WO2018066897A2 - 식물의 생산성 증대 기능과 노화 지연 기능을 갖는 mtatpg1 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 - Google Patents

식물의 생산성 증대 기능과 노화 지연 기능을 갖는 mtatpg1 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도 Download PDF

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    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance

Definitions

  • the present invention relates to MtATPG1 protein, its gene, and the use thereof having a function of increasing productivity and delaying aging of plants.
  • Plant senescence is considered to be a major step in the plant's lifecycle, and progresses in a highly sophisticated manner at the cellular, tissue, organ and individual levels through genetically regulated reactions. The aging process can occur differently in different organs of the plant. In the case of leaves, the degradation of chloroplasts is followed by the degradation of lipids, proteins and nucleic acids.
  • Cell structures such as cell membranes and intracellular compartments, are maintained until the end and lead to death after rearrangement of the degraded product nitrogen and nutrients (Lohman et al., Physiologia Plantarum, 1994, 92: 322-8 .; Smart, New Phytologist, 1994, 126: 419-48; Pruzinska et al., Plant Physiology, 2005, 139: 52-63).
  • the timing at which plants determine aging is related to nutrient retention and rearrangement, so flowering and seed production are often factors that promote aging. Plants also progress the aging process as a species-wide survival strategy for seasonal or unforeseen external environmental changes.
  • SAGs Senescence Associated Genes
  • Tomatoes have been reported to control the ripening of fruits by inhibiting the ethylene synthesis process (Oeller et al., Science. 1991, 254 (5030): 437-9) and also inhibit the expression of polygalacturonase genes involved in cell wall degradation.
  • Flav-O-Savor which increases the transport and storage properties of tomatoes, may be a typical commercialized example (Giovannoni et al., 1989, Plant Cell 1 (1): 53-63).
  • GmSARK gene and WRKY53 , WRKY6 and AtNAP genes belonging to the NAC family have been reported as genes overexpressed during aging (Miao et al., Plant Mol. Biol. 2004, 55: 853-867; Guo and Gan et al. , Plant J. 2006, 46 (4): 601-12; Li et al., Plant Mol Biol. 2006, 61: 829-844; Besseau et al., J Exp Bot 2012, 63 (7): 2667-79 Genes such as CBF2 and CBF3 are known to inhibit aging (Sobieszczuk-Nowicka et al., Physiol Plant 2007; 130: 590-600).
  • U.S. Pat.No.8420890 discloses a method for delaying aging by inhibiting the expression of AtNAP gene. Recently, studies have been conducted for overexpressing AtNAP to facilitate the harvesting of cotton or the like or to help ripening fruit. (Kou et al., J Exp Bot. 2012, 63 (17): 6139-47).
  • GhCKX a cytokinin regulator gene isolated from cotton
  • TobEA Tobacco Expression Atlas
  • the present invention also discloses a gene having a function of delaying aging and the like, which can improve the productivity of crops and the like.
  • An object of the present invention is to provide a MtATPG1 protein having a function of increasing productivity of plants and having a delaying function of aging.
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding the protein.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a plant having a yield increasing characteristic.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing a plant having aging delay characteristics.
  • the present invention relates to a MtATPG1 protein having a function of increasing productivity of a plant and having a function of delaying aging.
  • the inventor (s) is the gene of the protein based on the nucleotide sequence of the AT-hook DNA-binding protein (GeneBank accession number NC_016410.1) of Medicago truncatula ( Medicago truncatula )
  • productivity increase characteristics such as increase in biomass and / or increase in seed productivity of the individual were apparent, and delayed aging of the plant was apparent.
  • MtATPG1 M edicago t runcatula AT -hook p rotein of G enomine 1
  • MtATPG1 gene and protein these nucleotide sequences and amino acid sequences are disclosed in each of SEQ ID NO: 1 (or Fig. 16) and 2 (or FIG. 17).
  • the MtATPG1 protein of the invention is one of the polypeptides of (a), (b) and (c) below.
  • protein are used interchangeably with each other in the same sense as a polypeptide
  • gene is used interchangeably with each other in the same sense as a polynucleotide.
  • a "polypeptide comprising a substantial portion of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2" is still sufficient to retain productivity and delay plant aging as compared to the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: It is defined as a polypeptide comprising a portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the length of the polypeptide and the degree of activity of such a polypeptide does not matter since it still needs to be sufficient to retain productivity and delay plant aging.
  • polypeptide As such a polypeptide, the polypeptide which deleted the N-terminal part or C-terminal part in the polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is mentioned. This is because it is generally known in the art that even if the N- or C-terminal portion is deleted, such a polypeptide has the function of the original polypeptide. Of course, in some cases, the N-terminal or C-terminal moiety is necessary for maintaining the function of the protein, so that a polypeptide deleted with the N-terminal or C-terminal moiety does not exhibit this function. It is within the ordinary skill of one of ordinary skill in the art to distinguish and detect inactive polypeptides from active polypeptides.
  • the deletion of the N-terminal or C-terminal moiety as well as other moieties may still have the function of the original polypeptide.
  • one of ordinary skill in the art will be able to ascertain whether such deleted polypeptide still has the function of the original polypeptide within the scope of its usual ability.
  • the present specification discloses the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, furthermore, a polypeptide encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 increases plant productivity and delays aging of the plant.
  • the present invention confirms whether a polypeptide having a partial deletion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 still retains the function of the polypeptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It becomes very clear that it can fully confirm within a normal capability range. Therefore, in the present invention, the "polypeptide comprising a substantial part of the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2", as defined above, delays the aging of a plant that a person skilled in the art can manufacture within the range of its usual capacity based on the disclosure herein. It is to be understood as meaning including all polypeptides in a deleted form that have function and productivity enhancing function.
  • polypeptide substantially similar to the polypeptide of (a) and (b) includes a function comprising one or more substituted amino acids, but comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, ie, the productivity of a plant. It refers to a polypeptide having augmentation and delaying plant aging.
  • the degree of activity of the polypeptide or the degree of amino acid substitution is not a problem as long as the polypeptide containing at least one substituted amino acid retains the productivity of the plant and delays aging of the plant.
  • the polypeptide is a plant productivity. It is included in the present invention as long as it possesses augmentation and delaying plant aging. Even if one or more amino acids are substituted, if the amino acid before substitution is chemically equivalent to the substituted amino acid, the polypeptide comprising such substituted amino acid will still retain the function of the original polypeptide.
  • the polypeptide having such substituted amino acid (s) may be It will still retain the function of the original polypeptide.
  • a negatively charged amino acid such as glutamic acid
  • another negatively charged amino acid such as aspartic acid
  • polypeptide having such substituted amino acid (s) will still retain the function of the original polypeptide even if its activity is low. will be.
  • a polypeptide comprising amino acid (s) substituted at the N-terminal or C-terminal portion of the polypeptide will still retain the function of the original polypeptide.
  • Those skilled in the art can produce a polypeptide comprising one or more substituted amino acids as described above, but still retaining the productivity and delaying aging of plants possessed by the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • polypeptide comprising one or more substituted amino acids still has this function.
  • the present specification discloses an example in which the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are disclosed, and the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has a function of increasing productivity and delaying aging of plants. It is clear that the "polypeptide substantially similar to the polypeptide of (a) and (b)" of the present invention can be easily implemented by those skilled in the art.
  • polypeptide substantially similar to the polypeptide of (a) or (b) above should be understood as meaning including all polypeptides that contain one or more substituted amino acids but still have the functions of increasing plant productivity and delaying plant aging.
  • polypeptide substantially similar to the polypeptide of (a) or (b) above is meant to include all polypeptides that contain one or more substituted amino acids but still have the ability to increase plant productivity and delay plant aging, but nevertheless active
  • the polypeptide is preferably higher in sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the polypeptide has at least 60% sequence homology at the lower end of sequence homology, while at the upper limit of sequence homology, it is preferred that the polypeptide has 100% sequence homology. More specifically, the above sequence homology is 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% in order of higher.
  • polypeptides substantially similar to the polypeptides of (a) and (b) above are not only “polypeptides substantially similar to polypeptides comprising the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2", All descriptions above are intended to include “substantially similar to polypeptides comprising the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2" as well as “amino acids of SEQ ID NO: 2", since the polypeptide comprising substantially part thereof is included. The same applies to polypeptides that are substantially similar to polypeptides comprising substantial portions of the sequence.
  • polypeptide as described above refers to a polypeptide comprising the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a polypeptide comprising a substantial portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, having a function of increasing the productivity of the plant and delaying plant aging, and In addition to including polypeptides substantially similar to the above polypeptides, it is meant to include all polypeptides of the preferred embodiments as described above.
  • the polynucleotide of the present invention is substantially isolated to the isolated polynucleotide and the polypeptides encoding the polypeptide including all or a substantial part of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • Encoding an isolated polypeptide includes an isolated polynucleotide, and furthermore, in a preferred embodiment, an isolation that encodes all polypeptides having sequence homology in the sequence described above, with increased plant productivity and delayed plant aging.
  • Polynucleotides When amino acid sequences are found, those skilled in the art can readily prepare polynucleotides encoding such amino acid sequences based on those amino acid sequences.
  • isolated polynucleotide includes both chemically synthesized polynucleotides, polynucleotides isolated from organisms, especially Medicago truncatula , and polynucleotides containing modified nucleotides, It is defined as including all polymers of stranded or double stranded RNA or DNA.
  • the present invention relates to a method for producing a plant having productivity enhancing properties.
  • Method for producing a plant having a productivity enhancing feature of the present invention comprises the steps of (a) expressing a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a gene having a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the plant and (b) increased productivity And selecting the plant having the characteristic.
  • productivity enhancing properties means that the biomass (size and / or mass) of the whole, stem, root and / or leaves of the plant is increased compared to wild-type plants, and / or the productivity of the plant's seeds (plants) Number and / or mass of seeds per individual) is increased compared to wild type plants.
  • plant is meant to include mature plants, immature plants (plants), plant seeds, plant cells, plant tissues and the like.
  • plant cells or plant tissues are described in European Patent EP0116718, European Patent EP0270822, International Patent WO 84/02913, Gould et al. 1991, Plant Physiol 95,426-434, etc., can be used to develop and grow into mature plants.
  • plant includes all plants for which productivity gains can give useful results to humans. Therefore, the meaning of the plant includes crops (specifically, crops such as edible crops, feed crops, craft crops, and horticultural crops), forest trees, and ornamental plants. Specifically, rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, sorghum, legumes (specifically knotweed, hoe) to which Medicago truncatula from which the MtATPG1 gene of the present invention is isolated Fire, stone, bird, red bean, soybean, pea, adzuki bean, peanut, lentil, kidney bean, lupine, alfalfa or clover, ⁇ , shamrock, lump, etc.), Chinese cabbage, bok choy, kale, cauliflower, broccoli, Young radish, radish, freshly, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, carrot, ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugarcane,
  • crops specifically,
  • gene consisting of a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a gene encoding the first amino acid of SEQ ID NO: 2 while having a base sequence different from that of the gene of SEQ ID NO: 1 due to codon degeneracy
  • homologue of genes consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 having the characteristics of increasing the productivity of the plant, etc. due to the evolutionary pathways different according to the type of plant consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and other nucleotide sequences It is meant to include all genes.
  • the gene consisting of a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably higher in sequence homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and most preferably, having 100% sequence homology.
  • the gene has a sequence homology of 60% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • sequence homology is 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73 %, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, Higher in order of 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% is preferred.
  • step (a) may be performed by a genetic engineering method.
  • Genetic engineering method includes the steps of (i) inserting the gene of SEQ ID NO: 1 or a gene having a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 into an expression vector to be operably linked to a regulatory sequence capable of expressing it, and ( ii) transforming the expression vector into a plant.
  • operably means that the transcription and / or translation of a gene is linked to be affected. For example, if a promoter influences the transcription of a gene linked to it, the promoter and the gene are operably linked.
  • regulatory sequence is meant to include all sequences whose presence may affect the transcription and / or translation of a gene linked thereto, and such regulatory sequences include a promoter sequence and a polyadenylation signal. ), The replication start point .
  • promoter follows the conventional meaning known in the art, specifically located at the top (5 'side) based on the transcription initiation point of a gene, binding to DNA-dependent RNA polymerase By nucleic acid sequences having the function of controlling transcription of one or more genes, including sites, transcriptional initiation sites, transcription factor binding sites, and the like.
  • This promoter may be a TATA box (usually located at the transcription start point (+1) -20 to -30 position) above the transcription initiation point if it is of eukaryotes, and a CAAT box (typically about -75 position compared to the transcription start site) Present), a 5 'enhancer, a transcription repression factor, and the like.
  • Usable promoters include constitutive promoters (promoters which induce expression in all plant tissues at all times), inducible promoters (expression of target genes in response to specific external stimuli) as long as they are capable of expressing the gene of SEQ ID NO. 1 linked thereto. Promoters that induce expression or promoters that specifically induce expression in specific developmental periods or specific tissues). Representative examples of constitutive promoters that can be used include the promoter of the 35S RNA gene of cauliflower mosaic virus (CaMV), and the ubiquitin family of promoters (Christensen et al., 1992, Plant Mol). Biol. 18, 675-689; EP0342926; Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol.
  • constitutive promoters include the promoter of the 35S RNA gene of cauliflower mosaic virus (CaMV), and the ubiquitin family of promoters (Christensen et al., 1992, Plant Mol). Biol. 18, 675-689; EP0342926; Cornejo et
  • rice actin promoter Zhang et al. 1991, The Plant Cell 3, 1155-1165
  • rice actin promoter Zhang et al. 1991, The Plant Cell 3, 1155-1165
  • inducible promoters include the yeast metallothionein promoter (Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 4567, 1993), which is activated by copper ions, substituted by substituted benzenesulfonamides.
  • In2-1 and In2-2 promoters (Hershey et al., Plant Mol. Biol., 17: 679, 1991), GRE regulatory sequences regulated by glucocorticoids (Schena et al., Proc. Natl. Acad.
  • Transcription termination sequence is poly (A ) addition signal ( polyadenylation As a sequence acting as a signal ), it is intended to enhance the integrity and efficiency of transcription.
  • An example of a transcription termination sequence that can be used is nopalin Synthase (NOS) a transcription termination sequence, rice ⁇ - amylase RAmy1 A transcription termination sequence, Agrobacterium Tome Pacific Enschede of the gene of the gene Transcription termination sequence of octopine gene, transcription termination sequence of wheat heat shock protein 17, transcription termination sequence of wheat ubiquitin gene, transcription termination sequence of rice gluterin gene, transcription termination sequence of rice lactate dehydrogenase gene Etc. can be mentioned.
  • NOS nopalin Synthase
  • the expression vector may include a selection marker gene.
  • screening Marker gene means a gene encoding a trait that enables the selection of a plant comprising such a marker gene selectable marker gene may be a number of days antibiotic resistance genes and herbicide tolerance genes. Examples of antibiotic resistance genes Examples of antibiotic resistance genes include puromycin resistance genes (eg Streptomyces).
  • the herbicide resistance gene may include a vasta herbicide resistance bar gene.
  • the term "transformation” refers to a modification of the genotype of a host plant by the introduction of a hereditary gene, and regardless of the method used for the transformation, the herb gene is a host plant, more precisely a cell of the host plant. Introduced into and integrated into the genome of a cell.
  • the hereditary genes include homologous and heterologous genes, wherein “homologous genes” refer to endogenous genes of a host organism or the same species, and “heterologous genes” are genes that do not exist in the organism to which they are transformed.
  • the MtATPG1 gene of the present invention is homologous to Medicago truncatula from which it is isolated, but is heterologous to Arabidopsis and tomato plants.
  • a method of transforming a plant with an exogenous gene may use a method known in the art, such as a direct gene transfer method using a gene gun, an in planta transformation method using a floral dip, pollen mediation, and the like. Transformation methods, protoplast transformation methods, viral mediated transformation methods, liposome mediated transformation methods, and the like can be used.
  • a transformation method suitable for a specific plant for example, a method for transforming corn is described in US Pat. No.
  • Generally used in transforming plants is a method of infecting seedlings, plant seeds and the like with the transformed Agrobacterium.
  • Such Agrobacterium mediated transformation methods are well known in the art (Chilton et al., 1977, Cell 11: 263: 271; European Patent EP 0116718; US Patent US 4,940,838), and methods suitable for particular plants are also known in the art.
  • the Agrobacterium mediated transformation method uses Ti-plasmid, which will contain left and right border sequences that allow the integration of T-DNA into the genome of plant cells.
  • the selection step (b) may be selected through the characteristics of the inserted gene by growing and growing the transformed plant, or, if the selection marker gene is transformed together during transformation, the selection marker gene may be selected. Can be.
  • the characteristics of the inserted gene include the biomass of the plant and / or the productivity of the seed.
  • the present invention relates to a method for producing a plant having aging delay properties.
  • the method for producing a plant having a aging retardation property of the present invention comprises the steps of: (a) expressing a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a gene having a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the plant, and (b) Selecting the plant with the delayed phenotype.
  • aging delay refers to a property of prolonged plant life as compared to wild-type plants, and specifically, the yellowing and / or necrosis of leaves and / or stems is delayed compared to wild-type plants or the chlorophyll content of plants is wild-type. It is more characteristic than plants or photosynthetic efficiency of plants is higher than wild type plants.
  • Step (a) may be performed genetically, as for the genetic engineering method, as described with reference to a method for preparing a plant having productivity enhancing characteristics of the present invention.
  • the selected plant is selected using delayed aging characteristics, which are characteristics of the gene inserted by developing and growing a transformed plant (quantitative evaluation of leaf yellowing or necrosis, chlorophyll content, photosynthetic efficiency, etc.). Method, a method of mixing the above methods, etc.), and when the selection marker gene is transformed together during transformation, the selection may be performed using the selection marker gene.
  • the present invention relates to a method for increasing productivity of a plant.
  • the method for increasing the productivity of a plant of the present invention includes (a) an expression vector such that a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a gene having a sequence similar to that of SEQ ID NO: 1 is operably linked to a regulatory sequence capable of expressing it And (b) transforming the expression vector into a plant.
  • the present invention relates to a method for delaying aging of a plant.
  • the method for delaying aging of a plant of the present invention is to (a) operably link a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO. 1 or a gene having a sequence similar to that of SEQ ID NO. 1 to a regulatory sequence capable of expressing it. Inserting into the expression vector and (b) transforming the expression vector into a plant.
  • Steps (a) and (b) in the above methods are as described with reference to the method for producing a plant having the productivity enhancing properties of the present invention.
  • the present invention is a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a gene having a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 obtained by the method for producing a plant having the productivity enhancing characteristics of the present invention
  • the present invention relates to a transgenic plant having productivity enhancing properties.
  • the plant is a transgenic plant having productivity enhancing properties by introducing a gene encoding the MtATPG1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, in particular the gene MtATPG1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, into the plant .
  • the present invention is a gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a gene having a sequence similar to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 obtained by the method for producing a plant having the aging delay characteristics of the present invention
  • the present invention relates to a transgenic plant having delayed aging characteristics.
  • the plant is a transgenic plant having delayed aging characteristics by introducing a gene encoding the MtATPG1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, in particular the gene MtATPG1 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, into the plant .
  • the "transformed plant” is obtained by crossing with a transformed plant as well as when the gene is introduced and transformed into a plant cell, plant tissue, or plant seed capable of developing and growing into a mature plant. Genome modified plants, plant seeds derived from the plants, plant cells, plant tissues.
  • the present invention it is possible to provide the MtATPG1 protein and its gene, MtATPG1 , which have a function of increasing productivity and delaying aging of plants. Since the gene provides a function of increasing productivity and delaying aging of the plant, when the plant is transformed with the gene, it is possible to produce a plant having not only increased productivity but also delayed aging of the plant.
  • Figure 1 shows the structure (schematic diagram) of the pCSEN-MtATPG1 recombinant vector in which the MtATPG1 gene having a function of increasing productivity and delaying aging of plants is introduced in the sense direction.
  • Figure 2 is a photograph of the Arabidopsis grown 50 days and 70 days after germination of the Arabidopsis T 2 line transformed with the pCSEN-MtATPG1 recombinant vector of FIG. DAG, day after germination.
  • MtATPG1-3 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-9 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-11 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-17 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • Figure 3 shows the results of analyzing the expression of the MtATPG1 gene of Arabidopsis thalamus for 24 days after cotyledon generation of the Arabidopsis T 2 line transformed with the pCSEN-MtATPG1 recombinant vector of Figure 1 through qRT-PCR TUB was used as a PCR positive control.
  • MtATPG1-3 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-9 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-11 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-17 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • FIG. 4 is a diagram for increasing the productivity of the Arabidopsis line of FIG.
  • MtATPG1-3 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-9 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-11 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1-17 Arabidopsis T 2 line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1 IPT gene family is MtATPG1 IPT gene family and MtATPG1 involved in the cytokinin biosynthesis process of expressing Arabidopsis T 2 transformants
  • the expression of genes was analyzed by RT-PCR, and TUB was used as a PCR positive control.
  • the applied I PT1 , IPT3 , IPT5, and IPT7 genes are a family of genes involved in the cytokinin biosynthesis process.
  • MtATPG1 CLV1 gene is MtATPG1 CLV1 gene, histidine kinase (HK) gene family, and MtATPG1 in the cytokinin signaling pathway of expressing Arabidopsis T 2 transformants
  • HK histidine kinase
  • MtATPG1 in the cytokinin signaling pathway of expressing Arabidopsis T 2 transformants
  • TUB was used as a PCR positive control.
  • MtATPG1 Histidine phosphotransfer proteins (HP) gene family and MtATPG1 in the cytokinin signaling pathway of expressing Arabidopsis T 2 transformants The expression of genes was analyzed by RT-PCR, and TUB was used as a PCR positive control.
  • Figure 8 shows a possible model for the role of MtATPG1 gene having the function of increasing productivity and delaying aging through the cytokinin signaling pathway of Arabidopsis.
  • Figure 9 is a photograph of the Arabidopsis grown 40 days after germination of the Arabidopsis T 3 homo line transformed with the pCSEN-MtATPG1 recombinant vector of FIG. DAG, day after germination.
  • MtATPG1 -3-15 Arabidopsis T 3 homo line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1 -3-20 Arabidopsis T 3 homo line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1 -9-1 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • MtATPG1 -9-18 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • MtATPG1 -11-2 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • MtATPG1 -11-7 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • FIG. 10 is a photograph of Arabidopsis cultivars grown for 60 days after germination of the T 3 homo line transformed with the pCSEN-MtATPG1 recombinant vector of FIG. 1. DAG, day after germination.
  • MtATPG1 -3-15 Arabidopsis T 3 homo line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1 -3-20 Arabidopsis T 3 homo line transformed with pCSEN-MtATPG1 recombinant vector
  • MtATPG1 -9-1 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • MtATPG1 -9-18 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • MtATPG1 -11-2 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • MtATPG1 -11-7 pCSEN-MtATPG1 Transgenic Arabidopsis T 3 homo line with a recombinant vector
  • FIG. 11 shows Arabidopsis wild-type (Con) and variants MtATPG1 -3-15, MtATPG1 -3-20, MtATPG1 -9-1, MtATPG1 -9-18, MtATPG1 -11-2, and MtATPG1 - from day 16 after cotyledon production
  • Figure 3-3 shows the phenotype of the leaves on the left leaf 3-4 of 11-7 every 44 days
  • FIG. 12 shows the chlorophyll content of the leaves. DAE, day after emersion.
  • FIG. 13 is germinated after 21 days Arabidopsis wild-type (Con) and variants MtATPG1 -3-15, MtATPG1-3-20, MtATPG1 -9-1, MtATPG1 -9-18, MtATPG1 -11-2, and MtATPG1 -11-
  • Figure 7 of the left leaves 3-4 of the detachment to maintain the cancer state every two days to 8 days to observe the phenotype of the picture Figure 14 is a picture of the chlorophyll content of the leaves for this investigation. DAT, day after treatment.
  • FIG. 13B shows the phenotypic change of leaves treated with NaCl for 6 days in the same conditions. Picture. DAT, day after treatment.
  • 16 and 17 shows the amino acid sequence of the base sequence of each protein and MtATPG1 MtATPG1 gene.
  • Example 1 Medicago from truncatula Isolation of MtATPG1 Gene Providing Increased Plant Productivity and Delayed Aging
  • Example 1-1 Cultivation and Cultivation of Medicago truncatula
  • Medicago truncatula Jemalong A17 was cultivated in a growth chamber controlled by a 16/8 hour light cycle at a temperature of 22 ° C. in pots containing soil.
  • Forward primer (BglII / MTR4g 098450-F, 5) containing the sequence of restriction enzyme BglII represented by SEQ ID NO: 3 based on the nucleotide sequence of AT-hook DNA-binding protein (GeneBank accession number NC_016410.1) of M. truncatula . '-AGA TCT ATG CAA AAC ATC CAC AGG CAA AA-3') and a reverse primer (BstEII / MTR4g 098450-R, 5'-GGT GAC CTC AAA AAG GTT GAC) containing the sequence of restriction enzyme BstEII represented by SEQ ID NO: 4 GTG AAG CTG-3 ') was synthesized. The primer was used to amplify and isolate full-length cDNA from M. truncatula cDNA using polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the isolated cDNA As a result of analysis of the isolated cDNA, it has a 858 bp transcriptional translation frame (ORF) encoding 285 amino acids having a molecular weight of about 29.5 kDa, it was confirmed that it consists of one exon, AT- It has a hook motif it was named them as MtATPG1 (M edicago t runcatula AT -hook p rotein of G enomine 1).
  • MtATPG1 M edicago t runcatula AT -hook p rotein of G enomine 1
  • the gene is called “ MtATPG1 " or " MtATPG1 gene” using italics
  • the protein is called "MtATPG1" or "MtATPG1 protein”.
  • a transgenic Arabidopsis in which the MtATPG1 gene was introduced in the sense direction was prepared to change the expression of the MtATPG1 transcript.
  • SEQ ID NO: 3 is the restriction enzyme BglII represented by a forward primer and SEQ ID NO: 4, the sequence is included in the amplifier is limited MtATPG1 enzyme cDNA using a reverse primer sequences comprises a BstEII by PCR from the cDNA of M. truncatula It was.
  • the DNA was digested with restriction enzymes BglII and BstEII , and cloned in the sense direction into a pCSEN vector prepared under the control of the SEN1 promoter, an inducible promoter, to prepare a pCSEN-MtATPG1 recombinant vector, a sense construct for the MtATPG1 gene. It was.
  • the SEN1 promoter has specificity for the gene expressed according to the growth stage of the plant.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a pCSEN-MtATPG1 recombinant vector in which a MtATPG1 gene is introduced in a sense direction into a pCSEN vector.
  • BAR refers to a BAR gene (phosphinothricin acetyltransferase gene) that confers resistance to Basta herbicide, RB to the right border, LB to the left border, p35S to the CaMV 35S promoter, and T35S to CaMV 35S RNA polyA
  • pSEN refers to the SEN1 promoter
  • NOS polyA refers to the polyA of the nopaline synthase gene.
  • the pCSEN-MtATPG1 recombinant vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens using an electroporation method.
  • the transformed Agrobacterium cultures were incubated at 28 ° C. until the OD600 value was 1.0, and the cells were harvested by centrifugation at 25 ° C. at 5,000 rpm for 10 minutes.
  • Harvested cells were suspended in Infiltration Medium (IM; 1X MS SALTS, 1X B5 vitamin, 5% sucrose, 0.005% Silwet L-77, Lehle Seed, USA) medium until the final OD600 value was 2.0.
  • IM Infiltration Medium
  • the Arabidopsis was placed in a polyethylene bag for 24 hours. Thereafter, the transformed Arabidopsis cultivars continued to grow to harvest seeds (T 1 ).
  • T 1 a Arabidopsis transformed with only a wild type Arabidopsis or non- transgenic vector (pCSEN vector) containing no MtATPG1 gene was used.
  • Seeds harvested from the transformed Arabidopsis larvae as in ⁇ Example 2-1> were selected by immersing and incubating for 30 minutes in a 0.1% Bassta herbicide (light, South Korea) solution. Thereafter, during the growth of the transformed Arabidopsis, the pollen was treated 5 times with the Basta herbicide, and the transformed Arabidopsis was selected from each pollen.
  • the T 1 Arabidopsis transformed with the pCSEN-MtATPG1 vector compared to the control group (the Arabidopsis or wild-type Arabidopsis transformed only with the vector without the MtATPG1 gene) and their phenotypes, surprisingly the variants were distinct. Multiple traits and biomass enhancing traits were shown.
  • the phenotypes of these lines were examined by receiving T 2 transgenic seeds from the T 1 transgenic Arabidopsis. Phenotypic identification of selected Arabidopsis T 2 transformation lines was performed 50 and 70 days after germination (FIG. 2). MtATPG1 -3 with a pCSEN-MtATPG1 construct, MtATPG1 -9, MtATPG1-11 and Compared to Arabidopsis control (Col-0), the MtATPG1 -17 variant line showed a marked increase in biomass, such as an increase in plant size, and an increase in long shell length and number. An increase was caused.
  • RNA was extracted using the respective RNasey Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany ) from the leaves of MtATPG1 -17 variant. 1 ⁇ g of RNA each as a template and 5 minutes at 65 ° C. using Superscript III Reverse Tanscriptase (INVITROGEN, USA); 60 minutes at 50 ° C; And cDNA was synthesized at 70 ° C. for 15 minutes.
  • the synthesized cDNA was used as a template, and PCR was performed using the primers specific to the following Table 1 for the Tubulin gene used as the MtATPG1 gene and the PCR positive control.
  • PCR denatured template DNA by heating at 94 ° C. for 2 minutes and then 1 minute at 94 ° C .; 1 minute 30 seconds at 55 ° C; And 1 cycle at 72 °C one cycle was performed a total of 30 times, followed by a final reaction for 15 minutes at 72 °C. Then, the PCR product was confirmed by 1% agarose gel electrophoresis, the results are shown in FIG.
  • the productivity growth indicators applied are plant height, silique number (NTS), biomass (FW), biodry weight (DW), total seed weight (TSW), total seed number (TNS), and 1,000 seeds. Weight (1,000 SW), and the result is the average of 20 objects per line.
  • MtATPG1 gene mutant line MtATPG1-3, MtATPG1 -9, -11 and MtATPG1 All of MtATPG1 -17 showed 1.5 times more seed production than Arabidopsis control, and MtATPG1 -3 showed more than 2 times more seed production than control. In proportion to this increase in seed production, all variant lines had a long and numbered pattern of increase. On the other hand, the weight of 1,000 seeds was slightly different, but almost the same as the control.
  • MtATPG1 from M. truncatula Arabidopsis cytokinin biosynthesis gene IPT to determine if the gene is involved in cytokinin biosynthesis in Arabidopsis IPT1 of the (isopentenyltransferase) gene family (AT1G68460) , IPT3 (AT3G63110) , IPT5 (AT5G19040), and IPT7 (AT3G23630) gene expression of Arabidopsis wild-type and variants MtATPG1-3, MtATPG1--9 , and It was targeting MtATPG1 -11 (Fig. 5).
  • RT-PCR primer information for the applied gene and MtATPG1 and the positive control tubulin are shown in Table 2.
  • the expression of IPT genes in particular, the expression of IPT3 gene, which is expressed in Arabidopsis foliar leaves, was slightly different compared to the control , but not in all of the variants .
  • IPT involved in cytokinin biosynthesis Primer sequence and sequence number for the gene group , MtATPG1 gene, and positive control TUB gene expression
  • Gene name Forward / Reverse Primer SEQ ID NO
  • CLV1 genes for CLV1 / WUS pathway of cytokinin signaling pathway (receptor protein kinase CLAVATA1, AT1G75820) and HK2 (histidine kinase 2, AT5G35750) of the histidine kinase gene group has a function as a cytokinin receptor, HK3 (histidin kinase3, AT1G27320) and CRE1 ( HK4 : histidine kinase 4, AT2G01830) gene expression of Arabidopsis wild-type and MtATPG1--3 , MtATPG1--9 , and It was investigated targeting MtATPG1 -11 (Fig. 6).
  • RT-PCR primer information for the applied gene and MtATPG1 and the positive control tubulin are shown in Table 3.
  • expression of CRE1 gene was slightly different, but the other hand, the proportion and degree MtATPG1 genes expressed in the mutant, expression of the gene HK3 HK2 and rather higher in the degree MtATPG1 MtATPG1 -3 variant gene expression low.
  • the expression of the CLV1 gene did not have a big difference in all of the variants compared to the control.
  • MtATPG1 The genes were not significantly involved in the cytokinin biosynthesis and the CLV1 / WUS pathway in the cytokinin pathway, and in proportion to the expression of the CRE1 gene in the cytokinin receptor and inversely in the expression of the HK2 and HK3 genes.
  • MtATPG1 Gene expression regulates the expression of the CRE1 gene proportionally
  • MtATPG1 Low expression levels of genes induce high expression of HK2 and HK3 genes to provide multiplicative traits and MtATPG1 It could be hypothesized that high expression levels of genes induce high expression levels of CRE1 to provide traits of some melting extension along with multiplicity.
  • CLV1 in the cytokinin signaling pathway Gene histidine Primer sequence and sequence number for RT-PCR for kinase ( HK ) gene group , MtATPG1 , and positive control TUB gene gene Forward / Reverse Primer (SEQ ID NO)
  • CLV1 CLV1-RT-F 5'-ACT TAC CTC TGT CTC CCT CA-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • CLV1-RT-R 5'-GAC CAC CTT TAG ATC CAT GC-3 '(SEQ ID NO: 18)
  • HK3 HK3-RT-F 5'-CAA CAA CCA GCC CAT ATT CTC-3 '(SEQ ID NO: 19)
  • HK3-RT-R 5'-TTC CAA TAC CCA ATC CCC TC-3 '(Dial No.
  • AHP1 , AHP2 , AHP3 , AHP4 , AHP5 , and AHP6 genes of the phosphotransfer proteins (HP) gene group were also examined (FIG. 7).
  • the expression pattern of the gene was analyzed by RT-PCR, primer information used is shown in Table 4.
  • the gene expressed in proportion to the expression level of the MtATPG1 gene of the transformant was AHP1 .
  • the AHP2 to AHP6 genes were expressed almost in inverse proportion to the expression level of the MtATPG1 .
  • MtATPG1 gene expression histidine phosphotransfer proteins HP control the expression of genes of the gene family AHP1 proportionally, and relatively high expression of the gene MtATPG1 while acting as a negative regulator for AHP2 ⁇ AHP6 gene MtATPG1
  • HP histidine phosphotransfer proteins
  • AHP1 (AT3G21510) AHP1-RT-F: 5'-ATGGATTTGGTTCAGAAGCAGAA-3 (SEQ ID NO: 25) AHP1-RT-R: 5'-TCAAAATCCGAGTTCGACGGCC-3 (SEQ ID NO: 26) AHP2 (AT3G29350) AHP2I-RT-F: 5'-ATGGACGCTCTCATTGCTCAGC-3 (SEQ ID NO: 27) AHP2I-RT-R: 5'-TTA GTT AAT ATC CAC TTG AGG AAC -3 '(SEQ ID NO: 28) AHP3 (AT5G39340) AHP3-RT-F: 5'-GGACACACTCATTGCTCAGT-3 '(SEQ ID NO: 25) AHP1-RT-R: 5'-TCAAAATCCGAGTTCGACGGCC-3 (SEQ ID NO: 26) AHP2 (AT3G29350) AHP2I-RT-F: 5'-ATGGACGCTC
  • MtATPG1 is not significantly involved in cytokinin biosynthesis and CLV1 / WUS pathway in the cytokinin pathway, and 2) MtATPG1 is proportional to the expression of CRE1 gene in the cytokinin receptor gene.
  • MtATPG1 histidine phosphotransfer proteins (HP) AHP1 gene expression is also proportionally of genes, 4) a relatively high expression of the gene is MtATPG1 AHP2 ⁇ AHP6
  • the relatively low expression increased MtATPG1 gene increases the expression level of AHP2 ⁇ AHP6 gene Induces increased traits such as increased seed yield and increased biomass of plants, whereas increased expression of the MtATPG1 gene results in increased expression of the CRE1 and AHP1 genes, as shown above.
  • AHP1 When the gene has a positive regulator function, the aging delayed trait of the plant, and AHP2 ⁇ AHP6 When a gene has a positive regulator function, it may be used as an important indicator of increasing plant productivity (Figure 8).
  • the role of MtATPG1 in cytokinin signaling was similar to that of the Arabidopsis AT-hook gene. This fact suggests that this gene may also have similar functions in major crops and provide many advantages for the development of multi-bean varieties. do.
  • mutants MtATPG1 -11-2 and MtATPG1 -11-17 were found to have increased leaf yellowing from 36 days after cotyledon formation, resulting in necrosis of leaves after 44 days.
  • the remaining variant lines MtATPG1 -3-15, MtATPG1 -3-20, MtATPG1 -9-1, and MtATPG1 -9-18 were similar in aging progression to that of the control (FIG. 11).
  • chlorophyll content was measured during age-dependent aging.
  • Chlorophyll content was measured according to the method of Lichtenthaler and Wellburn ( Biochemical Society Transduction 603: 591 ⁇ 592, 1983) using extinction coefficients of 663.2 nm and 664.8 nm. As a result, as shown in FIG. 12, the chlorophyll content change during the age-dependent aging progression of the control and the mutant appeared similar to the previous phenotypic change pattern.

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Abstract

본 발명은 식물의 생산성 증대 기능 및 노화 지연 기능을 갖는 MtATPG1 단백질과 그 유전자인 MtATPG1 및 이들의 용도를 개시한다. 상기 유전자가 도입되어 발현된 식물체는 생산성이 증대되는 특성과 노화 지연 특성을 가진다.

Description

식물의 생산성 증대 기능과 노화 지연 기능을 갖는 MTATPG1 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도
본 발명은 식물의 생산성 증대 기능과 노화 지연 기능을 갖는 MtATPG1 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도에 관한 것이다.
식물의 노화(plant senescence)는 식물의 생애 주기(lifecycle) 중 주요한 단계로 여겨지며, 유전적으로 조절된 반응들을 통하여 세포, 조직, 기관 및 개체 수준에서 매우 정교하게 연계되어 진행된다. 노화 과정의 진행은 식물체의 여러 기관에서 다르게 일어날 수 있는데 잎의 경우 엽록체의 분해에 이어서 지질, 단백질, 핵산의 분해가 순차적으로 일어난다. 세포막과 세포 내 구획 등의 세포 구조물은 마지막까지 유지되며 분해된 산물인 질소와 영양분의 재배치가 일어난 후 죽음에 이르게 된다(Lohman et al., Physiologia Plantarum, 1994, 92:322-8.; Smart, New Phytologist, 1994, 126:419-48; Pruzinska et al., Plant Physiology, 2005, 139:52-63). 식물체가 노화를 결정하는 시기는 영양분의 보유상태나 재배치와 연관이 있기 때문에 개화나 종자의 생산은 종종 노화를 촉진하는 요인이 된다. 또한 식물체는 계절적인 변화나 예측하지 못했던 외부 환경 변화에 대한 종 전체의 생존 전략으로도 노화 과정을 진행시킨다.
식물에서 유용물질을 얻기 위하여 재배를 할 경우, 유용물질 생산에 사용 가능한 식물의 양과 시기가 한정적이며 기후 풍토 등의 외부 인자에 의한 영향에 민감하게 반응하여 식물이 노화 및 죽음에 이르는 문제점이 있기 때문에 식물의 노화에 대한 연구는 생물학적인 측면에서 생명 현상의 이해를 위해서뿐만 아니라 생산성, 저장성, 수송성 등의 증진을 통한 경제적 이윤 창출 측면에서도 매우 중요하다.
노화 과정은 여러 유전자의 발현 변화에 따라 진행되는데 광합성과 기초 대사 관련 유전자의 발현은 감소하며 세포사멸, 스트레스 반응 유전자, 가수분해 효소 관련 유전자의 발현은 증가하게 된다(Hopkins et al., New Phytologist, 2007, 175:201-14; Lim et al., Annual Review of Plant Biology, 2007, 58:115-136). 이러한 식물의 노화 관련 유전자(Senescence Associated Genes, SAGs)에 대한 연구는 학문적, 산업적 측면에서의 중요성 때문에 활발히 이루어지고 있다.
아실-가수분해효소 활성(acyl hydrolase activity)을 지니는 SAG101 유전자의 antisense 서열을 식물체에 도입시켜 노화를 지연시키는 기술(He and Gan, Plant Cell, 2002, 14(4):805-15)과 같이 직접적으로 노화 촉진 유전자의 발현을 저해하는 방법이 개발되었으며 노화 진행 시기 동안 노화를 저해하는 유전자를 과발현하는 방법도 개발되었다. 미국 등록특허 제 5689042호에는 SAG12 나 SAG13 유전자의 promoter에 cytokinin 합성 관련 유전자를 결합시켜 노화를 지연시키는 방법이 개시되어 있는데 SAG12 유전자의 promoter에 IPT 유전자를 재조합 할 경우 담배에서 50%의 생산성 증대를 볼 수 있었다. 같은 방법으로 상추에 도입시켰을 때 수확 후 저장성이 크게 증가되는 것을 알 수 있었다(McCabe et al., Plant Physiol. 2001, 127(2):505-16). 또한 SAG12 promoter에 옥수수의 homeobox gene(knotted1)을 발현시킨 담배에서 cytokinin의 level이 증가하고 잎의 노화도 지연되었다는 보고가 있었다(Naomi et al., Plant Cell, 1999, 11:1073-1080).
토마토의 경우 ethylene 합성과정을 저해하여 과일의 숙성을 조절한 사례가 보고되어 있으며(Oeller et al., Science. 1991, 254(5030):437-9) 또한 세포벽 분해와 관련된 polygalacturonase 유전자의 발현을 억제시켜 토마토의 운송성과 저장성을 증가시킨 Flav-O-Savor의 경우가 대표적으로 상업화된 예가 될 수 있다(Giovannoni et al., 1989, Plant Cell 1(1):53-63).
또한 노화 진행시 과발현되는 유전자로서 GmSARK 유전자와 NAC family에 속하는 WRKY53 , WRKY6 및 AtNAP 유전자 등이 보고되었으며(Miao et al., Plant Mol. Biol. 2004, 55:853-867; Guo and Gan et al., Plant J. 2006, 46(4):601-12; Li et al., Plant Mol Biol. 2006, 61:829-844; Besseau et al., J Exp Bot 2012, 63(7):2667-79) CBF2 , CBF3와 같은 유전자들은 노화를 억제시키는 것으로 알려졌다(Sobieszczuk-Nowicka et al., Physiol Plant 2007;130:590-600). 이들 유전자의 발현 조절은 노화를 지연시켜 결과적으로 작물의 생산성 등의 향상을 가져올 수 있다. 미국등록특허 제8420890호에는 AtNAP 유전자의 발현 억제를 통한 노화의 지연 방법이 개시되어 있는데 최근에는 AtNAP를 과발현시켜 목화 등의 수확을 용이하게 하거나 과실의 빠른 성숙을 돕는데 이용하기 위한 연구도 진행되고 있다(Kou et al., J Exp Bot. 2012, 63(17):6139-47).
최근 적절한 promoter의 적용을 통한 IPT 유전자의 발현 조절은 캐놀라에서 노화 지연과 더불어 생산성 증대의 농업형질을 제공하며, 흥미로운 점은 형질전환 식물에서 cytokinin 과발현에 의한 형태학적, 그리고 표현형적 이상이 전혀 나타나지 않는다는 것이다(Surya Kant et al., PLOS ONE. 2015, 10(1): e0116349. doi:10.1371/journal.pone.0116349). 또한 애기장대의 AT hook 유전자인 ATPG4도 유전자 발현 정도에 따라 노화 지연의 표현형적 특징, 혹은 생산성 증대의 표현형적 특징을 나타낸다고 제안되고 있다(대한민국 특허출원 10-2011-0110593). 한편 ATPG4 유전자의 발현 양상과는 반대로, 면화에서 분리된 cytokinin 조절 유전자인 GhCKX의 발현억제는 생산성 증대와 녹기연장의 형질을 제공하는 것으로 알려졌다. 본 유전자의 극심한 발현 억제는 녹기연장의 형질을, 그런 반면 적절한 발현 억제는 fiber와 종자의 생산성 증대를 유도한다고 보고되고 있다(Zhao et al., Mol Breeding. 2015, 35:60). 이러한 유전자들의 기능은 발현 조절을 통해 생산성 증대 및 노화 지연의 형질을 제공한다는 점에서 유전자 발현 조절과 생산성 증대에 대한 연구는 더욱 가속화될 것이다.
최근 담배의 생애 주기에 따른 유전자 발현 조사(Edwards et al., BMC Genomics. 2010, 11:142)를 통하여 Tobacco Expression Atlas (TobEA) 데이터베이스가 확보되었으며 식물의 노화와 생장 조절에 대한 유전자 연구는 더욱 가속화되고 있다.
본 발명도 작물의 생산성 등의 향상을 가져올 수 있는 노화 지연 등의 기능을 가지는 유전자 등을 개시한다.
본 발명의 목적은 식물의 생산성 증대 기능을 가지고 노화 지연 기능을 가지는 MtATPG1 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생산량 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 노화 지연 특성을 갖는 식물체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 기타의 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 일 측면에 있어, 식물의 생산성 증대 기능을 가지고 노화 지연 기능을 가지는 MtATPG1 단백질에 관한 것이다.
본 발명자(들)는 하기 실시예에서 확인되는 바와 같이, 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)의 AT-hook DNA-binding protein(GeneBank accession number NC_016410.1)의 염기서열을 기초로 상기 단백질의 유전자를 분리하고 상기 유전자를 애기장대에 형질전환시켜 발현시켰을 때, 개체의 생체량 증가 및/또는 종자 생산성 증가라는 생산성 증대 특성이 뚜렷하게 나타나고, 이와 더불어 식물의 노화 지연 현상이 뚜렷하게 나타남을 확인하였다.
이러한 실험 결과는 상기 유전자 및 단백질이 식물의 생산성을 증대시키고, 식물체의 노화를 지연시키는 데 관여한다는 것을 의미한다고 할 수 있다.
본 발명자들은 상기 유전자를 MtATPG1 ( M edicago t runcatula AT-hook protein of Genomine 1) 유전자 및 MtATPG1 단백질로 명명하였으며, 이들 염기서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1(또는 도 16) 및 2(또는 도 17)에 개시되어 있다.
본 발명의 MtATPG1 단백질은 하기 (a), (b) 및 (c)의 폴리펩티드들 중 하나이다.
(a) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드; 및
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드.
본 명세서에서, "단백질"이라는 용어는 폴리펩티드와 동일한 의미로서 서로 혼용되어 사용되며, "유전자"라는 용어는 폴리뉴클레오티드와 동일한 의미로서 서로 혼용되어 사용된다.
본 명세서에서, "서열번호 2에 기재된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 비교하였을 때 여전히 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 보유하기에 충분한 정도의 서열번호 2의 아미노산 서열의 일부분을 포함하는 폴리펩티드로서 정의된다. 여전히 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 보유하기에 충분하면 되므로, 상기 폴리펩티드의 길이 그리고 그러한 폴리펩티드가 가지는 활성의 정도는 문제되지는 않는다. 즉 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 활성이 낮더라도, 여전히 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 가지는 폴리펩티드라면 그 길이야 어떻든 상기 "서열번호 2에 기재된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"에 포함된다는 것이다. 당업자라면, 즉 본 출원시를 기준으로 공지된 관련 선행기술을 숙지하고 있는 자라면, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 일부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩티드는 여전히 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 보유할 것이라고 기대할 것이다. 그러한 폴리펩티드로서 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드를 들 수 있다. 그것은 일반적으로 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실되더라도 그러한 폴리펩티드는 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 가진다고 당업계에 공지되어 있기 때문이다. 물론 경우에 따라서는, N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 단백질의 기능 유지에 필수적이서 N-말단 부분 또는 C-말단 부분이 결실된 폴리펩티드가 상기 기능을 나타내지 않는 경우가 있을 수 있겠지만, 그럼에도 그러한 비활성의 폴리펩티드를 활성의 폴리펩티드와 구분하고 검출해내는 것은 당업자의 통상의 능력 범위 내에 속한다. 나아가 N-말단 부분 또는 C-말단 부분뿐만 아니라 그 이외의 다른 부분이 결실되더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 가질 수 있다. 여기서도 당업자라면 그의 통상의 능력의 범위 내에서 이러한 결실된 폴리펩티드가 여전히 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 가지는가를 충분히 확인할 수 있을 것이다. 특히 본 명세서가 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 개시하고 있고 나아가 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되고 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 보유하는지를 확인한 실시예를 개시하고 있다는 점에서, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 일부 서열이 결실된 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것인가를 당업자는 그의 통상의 능력 범위 내에서 충분히 확인할 수 있다는 것이 매우 자명해진다. 그러므로 본 발명에 있어서 상기 "서열번호 2에 기재된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드"는 상기 정의와 같이 본 명세서의 개시 내용에 기초하여 당업자가 그의 통상의 능력 범위 내에서 제조 가능한 식물의 노화 지연 기능 및 생산성 증대 기능을 가지는 결실된 형태의 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미로서 이해되어야 한다.
또한 본 명세서에서, "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"란 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하지만, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 기능, 즉 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 여기서도 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 보유하기만 한다면 그러한 폴리펩티드가 가지는 활성의 정도나 아미노산이 치환된 정도는 문제되지 않는다. 바꿔 얘기해서, 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 그 활성이 아무리 낮더라도 또 많은 수의 치환된 아미노산을 포함하고 있다고 하더라도 그러한 폴리펩티드가 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 보유하기만 한다면 본 발명에 포함된다는 것이다. 하나 이상의 아미노산이 치환되더라도 치환되기 전의 아미노산이 치환된 아미노산과 화학적으로 등가라면, 그러한 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 여전히 본래의 폴리펩티드의 기능을 보유할 것이다. 예컨대, 소수성 아미노산인 알라닌이 다른 소수성의 아미노산, 예를 들면 글리신, 또는 보다 더 소수성인 아미노산, 예를 들면 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드는 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 마찬가지로, 음으로 하전된 아미노산 예컨대, 글루탐산이 다른 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 아스파르산으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드도 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이며, 또한 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌이 다른 양으로 하전된 아미노산, 예컨대, 리신으로 치환되더라도 그러한 치환된 아미노산(들)을 가지는 폴리펩티드 또한 활성은 낮더라도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 또한 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 부분에서 치환된 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩티드도 본래의 폴리펩티드가 가지는 기능을 여전히 보유할 것이다. 당업자라면, 그 전술한 바의 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 가지는 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 여전히 보유하는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한 당업자라면 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 여전히 위 기능을 가지는가를 확인할 수 있다. 더구나 본 명세서가 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 개시하고 있고 또한 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 지님을 확인한 실시예를 개시하고 있기 때문에, 본 발명의 "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 당업자에게 용이하게 실시 가능한 것임이 분명하다. 그러므로 "상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 여전히 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 가지는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미로서 이해되어야 한다. 이처럼 "상기 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 하나 이상의 치환된 아미노산을 포함하면서도 여전히 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 가지는 모든 폴리펩티드를 포함하는 의미이지만, 그럼에도 활성의 정도라는 관점에서 봤을 때, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 서열 상동성이 높을수록 바람직하다. 상기 폴리펩티드는 서열 상동성의 하한에 있어서 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직한 반면, 서열 상동성의 상한에 있어서는 당연히 100%의 서열 상동성을 지니는 것이 바람직하다. 보다 더 구체적으로 위 서열 상동성은 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 순서대로 높아질수록 바람직하다. 그리고 본 발명의 "상기 (a) 및 (b)의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드"는 "서열번호 2의 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드" 뿐만 아니라 '서열번호 2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드'를 포함하므로 전술한 바의 모든 설명은 "서열번호 2의 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드"에 대해서 뿐만 아니라 "서열번호 2의 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드"에 대해서도 적용되어진다.
본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대한 것이다. 여기서 "전술한 바의 폴리펩티드"란 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 지니면서 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 전체를 포함하는 폴리펩티드, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열의 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드, 및 위 폴리펩티드들과 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 전술한 바의 바람직한 양태의 모든 폴리펩티드들을 포함하는 의미이다. 그러므로 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 지니면서, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 그 실질적인 부분을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리펩티드들에 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 암호화는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 나아가 바람직한 양태로서 식물의 생산성 증대 및 식물 노화 지연 기능을 지니면서 전술한 바의 서열 상동성의 순서대로 그 서열 상동성을 지니는 모든 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 아미노산 서열이 밝혀졌을 때, 그러한 아미노산 서열에 기초하여 그러한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 당업자라면 용이하게 제조할 수 있다.
한편 본 명세서에서 상기 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드, 생물체 특히 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)에서 분리된 폴리뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드를 함유한 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하며, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA의 중합체를 모두 포함하는 것으로서 정의된다.
본 발명은 또 다른 측면에 있어, 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법은 (a) 식물체에서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 유전자를 발현시키는 단계 및 (b) 생산성 증대 특성을 갖는 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 명세서에서, "생산성 증대 특성"이란 식물체의 전체, 줄기, 뿌리 및/또는 잎의 생체량(biomass; 크기 및/또는 질량)이 야생형 식물체에 비하여 증가한 특성, 및/또는 식물체의 종자의 생산성(식물 1개체 당 종자의 수 및/또는 질량)이 야생형 식물체에 비하여 증가한 특성을 말한다.
또한 본 명세서에서, "식물체"란 성숙한 식물, 미성숙 식물(유식물체), 식물 종자, 식물 세포, 식물 조직 등을 포함하는 의미이다. 식물 세포나 식물 조직이 형질전환에 사용될 경우에 형질전환된 식물 세포나 식물 조직은 유럽특허 EP0116718, 유럽특허 EP0270822, 국제특허 WO 84/02913, 문헌[Gould et al. 1991, Plant Physiol 95,426-434] 등에 개시된 방법을 사용하여 성숙한 식물체로 발육·생장시킬 수 있다.
또한 본 명세서에서, "식물"이란 생산성 증가가 인간에게 유용한 결과를 줄 수 있는 모든 식물을 포함한다. 따라서 상기 식물의 의미에는 작물(구체적으로 식용작물, 사료작물, 공예작물 등의 농작물과 원예작물을 포함함), 임목, 관상식물을 포함한다. 구체적으로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 본 발명의 MtATPG1 유전자가 분리된 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)가 속하는 콩과 식물(구체적으로 매듭풀, 괭이싸리, 돌콩, 새콩, 여우팥, 대두, 완두, 잠두콩, 땅콩,렌주콩, 강낭콩, 루핀콩, 자주개자리 또는 클로버, 칡, 토끼풀, 괴화 등), 배추, 청경채, 케일, 콜리플라워, 브로콜리, 열무(young radish), 무, 갓, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나 등이 포함될 것이고, 또한 스위치그라스, 억새, 갈대 등과 같은 바이오에너지 작물과 기타 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립 등이 포함될 것이다.
또한 본 명세서에서 "서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자"란 첫째 서열번호 2의 아미노산을 암호화하면서도 코돈의 축퇴성(codon degeneracy)으로 인하여 서열번호 1의 유전자와 다른 염기서열을 갖는 유전자와, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자의 동족체(homologue)로서 식물의 생산성 증대 특성 등을 지니면서 식물의 종류에 따른 진화적 경로의 상이로 인하여 서열번호 1의 염기서열과 다른 염기서열로 이루어진 모든 유전자를 포함하는 의미이다. 여기서 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열로 이루어진 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 서열 상동성이 높을수록 바람직하고, 가장 바람직하게는 당연히 100%의 서열 상동성을 지닐 때이다. 한편, 서열 상동성의 하한에 있어서는 상기 유전자가 서열번호 1의 염기서열과 60% 이상의 서열 상동성을 지니는 경우가 바람직할 것이다. 보다 더 구체적으로는 위 서열 상동성이 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 순서대로 높아질수록 바람직하다.
본 발명의 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (a)는 유전공학적 방법으로 수행될 수 있다.
유전공학적인 방법은 (i) 상기 서열번호 1의 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 유전자를 그것을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계, 및 (ii) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 명세서에서, "작동 가능하게"란 어떤 유전자의 전사 및/또는 번역이 영향을 받도록 연결된다는 의미이다. 예컨대 어떠한 프로모터가 그것에 연결된 어떤 유전자의 전사에 영향을 준다면 그 프로모터와 그 유전자는 작동 가능하게 연결된 것이다.
또 본 명세서에서, "조절 서열"이란 그것의 존재가 그것에 연결된 유전자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 모든 서열을 포함하는 의미이며, 이러한 조절 서열에는 프로모터 서열, 전사종결 서열(polyadenylation signal ), 복제 개시점을 포함한다.
또한 본 명세서에서, "프로모터"는 당업계에 알려진 통상의 의미를 따르는데, 구체적으로는 어떤 유전자의 전사 개시점을 기준으로 상위(5'쪽)에 위치하고, DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시점, 전사 인자 결합 부위 등을 포함하는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 서열을 의미한다. 이러한 프로모터는 그것이 진핵생물 유래일 경우 전사 개시점 상위에 있는 TATA 박스(통상 전사 개시점(+1) -20 내지 -30 위치에 존재), CAAT 박스(통상 전사 개시 부위와 비교하여 대략 -75 위치에 존재), 5'인핸서, 전사 억제 인자 등을 포함한다.
사용 가능한 프로모터는 그것에 연결된 서열번호 1의 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터라면 구성적 프로모터(모든 식물체 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터), 유도성 프로모터(특정 외부 자극에 반응하여 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 또는 특정 발달 시기나 특정 조직에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터) 모두 사용될 수 있다. 사용 가능한 구성적 프로모터의 대표적인 예로는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S RNA 유전자의 프로모터를 들 수 있고, 그 밖에 유비퀴틴(ubiquitin) 계열의 프로모터(Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18, 675-689; EP0342926; Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 23, 567-581), 벼 액틴 프로모터(Zhang et al. 1991, The Plant Cell 3, 1155-1165) 등을 들 수 있다. 사용 가능한 유도성 프로모터의 예로는 구리 이온에 의해 활성화되는 효모 메탈로티오네인 프로모터(Mett 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 90:4567, 1993), 치환 벤젠설폰아미드에 의해 활성화되는 In2-1 및 In2-2 프로모터(Hershey 등, Plant Mol. Biol., 17:679, 1991), 글루코코르티코이드에 의해 조절되는 GRE 조절 서열(Schena 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 88:10421, 1991), 에탄올 조절성 프로모터(Caddick 등, Nature Biotech., 16:177, 1998), 리뷸로스 비스-포스페이트 카르복실라제(ssRUBISCO)의 소 서브유니트에서 유래한 광 조절성 프로모터(Coruzzi 등, EMBO J., 3:1671, 1984; Broglie 등, Science, 224:838, 1984), 만노핀 신타제 프로모터(Velten 등, EMBO J., 3:2723, 1984), 노팔린 신타제(NOS) 프로모터, 옥토핀 신타제(OCS) 프로모터, 열 충격 프로모터(Gurley 등, Mol. Cell. Biol., 6:559, 1986; Severin 등, Plant Mol. Biol., 15:827, 1990) 벼 글루테린(glutelin) 프로모터, 콩 유래 렉틴(lectin) 프로모터, 배추 유래 나핀(napin) 프로모터 등을 들 수 있다.
전사 종결 서열은 poly (A ) 첨가 신호( polyadenylation signal )로 작용하는 서열로서 전사의 완결성 및 효율성을 높이기 위한 것이다. 사용될 수 있는 전사 종결 서열의 예로는 노팔린 신타아제 (NOS) 유전자의 전사 종결 서열, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 유전자의 전사 종결 서열, 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 전사 종결 서열, 밀 열 쇼크 단백질 17의 전사 종결 서열, 밀 유비퀴틴 유전자의 전사 종결 서열, 벼 글루테린 유전자의 전사 종결 서열, 벼 락테이트 디하이드로게나제 유전자의 전사 종결 서열 등을 들 수 있다.
상기 발현벡터는 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다. 여기서 " 선별 마커 유전자"란 그러한 마커 유전자를 포함하는 식물체의 선별을 가능하게 하는 형질을 암호화하는 유전자를 의미한다. 선별 마커 유전자는 항생물질 내성 유전자일 수 있고 제초제 내성 유전자일 수도 있다. 항생물질 내성 유전자의 예로는 항생물질 내성 유전자의 예로는 퓨로마이신 내성 유전자(예컨대 Streptomyces alboniger로부터 유래된 퓨로마이신 N-아세틸 트랜스퍼라제 유전자), 네오마이신 내성 유전자(예컨대 Streptomyces fradiae로부터 유래된 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자), 하이그로마이신 내성 유전자(Streptomyces hygroscopicus 로부터 유래된 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자), 블레오마이신 내성 유전자(Streptomyces verticillus로부터 유래된 블레오마이신 결합 단백질), 블라스티시딘 내성 유전자(예컨대 Streptomyces verticillum로부터 유래된 블라스티시딘 S-아세틸트랜스퍼라제 유전자), 하이그로마이신 내성 유전자(예컨대 Escherichia coli로부터 유래된 아미노사이클리톨 포스포트랜스퍼라제 유전자), 암피실린 내성 유전자(β-락타마제 유전자) 등을 들 수 있고, 제초제 내성 유전자의 예로는 바스타 제초제 저항성 bar 유전자 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, 상기 "형질전환"이란 왜래 유전자가 도입됨에 의한 숙주 식물체의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 그 왜래 유전자가 숙주 식물체, 더 정확하게는 숙주 식물의 세포 내로 도입되어 세포의 게놈에 통합된 것을 의미한다. 여기서 왜래 유전자에는 동종성 유전자와 이종성 유전자가 포함되는데, "동종성 유전자"란 숙주 유기체 또는 그와 동일한 생물종의 내인성 유전자를 의미하며, "이종성 유전자"란 그것이 형질전환되는 유기체에서는 존재하지 않는 유전자를 말한다. 예컨대 본 발명의 MtATPG1 유전자는 그것이 분리된 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)에는 동종성 유전자이지만, 애기장대나 토마토 식물에서는 이종성 유전자가 된다.
한편, 외래성 유전자로 식물을 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있는데, 예컨대 유전자 총을 사용한 직접적인 유전자 전달 방법, 프로랄 딥(floral dip)을 이용한 in planta 형질전환 방법, 화분 매개 형질전환 방법, 원형질체의 형질전환 방법, 바이러스 매개 형질전환 방법, 리포좀 매개 형질전환 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 특정 식물체에 적합한 형질전환 방법을 선택하여 사용할 수도 있는데, 예컨대 옥수수를 형질전환시키는 방법은 미국특허 US 6,140,553, 문헌(Fromm et al, 1990, Bio/Technology 8, 833-839), 문헌(Gordon-Kamm et al, 1990, The Plant Cell 2, 603-618) 등에 개시된 방법을 사용할 수 있으며, 벼를 형질전환시키기 위한 방법은 문헌(Shimamoto et al, 1989, Nature 338, 274-276), 문헌(Datta et al 1990, Bio/Technology 8, 736-740), 국제특허 WO 92/09696, 국제특허 WO 94/00977, 국제특허 WO 95/06722 등에 개시된 방법을 사용할 수 있다. 또 토마토나 담배 형질전환에 있어서는 문헌(An G. et al., 1986, Plant Physiol. 81: 301-305), 문헌 (Horsch R.B. et al, 1988, In: Plant Molecular Biology Manual A5, Dordrecht, Netherlands, Kluwer Academic Publishers, pp 1-9), 문헌(Koornneef M. et al, 1986, In: Nevins DJ. and R.A. Jones, eds. Tomato Biotechnology, New York, NY, USA, Alan R. Liss, Inc. pp 169-178) 등에 개시된 방법을 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 MtATPG1 유전자가 콩과식물에 속하는 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)에서 분리되었다는 점에서 본 발명의 MtATPG1 유전자는 그 콩과식물의 품종개량에 유용하게 사용되기 위해 콩과식물에 형질전환될 수 있는데, 이러한 콩과식물의 형질전환 방법 또한 당업계에 다수의 문헌을 통하여 공지되어 있다. 그러한 문헌으로서 예컨대 문헌(Plant Science (Shannon) 150(1), Jan.14, 2000, 41-49), 문헌(J. of Plant Biochemistry ＆ Biotechnology 9(2) July, 2000, 107-110), 문헌(Acta Physiologiae Plantarum 22(2), 2000, 111-119), 문헌(Molecular Breeding 5(1) 1999, 43-51), 문헌(In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology, Animal 34 (3 part 2) March, 1998, 53A), 문헌(Plant Cell Reports 16(8), 1997, 513-519 and 541-544), 문헌(Theoretical ＆ Applied Genetics 94(2), 1997, 151-158), 문헌(Plant Science, 117 (1-2), 1996, 131-138), 문헌(Plant Cell Reports 16(1-2), 1996, 32-37) 등을 들 수 있다.
일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이, 형질전환된 아그로박테리움으로 유식물체, 식물 종자 등을 감염시키는 방법이다.
이러한 아그로박테리움이 매개된 형질전환 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며(Chilton 등, 1977, Cell 11:263:271; 유럽특허 EP 0116718; 미국특허 US 4,940,838), 특정 식물체에 적합한 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 목화에 대해서는 미국특허 US 5,159,135, 콩에 대해서는 미국특허 US 5,824,877, 옥수수에 대해서는 미국특허 US 5,591,616 등을 참조할 수 있다. 아그로박테리움 매개 형질전환 방법은 Ti-플라스미드를 이용하는데, 이 플라스미드에는 T-DNA를 식물 세포의 게놈으로 통합시킬 수 있는 좌우 경계(border) 서열이 포함될 것이다.
한편, 상기 (b) 선별 단계는 형질전환된 식물체를 발육·성장시켜 삽입된 유전자의 특성을 통해 선별하거나, 형질전환 시에 선별 마커 유전자가 함께 형질전환될 경우에는 선별 마커 유전자를 이용하여 선별할 수 있다. 삽입된 유전자의 특성으로서는 식물체의 생체량 및/또는 종자의 생산성을 들 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 노화 지연 특성을 갖는 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 노화 지연 특성을 갖는 식물체의 제조 방법은 (a) 식물체에서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 유전자를 발현시키는 단계 및 (b) 노화가 지연된 표현형을 갖는 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 명세서에서, "노화 지연"이란 야생형 식물체에 비하여 식물 수명이 연장된 특성을 말하며, 구체적으로는 잎 및/또는 줄기의 황화 현상 및/또는 괴사 현상이 야생형 식물체 비하여 지연되거나 식물체의 엽록소 함량이 야생형 식물체에 비하여 많거나 식물체의 광합성 효율이 야생형 식물체 비하여 높은 특성 말한다.
상기 (a) 단계는 유전공학적으로 수행될 수 있는데, 이러한 유전공학적 방법에 대해서는 본 발명의 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법과 관련하여 설명한 바와 같다.
상기 (b) 선별 단계는 형질전환된 식물체를 발육·성장시켜 삽입된 유전자의 특성인 노화 지연 특성을 이용하여 선별하거나(잎의 황화 현상이나 괴사 현상의 진행 정도, 엽록소 함량, 광합성 효율 등을 정량하는 방법, 상기 방법들을 혼합한 방법 등을 통해 선별하는 방법임), 형질전환 시에 선별 마커 유전자가 함께 형질전환될 경우에는 선별 마커 유전자를 이용하여 선별할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 식물체의 생산성 증대 방법에 관한 것이다.
본 발명의 식물체의 생산성 증대 방법은 (a) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 유전자를 그것을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키고 (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 식물체의 노화를 지연시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 식물체의 노화를 지연시키는 방법은 (a) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 유전자를 그것을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키고 (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계를 포함한다.
상기 방법들에서 상기 (a) 및 (b) 단계는 상기 본 발명의 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법과 관련하여 설명한 바와 같다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 본 발명의 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법에 의하여 얻어진, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 유전자가 발현된, 생산성 증대 특성을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다.
바람직한 측면에 있어서, 상기 식물체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 MtATPG1 단백질을 암호화하는 유전자, 특히 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 MtATPG1이 식물체로 도입되어 발현됨으로써 생산성 증대 특성을 갖는 형질전환 식물체이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 본 발명의 노화 지연 특성을 갖는 식물체의 제조 방법에 의하여 얻어진, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 유사한 서열을 갖는 유전자가 발현된, 노화 지연 특성을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다.
바람직한 측면에 있어서, 상기 식물체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 MtATPG1 단백질을 암호화하는 유전자, 특히 서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 MtATPG1이 식물체로 도입되어 발현됨으로써 노화 지연 특성을 갖는 형질전환 식물체이다.
본 명세서에서, 상기 "형질전환 식물체"는 성숙한 식물로 발육·성장할 수 있는 식물 세포, 식물 조직, 또는 식물 종자에 상기 유전자가 도입되어 형질전환된 경우뿐만 아니라 형질전환된 식물과의 교배에 의해 얻어지는 게놈이 변형된 식물체, 그 식물체로부터 유래한 식물 종자, 식물 세포, 식물 조직을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 식물의 생산성 증대 기능과 노화 지연 기능을 가지는 MtATPG1 단백질과 그 유전자인 MtATPG1을 제공할 수 있다. 상기 유전자는 식물의 생산성 증대 기능 및 노화 지연 기능을 제공하므로, 이 유전자로 식물체를 형질전환시킬 경우, 생산성을 증가시킬 뿐만 아니라 식물의 노화 지연 기능을 가지는 식물체를 제작할 수 있다.
도 1은 식물의 생산성 증대 기능과 노화 지연 기능을 가지는 MtATPG1 유전자가 센스 방향으로 도입된 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터의 구조(모식도)를 나타낸 것이다.
도 2는 상기 도 1의 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 T2 라인을 발아 후 50일과 70일 동안 생육시킨 애기장대의 사진이다. DAG, day after germination.
Con: 애기장대 야생형 혹은 대조구
MtATPG1-3: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-9: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-11: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-17: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
도 3은 상기 도 1의 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 T2 라인을 자엽 생성 후 24일 동안 생육시킨 애기장대의 MtATPG1 유전자의 발현 양상을 qRT-PCR을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이며, TUB를 PCR 양성 대조구로 사용하였다.
Con: 애기장대 야생형
MtATPG1-3: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-9: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-11: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-17: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
도 4는 상기 도 3의 애기장대 라인의 생산성 증대에 대한 그림이다.
Con: 애기장대 야생형
MtATPG1-3: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-9: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-11: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
MtATPG1-17: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T2 라인
Height: 키, NTS: 장각과 수, FW: 생체량, DW: 생체 건량, TSW: 총 종자 무게, TNS: 총 종자 수, 1,000SW: 1,000개의 종자 무게
도 5는 MtATPG1 발현 애기장대 T2 형질전환체의 cytokinin 생합성 과정에 관여하는 IPT 유전자군과 MtATPG1 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이며, TUB를 PCR 양성 대조구로 사용하였다. 적용된 IPT1 , IPT3 , IPT5, 그리고 IPT7 유전자들은 cytokinin 생합성 과정에 관여하는 유전자군이다.
도 6은 MtATPG1 발현 애기장대 T2 형질전환체의 cytokinin signaling pathway에서 CLV1 유전자, histidine kinase (HK) 유전자군, 그리고 MtATPG1 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이며, TUB를 PCR 양성 대조구로 사용하였다.
도 7은 MtATPG1 발현 애기장대 T2 형질전환체의 cytokinin signaling pathway에서 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군과 MtATPG1 유전자의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 나타낸 것이며, TUB를 PCR 양성 대조구로 사용하였다.
도 8은 애기장대의 cytokinin signaling 경로를 통한 생산성 증대와 노화 지연의 기능을 가지는 MtATPG1 유전자의 역할에 대한 제안 가능한 모델을 나타낸 것이다.
도 9는 상기 도 1의 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 T3 homo 라인을 발아 후 40일 동안 생육시킨 애기장대의 사진이다. DAG, day after germination.
Con: 애기장대 야생형 혹은 대조구
MtATPG1 -3-15: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -3-20: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -9-1: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -9-18: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -11-2: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -11-7: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
도 10은 상기 도 1의 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 T3 homo 라인을 발아 후 60일 동안 생육시킨 애기장대의 사진이다. DAG, day after germination.
Con: 애기장대 야생형 혹은 대조구
MtATPG1 -3-15: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -3-20: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -9-1: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -9-18: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -11-2: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
MtATPG1 -11-7: pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대 T3 homo 라인
도 11은 자엽 생성 후 16일부터 애기장대 야생형(Con)과 변이체 MtATPG1 -3-15, MtATPG1 -3-20, MtATPG1 -9-1, MtATPG1 -9-18, MtATPG1 -11-2, 그리고 MtATPG1 -11-7의 3-4번 좌엽(rosette leaf)을 매 4일마다 44일까지 잎의 표현형을 관찰한 그림이며, 도 12는 이에 대한 잎의 엽록소 함량의 조사한 그림이다. DAE, day after emersion.
도 13은 발아 후 21일째 애기장대 야생형(Con)과 변이체 MtATPG1 -3-15, MtATPG1-3-20, MtATPG1 -9-1, MtATPG1 -9-18, MtATPG1 -11-2, 그리고 MtATPG1 -11-7의 3-4번 좌엽을 detach하여 암상태를 유지하여 매 2일마다 8일까지 잎의 표현형을 관찰한 그림이며, 도 14는 이에 대한 잎의 엽록소 함량을 조사한 그림이다. DAT, day after treatment.
도 15는 발아 후 25일째 애기장대 야생형(Con)과 변이체 MtATPG1 -3-15, MtATPG1-3-20, MtATPG1 -9-1, MtATPG1 -9-18, MtATPG1 -11-2, 그리고 MtATPG1 -11-7의 3-4번 좌엽을 detach하여 6일간 H2O2를 처리한 잎의 표현형 변화를 도시한 그림이며, 도 13B는 동일 조건의 시료에 6일간 NaCl을 처리한 잎의 표현형 변화를 도시한 그림이다. DAT, day after treatment.
도 16 및 도 17은 각각 MtATPG1 유전자의 염기서열과 MtATPG1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
는하 본 발명의 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> Medicago truncatula로부터 식물의 생산성 증대와 노화 지연 기능을 제공하는 MtATPG1 유전자의 분리
식물의 생산성 증대와 노화 지연 기능을 가지는 MtATPG1 유전자를 Medicago truncatula로부터 분리하기 위하여 다음과 같은 과정을 수행하였다.
<실시예 1-1> Medicago truncatula 의 재배 및 배양
Medicago truncatula Jemalong A17(New Phytologist, 174:299-303, 2007)은 토양을 담은 화분에서 22℃의 온도에서 16/8시간 명암 주기로 조절되는 생장 조절기(growth chamber)내에서 재배하였다.
<실시예 1-2> RNA 추출과 cDNA 라이브러리의 제조
Medicago truncatula cDNA 라이브러리를 만들기 위해서 여러 분화 단계의 전체 기관으로부터 RNasey Plant Mini Kit(QIAGEN, Germany)을 사용하여 RNA를 추출하였고, 추출된 전체 RNA로부터 Superscript III Reverse Tanscriptase(INVITROGEN, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
<실시예 1-3> 식물의 생산성 증대와 노화 지연을 제공하는 MtATPG1 유전자 분리
M. truncatula의 AT-hook DNA-binding protein(GeneBank accession number NC_016410.1)의 염기서열을 기초로 하여 서열번호 3으로 표기된 제한효소 BglII의 서열이 포함된 정방향 primer(BglII/MTR4g 098450-F, 5'-AGA TCT ATG CAA AAC ATC CAC AGG CAA AA-3')와 서열번호 4로 표기된 제한효소 BstEII의 서열이 포함된 역방향 primer(BstEII/MTR4g 098450-R, 5'-GGT GAC CTC AAA AAG GTT GAC GTG AAG CTG-3')를 합성하였다. 상기 primer를 사용하여 M. truncatula cDNA로부터 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 전장 cDNA를 증폭하고 분리하였다.
상기 분리된 cDNA의 분석 결과, 약 29.5 kDa의 분자량을 갖는 285개의 아미노산을 암호화하는 858bp 크기의 전사 해독 틀(ORF)을 가지고 있으며, 1 개의 엑손(exon)으로 구성되어 있음을 확인하였고, AT-hook motif를 가지고 있어 이를 MtATPG1( M edicago t runcatula AT-hook protein of Genomine 1)으로 명명하였다. 이하 유전자는 이탤릭체를 사용하여 "MtATPG1" 혹은 "MtATPG1 유전자"라 하고, 단백질은 "MtATPG1" 혹은 "MtATPG1 단백질"이라고 한다.
< 실시예 2> MtATPG1 유전자에 대한 센스 구성체(construct)가 도입된 형질전환 애기장대의 제조 및 특성 분석
<실시예 2-1> MtATPG1 유전자에 대한 센스 구성체가 도입된 형질전환 애기장대의 제조
상기 유전자가 식물의 생산성 증대와 노화 지연을 제공하는지를 확인하기 위하여 MtATPG1 유전자가 센스 방향으로 도입된 형질전환 애기장대를 제조하여 MtATPG1 전사체의 발현을 변화시켰다.
서열번호 3으로 표시되고 제한효소 BglII의 서열이 포함된 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 표시되고 제한효소 BstEII의 서열이 포함된 역방향 프라이머를 이용하여 M. truncatula의 cDNA로부터 PCR을 이용하여 MtATPG1 cDNA를 증폭하였다. 상기 DNA를 제한효소 BglII와 BstEII로 절단하고, 유도성 프로모터(inducible promoter)인 SEN1 프로모터의 조절을 받도록 제작한 pCSEN 벡터에 센스 방향으로 클로닝하여 MtATPG1 유전자에 대한 센스 구성체인 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 SEN1 프로모터는 식물의 생장 단계에 따라 발현되는 유전자에 대해 특이성을 갖는다.
한편, 도 1은 pCSEN 벡터에 MtATPG1 유전자가 센스 방향으로 도입된 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터를 도시한 그림이다. 도 1에서 BAR는 바스타 제초제에 대한 저항성을 부여하는 BAR 유전자(phosphinothricin acetyltransferase gene)를 가리키고, RB는 오른쪽 경계(Right Border), LB는 왼쪽 경계(Left Border), p35S는 CaMV 35S 프로모터, T35S는 CaMV 35S RNA polyA, pSEN은 SEN1 프로모터, NOS polyA는 노파린 합성 유전자(nopaline synthase gene)의 polyA를 가리킨다.
상기 pCSEN-MtATPG1 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에 일랙트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 도입시켰다. 형질전환된 아그로박테리움 배양액을 28℃에서 O.D.600 값이 1.0이 될 때까지 배양하였고, 25℃에서 5,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 최종 O.D.600 값이 2.0이 될 때까지 Infiltration Medium(IM; 1X MS SALTS, 1X B5 vitamin, 5% sucrose, 0.005% Silwet L-77, Lehle Seed, USA) 배지에 현탁하였다. 4주된 애기장대를 진공 챔버(vacuum chamber)에 있는 아그로박테리움 현탁액에 침지시키고, 10분 동안 104 Pa의 진공 하에 두었다. 침지 후, 애기장대를 24시간 동안 폴리에틸렌 백(polyethylene bag)에 두었다. 이후, 형질전환된 애기장대를 계속 생장시켜 종자(T1)를 수확하였다. 대조군으로는 형질전환되지 않은 야생형(wild type) 애기장대 또는 MtATPG1 유전자가 포함되지 않은 벡터(pCSEN 벡터)만으로 형질전환된 애기장대를 사용하였다.
<실시예 2-2> T2 형질전환 애기장대의 특성 분석
상기 <실시예 2-1>에서와 같이 형질전환한 애기장대에서 수확한 종자는 0.1% 바스타(Basta) 제초제(경농, 한국) 용액에서 30분 동안 침지시키고 배양함으로써 선별하였다. 이후 형질전환한 애기장대의 생육 동안 상기 화분에 바스타 제초제를 5회 처리한 후, 각 화분에서 형질전환된 애기장대를 선별하였다. pCSEN-MtATPG1 벡터로 형질전환된 T1 애기장대는 대조군(MtATPG1 유전자가 포함되지 않은 벡터(pCSEN 벡터)만으로 형질전환된 애기장대 혹은 야생형 애기장대)과 그들의 표현형을 비교하여 볼 때, 놀랍게도 변이체들은 뚜렷한 다수성 형질 및 바이오매스 증대 형질을 보였다.
이러한 형질전환 애기장대의 표현형 변화를 보다 정확히 확인하기 위하여 T1 형질전환 애기장대로부터 T2 형질전환 종자를 받아 이들 라인의 표현형을 조사하였다. 선별된 애기장대 T2 형질전환 라인들의 표현형 확인은 발아 후 50일째와 70일째 수행하였다(도 2). pCSEN-MtATPG1 구성체를 가지고 있는 MtATPG1 -3, MtATPG1 -9, MtATPG1-11과 MtATPG1 -17 변이체 라인은 애기장대 대조구(Col-0)와 비교하여 볼 때, 식물체의 개체 크기 증가와 같은 바이오매스 증대와 장각과 수의 증가 현상이 뚜렷하게 나타났으며, 아울러 이들 변이체들은 종자 생산량에서도 뚜렷한 증가 현상이 유발되었다.
선별된 생산성 증대 표현형을 가지는 변이체의 MtATPG1 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 자엽 생성 후 24일 동안 생육한 애기장대 야생형과 MtATPG1 -3, MtATPG1-9, MtATPG1 -11과 MtATPG1 -17 변이체의 잎으로부터 RNasey Plant Mini Kit(QIAGEN, Germany)을 사용하여 전체 RNA를 각각 추출하였다. 각각 1㎍의 RNA를 주형으로 하고, Superscript III Reverse Tanscriptase(INVITROGEN, USA)을 이용하여 65℃에서 5분; 50℃에서 60분; 및 70℃에서 15분의 조건으로 cDNA를 합성하였다. 이후, 합성된 cDNA를 주형으로 하고, 하기 MtATPG1 유전자와 PCR 양성 대조구로 사용된 Tubulin 유전자에 대해 하기 [표 1]의 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 2분간 가열하여 주형 DNA를 변성시킨 후, 94℃에서 1분; 55℃에서 1분 30초; 및 72℃에서 1분을 한 사이클로 하여 총 30회 반복 수행한 다음, 72℃에서 15분간 최종 반응시켜 수행하였다. 이후, 1% 아가로스 겔 전기영동으로 PCR 산물을 확인하였으며, 그 결과는 도 3에 도시되었다.
그 결과, 4개의 변이체 라인 모두 애기장대 대조구에 비하여 MtATPG1 유전자의 발현이 나타남을 확인하였으며, 이러한 사실은 본 변이체들이 MtATPG1 유전자가 도입된 변이체임을 증명하고 있다. 흥미롭게도, 4개의 변이체 라인 모두 개체 크기와 장각과 생산량 증가와 같은 다수성의 표현형적 특징을 가지는 것으로 나타났다. 한편 본 변이체들은 애기장대의 AT-hook protein을 암호화하는 ATPG 유전자 그룹에서 나타나는(Lim et al., Plant J. 2007, 52:1140, 대한민국 특허출원 10-2011-0110593) 녹기 연장의 형질은 그리 강하게 나타나지 않았으나, 여전히 유전자의 발현 정도가 높은 변이체 MtATPG1 -11과 MtATPG1 -17에서는 녹기 연장의 형질을 가지고 있음을 알 수 있었다(아래 실시예 5의 결과 참조). 이러한 결과를 종합하여 보면, 우리가 제시한 유전자 발현조절을 통한 녹기 연장과 생산성 증대에 대한 모델이 적합하다는 것을 확인할 수 있었다. 즉, MtAPTG1 유전자의 도입은 다수성에 대한 표현형적 특징을 제공하며, 이들의 높은 발현량은 녹기 연장의 표현형적 특징을 제공한다는 것이다. 따라서 본 유전자의 적정 발현은 종자의 수확시기가 대조구와 비슷한 다수성 형질을 제공한다는 점에서 다수성 작물 개발에 보다 많은 장점을 제공하리라 확신한다.
MtATPG1 유전자와 TUB 유전자 발현을 위한 프라이머 서열 및 서열번호
유전자명 정방향/역방향프라이머 (서열번호)
MtATPG1 5'-AGA TCT ATG CAA AAC ATC CAC AGG CAA AA-3' (서열번호 5) 5'-GGT GAC CTC AAA AAG GTT GAC GTG AAG CTG-3' (서열번호 6)
Tubulin 5'-AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3'(서열번호 7) 5'- CCT TCT TCA TCC GCA GTT - 3'( 서열번호 8)
<실시예 3> MtATPG1 발현 변이체의 생산성 증대에 대한 특성 분석
MtATPG1 유전자의 발현을 통하여 얻어진 식물체의 생산성 증대에 대한 특성을 확인하기 위하여 변이체 MtATPG1 -3, MtATPG1 -9, MtATPG1 -11과 MtATPG1 -17의 라인별로 종자 수확량 등과 같은 생산성 증대 지표를 적용하여 애기장대 대조구와 비교해 보았다.
적용된 생산성 증대 지표는 식물의 키(height), 장각과(silique) 수(NTS), 생체량(FW), 생체건량(DW), 총 종자 무게(TSW), 총 종자 수(TNS), 그리고 1,000개의 종자 무게(1,000SW)이며, 결과는 라인별로 각 20개체의 평균값이다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, MtATPG1 유전자 발현 변이체 라인, MtATPG1-3, MtATPG1 -9, MtATPG1 -11과 MtATPG1 -17 모두는 애기장대 대조구에 비하여 1.5배 이상의 종자 생산이 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 MtATPG1 -3은 대조구에 비하여 2배 이상의 종자 생산이 증가하였다. 이러한 종자 생산의 증가와 비례하여 모든 변이체 라인들은 장각과 수의 증가 패턴을 가졌다. 한편 종자 1,000개의 무게는 약간의 차이는 있으나 거의 대부분이 대조구와 비슷한 것으로 나타났다. 이러한 사실로 미루어보아 MtATPG1 유전자의 발현은 종자 크기에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 생각되는 반면, 장각과 수의 증가를 유도하여 최종적으로 종자 생산량 증가를 이끄는 것으로 생각된다. 그리고 식물체의 크기에는 변이체와 대조구에 있어서 큰 차이가 없었으나 생체량과 생체 건량에 있어서는, 특히 생체 건량에 있어서는 변이체 모두는 대조구에 비하여 뚜렷한 증가 현상이 나타났다.
흥미로운 사실은 생산성 증대 특정 형질을 가지는 변이체 라인들의 수확 시기는 애기장대 대조구와 큰 차이가 없다는 것이다. 이러한 사실은 본 유전자의 발현으로 인한 생산성 증대는 대조구의 수확시기가 비슷하여 작물의 수확시기에 대한 문제점을 최소화할 수 있다는 것이다.
따라서 본 유전자의 주요 작물 품종 개발에 대한 적용은 다수성 형질 및 바이오매스 증대와 같은 생산성 증대 증대라는 측면에서 매우 가치가 높을 것으로 판단된다.
< 실시예 4> MtATPG1 발현 변이체의 cytokinin signaling pathway에 대한 특성 분석
M. truncatula에서 분리한 MtATPG1 유전자가 애기장대의 cytokinin 생합성에 관여하는지를 규명하기 위하여 애기장대 cytokinin 생합성 유전자 IPT (isopentenyltransferase) 유전자군의 IPT1 (AT1G68460), IPT3 (AT3G63110), IPT5 (AT5G19040), 그리고 IPT7 (AT3G23630) 유전자의 발현을 애기장대 야생형과 변이체 MtATPG1-3, MtATPG1 -9, 그리고 MtATPG1 -11을 대상으로 조사하였다(도 5). 적용된 유전자 및 MtATPG1과 양성대조구인 tubulin에 대한 RT-PCR용 primer 정보는 표 2에서 제시하였다. 그 결과 IPT 유전자들의 발현, 특히 애기장대 잎에 많이 발현되는 IPT3 유전자의 발현은 대조구와 비교하여 약간의 차이는 있으나 변이체 모두에서 큰 차이를 가지지 않았다 .
cytokinin 생합성에 관여하는 IPT 유전자군, MtATPG1 유전자, 그리고 양성 대조구인 TUB 유전자 발현을 위한 프라이머 서열 및 서열번호
유전자명 정방향/역방향프라이머 (서열번호)
IPT1 5'-TAC TCG TTT CCC TTC AG-3'(서열번호 9) 5'-ACC CAG ATG AAA CAA CA-3'(서열번호 10)
IPT3 5'-ACA ACC ATT GCC TCC TT-3'(서열번호 11) 5'-CGG ATT CAA TGG AGA GA-3'(서열번호 12)
IPT5 5'-TCC TGA GGA AAG CCT TG-3'(서열번호 13) 5'-AGC TCT GGA ACT CCA AT-3'(서열번호 14)
IPT7 5'-GGT CGA CGT TTC CTT AC-3'(서열번호 15) 5'-GAT TCT CTC GCT TGG TC-3'(서열번호 16)
MtATPG1 5'-AGA TCT ATG CAA AAC ATC CAC AGG CAA AA-3'(서열번호 5) 5'-GGT GAC CTC AAA AAG GTT GAC GTG AAG CTG-3'(서열번호 6)
Tubulin 5'-AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3'(서열번호 7) 5'-CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3'(서열번호 8)
우리는 또한 cytokinin signaling pathway 중 CLV1 / WUS pathway에 관여하는 CLV1 유전자(receptor protein kinase CLAVATA1, AT1G75820)와 cytokinin receptor로서 기능을 가지는 histidine kinase 유전자군의 HK2(histidine kinase 2, AT5G35750), HK3(histidin kinase3, AT1G27320) 그리고 CRE1(HK4: histidine kinase 4, AT2G01830) 유전자의 발현을 애기장대 야생형과 MtATPG1 -3, MtATPG1 -9, 그리고 MtATPG1 -11을 대상으로 조사하였다(도 6). 적용된 유전자 및 MtATPG1과 양성대조구인 tubulin에 대한 RT-PCR용 primer 정보는 표 3에서 제시하였다. 그 결과 흥미롭게도 CRE1 유전자의 발현은 약간의 차이는 있지만 MtATPG1 유전자 발현 정도와 비례하여 변이체에서 발현된 반면, HK2와 HK3 유전자의 발현은 오히려 MtATPG1 유전자 발현 정도가 낮은 MtATPG1 -3 변이체에서 높게 나타났다. 한편 CLV1 유전자의 발현은 대조구와 비교하여 변이체 모두에서 큰 차이를 가지지 않았다. 이러한 사실을 통하여 MtATPG1 유전자가 cytokinin pathway 중 cytokinin 생합성 및 CLV1/WUS pathway에는 크게 관여하지 않으며, cytokinin receptor중 CRE1 유전자의 발현에 비례적으로, 그리고 HK2와 HK3 유전자의 발현에는 반비례적으로 관여한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 MtATPG1 유전자 발현은 CRE1 유전자의 발현을 비례적으로 조절하고, MtATPG1 유전자의 낮은 발현량은 HK2와 HK3 유전자의 높은 발현을 유도하여 다수성 형질을 제공하고 MtATPG1 유전자의 높은 발현량은 CRE1의 높은 발현량을 유도하여 다수성 형질과 더불어 일부 녹기 연장의 형질을 제공한다는 가설을 세울 수 있었다.
cytokinin signaling pathway에서 CLV1 유전자, histidine kinase ( HK ) 유전자군, MtATPG1 , 그리고 양성 대조구 TUB 유전자에 대한 RT-PCR용 primer 서열 및 서열번호
유전자 정방향/역방향프라이머 (서열번호)
CLV1 CLV1-RT-F : 5'-ACT TAC CTC TGT CTC CCT CA-3'(서열번호 17) CLV1-RT-R : 5'-GAC CAC CTT TAG ATC CAT GC-3'(서열번호 18)
HK3 HK3-RT-F : 5'-CAA CAA CCA GCC CAT ATT CTC-3'(서열번호 19) HK3-RT-R : 5'-TTC CAA TAC CCA ATC CCC TC-3'(서얼번호 20)
CRE1 WOL-RT-F : 5'-CTG AGG AGC AGT CAT TAT CG-3'(서열번호 21) WOL-RT-R : 5'-GGT TTT GTT GGG AGA GGA GA-3'(서열번호 22)
HK2 HK2-RT-F : 5'-GTA TGG CTC AGA AAT TGG GG-3'(서열번호 23) HK2-RT-R : 5'-GCC AGA GAG GAG AGA TGA AA-3'(서열번호 24)
MtATPG1 5'-AGA TCT ATG CAA AAC ATC CAC AGG CAA AA-3' (서열번호 5) 5'-GGT GAC CTC AAA AAG GTT GAC GTG AAG CTG-3' (서열번호 6)
Tubulin 5'-AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3'(서열번호 7) 5'-CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3'(서열번호 8)
우리는 cytokinin signaling의 다음 단계인 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군의 AHP1 , AHP2 , AHP3 , AHP4 , AHP5 , 그리고 AHP6 유전자의 발현 양상 또한 조사하였다(도 7). 상기 유전자의 발현 양상은 RT-PCR을 통하여 분석하였으며, 사용된 프라이머 정보는 표 4에서 제시하였다. 그 결과, 형질전환체의 MtATPG1 유전자의 발현량과 비례적으로 발현한 유전자는 AHP1이었으며, 흥미롭게도 AHP2~AHP6 유전자는 MtATPG1의 발현량과 거의 반비례적으로 발현되었다. 즉 MtATPG1의 발현량이 상대적으로 높으면 AHP2 ~ AHP6 유전자는 대조구와 유사하거나 낮은 발현량을 나타낸 반면 MtATPG1의 발현량이 상대적으로 낮으면 AHP2 ~ AHP6 유전자는 상대적으로 대조구보다 높은 발현량을 나타내었다. 이러한 사실은 MtATPG1 유전자 발현은 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군 중 AHP1 유전자의 발현을 비례적으로 조절하고, MtATPG1 유전자의 상대적으로 높은 발현은 AHP2 ~ AHP6 유전자에 대한 negative regulator로 작용하는 반면 MtATPG1 유전자의 상대적으로 낮은 발현은 AHP2 ~ AHP6 유전자에 대한 positive regulator로 작용한다는 것을 시사한다.
cytokinin signaling pathway에서 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군, MtATPG1, 그리고 양성 대조구 TUB 유전자에 대한 RT-PCR용 primer 서열 및 서열번호
유전자 정방향/역방향프라이머 (서열번호)
AHP1 (AT3G21510) AHP1-RT-F: 5'-ATGGATTTGGTTCAGAAGCAGAA-3(서열번호 25)AHP1-RT-R: 5'-TCAAAATCCGAGTTCGACGGCC-3(서열번호 26)
AHP2 (AT3G29350) AHP2I-RT-F: 5'-ATGGACGCTCTCATTGCTCAGC-3(서열번호 27)AHP2I-RT-R: 5'-TTA GTT AAT ATC CAC TTG AGG AAC -3'(서열번호 28)
AHP3 (AT5G39340) AHP3-RT-F: 5'-GGACACACTCATTGCTCAGT-3'(서열번호 29)AHP3-RT-R: 5'-CTGCAAACATCTCACACACC-3'(서열번호 30)
AHP4 (AT3G16360) AHP4I-RT-F: 5'-ATGCAGAGGCAAGTGGCACTCA-3'(서열번호 31)AHP4I-RT-R: 5'-TTACTTGGGCCTACGTGCTGTC-3'(서열번호 32)
AHP5 (AT1G03430) AHP5-RT-F: 5'-GGTAGTAGCTCCAGTGTCG-3' (서열번호 33)AHP5-RT-R: 5'-CTAATTTATATCCACTTGAGGAAT-3'(서열번호 34)
AHP6 (AT1G80100) AHP6-3UTR-F: 5'-CAAGCCGACATCAACCGGCTC-3'(서열번호 35)AHP6-3UTR-R: 5'-AGGGTTTCGCTTCGGTAGCTT-3'(서열번호 36)
MtATPG1 5'-AGA TCT ATG CAA AAC ATC CAC AGG CAA AA-3'(서열번호 5) 5'-GGT GAC CTC AAA AAG GTT GAC GTG AAG CTG-3'(서열번호 6)
Tubulin 5'-AAG AGG TTC TCA GCA GTA-3(서열번호 7) 5'-CCT TCT TCA TCC GCA GTT-3(서열번호 8)
이러한 분석을 통하여 우리는 다음과 같은 가설을 세울 수 있었다: 1) MtATPG1은 cytokinin pathway 중 cytokinin 생합성 및 CLV1/WUS pathway에는 크게 관여하지 않음, 2) MtATPG1은cytokinin receptor 유전자 중 CRE1 유전자의 발현을 비례적으로 조절함, 3) MtATPG1은 histidine phosphotransfer proteins(HP) 유전자군 중 AHP1 유전자 발현도 비례적으로 조절함, 4) MtATPG1 유전자의 상대적으로 높은 발현은 AHP2 ~ AHP6 유전자에 대한 발현에 큰 영향을 미치지 않는 반면 MtATPG1 유전자의 상대적으로 낮은 발현은 AHP2 ~ AHP6 유전자에 대한 발현 증가를 유도함, 5) 따라서 MtATPG1 유전자의 상대적으로 낮은 발현 증가는 AHP2 ~ AHP6 유전자의 발현량 증가를 유도하여 식물의 종자 수확량 증가, 바이오매스 증가와 같은 생산성 증대의 형질을 제공하는 반면, MtATPG1 유전자의 발현 증가는 CRE1과 AHP1 유전자의 발현량 증가를 유발하고, 이는 앞선 내용에서 보는 바와 같이 다수성 형질 제공과 더불어 노화관련 유전자의 발현을 조절하여 노화 지연의 형질을 제공함.
이러한 가설을 통해 AHP1 유전자가 positive regulator 기능을 가졌을 때 식물의 노화 지연 형질을, 그리고 AHP2 ~ AHP6 유전자가 positive regulator 기능을 가졌을 때 식물의 생산성 증대를 제공하는 중요한 지표로 사용될 수 있을 것이다(도 8). 이러한 MtATPG1의 cytokinin signaling에 대한 역할은 애기장대의 AT-hook 유전자의 역할과 유사한 것으로 나타났으며, 이러한 사실은 본 유전자 또한 주요 작물에서도 유사한 기능을 가져 다수성 콩 품종 개발에 많은 장점을 제공하리라 생각된다.
< 실시예 5> MtATPG1 발현 변이체의 세대 진전을 통한 호모 라인 선별 및 기능 분석
우리는 변이체의 다수성 형질 및 녹기 연장에 대한 표현 형질 안정성을 확인하기 위하여 확보된 변이체를 세대 진전시켜 homo 라인을 선별하고 그들의 표현형이 앞 세대의 표현형과 같은 지를 확인하였다. 도 9와 10에서 보는 바와 같이 발아 후 40일째, 그리고 60일째 형질전환체 T3 라인의 대부분은 앞선 결과와 마찬가지로 뚜렷한 다수성 형질 및 바이오매스 증대 형질을 나타내었다. 한편 형질전환 라인 중 MtATPG1 -11-2와 MtATPG1 -11-7 라인들의 경우, 생산성 증대 형질과 더불어 녹기 연장의 형질도 일부 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 녹기연장 형질은 앞서 언급한 바와 같이 MtATPG1 유전자의 높은 발현량에 기인하는 것으로 판단되며, 이러한 표현형적 특징은 앞 세대와 약간의 차이가 있는데 이러한 차이점은 hetero 라인으로부터 homo 라인이 선별되면서 표현형의 안정화에 따르는 것이라 생각된다.
세대 진전된 homo 라인들의 생산성 증대에 대한 형질을 확인하기 위하여 본 발명자들은 생산성 지표를 분석하여 형질전환체의 농업형질을 조사하였다. MtATPG1 유전자 발현 변이체 라인 모두는 애기장대 대조구에 비하여 1.3배 이상의 종자 생산 증가가 나타났으며, 특히 MtATPG1 -3-15와 MtATPG1 -3-20은 애기장대 대조구에 비하여 1.6배 이상의 종자 생산 증가가 나타났다. 이러한 종자 생산의 증가와 비례하여 대부분의 변이체 라인들은 장각과 수의 증가 양상을 가졌으며, 종자 1,000개의 무게는 모든 변이체들이 대조구와 비슷하게 나타났다. 또한 생체량과 생체 건량에 있어서도 변이체 모두는 대조구에 비하여 뚜렷한 증가 현상이 나타났다(표 5). 이러한 결과는 앞선 세대의 생산성 증대에 대한 결과와 같은 양상을 나타내었다. 이러한 사실로 미루어보아 MtATPG1 유전자의 발현이 세대진전에 있어서도 생산성 증대 형질에 대한 표현형적 형질의 안정화를 유지한다는 점에서 작물에 적용 시 생산성 증대 형질의 안정적인 세대진전이 이루어질 수 있으리라 판단된다.
Figure PCTKR2017010855-appb-T000001
한편 앞선 결과에서 보듯이 MtATPG1 발현 T2 변이체들은 애기장대의 AT-hook protein을 암호화하는 유전자 그룹에서 나타나는 녹기 연장의 형질은 그리 강하게 나타나지 않았으나, 여전히 유전자의 발현 정도가 높은 변이체 MtATPG1 -11과 MtATPG1-17에서는 녹기연장의 형질을 가지고 있음을 알 수 있었다.
본 유전자의 녹기 연장에 대한 형질을 정확히 분석하기 위하여 세대진전을 통해 확보된 T3 homo 변이체 라인들을 대상으로 나이-의존적 노화 및 암-유도 노화에 대한 특성을 조사하였다. MtATPG1 발현 변이체의 나이-의존적 노화 지연 형질을 확인하기 위하여, T3 homo 세대에서 자엽 생성 후 16일 이후부터 3-4번 좌엽(rosette leaf)을 매 4일마다 48일까지 표현형 관찰과 잎 엽록소 함량을 측정하여 애기장대 대조구와 비교하였다. 그 결과, 애기장대 대조구의 경우 32일 이후 잎의 황화 현상이 시작하여 40일째 잎이 괴사(necrosis) 상태에 접어들었다. 한편 변이체 MtATPG1 -11-2와 MtATPG1 -11-17은 자엽 생성 후 36일째부터 잎의 황화 현상이 심화되어 44일 이후 잎의 괴사 현상이 일어남을 확인할 수 있었다. 나머지 변이체 라인 MtATPG1 -3-15, MtATPG1 -3-20, MtATPG1 -9-1, 그리고 MtATPG1 -9-18은 노화 진행 양상이 대조구의 그것과 유사하였다(도 11). 이러한 표현형적 특징을 보다 자세히 조사하기 위하여 나이-의존적 노화 동안 엽록소 함량을 측정하였다. 엽록소 함량은 663.2 nm와 664.8 nm의 흡광 계수를 이용하여 Lichtenthaler와 Wellburn의 방법(Biochemical Society Transduction 603:591~592, 1983)에 따라 측정하였다. 그 결과, 도 12에 도시된 바와 같이, 대조구와 변이체의 나이-의존적 노화 진행 동안 엽록소 함량 변화는 앞선 표현형 변화 양상과 유사하게 나타났다.
노화 촉진 요인으로 알려진 암 처리에 대한 MtATPG1 발현 변이체의 잎의 노화 지연 형질의 특성을 분석하기 위하여 T3 homo 세대에서 발아 후 21일째 3-4번 좌엽(rosette leaf)을 detach하여 3 mM MES 완충용액(2-[N-morpholino]-ethanesulfonic acid, pH 5.8)에 부유시킨 후, 암 상태를 유지하여 매 2일마다 8일까지 표현형 관찰과 잎 엽록소 함량을 측정하여 애기장대 대조구와 비교하였다. 그 결과, 애기장대 대조구의 경우 암 처리 후 4일 이후부터 잎의 황화 현상이 진행되어 8일 이후 잎이 괴사(necrosis) 상태에 접어들었으며, MtATPG1 -11-2와 MtATPG1 -11-17을 제외한 나머지 변이체 라인들도야생종과 같이 암 처리 후 4일 이후부터 잎의 황화 현상이 진행되고 8일째 잎이 괴사 상태에 접어듦을 알 수 있었다(도 13). 이러한 표현형적 특징을 확인하기 위하여 암-유도 노화 동안 엽록소 함량을 조사한 결과 나이-의존적 노화와 마찬가지로 대조구와 비슷한 엽록소 함량 감소 패턴을 가졌다(도 14). 본 연구를 통해 규명된 MtATPG1 -11-2와 MtATPG1 -11-17 라인의 녹기 연장 형질은 본 유전자 MtATPG1의 높은 발현량에 기인하며, 이러한 사실로 미루어 보아 MtATPG1 유전자의 일반적인 발현은 식물의 노화에 있어서는 큰 효과가 없는 반면, 유전자 발현이 강력해지면 식물의 녹기 연장 형질을 일부 제공하는 것으로 판단된다.
한편, 우리는 MtATPG1 유전자가 스트레스에 대한 저항성을 제공하는 지를 확인하기 위하여, 산화 스트레스의 경우 3 mM MES 용액에 4 mM H2O2를 첨가하여 발아 후 25일 된 3, 4번 잎을 detach하여 floating한 후 매 3일 간격으로 잎의 표현형적 변화와 엽록소 함량 변화를 조사하여 산화 스트레스에 대한 저항성 정도를 조사하였으며, salt 스트레스의 경우 동일한 조건에서 150 mM NaCl을 첨가하여 salt 스트레스에 대한 저항성을 조사하였다. 그 결과 본 변이체들은 산화 및 salt 스트레스에 대한 저항성을 크게 가지지 않음을 확인할 수 있었다(도 15). 또한 변이체의 엽록소 함량 변화 양상도 표현형적 변화와 유사한 양상을 가졌다(data not shown). 이러한 사실은 MtATPG1이 식물의 산화 및 salt 스트레스에 대한 저항성을 크게 제공하지 않는다는 것을 의미한다.

Claims (10)

  1. 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 갖고, 식물의 생산성 증대 기능, 스트레스 내성 기능 및 노화 지연 기능을 갖는 MtATPG1 단백질.
  2. 제1항의 단백질을 암호화하는 MtATPG1 유전자.
  3. (a) 제2항의 유전자를 그것을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계,
    (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계, 및
    (c) 생산성 증대 특성을 갖는 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 구성되는 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자인 것을 특징으로 하는 생산성 증대 특성을 갖는 식물체의 제조 방법.
  5. (a) 제2항의 유전자를 그것을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계,
    (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계, 및
    (c) 노화 지연 특성을 갖는 식물체를 선별하는 단계를 포함하여 구성되는 노화 지연 특성을 갖는 식물체의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자인 것을 특징으로 하는 노화 지연 특성을 갖는 식물체의 제조 방법.
  7. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 그것을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계, 및
    (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는
    식물체의 생산성을 증대시키는 방법.
  8. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 그것을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계, 및
    (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계를 포함하는
    식물체의 노화를 지연시키는 방법.
  9. 제3항 기재의 방법에 의하여 얻어진 것으로서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 식물체에 도입되어 발현됨으로써 생산성 증대 특성을 갖는 형질전환 식물체.
  10. 제5항 기재의 방법에 의하여 얻어진 것으로서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 식물체에 도입되어 발현됨으로써 노화 지연 특성을 갖는 형질전환 식물체.
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