACATC TTTAATTGAC ATATGTTTTG TTTGTTTGTT TTTTTTTACT GGCCACACAA 1080
ATTGACAACA ATGGTCATGC ATGAAATGAA ATGTTTGTTG TCAATTTTTT TTACTAACTT 1140
GTAATATCAT TATGAAATGA AATAGAAGGT ATATATTACA AAATATTACC TAAAAGTAGA 1200
GCAATCTTAG AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAGAAA AAGAAAAAGA AACAAGATTA 1260
CAATGCATTT AAAAAGAGAT GGAAAGAATC CGAGCTATCG AATCCAAAGA AGCATCTACT 1320
TCCTCCATCT GTTCTTGTAT CGTCTACCAG AGATGGTGTT CCGGATCTCT CGATCAATAT 1380
TCTTAAAGAT GGTTGTTGGA GGGATCCTTT GGCTATTATG GAGAACATTA TTCGTTTATC 1440
TCCAGATGTG ATAGACAAAG GGCTGTGTGG CCTGTGAGAC CGATGGCCAC TTAATTATTG 1500
GTTTTTTGTC AATGGTTGTG TATGCATAGA AATTCCCACA ACCGTTTGTG GCTTAACACA 1560
ATTTACCAGG GGTTTAAGTG GTTAAATTGA TACATGTAGA TCTAAAGTTT TATGCTAATA 1620
TAAATTAGTT TTAATTATAT AAATTTTAAC TACGCTCATG ACACGTAAAT GGTAGACCAA 1680
TATGTGGTGC TCTATTAACT AAGGGGTGCT TCATTATTAA TTCATAAAGA TTTCTTTACT 1740
ATACAAGACT TGTCAAAAGG AAAAGTAGTA TTTTCGTACT ACGTCTACCC CTCTCACGGA 1800
TATGTGTGGT CGAGCAGTCA TTATCATAAT GTGGAATTTT GAATTGAGCG AGGTTTCAAA 1860
GTTCAAAACT ATCACAACTA GTCTTGATCA ATTCTATATA AGATCTGTGA TCTTGGTTGA 1920
AGAAAAGAAT CGTCGTAGGT TGATATTTAA CAAGGAATGG CAAAGGAAGG GGGC       1974

Claims (13)

1.一种遗传构建物，它包含衰老特异性启动子序列和与之操作性连接的蛋白质编码DNA序列，所述启动子序列是SAG12启动子序列，所述SAG12启动子包含SEQ ID NO：2的1-602bp，所述蛋白质编码DNA序列并不天然与所述启动子序列相关联。
2.根据权利要求1所述的构建物，其中的蛋白质编码序列编码一种植物激素合成酶。
3.根据权利要求2所述的构建物，其中的蛋白质编码序列编码催化植物激素细胞分裂素合成的酶。
4.根据权利要求3所述的构建物，其中的蛋白质编码序列编码异戊烯基转移酶。
5.根据权利要求1所述的构建物，它还包含SAG12-1的5’非翻译区。
6.一种遗传构建物，它包含一个如权利要求1所述的SAG12启动子，该启动子与编码催化细胞分裂素合成的酶的DNA序列可操作地连接。
7.根据权利要求6所述的构建物，其中的DNA序列编码异戊烯基转移酶。
8.一种细胞，它包含权利要求1所述的构建物。
9.一种细胞，它包含权利要求6所述的构建物。
10.一种制造转基因植物的方法，包括用权利要求1所述的构建物转化植物细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，包括用权利要求2所述的构建物转化植物细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，包括用权利要求3所述的构建物转化植物细胞。
13.根据权利要求11所述的方法，包括用权利要求4所述的构建物转化植物细胞。
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