KR20230023402A - 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 - Google Patents

식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230023402A
KR20230023402A KR1020210105509A KR20210105509A KR20230023402A KR 20230023402 A KR20230023402 A KR 20230023402A KR 1020210105509 A KR1020210105509 A KR 1020210105509A KR 20210105509 A KR20210105509 A KR 20210105509A KR 20230023402 A KR20230023402 A KR 20230023402A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mtatpp4
gene
mtatpp3
seq
plant
Prior art date
Application number
KR1020210105509A
Other languages
English (en)
Inventor
이동희
한민우
정영수
Original Assignee
주식회사 팜앤셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 팜앤셀 filed Critical 주식회사 팜앤셀
Priority to KR1020210105509A priority Critical patent/KR20230023402A/ko
Publication of KR20230023402A publication Critical patent/KR20230023402A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 발명은 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 MtATPP4 단백질 및 MtATPP3 단백질과 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 MtATPP3 및 MtATPP4 단백질과 그 유전자인 MtATPP3 및 MtATPP4는 식물체에서 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 특성을 부여할 수 있으며, 상기 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킬 경우, 식물체의 다수확성을 증가시킬 뿐 아니라 노화 지연 및 내재성 강화 특성을 갖는 식물체를 생산할 수 있다.

Description

식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도{AT-hook proteins of Medicago truncatula conferred high-yielding, delaying senescence and enhancing stress tolerance in plants, the gene encoding the protein and those uses}
본 발명은 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 MtATPP4 단백질 및 MtATPP3 단백질과 상기 단백질을 코딩하는 유전자 및 이들의 용도에 관한 것이다.
식물 노화(senescence)는 식물 발달과정 중의 마지막 단계에서 진행되는 일련의 생화학적, 생리학적 현상을 의미한다. 식물 노화의 시작은 세포 내에 급격한 변화를 일으키는 전환점으로서 식물은 점차적으로 합성 능력이 저하되고 세포 내의 구조물들과 거대 분자들이 단계적으로 분해되어 세포의 항상성(homeostasis)을 잃음으로써 세포는 결국 사멸하게 된다(Matile P., 1992 In Crop Photosynthesis : Spatial and Temporal Determinants 413-440; Nooden L. D., 1988, In Senescence and Aging in Plants; Thiman K. V., 1980, In Senescence in Plants 85-115; Thomas H. et al., 1993, Annu. Rev. Plant Physiol. 123:193-219). 이러한 일련의 과정들은 단순히 수동적으로 식물 조직의 붕괴가 일어나는 것이 아니라 유전적으로 계획되어 있어 세포, 조직, 기관의 수준에서 매우 정교하고 능동적으로 진행되는 과정이다.
식물체의 노화는 작물의 생산성이나 수확 후 저장 효율에 영향을 미치는 중요한 요인이며, 식물의 생산성, 저장성, 수송성 등의 증진과 같은 경제적 측면에서도 영향을 미치기 때문에 식물의 노화 현상을 밝히기 위한 유전학적, 분자 생물학적, 생리학적 및 생화학적 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 식물 호르몬에 관련된 연구들이 주류를 이루고 있을 뿐, 노화 조절을 위한 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 이용한 식물체 노화 조절에 관한 연구에 대해서는 아직 미흡한 상태이다.
최근 급변하는 기후는 작물의 생산성을 감소시키는 주요한 원인으로 대두되고 있다. 식물은 다양한 조절 기작을 통하여 다양한 환경에 적응하며 생존한다. 특히 비생물적 스트레스 (abiotic stress)에 대한 기작은 적응을 위한 중요한 요인이다. 비생물적 스트레스란 식물세포의 항상성을 방해하여 결국 식물 성장을 저해하는 기후나 토양 조건을 일컫는다. 그 예로서 수분 과잉/부족, 독성 이온, 고온, 저온, 대기 오존 (O3) 등이 있다. 즉, 식물은 기후, 풍토 등과 같은 외부 인자에 민감하게 반응하여 노화가 촉진되고 죽음에 이르게 된다. 따라서, 외부의 다양한 영향으로부터 식물의 노화를 지연시킴으로써 생산성을 유지시키고, 나아가 식물의 다수확성을 위한 노화 조절, 내재성 강화 등에 관한 연구도 필요한 실정이다.
종래에는 식물의 노화를 지연시키기 위한 다양한 기술들이 공개된 바 있다. 아실-가수분해효소 활성(acyl hydrolase activity)을 지니는 SAG101 유전자의 antisense 서열을 식물체에 도입시켜 노화를 지연시키는 기술과 같이 직접적으로 노화 촉진 유전자의 발현을 저해하는 방법, 노화 진행 시기 동안 노화를 저해하는 유전자를 과발현하는 방법이 공개된 바 있다. 구체적으로, 미국등록특허 제05689042호에는 노화 관련 유전자인 SAG12 또는 SAG13 유전자의 promoter에 cytokinin 합성 관련 유전자를 결합시켜 노화를 지연시킬 경우, 담배에서 생산성이 50% 증가함이 개시되어 있다. 또한, SAG12 promoter에 옥수수의 homeobox gene(KNOTTED1)을 발현시킨 담배에서 cytokinin의 level이 증가하고 잎의 노화도 지연됨이 개시되어 있고, 토마토의 경우 ethylene 합성과정을 저해하여 과일의 숙성을 조절한 사례가 보고가 있으며(Oeller et al., Science. 1991, 254(5030):437-9), 세포벽 분해와 관련된 polygalacturonase 유전자의 발현을 억제시켜 토마토의 운송성과 저장성을 증가시킨 Flav-O-Savor의 경우가 대표적으로 상업화된 예가 될 수 있다(Giovannoni et al., 1989, Plant Cell 1(1):53-63). 더욱이, 최근 노화 지연의 형질을 가지고 있는 자포니카 벼의 OsSGR 유전자를 상대적으로 노화가 빠른 인디카 벼에 도입한 근동질 계통(Near isogenic line)을 육성한 결과, 새로 개발한 벼 품종은 광합성 양과 기간이 증가하여 등숙률(곡식이 알차게 여무는 비율)이 9%, 벼 생산성이 7% 향상되었다(Shin et al., 2020, Nature communications 11:2819).
또한, 종래에는 노화 진행 시 과발현되는 유전자로서 GmSARK 유전자와 NAC family에 속하는 WRKY53, WRKY6 및 AtNAP 유전자 등이 보고되었으며(Miao et al., 2004, Plant Mol. Biol. 55:853-867; Guo and Gan et al., 2006, Plant J. 46(4):601-12; Li et al., 2006, Plant Mol. Biol. 61:829-844; Besseau et al., 2012, J. Exp. Bot. 63(7):2667-79), CBF2, CBF3와 같은 유전자들은 노화를 억제시키는 것으로 알려졌다(Sobieszczuk-Nowicka et al., 2007, Physiol. Plant. 130:590-600). 이들 유전자의 발현 조절은 노화를 지연시켜 결과적으로 작물의 생산성 등의 향상을 가져올 수 있다. 구체적으로 미국 등록특허 제08420890호에는 AtNAP 유전자의 발현 억제를 통한 노화의 지연 방법이 개시되어 있는데 최근에는 AtNAP를 과발현시켜 목화 등의 수확을 용이하게 하거나 과실의 빠른 성숙을 돕는데 이용하기 위한 연구도 진행되고 있다(Kou et al., 2012, J. Exp. Bot. 63(17):6139-47).
적절한 promoter의 적용을 통한 IPT 유전자의 발현 조절은 캐놀라에서 노화 지연과 더불어 생산성 증대의 농업형질을 제공하며, 형질전환 식물에서 cytokinin 과발현에 의한 형태학적, 그리고 표현형적 이상이 전혀 나타나지 않는다는 것이다(Surya Kant et al., 2015, PLOS ONE, 10(1): e0116349. doi:10.1371/journal.pone.0116349). 최근 AtMYB32xs 프로모터의 조절을 받는 IPT 유전자의 도입은 밀에서 다수확성 형질을 제공하였으며, 이러한 사실로 미루어보아 이는 타 작물에서도 작물 생산량 증가에 대한 positive regulator로 작동할 수 있을 것으로 제안되고 있다(Joshi et al., 2019, Frontiers in Plant Science 10:1285).
또한 한국등록특허 제1855134호에는 애기장대의 AT hook 유전자인 ATPG4도 유전자 발현 정도에 따라 노화 지연의 표현형적 특징, 혹은 생산성 증대의 표현형적 특징을 나타낸다고 제안되고 있다. 한편 ATPG4 유전자의 발현 양상과는 반대로, 면화에서 분리된 cytokinin 조절 유전자인 GhCKX의 발현 억제는 생산성 증대와 녹기 연장의 형질을 제공하는 것으로 알려졌다. 본 유전자의 극심한 발현 억제는 녹기 연장의 형질을, 그런 반면 적절한 발현 억제는 fiber와 종자의 생산성 증대를 유도한다고 보고되고 있다(Zhao et al., 2015, Mol. Breeding. 35:60). 이러한 유전자들의 기능은 발현 조절을 통해 생산성 증대 및 노화 지연의 형질을 제공한다는 점에서 유전자 발현 조절과 생산성 증대의 상관 연구는 더욱 가속화될 것이다.
한편, 식물이 노화되는 정도와 형태는 수많은 종류의 노화 유전자들이 상호작용하며 발현되는 양상에 따라 달라지기 때문에 식물의 노화 유전자들에 대한 연구는 유용 식물체의 생산성을 결정하는 중요한 요소가 될 것이며, 이와 같은 연구는 식물의 노화를 지연시킴으로써 작물의 생산성에 긍정적인 영향을 미칠 것이다. 따라서 식물 노화 및 생육 과정에 대한 충분한 이해 및 관련 유전자 기능에 대한 실험적 증명을 통하여 작물의 생산성, 품질, 저장성 등과 같은 농업적 형질의 향상을 꾀할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 식물의 다수확성 형질의 향상을 가져올 수 있는 노화 지연, 내재성 강화 등의 기능을 가지는 유전자를 스크리닝하고 발굴하기 위해 예의 연구노력한 결과, 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula)에서 분리한 MtATPP4 단백질 및 MtATPP3 단백질이 식물에 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 부여할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
US 05689042A US 08420890B2 KR 1855134 B1
Matile P., 1992, In Crop Photosynthesis : Spatial and Temporal Determinants 413-440; Nooden L. D., 1988, In Senescence and Aging in Plants; Thiman K. V., 1980, In Senescence in Plants 85-115; Thomas H. et al., 1993, Annu. Rev. Plant Physiol. 123:193-219 Oeller et al., 1991, Science 254(5030):437-9 Giovannoni et al., 1989, Plant Cell 1(1):53-63 Shin et al., 2020, Nature communications 11:2819 Miao et al., 2004, Plant Mol. Biol. 55:853-867; Guo and Gan et al., 2006, Plant J. 46(4):601-12; Li et al., 2006, Plant Mol. Biol. 61:829-844; Besseau et al., 2012, J. Exp. Bot. 63(7):2667-79 Sobieszczuk-Nowicka et al., 2007, Physiol. Plant. 130:590-600 Kou et al., 2012, J. Exp. Bot. 63(17):6139-47 Surya Kant et al., 2015, PLOS ONE 10(1): e0116349. doi:10.1371/journal.pone.0116349 Joshi et al., 2019, Frontiers in Plant Science 10:1285 Zhao et al., 2015, Mol. Breeding. 35:60
따라서, 본 발명의 주된 목적은 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 MtATPP4 단백질 및 MtATPP3 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 MtATPP4 단백질 및 MtATPP3 단백질을 암호화하는 MtATPP4 유전자 및 MtATPP3 유전자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 MtATPP4 유전자 또는 MtATPP3 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 형질전환 식물체 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 MtATPP4 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 MtATPP4 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP4 유전자를 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는 MtATPP3 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 MtATPP3 단백질을 암호화하는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP3 유전자를 제공한다.
본 발명자들은 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 형질전환 식물체를 생산하기 위하여 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula)의 AT-hook DNA-binding protein, MtATPP4(GeneBank accession number XP_003616459.1)와 MtATPP3(GeneBank accession number XM_003611166.1)의 염기서열로부터 식물의 다수확성 형질의 향상을 가져올 수 있는 노화 지연 등의 기능을 가지는 유전자를 스크리닝하고 분리하였으며, 분리한 유전자를 애기장대에 형질전환시켜 발현시켰을 때, 개체의 크기 및 종자 생산량 증가에 따른 개체의 다수확성과 식물의 노화 지연 특성 및 내재성 강화 특성이 나타남을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 유전자를 MtATPP4( M edicago t runcatula AT-hook protein of Pharmncell 4)와 MtATPP3( M edicago t runcatula AT-hook protein of Pharmncell 3)으로 명명하였으며, 상기 각각의 유전자가 코딩하는 단백질을 MtATPP4 단백질과 MtATPP3 단백질로 명명하였다. 상기 MtATPP4 유전자의 염기서열 및 MtATPP4 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 개시되어 있고, MtATPP3 유전자의 염기서열 및 MtATPP3 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 서열번호 4에 개시되어 있다.
본 발명의 MtATPP4 단백질 또는 MtATPP3 단백질은 전술한 아미노산 서열 2 또는 4로 이루어진 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명 단백질의 변이체란, 본 발명의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 아미노산 유사체의 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 경우에 따라서 본 발명의 단백질은 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)된 것 일 수도 있다.
또한, 본 발명의 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 이들의 기능적 동등물을 포함한다.
상기 용어 '기능적 동등물'이란, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성'이란 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기능을 부여하는 활성을 의미한다.
본 명세서에서, "다수확성"이란 좁게는 식물체 종자의 생산성(식물 1개체 당 종자의 수 및/또는 질량)이 야생형 식물체에 비해 증가하여 식물(작물)의 많은 수확량을 나타내는 특성으로, 넓게는 식물체 종자의 수확량 증가와 더불어 식물체의 전체, 줄기, 뿌리 및/또는 잎의 생체량(biomass; 크기 및/또는 질량)이 야생형 식물체에 비하여 증가한 특성을 의미한다.
본 명세서에서, “노화 지연”이란 야생형 식물체에 비하여 식물 수명이 연장된 특성을 일컫는 것으로, 구체적으로는 잎 및/또는 줄기의 황화 현상이나 괴사 현상이 야생형 식물체 비하여 지연되거나 식물체의 엽록소 함량이 야생형 식물체에 비하여 많은 특성을 의미한다.
본 명세서에서, “내재성 강화”란 야생형 식물체에 비하여 식물이 가지고 있는 성질이 강화된 특성을 일컫는 것으로, 구체적으로는 염 또는 과산화수소와 같은 스트레스에 대한 저항성이 야생형 식물체에 비해 강화되어 잎 및/또는 줄기의 황화 현상이나 괴사 현상이 지연되거나 식물체의 엽록소 함량이 많은 특성을 의미한다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자의 염기서열은 이와 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기 본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자에 의해 암호화되고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 바람직하게는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자에 의해 암호화된다. 상기 유전자 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP4 유전자 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP3 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, “재조합 발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
본 발명에서의 재조합 발현 벡터는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP4 유전자 또는 MtATPP3 유전자에 작동적으로 결합(operatively linked)되도록 구성되어 있다.
본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절할 수 있다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 재조합 발현 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae)및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 본 발명에서는 식물세포 전환용 벡터로서 아그로박테리움 튜머파시엔스을 이용하였다.
본 발명의 유전자는 식물에서 분리되었고, 식물(작물)의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 제공할 수 있으므로, 식물에 대하여 가장 바람직한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터가 식물 세포에 적용되는 경우, 본 발명에 적합한 프로모터는 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제(nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트(ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터, 유도성 프로모터(inducible promoter)인 SEN1 프로모터를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 벡터로, 재조합 발현 벡터는 BAR 유전자(phosphinothricin acetyltransferase gene), CaMV 35S 프로모터, CaMV 35S RNA polyA, SEN1 프로모터, polyA를 포함한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP4 유전자 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP3 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스에 도입시켜 형질전환 시키는 제1 단계, 상기 제1 단계에서 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 배양하여 세포를 수확하는 제2 단계, 식물체를 상기 제2 단계의 세포를 배지에 현탁시킨 현탁액에 침지시켜 형질전환 시키는 제3 단계, 및 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 기능(특성)을 갖는 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업 계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있으며, 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있다(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977), 미국 등록특허 제 5,004,863호, 제5,349,124호 및 제5,416,011호). 일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011호).
본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method), 열충격법(heat shock) 및 냉동-해빙법(freezethaw method) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서 전기천공법(electroporation)을 사용한다.
형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(npt II) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP4 유전자 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP3 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 식물체에 도입되어 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 명세서에서, "식물체"란 다수확성이 인간에게 유용한 결과를 줄 수 있는 모든 식물을 포함하며, 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물조직, 식물 세포 또는 조직으로부터 유래된 캘러스 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다. 따라서 상기 식물의 의미에는 작물(구체적으로 식용작물, 사료작물, 공예작물 등의 농작물과 원예작물을 포함함), 임목, 관상식물을 포함한다. 구체적으로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 콩과 식물, 배추, 청경채, 케일, 콜리플라워, 브로콜리, 열무(young radish), 무, 갓, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 "형질전환"이란 외래 유전자가 도입됨에 의한 숙주 식물체의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 그 외래 유전자가 숙주 식물체, 더 정확하게는 숙주 식물의 세포 내로 도입되어 세포의 게놈에 통합된 것을 의미한다. 여기서 외래 유전자에는 동종성 유전자와 이종성 유전자가 포함되는데, "동종성 유전자"란 숙주 유기체 또는 그와 동일한 생물종의 내인성 유전자를 의미하며, "이종성 유전자"란 그것이 형질전환되는 유기체에서는 존재하지 않는 유전자를 말한다. 예컨대 본 발명의 MtATPP4 유전자 및 MtATPP3 유전자는 그것이 분리된 메디카고 트런카툴라에는 동종성 유전자이지만, 애기장대 식물에서는 이종성 유전자가 된다.
본 발명의 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업 계에 일반적으로 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환 시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며, 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환 시킬 수 있다. 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다. 일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법으로, 본 발명의 형질전환은 아그로박테리움을 매개체로 이용한 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP4 유전자 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP3 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 식물체에 도입되어 형질전환된 형질전환 식물체의 다수확성을 확인하기 위하여 재조합 발현 벡터가 도입되지 않은 야생형 식물체와 종사수확량을 확인한 결과, 본 발명에 따른 형질전환 식물체의 종자수확량이 현저히 증가한 것을 확인하였다(본원발명 도 4 및 도 19 참조). 또한, 본 발명에 따른 형질전환 식물체의 노화 지연 특성을 야생형 식물체와 비교한 결과, 본 발명에 따른 형질전환 식물체의 잎이 야생형 식물체의 잎보다 황화 현상 및 엽록소 함량의 감소가 느리게 나타나는 것을 확인하였다(도 5 내지 도 8, 도 20 및 도 21 참조). 또한, 본 발명에 따른 형질전환 식물체의 내재성 강화 특성을 야생형 식물체와 비교한 결과, 염 및 과산화수소를 처리하였을 때 형질전환 식물체의 잎이 야생형 식물체의 잎보다 황화 현상 및 엽록소 함량의 감소가 느리게 나타나는 것을 확인하였다(도 9 내지 도 12, 도 22 및 도 23 참조). 이러한 결과는, 본 발명에 따른 MtATPP3 및 MtATPP4 단백질과 그 유전자인 MtATPP3 및 MtATPP4는 식물체에서 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 특성을 부여할 수 있으며, 상기 유전자가 도입되어 발현된 형질전환 식물체의 경우 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 특성을 가지게 되어 농업 분야에 긍정적인 효과를 줄 수 있음을 시사한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 MtATPP3 및 MtATPP4 단백질과 그 유전자인 MtATPP3 및 MtATPP4는 식물체에서 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 특성을 부여할 수 있으며, 상기 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시킬 경우, 식물체의 다수확성을 증가시킬 뿐 아니라 노화 지연 및 내재성 강화 특성을 갖는 식물체를 생산할 수 있다.
도 1은 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 제공하는 MtATPP4 유전자가 센스 방향으로 도입된 pSEN-MtATPP4 재조합 벡터의 구조(모식도)이다.
도 2는 pSEN-MtATPP4 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 T3 라인을 발아 후 50일(도 2a)과 70(도 2b)일 동안 생육시킨 애기장대의 사진이다. DAG, day after germination.(Col-0: 애기장대 야생형 혹은 대조구, MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210, MtATPP4-1609: pSEN-MtATPP4 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 라인)
도 3은 pSEN-MtATPP4 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 T3 라인을 자엽 생성 후 24일 동안 생육시킨 애기장대의 MtATPP4 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과이다(TUB: PCR 양성 대조구).
도 4는 본 발명에 따른 애기장대 라인의 생산성 지표 분석을 통한 생산성 증대에 대한 그림이다(Height: 키, NTS: 장각과 수, FW: 생체량, DW: 생체 건량, TSW: 총 종자 무게).
도 5는 T3 호모 세대에서 자엽 생성 후 16일부터 애기장대 야생형(Col-0)과 본 발명에 따른 변이체 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210, 그리고 MtATPP4-1609의 3-4번 좌엽을 매 4일마다 56일까지 잎의 표현형을 관찰한 결과이다.
도 6은 도 5에 대한 잎의 엽록소 함량을 조사한 그림이다. DAE, day after emersion.
도 7은 발아 후 21일째 애기장대 야생형(Col-0)과 본 발명에 따른 변이체 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210, 그리고 MtATPP4-1609의 3-4번 좌엽을 분리하여 암상태를 유지하여 매 2일마다 6일까지 잎의 표현형을 관찰한 결과이다.
도 8은 도 6에 대한 잎의 엽록소 함량을 조사한 결과이다. DAT, day after treatment.
도 9는 발아 후 25일째 애기장대 야생형(Col-0)과 본 발명에 따른 변이체 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210, 그리고 MtATPP4-1609의 3-4번 좌엽을 분리하여 부유시킨 후 3일 간격으로 6일간 150mM의 NaCl을 처리한 입의 표현형 변화를 관찰한 결과이다.
도 10은 도 9에 대한 잎의 엽록소 함량 변화를 조사한 결과이다.
도 11은 발아 후 25일째 애기장대 야생형(Col-0)과 본 발명에 따른 변이체 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210, 그리고 MtATPP4-1609의 3-4번 좌엽을 분리하여 부유시킨 후 3일 간격으로 6일간 4mM의 H2O2를 처리한 잎의 표현형 변화를 관찰한 결과이다.
도 12는 도 11에 대한 잎의 엽록소 함량 변화를 조사한 결과이다.
도 13은 MtATPP4-발현 애기장대 T3 형질전환체의 cytokinin 생합성 과정에 관여하는 IPT 유전자군과 MtATPP4 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이다(TUB: PCR 양성 대조구).
도 14는 MtATPP4-발현 애기장대 T3 형질전환체의 cytokinin signaling pathway에서 CLV1 유전자, cytokinin receptor인 histidine kinase (HK) 유전자군, 그리고 MtATPP4 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과이다(TUB: PCR 양성 대조구).
도 15는 MtATPP4-발현 애기장대 T3 형질전환체의 cytokinin signaling pathway에서 histidine phosphotransfer proteins (HP) 유전자군과 MtATPP4 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과이다(TUB: PCR 양성 대조구).
도 16은 MtATPP4-발현 애기장대 T3 형질전환체의 auxin 생합성에서 flavin-containing monooxygenase (YUC) 유전자군과 MtATPP4 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과이다(TUB: PCR 양성 대조구).
도 17은 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 제공하는 MtATPP3 유전자가 센스 방향으로 도입된 pSEN-MtATPP3 재조합 벡터의 구조(모식도)이다.
도 18는 pSEN-MtATPP3 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 변이체 T3 라인인 MtATPP3-59, MtATPP3-64, MtATPP3-1102, MtATPP3-1403, MtATPP3-2001, 그리고 MtATPP3-2003를 발아 후 50일(도 18a)과 70일(도 18b) 동안 생육시킨 애기장대의 사진이다(DAG: day after germination).
도 19는 본 발명에 따른 애기장대 라인의 생산성 지표 분석을 통한 생산성 증대 도면이다(Height: 키, NTS: 장각과 수, FW: 생체량, DW: 생체 건량, TSW: 총 종자 무게).
도 20은 T3 호모 세대에서 자엽 생성 후 16일부터 애기장대 야생형(Col-0)과 변이체 MtATPP3-59, MtATPP3-64, MtATPP3-1102, MtATPP3-1403, MtATPP3-2001, 그리고 MtATPP3-2003의 3-4번 좌엽을 매 4일마다 48일까지 잎의 엽록소 함량을 조사한 결과이다 (DAE: day after emersion).
도 21은 발아 후 21일째 애기장대 야생형(Col-0)과 변이체 MtATPP3-59, MtATPP3-64, MtATPP3-1102, MtATPP3-1403, MtATPP3-2001, 그리고 MtATPP3-2003의 3-4번 좌엽을 분리하여 암상태를 유지하여 매 2일마다 6일까지 잎의 엽록소 함량을 조사한 결과이다(DAT: day after treatment).
도 22는 발아 후 25일째 애기장대 야생형(Col-0)과 변이체 MtATPP3-59, MtATPP3-64, MtATPP3-1102, MtATPP3-1403, MtATPP3-2001, 그리고 MtATPP3-2003의 3-4번 좌엽을 분리하여 부유시킨 후 2일 간격으로 4일간 150mM의 NaCl을 처리한 입의 엽록소 함량 변화를 나타낸 결과이다.
도 23은 발아 후 25일째 애기장대 야생형(Col-0)과 변이체 MtATPP3-59, MtATPP3-64, MtATPP3-1102, MtATPP3-1403, MtATPP3-2001, 그리고 MtATPP3-2003의 3-4번 좌엽을 분리하여 부유시킨 후 2일 간격으로 4일간 4mM의 H2O2를 처리한 잎의 엽록소 함량 변화를 나타낸 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 메디카고 트런카툴라( Medicago truncatula )로부터 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 제공하는 AT-hook 유전자의 분리
식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 제공하는 MtATPP3과 MtATPP4 유전자를 메디카고 트런카툴라로부터 분리하기 위하여 다음과 같은 과정을 수행하였다.
1) 메디카고 트런카툴라의 재배
메디카고 트런카툴라 품종, Medicago truncatula Jemalong A17(New Phytologist, 174:299-303, 2007)을 토양을 담은 화분에서 22℃의 온도에서 16/8시간 명암 주기를 가지는 생장 조절기(growth chamber) 내에서 재배하였다.
2) RNA 추출과 cDNA 라이브러리의 제조
메디카고 트런카툴라 cDNA 라이브러리를 만들기 위해서 여러 분화 단계의 전체 기관으로부터 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Germany)을 사용하여 RNA를 추출하였고, 추출된 전체 RNA로부터 Superscript III Reverse Tanscriptase(INVITROGEN, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
3) 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화를 제공하는 MtATPP4 와 MtATPP3 유전자 분리
메디카고 트런카툴라의 AT-hook DNA-binding protein(GeneBank accession number XP_003616459.1)의 염기서열을 기초로 하여 서열번호 5로 표기된 제한효소 BglII의 서열이 포함된 정방향 primer (BglII/MTR5g080580-F, 5'-AGA TCT ATG TCG AAT CGA TGG TGG AGT G-3')와 서열번호 6으로 표기된 제한효소 BstEII의 서열이 포함된 역방향 primer (BstEII/MTR5g080580-R, 5'-GGT GAC CTC AAT ATG GAG GTG GAT GTG GAC-3')를 합성하였다. 상기 primer를 사용하여 메디카고 트런카툴라 cDNA로부터 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 전장 cDNA를 증폭하고 분리하였다. 상기 분리된 cDNA의 분석 결과, 328개의 아미노산을 암호화하는 987bp 크기의 전사 해독 틀(ORF)을 가지고 있으며, AT-hook motif를 가지고 있어 이를 MtATPP4 ( M edicago t runcatula AT-hook protein of Pharmncell 4)로 명명하였다.
한편 MtATPP3 유전자의 경우, 메디카고 트런카툴라의 AT-hook DNA-binding protein(GeneBank accession number XM_003611166.1)의 염기서열을 기초로 하여 서열번호 7로 표기된 제한효소 PacI의 서열이 포함된 정방향 primer(PacI/MTR5g011520-F, 5'-TTA ATT AAA TGG ATC AAA TAA CAT CAC ATG GA-3')와 서열번호 8로 표기된 제한효소 AscI의 서열이 포함된 역방향 primer(AscI/MTR5g011520-R, 5'-GGC GCG CCT CAA TAC GGA GAA CGC CCG GTT-3')를 합성하고 이를 사용하여 메디카고 트런카툴라 cDNA로부터 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 전장 cDNA를 증폭하고 분리하였다.
상기 분리된 cDNA의 분석 결과, 325개의 아미노산을 암호화하는 978bp 크기의 전사 해독 틀(ORF)을 가지고 있으며, AT-hook motif를 가지고 있어 우리는 이를 MtATPP3 ( M edicago t runcatula AT-hook protein of Peharmncell 3)으로 명명하였다.
실시예 2: MtATPP4 유전자에 대한 센스 구성체(construct)가 도입된 형질전환 애기장대의 제조 및 특성 분석
1) MtATPP4 유전자에 대한 센스 구성체가 도입된 형질전환 애기장대의 제조
상기 유전자가 식물의 다수성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 제공하는지를 확인하기 위하여 MtATPP4 유전자를 센스 방향으로 도입하여 본 유전자의 전사체 발현 변화를 유도한 형질전환 애기장대를 제조하였다.
서열번호 5로 표시되고 제한효소 BglII의 서열이 포함된 정방향 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되고 제한효소 BstEII의 서열이 포함된 역방향 프라이머를 이용하여 메디카고 트런카툴라의 cDNA로부터 PCR을 이용하여 MtATPP4 cDNA를 증폭하였다. 상기 DNA를 제한효소 BglII와 BstEII로 절단하고, 유도성 프로모터(inducible promoter)인 SEN1 프로모터의 조절을 받도록 제작한 pSEN 벡터에 센스 방향으로 클로닝하여 MtATPP4 유전자에 대한 센스 구성체인 pSEN-MtATPP4 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 SEN1 프로모터는 식물의 생장 단계에 따라, 특히 노화 단계에 따라 발현되는 유전자에 대해 특이성을 갖는다.
상기 pSEN-MtATPP4 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에 일랙트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 도입시켰다. 형질전환된 아그로박테리움 배양액을 28℃에서 O.D.600 값이 1.0이 될 때까지 배양하였고, 25℃에서 5,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 최종 O.D.600 값이 2.0이 될 때까지 Infiltration Medium(IM; 1X MS SALTS, 1X B5 vitamin, 5% sucrose, 0.005% Silwet L-77, Lehle Seed, USA) 배지에 현탁하였다. 배양된 균주를 플로럴 딥핑 방법 (floral dipping method; Clough et al., Plant J (1998) 16:735-743)에 따라 애기장대 야생형 (Col-0)에 형질전환시켰다. 이후, 형질전환된 애기장대를 계속 생장시켜 종자(T1)를 수확하였다. 대조군으로는 형질전환되지 않은 야생형(wild type) 애기장대 또는 MtATPP4 유전자가 포함되지 않은 벡터(pSEN 벡터)만으로 형질전환된 애기장대를 사용하였다.
2) T 3 형질전환 애기장대의 특성 분석
상기 실시예 2-1)에 따라 형질전환된 애기장대에서 수확한 종자는 0.1% 바스타(Basta) 제초제(경농, 한국) 용액에서 30분 동안 침지시키고 배양함으로써 선별하였다. 이후 형질전환한 애기장대의 생육 동안 주기적으로 바스타 제초제를 처리한 후, 각 화분에서 제초제 저항성을 형질을 가지는 형질전환된 애기장대를 선별하였다. pSEN-MtATPP4 벡터로 형질전환된 T1 애기장대는 야생형과 그들의 표현형을 비교하여 볼 때, 놀랍게도 변이체들은 뚜렷한 다수확성 형질 및 생산성 증대 형질을 보였다.
이러한 형질전환 애기장대의 표현형 변화를 정확히 확인하기 위하여 T1 형질전환 애기장대로부터 세대 진전을 거쳐 T3 형질전환 종자를 받아 이들 라인의 표현형을 조사하였다. 선별된 애기장대 T3 형질전환 라인들의 표현형 확인은 발아 후 50일째와 70일째 수행하였다(도 2). pSEN-MtATPP4 구성체를 가지고 있는 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210과 MtATPP4-1609 변이체 라인 모두는 애기장대 야생형(Col-0)와 비교하여 볼 때, 식물체의 다수확성 형질이 뚜렷하게 나타났으며 흥미로운 점은 이들 변이체 중 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210 변이체 라인은 다수확성 형질과 더불어 노화 지연 형질도 뚜렷하게 나타났다. 또한, MtATPP4-발현 변이체 라인 모두는 발아 후 50일에서 70일 동안 생육했을 때 애기장대 야생형에 비하여 개체 크기 및 종자 생산량 증가와 같은 생산성에 대한 뚜렷한 증가 현상이 나타났다. 따라서 본 MtATPP4 유전자는 식물의 다수확성 및 노화 지연 형질 제공에 있어서 강력한 유전자원으로 판단된다.
이러한 다수확성과 노화 지연 형질이 라인마다 차이가 있었는데 이는 본 유전자의 발현이 라인마다 차이가 있음에 기인하는 것으로 판단된다. 이러한 표현형적 특징이 도입 유전자의 발현 조절에 의해 유도되는지를 확인하기 위하여 자엽 생성 후 24일 동안 생육한 애기장대 야생형과 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210과 MtATPP4-1609 변이체의 잎으로부터 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Germany)을 사용하여 전체 RNA를 각각 추출하였다. 각각 1㎍의 RNA를 주형으로 하고, Superscript III Reverse Tanscriptase(INVITROGEN, USA)을 이용하여 65℃에서 5분; 50℃에서 60분; 및 70℃에서 15분의 조건으로 cDNA를 합성하였다. 이후, 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 하기 MtATPP4 유전자와 PCR 양성 대조구로 사용된 Tubulin 유전자에 대해 하기 [표 1]의 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 참고로 [표 1]은 MtATPP4 유전자와 tubulin 유전자 발현을 위한 프라이머 서열 및 서열번호에 관한 것이다.
PCR은 94℃에서 2분간 가열하여 주형 DNA를 변성시킨 후, 94℃에서 1분; 55℃에서 1분 30초; 및 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 총 30회 반복 수행한 다음, 72℃에서 15분간 최종 반응시켜 수행하였다. 이후, 1% 아가로스 겔 전기영동으로 PCR 산물을 확인하였으며, 그 결과는 도 3에 도시되었다.
유전자명 프라이머 서열 (서열번호)
MtATPP4 정방향 프라이머 5'-AGA TCT ATG TCG AAT CGA TGG TGG AGT G-3' (서열번호 9)
역방향 프라이머 5'-GGT GAC CTC AAT ATG GAG GTG GAT GTG GAC-3' (서열번호 10)
Tubulin 정방향 프라이머 5'-CTC AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3' (서열번호 11)
역방향 프라이머 5'-TCA CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3' (서열번호 12)
그 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이, 애기장대 야생형에는 MtATPP4 유전자의 발현이 나타나지 않지만 본 발명의 실시예에 따른 변이체 라인 모두에서 MtATPP4 유전자의 발현이 라인마다 약간의 차이는 있지만 나타남을 확인하였으며, 이러한 사실은 본 발명에 따른 변이체들이 MtATPP4 유전자가 도입되어 발현된 변이체임을 증명하고 있다. 이러한 변이체 중 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210는 높은 유전자 발현율을 가지는데 이러한 높은 유전자 발현율이 식물체의 노화 지연을 조절하는 것으로 판단되며, 이러한 유전자 발현의 차이는 변이체간의 노화 지연 현상과 다수확성 형질의 차이를 제공할 것으로 판단된다.
3) MtATPP4-발현 변이체의 다수확성 형질에 대한 특성 분석
MtATPP4 유전자의 발현이 식물체의 다수확성 및 생산성 증대 형질을 제공하는지를 정확히 분석하기 위하여 변이체 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210과 MtATPP4-1609에 대한 종자 수확량 등과 같은 생산성 증대 지표를 조사하여 애기장대 야생형과 비교해 보았다.
적용된 생산성 증대 지표는 식물의 키(height), 장각과(silique) 수(NTS), 생체량(FW), 생체건량(DW), 총 종자 무게(TSW), 총 종자 수(TNS), 그리고 1,000개의 종자 무게(1,000SW)이며, 결과는 라인별로 각 20개체의 평균값이다(도 4).
그 결과 도 4에서 보는 바와 같이, cytokinin-과발현 표현형질이 강하게 나타나는 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210을 포함한 모든 형질전환 호모라인(homo line)들은 야생형에 비하여 뚜렷한 다수확성 및 생산성 증대 형질을 가지는 것으로 나타났다. 모든 형질전환 라인들은 야생형에 비하여 150% 이상의 종자수확량을 나타냈으며, 특히 MtATPP4-33과 MtATPP4-44는 야생형에 비하여 약 180% 이상의 종자수확량을 나타냈다. 그런 반면 종자 1,000개의 무게는 변이체 라인과 야생형이 큰 차이가 없었다. 따라서 이러한 종자 생산의 증가는 변이체 라인들의 종자 크기와 관계없이 장각과 수의 증가에 기인하는 것으로 판단된다. 그리고 흥미로운 사실은 cytokinin-과발현 표현형을 가지는 MtATPP4-33과 MtATPP4-44를 제외한 대부분의 변이체 라인들은 야생형과 비슷한 수확 시기를 가진다는 점에서 본 유전자는 다수확성 작물 개발에 보다 많은 장점을 제공할 것이다. 이러한 사실로 미루어보아 MtATPP4 유전자의 발현이 다수확성을 포함한 생산성 증대의 농업 형질을 제공하고, 이러한 생산성 증대 농업 형질이 세대진전에 있어서도 지속적이고 안정적으로 제공된다는 점에서 MtATPP4 유전자는 필드에서 적용 가능한 다수확성 농업형질로 적용될 수 있을 것이다. 상기 변이체들의 생산성 증대에 대한 표현형적 차이는 정도의 차이는 있지만 선행연구에서 제안하였듯이 아마 MtATPP4 유전자의 발현 정도의 차이에 의해 나타나리라 판단된다.
4) MtATPP4-발현 변이체의 노화 지연 형질에 대한 특성 분석
MtATPP4-발현 변이체의 노화 지연에 대한 형질을 정확히 분석하기 위하여 세대진전을 통해 확보된 T3 호모 변이체 라인들을 대상으로 나이-의존적 노화 및 암-유도 노화에 대한 특성을 조사하였다. 나이-의존적 노화 지연 형질을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 MtATPP4-발현 변이체의 T3 호모 라인에서 자엽 생성 후 16일 이후부터 3-4번 좌엽(rosette leaf)을 매 4일마다 56일까지 잎의 표현형 관찰과 엽록소 함량을 측정하여 애기장대 야생형과 비교하였다. 이때 엽록소 함량은 Lichtenthaler와 Wellburn의 방법(Biochemical Society Transduction 603: 591~592, 1983)에 따라 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과 도 5에서 확인할 수 있듯이, 애기장대 야생형의 경우 자엽 생성 후 36일째부터 잎의 황화 현상이 급속히 진행되어 44일째 잎이 괴사(necrosis) 상태에 접어든 반면 변이체 라인 모두는 잎의 황화 및 괴사 시기가 야생형보다 지연됨을 볼 수 있었으며, 그 중 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210 변이체 라인은 44일부터 잎의 황화 현상이 진행되어 56일째 잎의 괴사 현상이 나타나 야생형에 비하여 강력한 노화 지연의 특성을 가지는 것으로 나타났다. 이는 MtATPP4 유전자가 노화에 있어서 강력한 negative regulator 역할을 담당하는 것으로 판단된다.
야생형과 변이체 라인의 나이-의존적 노화 동안 엽록소 함량 변화는 도 6에 제시하였다. 도 6에 도시된 바와 같이 야생형의 경우 엽록소 함량이 자엽 생성 후 16일 이후부터 지속적으로 감소하여 44일째 엽록소의 함량이 최소 수준에 도달하였으나, 변이체 라인들은 모두 야생형에 비하여 나이-의존적 노화 동안 엽록소 함량의 감소가 지연되었으며, 특히 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210 변이체 라인의 경우 엽록소 분해가 강력하게 지연되는 것으로 나타났다. 상기 결과로부터, MtATPP4-발현 변이체는 야생형에 비하여 잎의 수명이 훨씬 긴 표현형적 특징을 갖는 것으로 나타났으며, 이러한 노화 지연의 효과는 MtATPP4 유전자로 인하여 엽록소 분해와 같은 노화에 따른 생화학적 변화가 지연됨으로써 유발되는 것으로 보인다.
식물 노화를 유도하는 요인으로 알려진 암 처리에 대한 야생형 애기장대와 MtATPP4-발현 변이체 라인의 잎의 암-유도 노화 형질의 특성을 분석하기 위하여 T3 세대에서 발아 후 21일째 3-4번 좌엽을 분리하여 3mM MES 완충용액(2-[N-morpholino]-ethanesulfonic acid, pH 5.8)에 부유시킨 후, 암 상태를 유지하여 매 2일마다 표현형 관찰 및 잎 엽록소 함량 변화를 조사하여 야생형 애기장대와 MtATPP4-발현 변이체 라인들을 비교하였으며, 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
그 결과 도 7 및 도 8에서 확인할 수 있듯이, 애기장대 야생형의 경우 암 처리 후 4일 이후부터 잎의 황화 현상이 급속히 진행되어 6일째 잎이 괴사(necrosis) 상태에 접어든 반면, 변이체 라인들은 전체적으로 암-유도 노화 지연의 특징을 가지고 있었으며, 특히 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210 변이체 라인은 강력한 암-유도 노화 지연의 특징을 가지고 있었다(도 7). 이러한 결과는 엽록소 함량 변화에서도 같은 경향을 나타내었다(도 8). 따라서 MtATPP4-발현 변이체는 나이-의존적 노화와 마찬가지로 암-유도 노화에 있어서도 야생형에 비하여 잎의 노화 지연이라는 표현형적 특징을 갖는 것으로 나타났으며, 이러한 노화 지연의 효과는 MtATPP4 유전자에 의한 엽록소 함량 감소 등으로 표현되는 노화에 따른 생화학적 변화가 지연됨으로써 유발되는 것으로 보인다.
상기 결과를 종합해 보면, MtATPP4 유전자는 식물의 다수확성 형질뿐만 아니라 노화 지연의 형질을 제공하며, 이러한 형질의 복합성은 MtATPP4 유전자의 발현 차이에 기인하는 것으로 판단된다. 따라서 본 유전자의 유용 작물 적용은 다수확성과 같은 생산성 증대뿐만 아니라 노화 지연이라는 복합적인 농업형질의 측면에서 매우 가치가 높을 것으로 보인다.
5) MtATPP4-발현 변이체의 내재성 강화 형질에 대한 특성 분석
MtATPP4-발현 변이체에 대한 염(salt) 스트레스 저항성 분석은 3mM MES 용액에 150mM NaCl을 첨가하여 발아 후 25일 된 3, 4번 잎을 분리하여 부유시킨 후 3일 간격으로 6일 동안 잎의 표현형과 엽록소 함량 변화를 조사하여 염 스트레스에 대한 저항성 정도를 라인별로 각 15개체를 조사하였으며, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
그 결과 도 9 및 도 10에서 확인할 수 있듯이, 대부분의 변이체 라인들이 염 스트레스에 대한 저항성을 가지고 있었으며, 특히 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210 변이체는 6일 동안의 염 스트레스 처리 후에도 약 80% 이상의 엽록소 함량을 가지고 있어, 애기장대 야생형의 40%대의 엽록소 함량과는 엄청난 차이를 가졌다. 앞서 규명한 바와 같이 MtATPP4-33과 MtATPP4-1210 변이체 라인은 노화 지연에서도 강력한 형질을 나타내어, 염 스트레스 저항성 형질도 이와 연관이 있을 것으로 판단된다.
MtATPP4-발현 변이체의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 조사하기 위하여 3mM MES 용액에 4mM H2O2를 첨가하여 발아 후 25일 된 3, 4번 잎을 분리하여 부유시킨 후 매 3일 간격으로 6일 동안 표현형과 엽록소 함량 변화를 조사하여 H2O2 스트레스에 대한 저항성 정도를 라인별로 각 15개체를 조사하였으며, 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.
그 결과 도 11 및 도 12에서 확인할 수 있듯이, 애기장대 야생형에 비하여 MtATPP4-발현 변이체 라인에서 보다 높은 산화 스트레스 저항성을 가졌으며, 특히 MtATPP4-1210 변이체 라인에서는 6일 동안의 산화 스트레스 하에서도 약 70% 이상의 엽록소 함량을 보유하였다.
이러한 사실로 미루어보아 MtATPP4는 식물의 다수확성, 노화 지연, 그리고 염과 산화 스트레스 등에 대한 내재성 강화 형질을 제공하여 고부가 작물 개발에 있어 중요한 역할을 할 수 있으리라 판단되며, 앞서 제시한 노화 지연의 형질은 스트레스 저항성의 형질과 연관되는 것으로 판단된다.
6) 식물 호르몬 signaling에 있어서 MtATPP4 유전자의 역할
메디카고 트런카툴라에서 분리한 MtATPP4 유전자가 애기장대의 cytokinin 생합성에 관여하는지를 규명하기 위하여 애기장대 야생형과 본 발명에 따른 변이체 MtATPP4-33, MtATPP4-44, MtATPP4-74, MtATPP4-1210, 그리고 MtATPP4-1609를 대상으로 애기장대 cytokinin 생합성 유전자 IPT(isopentenyltransferase) 유전자군 중 IPT1(AT1G68460), IPT3(AT3G63110), IPT5(AT5G19040), 그리고 IPT7(AT3G23630) 유전자 4종의 발현을 조사하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다. 적용된 유전자 및 MtATPP4와 양성 대조구인 tubulin에 대한 RT-PCR용 primer 정보는 표 2에서 나타내었다. 참고로 [표 2]는 Cytokinin 생합성에 관여하는 IPT 유전자군, MtATPP4 유전자, 그리고 양성 대조구인 TUB 유전자 발현을 위한 프라이머 서열 및 서열번호를 정리한 것이다.
유전자명 프라이머 서열 (서열번호)
IPT1 정방향 프라이머 5’-CGC TAC TCG TTT CCC TTC AG-3’ (서열번호 13)
역방향 프라이머 5’-TCG ACC CAG ATG AAA CAA CA-3’ (서열번호 14)
IPT3 정방향 프라이머 5’-CAA ACA ACC ATT GCC TCC TT-3’ (서열번호 15)
역방향 프라이머 5’-GGA CGG ATT CAA TGG AGA GA-3’ (서열번호 16)
IPT5 정방향 프라이머 5’-CAC TCC TGA GGA AAG CCT TG-3’ (서열번호 17)
역방향 프라이머 5’-TCG AGC TCT GGA ACT CCA AT-3’ (서열번호 18)
IPT7 정방향 프라이머 5’-TTG GGT CGA CGT TTC CTT AC-3’ (서열번호 19)
역방향 프라이머 5’-GAC GAT TCT CTC GCT TGG TC-3’ (서열번호 20)
MtATPP4 정방향 프라이머 5'-AGA TCT ATG TCG AAT CGA TGG TGG AGT G-3' (서열번호 9)
역방향 프라이머 5'-GGT GAC CTC AAT ATG GAG GTG GAT GTG GAC-3' (서열번호 10)
Tubulin 정방향 프라이머 5'-CTC AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3' (서열번호 11)
역방향 프라이머 5'-TCA CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3' (서열번호 12)
그 결과, 도 13에서 확인할 수 있듯이, IPT5 유전자의 발현 변화는 본 발명에 따른 모든 변이체의 MtATPP4의 발현 변화와 같은 양상을 나타내는 반면, IPT1, IPT5 및 IPT7은 변이체에서 MtATPP4의 발현 변화와 같은 양상을 찾기 힘들었다. 이러한 사실로 미루어보아 MtATPP4 유전자가 IPT5 발현을 비례적으로 조절하여 cytokinin 생합성에 관여하는 것으로 판단된다.
본 발명자들은 앞서 제시한 결과로부터 애기장대 및 메디카고 트런카툴라의 AT-hook family gene이 cytokinin signaling에 있어서 cytokinin receptor인 HK(histidin kinase) gene family와 HP(histidine phosphotransfer protein) gene family의 발현을 조절하여 노화 지연 혹은/그리고 생산성 증대의 표현형적 특징을 제공한다고 보고한 바 있다(대한민국 공개특허 제10-2019-0068282; 대한민국 공개특허 제10-2018-0038717). 본 발명자들은 메디카고 트런카툴라에서 분리한 MtATPP4 유전자 또한 애기장대의 cytokinin signaling에 관여하는지를 규명하기 위하여 cytokinin signaling pathway 중 CLV1/WUS pathway에 관여하는 CLV1 유전자(receptor protein kinase CLAVATA1, AT1G75820)와 cytokinin receptor로서 기능을 가지는 histidine kinase 유전자군의 HK2(histidine kinase 2, AT5G35750), HK3(histidin kinase3, AT1G27320) 그리고 CRE1(HK4: histidine kinase 4, AT2G01830) 유전자의 발현을 애기장대 야생형과 변이체 라인을 대상으로 조사하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 조사 대상 유전자 및 양성 대조구인 tubulin에 대한 RT-PCR용 primer 정보는 표 3에 나타내었다. 참고로 [표 3]은 Cytokinin signaling pathway에서 CLV1 유전자, histidine kinase (HK) 유전자군, MtATPP4, 그리고 양성 대조구 TUB 유전자에 대한 RT-PCR용 프라이머 서열 및 서열번호를 정리한 것이다.
유전자명 프라이머 서열 (서열번호)
CLV1 정방향 프라이머 CLV1-RT-F : 5’- ACT TAC CTC TGT CTC CCT CA -3’ (서열번호 21)
역방향 프라이머 CLV1-RT-R : 5’- GAC CAC CTT TAG ATC CAT GC -3’ (서열번호 22)
HK3 정방향 프라이머 HK3-RT-F : 5’- CAA CAA CCA GCC CAT ATT CTC -3’ (서열번호 23)
역방향 프라이머 HK3-RT-R : 5’- TTC CAA TAC CCA ATC CCC TC -3’ (서열번호 24)
CRE1 정방향 프라이머 WOL-RT-F : 5’- CTG AGG AGC AGT CAT TAT CG -3’ (서열번호 25)
역방향 프라이머 WOL-RT-R : 5’- GGT TTT GTT GGG AGA GGA GA -3’ (서열번호 26)
HK2 정방향 프라이머 HK2-RT-F : 5’- GTA TGG CTC AGA AAT TGG GG -3’ (서열번호 27)
역방향 프라이머 HK2-RT-R : 5’- GCC AGA GAG GAG AGA TGA AA -3’ (서열번호 28)
MtATPP4 정방향 프라이머 5'-AGA TCT ATG TCG AAT CGA TGG TGG AGT G-3' (서열번호 9)
역방향 프라이머 5'-GGT GAC CTC AAT ATG GAG GTG GAT GTG GAC-3' (서열번호 10)
Tubulin 정방향 프라이머 5'-CTC AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3' (서열번호 11)
역방향 프라이머 5'-TCA CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3' (서열번호 12)
그 결과 도 14에서 확인할 수 있듯이, CLV1 유전자의 발현은 야생형과 비교하여 본 발명에 따른 변이체 모두에서 큰 차이를 가지지 않았다. 이러한 결과는 MtATPP4 유전자가 cytokinin pathway 중 CLV1/WUS pathway에는 크게 관여하지 않는다는 것을 의미한다. 한편, CRE1 유전자의 발현은 MtATPP4 유전자 발현 정도와 비례하여 본 발명에 따른 변이체에서 발현하였으며, HK2 또한 유사한 발현 양상을 나타낸 반면, HK3 유전자의 발현은 야생형과 비교하여 변이체 모두에서 이러한 경향성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 MtATPP4 유전자가 cytokinin receptor 중 CRE1와 HK2 유전자, 특히 CRE1의 발현에 비례적으로 관여한다는 것을 의미한다. 따라서 MtATPP4 유전자는 IPT5 유전자의 비례적 발현 조절을 통하여 cytokinin 생합성에 관여하고, cytokinin receptor 중 CRE1 유전자의 비례적 발현 조절을 통하여 cytokinin signaling에 관여하여 식물의 다수확성 및 노화 지연 형질을 제공하는 것으로 판단된다. 한편 다수확성과 노화 지연에 대한 상관관계는 좀 더 세밀한 분자생물학적 분석이 필요할 것으로 보인다.
본 발명자들은 애기장대 야생형과 본 발명에 따른 변이체를 대상으로 이러한 cytokinin signaling에 대한 정확한 분석을 위하여 다음 단계인 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군의 AHP1, AHP2, AHP3, AHP4, AHP5, 그리고 AHP6 유전자의 발현 양상 또한 조사하였다. 상기 유전자의 발현 양상은 RT-PCR을 통하여 분석하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 이때 양성 대조구로는 tubulin을 사용하였고, 사용된 프라이머는 표 4에서 나타내었다. 참고로 [표 4]는 Cytokinin signaling pathway에서 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군, MtATPP4, 그리고 양성 대조구 TUB 유전자에 대한 RT-PCR용 프라이머 서열 및 서열번호를 정리한 것이다.
유전자명 프라이머 서열(서열번호)
AHP1
(AT3G21510)		 정방향 프라이머 AHP1-RT-F: 5’- ATGGATTTGGTTCAGAAGCAGAA -3’ (서열번호 29)
역방향
프라이머		 AHP1-RT-R: 5’- TCAAAATCCGAGTTCGACGGCC -3’ (서열번호 30)
AHP2
(AT3G29350)		 정방향 프라이머 AHP2-RT-F: 5’- ATGGACGCTCTCATTGCTCAGC -3’ (서열번호 31)
역방향
프라이머		 AHP2-RT-R: 5’- TTA GTT AAT ATC CAC TTG AGG AAC -3' (서열번호 32)
AHP3
(AT5G39340)		 정방향 프라이머 AHP3-RT-F: 5’- GGACACACTCATTGCTCAGT -3’ (서열번호 33)
역방향
프라이머		 AHP3-RT-R: 5’- CTGCAAACATCTCACACACC -3’ (서열번호 34)
AHP4
(AT3G16360)		 정방향 프라이머 AHP4-RT-F: 5’- ATGCAGAGGCAAGTGGCACTCA -3’ (서열번호 35)
역방향
프라이머		 AHP4-RT-R: 5’- TTACTTGGGCCTACGTGCTGTC -3’ (서열번호 36)
AHP5
(AT1G03430)		 정방향 프라이머 AHP5-RT-F: 5'- GGTAGTAGCTCCAGTGTCG -3' (서열번호 37)
역방향
프라이머		 AHP5-RT-R: 5’- CTAATTTATATCCACTTGAGGAAT-3’ (서열번호 (38)
AHP6
(AT1G80100)		 정방향 프라이머 AHP6-3UTR-F: 5'- CAAGCCGACATCAACCGGCTC -3' (서열번호 39)
역방향
프라이머		 AHP6-3UTR-R: 5'- AGGGTTTCGCTTCGGTAGCTT -3' (서열번호 40)
MtATPP4 정방향 프라이머 5'-AGA TCT ATG TCG AAT CGA TGG TGG AGT G-3' (서열번호 9)
역방향
프라이머		 5'-GGT GAC CTC AAT ATG GAG GTG GAT GTG GAC-3' (서열번호 10)
Tubulin 정방향 프라이머 5'-CTC AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3' (서열번호 11)
역방향
프라이머		 5'-TCA CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3' (서열번호 12)
그 결과, 도 15에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 변이체의 MtATPP4 유전자의 발현량과 비례적으로 발현한 유전자는 AHP1인 반면, 다른 AHP 유전자들은 변이체에서 MtATPP4 유전자의 발현과 같은 양상을 나타내지 않았다. 이러한 사실은 MtATPP4 유전자 발현은 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군 중 AHP1 유전자의 발현을 비례적으로 조절한다는 것을 시사한다.
이러한 분석을 통하여 본 발명자들은 다음과 같은 가설을 세울 수 있었다: MtATPP4는 1) cytokinin biosynthesis 유전자 중 IPT5 유전자의 발현을 비례적으로 조절, 2) cytokinin receptor 유전자 중 CRE1 유전자의 발현을 비례적으로 조절, 그리고 3) histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군 중 AHP1 유전자 발현을 비례적으로 조절하여 식물의 다수확성, 바이오매스 증가와 같은 생산성 증대와 노화 지연, 그리고/혹은 내재성 강화 형질을 제공한다.
최근, Lee와 Seo(2017)는 애기장대에서 AT-hook motif를 가진 유전자인 AHL29는 YUC 유전자 발현 조절을 통해 auxin 생합성에 관여한다고 보고하고 있다. 우리는 메디카고 트런카툴라에서 분리한 MtATPP4 유전자가 cytokinin signaling뿐만 아니라 auxin 생합성에도 관여하는지를 규명하기 위하여 애기장대의 auxin 생합성에서 중요한 역할을 담당하는 YUC 유전자 10종에 대한 유전자 발현 양상을 애기장대 야생형과 변이체 라인을 대상으로 조사하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 적용된 유전자 및 MtATPP4와 양성 대조구인 tubulin에 대한 RT-PCR용 primer 정보는 표 5에서 나타내었다.
참고로 [표 5]는 애기장대 auxin 생합성에서 YUC 유전자군, MtATPP4, 그리고 양성 대조구 TUB 유전자에 대한 RT-PCR용 프라이머 서열 및 서열번호를 정리한 것이다.
유전자명 프라이머 서열 (서열번호)
YUC1
(AT4G32540)		 정방향 프라이머 YUC1-F: 5'-GTCCGACATAACGCATCTCC-3’ (서열번호 41)
역방향
프라이머		 YUC1-R: 5'-CAATCCTTTCCCTCCTCTCC-3‘ (서열번호 42)
YUC2
(AT4G13260)		 정방향 프라이머 YUC2-F: 5'-CGTTCCACTTGCATAGCGTC-3‘ (서열번호 43)
역방향
프라이머		 YUC2-R: 5'-CCACATCCTACAACCAAAATCTTC-3' (서열번호 44)
YUC3
(AT1G04610)		 정방향 프라이머 YUC3-F: 5'-TCTCAAACTCCATCTACCTAAACAG-3' (서열번호 45)
역방향
프라이머		 YUC3-R: 5'-CACATCCCACCACCAAAACC-3' (서열번호 46)
YUC4
(AT5G11320)		 정방향 프라이머 YUC4-F: 5'-AACCTACTCAAATCTTCGTTCC-3' (서열번호 47)
역방향
프라이머		 YUC4-R: 5'-CACAACCAACCACCAAAACC-3' (서열번호 48)
YUC5 (AT5G43890z) 정방향 프라이머 YUC5-F: 5'-GAGCAGATTGCATAGCTTCAC-3' (서열번호 49)
역방향
프라이머		 YUC5-R: 5'-ACATCCGACGACAAGAACAC-3' (서열번호 50)
YUC6
(AT5G25620)		 정방향 프라이머 YUC6-F: 5'-GTAAACTAGCACATGACCACC-3 (서열번호 51)
역방향
프라이머		 YUC6-R: 5'-AAACTTATCCATCCCCTCAAAC-3 (서열번호 52)
YUC7
(AT2G33230)		 정방향 프라이머 YUC7-F: 5'-TGAAACGCCAAGAAGTTCC-3 (서열번호 53)
역방향
프라이머		 YUC7-R: 5'-ACCACCAAAATCTTCTAAACCC-3' (서열번호 54)
YUC8
(AT4G28720)		 정방향 프라이머 YUC8-F: 5'-GCAAACCATTTCGCTAAGCC-3' (서열번호 55)
역방향
프라이머		 YUC8-R: 5'-CCTGTCCTTCCTTTCCAACC-3' (서열번호 56)
YUC10 (AT1G48910) 정방향 프라이머 YUC10-F: 5'-ACCAACACTCAATCCCAAAC-3' (서열번호 57)
역방향
프라이머		 YUC10-R: 5'-GCATAATCTCTCCCCCAAAAG-3' (서열번호 58)
YUC11 (AT1G21430) 정방향 프라이머 YUC11-F: 5'-CCCTCAAACACTCCTACCTTC-3' (서열번호 59)
역방향
프라이머		 YUC11-R: 5'-GTCTTCCCTTCTATACGCTTAATC-3' (서열번호 60)
MtATPP4 정방향 프라이머 5'-AGA TCT ATG TCG AAT CGA TGG TGG AGT G-3' (서열번호 9)
역방향
프라이머		 5'-GGT GAC CTC AAT ATG GAG GTG GAT GTG GAC-3' (서열번호 10)
Tubulin 정방향 프라이머 5'-CTC AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3' (서열번호 11)
역방향
프라이머		 5'-TCA CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3' (서열번호 12)
그 결과 애기장대 대조구 및 본 발명에 따른 변이체에서 YUC2, YUC3, YUC5, YUC6, YUC7, 그리고 YUC8의 발현을 확인할 수 있어서, 이들 유전자에 대한 발현을 분석하였다. 흥미롭게도 애기장대 야생형과 변이체에서 YUC2와 YUC3 유전자의 발현이 정도의 차이는 있지만 MtATPP4 유전자의 발현 양상과 비례적으로 나타남을 확인할 수 있었던 반면, 다른 YUC 유전자들은 그 연관성을 찾기가 힘들었다. 이러한 사실로 미루어보아 MtATPP4 유전자는 YUC 유전자군에서 YUC2와 YUC3의 발현을 비례적으로 조절하여 옥신 생합성에 관여하는 것으로 보인다.
실시예 3: MtATPP3 유전자에 대한 센스 구성체(construct)가 도입된 형질전환 애기장대의 제조 및 특성 분석
1) MtATPP3 유전자에 대한 센스 구성체가 도입된 형질전환 애기장대의 제조
상기 유전자도 앞서 MtATPP4와 마찬가지로 식물의 다수성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 제공하는지를 확인하기 위하여 MtATPP3 유전자가 센스 방향으로 도입된 형질전환 애기장대를 제조하였다.
제한효소 PacI의 서열이 포함된 정방향 프라이머(서열번호 7) 및 제한효소 AscI의 서열이 포함된 역방향 프라이머(서열번호 8)를 합성하고, 메디카고 트런카툴라의 cDNA로부터 PCR을 이용하여 MtATPP3 cDNA를 증폭하였다. 상기 DNA를 제한효소 PacI과 AscI으로 절단하고, 유도성 프로모터(inducible promoter)인 SEN1 프로모터의 조절을 받도록 제작한 pSEN 벡터에 센스 방향으로 클로닝하여 pSEN-MtATPP3 재조합 벡터를 제작하였다.
도 17은 pSEN 벡터에 MtATPP3 유전자가 센스 방향으로 도입된 pSEN-MtATPP3 재조합 벡터를 도시한 모식도이다.
상기 pSEN-MtATPP3 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스에 일랙트로포레이션 방법을 이용하여 도입한 후, 실시예 2-1)의 형질전환 방법을 통하여 형질전환된 애기장대를 생장시켜 종자(T1)를 수확하였다. 대조군으로는 형질전환되지 않은 야생형(wild type) 애기장대 또는 MtATPP3 유전자가 포함되지 않은 벡터(pCSEN 벡터)만으로 형질전환된 애기장대를 사용하였다.
2) T 3 형질전환 애기장대의 특성 분석
상기 실시예 3-1)을 통해 형질전환된 애기장대에서 수확한 종자는 0.1% 바스타(Basta) 제초제 처리를 통하여 각 화분에서 형질전환 애기장대를 선별하였다. pSEN-MtATPP3 벡터로 형질전환된 T1 애기장대는 대조군(pSEN 벡터만으로 형질전환된 애기장대 혹은 야생형 애기장대)과 그들의 표현형을 비교하여 볼 때, MtATPP4-발현 변이체의 경우와 마찬가지로 MtATPP3-발현 변이체들은 뚜렷한 다수확성 및 생산성 증대 형질을 보였다.
이러한 형질전환 애기장대의 표현형 형질을 정확히 확인하기 위하여 T3 형질전환 라인의 표현형을 조사하였다. 선별된 애기장대 T3 형질전환 라인들의 표현형 확인은 발아 후 50일째와 70일째 수행하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 확인할 수 있듯이, pSEN-MtATPP3 구성체를 가지고 있는 MtATPP3-59, MtATPP3-64, MtATPP3-1102, MtATPP3-1403, MtATPP3-2001과 MtATPP3-2003 변이체 라인 모두는 애기장대 야생형(Col-0)와 비교하여 볼 때, 식물체의 다수확성 형질뿐만 아니라 바이오매스 증대와 같은 생산성 증대 형질이 뚜렷하게 나타났으며, 이러한 형질은 변이체 라인마다 약간의 차이를 가지는데 이러한 차이는 아마 본 유전자의 발현 정도에 기인하는 것으로 판단된다.
3) MtATPP3-발현 변이체의 다수확성 형질에 대한 특성 분석
MtATPP3-발현 변이체가 다수확성 및 생산성 증대 형질을 가지는지를 정확히 분석하기 위하여 본 발명에 따른 변이체 MtATPP3-59, MtATPP3-64, MtATPP3-1102, MtATPP3-1403, MtATPP3-2001과 MtATPP3-2003에 대한 종자수확량 등과 같은 생산성 증대 지표를 적용하여 애기장대 야생형과 비교하였으며, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 적용된 생산성 증대 지표는 식물의 키(height), 장각과(silique) 수(NTS), 생체량(FW), 생체건량(DW), 총 종자 무게(TSW), 총 종자 수(TNS), 그리고 1,000개의 종자 무게(1,000SW)이며, 결과는 라인별로 각 20개체의 평균값이다.
그 결과 도 19에서 확인할 수 있듯이, 모든 형질전환 라인들은 야생형에 비하여 뚜렷한 다수확성 형질을 가지는 것으로 나타났다. 모든 형질전환 라인들은 야생형에 비하여 118% 이상의 종자수확량을 나타냈으며, 특히 형질전환 라인 중 MtATPP3-59와 MtATPP3-2001은 야생형에 비하여 약 135% 이상의 종자수확량을 나타냈다. 그런 반면 종자 1,000개의 무게는 변이체 라인과 야생형이 큰 차이가 없었다. 상기 변이체들의 생산성 증대에 대한 표현형적 차이는 정도의 차이는 있지만 선행연구에서 언급하였듯이 아마 MtATPP3 유전자의 발현 정도의 차이에 의해 나타나리라 판단된다.
4) MtATPP3-발현 변이체의 노화 지연 형질에 대한 특성 분석
MtATPP3-발현 변이체의 노화 지연에 대한 형질을 정확히 분석하기 위하여 세대진전을 통해 확보된 T3 호모 변이체 라인들을 대상으로 나이-의존적 노화 및 암-유도 노화에 대한 특성을 조사하였으며, 그 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.
그 결과 도 20에서 확인할 수 있듯이, 애기장대 야생형의 경우 자엽 생성 후 36일째부터 잎의 황화 현상이 급속히 진행되어 44일부터 잎이 괴사(necrosis) 상태에 접어들었다. 반면 본 발명에 따른 변이체 라인 모두는 잎의 황화 현상 및 괴사 시점이 야생형보다 지연됨을 볼 수 있었으며, 그 중 MtATPP3-1403, MtATPP3-64와 MtATPP3-2001 변이체 라인은 48일째에도 엽록소 함량이 40% 이상을 유지하고 있었다.
또한 도 21에서 확인할 수 있듯이, 야생형 애기장대와 MtATPP3-발현 변이체 라인의 잎의 암-유도 노화 형질 특성을 분석한 결과, 나이-의존적 노화와 마찬가지로 본 발명에 따른 변이체 라인들은 모두 야생형에 비하여 암-유도 노화 동안 엽록소 분해가 감소하였으며, 특히 MtATPP3-64와 MtATPP3-1102 변이체 라인은 강력한 암-유도 노화 지연의 특징을 가지고 있었다.
따라서 MtATPP3-발현 변이체, 특히 MtATPP3-64 변이체 라인은 나이-의존적 노화와 마찬가지로 암-유도 노화에 있어서도 야생형에 비해 잎의 수명이 훨씬 긴 표현형을 갖는 것으로 나타났으며, 이러한 수명연장의 효과는 MtATPP3 유전자에 의한 엽록소 함량 감소로 표현되는 노화에 따른 생화학적 변화가 지연됨으로써 유발되는 것으로 보인다.
5) MtATPP3-발현 변이체의 내재성 강화 형질에 대한 특성 분석
MtATPP3-발현 변이체에 대한 염(salt) 스트레스 저항성 분석은 3mM MES 용액에 150mM NaCl을 첨가하여 발아 후 25일 된 3, 4번 잎을 분리하여 부유시킨 후 3일 간격으로 6일 동안 잎의 표현형과 엽록소 함량 변화를 조사하여 염 스트레스에 대한 저항성 정도를 라인별로 각 15개체를 조사하였으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다.
그 결과 도 22에서 확인할 수 있듯이, 대부분의 본 발명에 따른 변이체 라인들이 염 스트레스에 대한 저항성을 가지고 있었으며, 특히 MtATPP3-64 발현 변이체는 4일 동안의 염 스트레스 처리 후에도 약 60% 이상의 엽록소 함량을 가지고 있어, 애기장대 야생형의 20%대의 엽록소 함량과는 엄청난 차이가 나타내었다. 앞서 규명한 바와 같이 MtATPP3-64 발현 변이체 라인은 노화 지연에서도 강력한 형질을 나타내어, 염 스트레스 저항성 형질도 이와 연관이 있을 것으로 판단된다.
MtATPP3-발현 변이체의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 조사하기 위하여 3mM MES 용액에 4mM H2O2를 첨가하여 발아 후 25일 된 3, 4번 잎을 분리하여 부유시킨 후 매 3일 간격으로 6일 동안 표현형과 엽록소 함량 변화를 조사하여 H2O2 스트레스에 대한 저항성 정도를 라인별로 각 15개체를 조사하였으며, 그 결과를 도 23에 나타내었다.
그 결과 도 23에서 확인할 수 있듯이, 염 스트레스 저항성 결과와 마찬가지로 애기장대 야생형에 비하여 MtATPP3-발현 변이체 라인에서 보다 높은 산화 스트레스 저항성을 가졌으며, 특히 MtATPP3-64 발현 변이체 라인에서는 4일 동안의 산화 스트레스 하에서도 약 60% 이상의 엽록소 함량을 보유하였다.
이러한 사실로 미루어보아 MtATPP3은 식물의 다수확성, 노화 지연, 그리고 염과 산화 스트레스와 같은 다양한 스트레스에 대한 내재성 강화 형질을 제공하여 고부가 작물 개발에 있어 중요한 역할을 할 수 있으리라 판단되며, 노화 지연의 형질은 스트레스 저항성의 형질과 연관되는 것으로 보인다.
<110> Pharmncell Inc. <120> proteins conferred high-yielding, delaying senescence and enhancing stress tolerance in plants, the gene encoding the protein and those uses <130> JDP21032/PHC <160> 60 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MtATPP4 <400> 1 atgtcgaatc gatggtggag tggaagacaa acggaggcga acccggtcga aggagagaac 60 cgaaacggtc caacccggat cattttacga agagagtcac gaagggcaag taacggtagc 120 gttaacggca acgttaccgg cggtaacgtt actccaacga ggagtaacac cagcaatacc 180 ggcaccggca acagcaacgg ccatgttaac gacgaacttg agaacagcaa tggccgttcc 240 ggcgaccaga ccgccagaag tggacgccgg ccacgtggac gtccgccggg gtcgaagaac 300 aagccaaaac caccgctgat gatcacaaaa gaaactccaa acgctcttag cagcgttatc 360 ttggaagtcg ccaacggagc cgacatcgcc catagcattt catcctatgc taaccgtcgc 420 caccgtggtg tttcagttct cagcggcact ggttatgtta ccaacgtgac actccggcaa 480 gataatgctc cgggaggaat gatatctctt caagggaggt gtcacattct gtcactcagc 540 ggtgcttttt tgcctccgcc ttcgccgcct gatgctactg gactgactgt ttatcttgct 600 ggaggtcagg ggcaggttgt tggaggattg gttatcgggt cgttgattgc gtcggggccg 660 gtgatggttg ttgctgcaac ttttgctaat gctacttatg aaaggttgcc tttggaagat 720 gaagatgaag gagatgaaga gaattttcaa gaggttgata acattaatct tgttgttaac 780 aatggtaatc atgttgctaa tggtgatggt ggttctggtt ctctttctgg gtcagcaagt 840 ggaagtggtg gtggcggtgg tggtggtgca acttctcatg gattaggtga atacagtttt 900 aatccaagta tgattcaaaa tggaaatgat agtggacatg gacacggaca cgatgtgttc 960 tggcgtccac atccacctcc atattga 987 <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MtATPP4 <400> 2 Met Ser Asn Arg Trp Trp Ser Gly Arg Gln Thr Glu Ala Asn Pro Val 1 5 10 15 Glu Gly Glu Asn Arg Asn Gly Pro Thr Arg Ile Ile Leu Arg Arg Glu 20 25 30 Ser Arg Arg Ala Ser Asn Gly Ser Val Asn Gly Asn Val Thr Gly Gly 35 40 45 Asn Val Thr Pro Thr Arg Ser Asn Thr Ser Asn Thr Gly Thr Gly Asn 50 55 60 Ser Asn Gly His Val Asn Asp Glu Leu Glu Asn Ser Asn Gly Arg Ser 65 70 75 80 Gly Asp Gln Thr Ala Arg Ser Gly Arg Arg Pro Arg Gly Arg Pro Pro 85 90 95 Gly Ser Lys Asn Lys Pro Lys Pro Pro Leu Met Ile Thr Lys Glu Thr 100 105 110 Pro Asn Ala Leu Ser Ser Val Ile Leu Glu Val Ala Asn Gly Ala Asp 115 120 125 Ile Ala His Ser Ile Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg His Arg Gly Val 130 135 140 Ser Val Leu Ser Gly Thr Gly Tyr Val Thr Asn Val Thr Leu Arg Gln 145 150 155 160 Asp Asn Ala Pro Gly Gly Met Ile Ser Leu Gln Gly Arg Cys His Ile 165 170 175 Leu Ser Leu Ser Gly Ala Phe Leu Pro Pro Pro Ser Pro Pro Asp Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Thr Val Tyr Leu Ala Gly Gly Gln Gly Gln Val Val Gly 195 200 205 Gly Leu Val Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ser Gly Pro Val Met Val Val 210 215 220 Ala Ala Thr Phe Ala Asn Ala Thr Tyr Glu Arg Leu Pro Leu Glu Asp 225 230 235 240 Glu Asp Glu Gly Asp Glu Glu Asn Phe Gln Glu Val Asp Asn Ile Asn 245 250 255 Leu Val Val Asn Asn Gly Asn His Val Ala Asn Gly Asp Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ala Thr Ser His Gly Leu Gly Glu Tyr Ser Phe Asn Pro Ser Met 290 295 300 Ile Gln Asn Gly Asn Asp Ser Gly His Gly His Gly His Asp Val Phe 305 310 315 320 Trp Arg Pro His Pro Pro Pro Tyr 325 <210> 3 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MtATPP3 <400> 3 atggatcaaa taacatcaca tggacattca cttcctccac ctttccacac agcaagagat 60 cttcatcttc accatcaaca ccaacagcag caacaacaac aacaacacca tcaattccac 120 actttacagc agcagcaaca aaccacagat caagatgaac aaagcggaag tagcagcggc 180 ggtggactca acctcacaaa ccgagaagaa aacagcaaca acaagttcag cacagatttt 240 agccccaagt tagaatccgg aggaggtggt tccggtggcg acaccgattc aatgacaaga 300 agaccaagag gaagaccagc tggatccaaa aacaaaccaa aaccaccgat tatcatcaca 360 cgtgacagcg caaacgcctt gaaaactcac gtgatggaag ttgcagacgg ttgtgacgtt 420 gttgaaagtg tcaacaactt cgctagacgc cgtcaaagag gcgtttgcat catgagtggg 480 acagggacgg ttacaaacgt gacactaagg caaccggctt ctcctggagc tgttgttaca 540 cttcatggaa ggttcgagat tctttcgctg gctggatcgt ttcttccacc acctgctccg 600 cccgctgctt ctggtttgac catatattta gcgggcggac aagggcaggt tgttggtgga 660 agtgttgttg gtgctttgat tgcttctgga cctgttgtta ttatgtctgc ttcttttagt 720 aacgctgctt atgagagact tcctttggaa gatgatgatg gttcttctat tcaacaactt 780 caaggtggtg gtggtggtgg ttctccaagt ggtggtggcg gtggtgttca gcaacaacaa 840 caacagcttt taggagattc aactgctcca ctttttcaag ctatgcatcc tcctaattct 900 aatcctaatc ttaatcctaa tcttctcggt cagatgcctt ctgataattt ctggccaacc 960 gggcgttctc cgtattga 978 <210> 4 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MtATPP3 <400> 4 Met Asp Gln Ile Thr Ser His Gly His Ser Leu Pro Pro Pro Phe His 1 5 10 15 Thr Ala Arg Asp Leu His Leu His His Gln His Gln Gln Gln Gln Gln 20 25 30 Gln Gln Gln His His Gln Phe His Thr Leu Gln Gln Gln Gln Gln Thr 35 40 45 Thr Asp Gln Asp Glu Gln Ser Gly Ser Ser Ser Gly Gly Gly Leu Asn 50 55 60 Leu Thr Asn Arg Glu Glu Asn Ser Asn Asn Lys Phe Ser Thr Asp Phe 65 70 75 80 Ser Pro Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Thr Asp 85 90 95 Ser Met Thr Arg Arg Pro Arg Gly Arg Pro Ala Gly Ser Lys Asn Lys 100 105 110 Pro Lys Pro Pro Ile Ile Ile Thr Arg Asp Ser Ala Asn Ala Leu Lys 115 120 125 Thr His Val Met Glu Val Ala Asp Gly Cys Asp Val Val Glu Ser Val 130 135 140 Asn Asn Phe Ala Arg Arg Arg Gln Arg Gly Val Cys Ile Met Ser Gly 145 150 155 160 Thr Gly Thr Val Thr Asn Val Thr Leu Arg Gln Pro Ala Ser Pro Gly 165 170 175 Ala Val Val Thr Leu His Gly Arg Phe Glu Ile Leu Ser Leu Ala Gly 180 185 190 Ser Phe Leu Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ser Gly Leu Thr Ile 195 200 205 Tyr Leu Ala Gly Gly Gln Gly Gln Val Val Gly Gly Ser Val Val Gly 210 215 220 Ala Leu Ile Ala Ser Gly Pro Val Val Ile Met Ser Ala Ser Phe Ser 225 230 235 240 Asn Ala Ala Tyr Glu Arg Leu Pro Leu Glu Asp Asp Asp Gly Ser Ser 245 250 255 Ile Gln Gln Leu Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Val Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Leu Gly Asp Ser Thr 275 280 285 Ala Pro Leu Phe Gln Ala Met His Pro Pro Asn Ser Asn Pro Asn Leu 290 295 300 Asn Pro Asn Leu Leu Gly Gln Met Pro Ser Asp Asn Phe Trp Pro Thr 305 310 315 320 Gly Arg Ser Pro Tyr 325 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglII/MTR5g080580-F(Forward primer) <400> 5 agatctatgt cgaatcgatg gtggagtg 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BstEII/MTR5g080580-R(Reverse primer) <400> 6 ggtgacctca atatggaggt ggatgtggac 30 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PacI/MTR5g011520-F(Forward primer) <400> 7 ttaattaaat ggatcaaata acatcacatg ga 32 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AscI/MTR5g011520-R(Reverse primer) <400> 8 ggcgcgcctc aatacggaga acgcccggtt 30 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MtATPP4 Forward primer <400> 9 agatctatgt cgaatcgatg gtggagtg 28 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MtATPP4 Reverse primer <400> 10 ggtgacctca atatggaggt ggatgtggac 30 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubulin Forward primer <400> 11 ctcaagaggt tctcagcagt a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubulin Reverse primer <400> 12 tcaccttctt catccgcagt t 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT1 Forward primer <400> 13 cgctactcgt ttcccttcag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT1 Reverse primer <400> 14 tcgacccaga tgaaacaaca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT3 Forward primer <400> 15 caaacaacca ttgcctcctt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT3 Reverse primer <400> 16 ggacggattc aatggagaga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT5 Forward primer <400> 17 cactcctgag gaaagccttg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT5 Reverse primer <400> 18 tcgagctctg gaactccaat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT7 Forward primer <400> 19 ttgggtcgac gtttccttac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IPT7 Reverse primer <400> 20 gacgattctc tcgcttggtc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLV1 Forward primer <400> 21 acttacctct gtctccctca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CLV1 Reverse primer <400> 22 gaccaccttt agatccatgc 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK3 Forward primer <400> 23 caacaaccag cccatattct c 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK3 Reverse primer <400> 24 ttccaatacc caatcccctc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE1 Forward primer <400> 25 ctgaggagca gtcattatcg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRE1 Reverse primer <400> 26 ggttttgttg ggagaggaga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Forward primer <400> 27 gtatggctca gaaattgggg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HK2 Reverse primer <400> 28 gccagagagg agagatgaaa 20 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP1 Forward primer <400> 29 atggatttgg ttcagaagca gaa 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP1 Reverse primer <400> 30 tcaaaatccg agttcgacgg cc 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP2 Forward primer <400> 31 atggacgctc tcattgctca gc 22 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP2 Reverse primer <400> 32 ttagttaata tccacttgag gaac 24 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP3 Forward primer <400> 33 ggacacactc attgctcagt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP3 Reverse primer <400> 34 ctgcaaacat ctcacacacc 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP4 Forward primer <400> 35 atgcagaggc aagtggcact ca 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP4 Reverse primer <400> 36 ttacttgggc ctacgtgctg tc 22 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP5 Forward primer <400> 37 ggtagtagct ccagtgtcg 19 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP5 Reverse primer <400> 38 ctaatttata tccacttgag gaat 24 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP6 Forward primer <400> 39 caagccgaca tcaaccggct c 21 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHP6 Reverse primer <400> 40 atggacgctc tcattgctca gc 22 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC1 Forward primer <400> 41 gtccgacata acgcatctcc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC1 Reverse primer <400> 42 caatcctttc cctcctctcc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC2 Forward primer <400> 43 cgttccactt gcatagcgtc 20 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC2 Reverse primer <400> 44 ccacatccta caaccaaaat cttc 24 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC3 Forward primer <400> 45 tctcaaactc catctaccta aacag 25 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC3 Reverse primer <400> 46 cacatcccac caccaaaacc 20 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC4 Forward primer <400> 47 aacctactca aatcttcgtt cc 22 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC4 Reverse primer <400> 48 cacaaccaac caccaaaacc 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC5 Forward primer <400> 49 gagcagattg catagcttca c 21 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC5 Reverse primer <400> 50 acatccgacg acaagaacac 20 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC6 Forward primer <400> 51 gtaaactagc acatgaccac c 21 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC6 Reverse primer <400> 52 aaacttatcc atcccctcaa ac 22 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC7 Forward primer <400> 53 tgaaacgcca agaagttcc 19 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC7 Reverse primer <400> 54 accaccaaaa tcttctaaac cc 22 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC8 Forward primer <400> 55 gcaaaccatt tcgctaagcc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC8 Reverse primer <400> 56 cctgtccttc ctttccaacc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC10 Forward primer <400> 57 cctgtccttc ctttccaacc 20 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC10 Reverse primer <400> 58 gcataatctc tcccccaaaa g 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC11 Forward primer <400> 59 ccctcaaaca ctcctacctt c 21 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YUC11 Reverse primer <400> 60 gtcttccctt ctatacgctt aatc 24

Claims (12)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 식물의 다수확성 기능을 갖는 MtATPP4 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 MtATPP4 단백질은 노화 지연, 내재성 강화 또는 두 가지 모두의 기능을 더 갖는 것을 특징으로 하는 MtATPP4 단백질.
  3. 제1항의 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP4 유전자.
  4. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  5. 제4항에 따른 재조합 발현 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에 도입시켜 형질전환 시키는 제1 단계;
    상기 제1 단계에서 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 배양하여 세포를 수확하는 제2 단계;
    상기 제2 단계의 세포를 식물체에 형질전환하는 제3 단계; 및
    다수확성, 노화지연 및 내재성 강화로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 식물체를 선별하는 단계;를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  6. 제4항의 재조합 발현 벡터가 식물체에 도입되어 형질전환된 형질전환 식물체.
  7. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 식물의 다수확성 기능을 갖는 MtATPP3 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 MtATPP3 단백질은 노화 지연, 내재성 강화 또는 두 가지 모두의 기능을 더 갖는 것을 특징으로 하는 MtATPP3 단백질.
  9. 제7항의 단백질을 암호화하는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 MtATPP3 유전자.
  10. 제9항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  11. 제10항에 따른 재조합 발현 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에 도입시켜 형질전환 시키는 제1 단계;
    상기 제1 단계에서 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 배양하여 세포를 수확하는 제2 단계;
    상기 제2 단계의 세포를 식물체에 형질전환하는 제3 단계; 및
    다수확성, 노화지연 및 내재성 강화 특성을 갖는 식물체를 선별하는 단계;를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법.
  12. 제10항의 재조합 발현벡터가 식물체에 도입되어 형질전환된 형질전환 식물체.
KR1020210105509A 2021-08-10 2021-08-10 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 KR20230023402A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210105509A KR20230023402A (ko) 2021-08-10 2021-08-10 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210105509A KR20230023402A (ko) 2021-08-10 2021-08-10 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230023402A true KR20230023402A (ko) 2023-02-17

Family

ID=85327638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210105509A KR20230023402A (ko) 2021-08-10 2021-08-10 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230023402A (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5689042A (en) 1995-03-29 1997-11-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants with altered senescence characteristics
US8420890B2 (en) 2006-03-28 2013-04-16 Cornell Research Foundation, Inc. Use of NAP gene to manipulate leaf senescence in plants
KR101855134B1 (ko) 2011-10-27 2018-05-09 제노마인(주) 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ4 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5689042A (en) 1995-03-29 1997-11-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants with altered senescence characteristics
US8420890B2 (en) 2006-03-28 2013-04-16 Cornell Research Foundation, Inc. Use of NAP gene to manipulate leaf senescence in plants
KR101855134B1 (ko) 2011-10-27 2018-05-09 제노마인(주) 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ4 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Giovannoni et al., 1989, Plant Cell 1(1):53-63
Joshi et al., 2019, Frontiers in Plant Science 10:1285
Kou et al., 2012, J. Exp. Bot. 63(17):6139-47
Matile P., 1992, In Crop Photosynthesis : Spatial and Temporal Determinants 413-440; Nooden L. D., 1988, In Senescence and Aging in Plants; Thiman K. V., 1980, In Senescence in Plants 85-115; Thomas H. et al., 1993, Annu. Rev. Plant Physiol. 123:193-219
Miao et al., 2004, Plant Mol. Biol. 55:853-867; Guo and Gan et al., 2006, Plant J. 46(4):601-12; Li et al., 2006, Plant Mol. Biol. 61:829-844; Besseau et al., 2012, J. Exp. Bot. 63(7):2667-79
Oeller et al., 1991, Science 254(5030):437-9
Shin et al., 2020, Nature communications 11:2819
Sobieszczuk-Nowicka et al., 2007, Physiol. Plant. 130:590-600
Surya Kant et al., 2015, PLOS ONE 10(1): e0116349. doi:10.1371/journal.pone.0116349
Zhao et al., 2015, Mol. Breeding. 35:60

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2008221696B2 (en) Transferases, epimerases, polynucleotides encoding these and uses thereof
KR101855136B1 (ko) 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ7 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR101556927B1 (ko) 식물 왜화 유도 기능을 가진 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도
KR101803500B1 (ko) 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도
KR20140021424A (ko) 비생물학적 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자 및 그의 용도
Peng et al. Increasing branch and seed yield through heterologous expression of the novel rice S-acyl transferase gene OsPAT15 in Brassica napus L.
KR20110092148A (ko) 식물의 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｈｇ１ 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
WO2018066897A2 (ko) 식물의 생산성 증대 기능과 노화 지연 기능을 갖는 mtatpg1 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR101855134B1 (ko) 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ4 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR20230023402A (ko) 식물의 다수확성, 노화 지연 및 내재성 강화 기능을 갖는 메디카고 트런카툴라 AT-hook 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR100871591B1 (ko) 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (ＣａＰＬＡ１)형질전환 식물체 및 고추 씨에이피엘에이원 (ＣａＰＬＡ１)유전자
KR20180093478A (ko) 고추 유래 탈인산화 유전자 CaAIPP1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법
KR100861717B1 (ko) ＡｔＣＰＬ５유전자와 ＡｔＣＰＬ５유전자가 과발현되는형질전환 식물체
WO2014209036A1 (ko) 식물의 생산성 증대 기능, 스트레스 내성 기능 및 노화 지연 기능을 갖는 atpg10 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR101855137B1 (ko) 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ8 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
WO2014209060A1 (ko) 식물의 생산성 증대 기능, 스트레스 내성 기능 및 노화 지연 기능을 갖는 atpg6 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR100438887B1 (ko) 애기장대로부터 분리한 식물의 잎 수명 조절 유전자 ｏｒｅ４ 및 그 변이형 유전자
KR20130095482A (ko) 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ａｔｐｇ３ 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR20190083578A (ko) 식물의 환경 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도
KR101592357B1 (ko) 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도
KR20040075252A (ko) 식물의 개화시기 조절 유전자 및 이를 이용한 식물의개화시기 조절 방법
KR102072276B1 (ko) 식물의 저온 스트레스 저항성을 증진시키는 신규 유전자 및 이의 용도
KR100833476B1 (ko) 성장이 향상된 ＡｔＰＦＰ 형질전환 식물체
KR20190068282A (ko) 식물의 생산성 증대 기능, 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ahl26 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
KR101648559B1 (ko) 스트레스 유래 비정상적 단백질 제거를 통한 식물 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal