KR20180093478A - 고추 유래 탈인산화 유전자 CaAIPP1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래 신규 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 유전자, 단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 CaAIPP1 단백질의 ABA 신호전달의 음성조절자로 기능하고, 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 감소 효과를 확인하였는바, CaAIPP1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 유래 탈인산화 유전자 CaAIPP1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{Method for improving the resistance to drought stress using pepper protein phosphatase CaAIPP1 in plants}

본 발명은 고추 유래 신규 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 유전자, 단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄 (drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산 (abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화시킨다.

이러한 ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도 (hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제 (E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절다고 알려져 있으나, 완전한 ABA 신호전달 경로는 아직 규명되지 않았다. 식물세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려져 있다. 수용체가 ABA를 인식하면 SnRK2 (non-fermenting 1-related subfamily 2) 단백질 인산화효소 (kinase) 및 PP2Cs (type 2C protein phosphatases) 각각에 의해 하위 단백질이 인산화 및 탈인산화 된다. SnRK2.2, SnRK2.3, 및 SnRK2.6 (OST1)와 같은 SnRK2 인산화효소는 ABA 신호전달의 양성 조절자로써 기능하고, 이와 반대로 group A PP2Cs 인산가수분해효소는 ABA의 음성 조절자 기능을 하며, ABA 수용체인 PYR/PYL/RCAR 단백질들은 group A PP2Cs과 상호작용하여 이들의 활성을 억제한다고 보고되어 있다. PYR/PYL/RCAR에 의해 ABA 발현 증가가 인식되면 단백질 인산가수분해효소-인산화효소 상호작용이 억제되고, SnRK2 type 인산화효소 분비가 유도된다. SnRK2 인산화효소는 전사인자 및 SLAC1 음이온 채널을 포함하는 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.

한편, 유비퀴틴화 (ubiquitination) 경로를 통한 단백질 분해는 식물체가 비생물적 스트레스에 대한 적응 및 방어 반응을 조절하기 위한 중요한 기작 중 하나이다. 유비퀴틴화는 E1 (ubiquitin activating enzyme), E2 (ubiquitin-conjugating enzyme) 및 E3 (ubiquitin ligase)로 구성되는 3가지 효소의 연속적인 작용에 의해 일어나는 중요한 번역 후 조절과정이다. 유비퀴틴이 E1에 의해 활성화되면, 활성화된 유비퀴틴은 E2로 전달되고 E3 리가아제가 유비퀴틴과 표적 단백질을 결합시킨다. 이러한 과정에서 E3 리가아제가 표적 단백질을 결정하고 이에 결합한다. 유비퀴틴화는 세포 내 고유 기작이며, 진핵세포에서 다양한 표적 단백질에 따라 수백 또는 수천 개의 E3 리가아제가 존재한다고 알려져 있다. E3 리가아제는 서브유닛 구성에 따라 두 가지 타입으로 분류되는데, RING (really interesting new gene), HECT (homology to E6-AP C-terminus), 및 PUB (plant U-box) E3 리가아제는 단일 서브유닛으로 구성되는 반면, SCF (Skp(S-phase kinase-associated protein)/cullin/F-box) 및 CUL4-DDB1 (CULLIN4-damaged-specific DNA binding protein1)는 다중 서브유닛으로 구성된다. 최근, 애기장대 (Arabidopsis) 식물에 1,400 종 이상의 E3 리가아제가 존재한다고 보고되었으며, 애기장대 게놈은 242개의 RING E3 리가아제를 암호화하고, RING E3 리가아제가 생물 및 비생물적 스트레스에 대한 적응에 관여한다고 보고되었다. RING E3 리가아제는 벼 (Oryza sativa), 옥수수 (Zea mays), 고추 (Capsicum annum) 및 애기장대 (Arabidopsis thaliana)와 같은 다양한 외떡잎 및 쌍떡잎 식물에서 ABA 신호전달 및 비생물적 스트레스에 반응하여 양성 또는 음성 조절자로써 역할을 한다고 알려져 있으며, 이는 식물체에서 널리 보존되어 있음을 의미한다(Plant Biotechnol J 11, 432-445). 최근에는, RING type E3 리가아제인 RSL1이 세포막에서 PYR1 및 PYL4과 같은 ABA 수용체의 유비퀴틴화를 통한 분해에 관여하고, CRL4-type E3 리가아제 복합체는 PYL8 ABA 수용체를 분해한다고 보고되었다. 상기와 같이, 많은 식물체를 이용하여 E3 리가아제가 ABA 신호전달 경로를 통해 건조 스트레스 반응에 관여하는지 연구되고 있으나, 그 결과는 아직 미비한 실정 (한국 등록 특허 10-1335440)이다.

본 발명자들은 탈인산화 유전자의 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추 유래 탈인산화 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자가 ABA 신호전달의 양성조절자인 CaAIRF1 단백질의 유비퀴틴화를 매개하여 분해를 촉진시키며, 상기 유전자를 침묵시킬 경우, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하여, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaAIPP1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CaAIPP1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaAIPP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 이용한 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 유전자를 제공한다.

본 발명은 상기 CaAIPP1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 CaAIPP1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 CaAIPP1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명은 CaAIPP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 이용한 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대일 수 있다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 신규 CaAIPP1 유전자를 동정하였으며, CaAIPP1 단백질은 ABA 신호전달의 음성조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 감소 효과를 확인하였는바, CaAIPP1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 CaAIRF1 및 CaAIPP1의 상호작용을 검증하기 위해 (A) yeast 2-hybrid (Y2H) screen assay, (B) 2분자 형광 상보성 분석 및 (C) Pull-down assay를 수행한 결과이다.
도 2a는 CaAIPP1 및 ABA 수용체인 CaRLP1의 상호작용을 검증한 결과이다.
도 2b는 CaAIPP1 및 ABA 수용체인 AtRCARs의 상호작용을 검증한 결과이다.
도 3은 CaAIPP1 단백질 분해가 유비퀴틴화에 의한 것인지 알아보기 위해, GST-CaAIPP1 재조합 단백질을 이용하여, 26S 프로테아좀 억제제 (MG132) 첨가 유무에 따른 CaAIPP1 단백질 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 4는 다중 서열 정렬 결과를 나타낸 도면으로, CaAIPP1 단백질과 다른 종 식물의 아미노산 서열의 상동성을 분석한 결과이다.
도 5는 고추 유래 CaAIPP1 유전자의 아미노산 서열 분석 및 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 6 및 도 7은 CaAIPP1 유전자 과발현 형질전환 식물의 ABA 감수성 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 CaAIPP1 유전자 과발현 형질전환 식물의 건조 저항성 감소 효과를 확인한 결과이다.

본 발명자들은, ABA 신호전달의 음성조절자로 기능하는 탈인산화 유전자인 CaAIPP1 유전자를 동정하였고, 상기 유전자가 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스에 대한 저항성 감소를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자 단백질을 암호화하는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 CaAIPP1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드를 제공한다.

본 발명의 유전자인 CaAIPP1은 고추로부터 분리하였으며, 상기 CaAIPP1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaAIPP1 유전자에 의해 코딩되는 펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "음성 조절인자 (negative regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaAIPP1은 건조 스트레스에 대한 조절에서 억제하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하고, 이로 인해, CaAIPP1 유전자가 과발현되는 경우, ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소될 수 있다.

본 발명자들은 유비퀴틴화에 작용하는 효소인 E3 리가아제가 ABA 신호전달 경로를 통해 건조 스트레스 반응에 관여하는지 연구하던 중, type 2C 단백질 포스파타아제 (phosphatase)의 전사 및 안정성 조절을 통해, ABA 및 가뭄 스트레스의 조절 인자로서 기능한다는 것을 확인하여, 탈인산화 단백질인 CaAIPP1를 동정하였고, 상기 CaAIPP1 및 CaAIRF1 단백질의 상호작용을 확인하였다 (실시예 2 참조).

우선, 본 발명의 일실시예에서는, in vitro self-ubiquitination assay에서 CaAIRF1를 기질로 첨가하였을 때 CaAIPP1의 단백질 분해가 일어남을 확인하였고, 융합단백질 발현 분석을 통해 CaAIRF1이 CaAIPP1의 단백질 분해에 직접적으로 관여함을 알 수 있었다 (실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, CaAIPP1 유전자의 서열 분석 및 서열 정렬 분석을 수행하였으며 (실시예 4 참조), CaAIPP1 단백질의 세포 내 위치 및 발현을 확인하였다 (실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaAIPP1을 과발현하는 형질전환 식물체를 제조하여 대조군 식물체와 CaAIPP1 과발현 식물체의 잎 온도, 증산률, 형태 및 생존률, 관련 유전자들의 발현변화 측정을 통해 CaAIRF1이 식물체의 ABA 감수성을 감소시키는 음성조절자로 작용함을 확인하였다 (실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaAIPP1을 과발현하는 형질전환 식물체를 제조하여 대조군 식물체와 CaAIPP1 과발현 식물체의 잎 온도, 증산률, 형태 및 생존률, 관련 유전자들의 발현변화 측정을 통해 CaAIPP1이 식물체의 건조 스트레스 저항성을 감소시키는 음성조절자로 작용함을 확인하였다 (실시예 7 참조).

따라서, CaAIPP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써, 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaAIPP1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 억제제는 CaAIPP1 유전자의 서열, 상기 서열에 상보적인 서열 또는 상기 유전자 서열의 단편에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), 리보자임 (ribozyme), DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), 안티센스 뉴클레오티드 중 어느 하나인 것이 바람직하고, CaAIPP1 단백질에 상보적으로 결합하여 활성을 억제하는 화합물, 펩티드 (Peptide), 펩티드 미메틱스 (Peptide Minetics), 항체, 또는 압타머 (aptamer) 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, CaAIPP1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 상기 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부를 식물 세포로 전이시킬 수 있는 플라스미드 벡터, pTRV1 또는 pTRV2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 상기 벡터는 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 CaAIPP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 이용한 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추 (Capsicum annuum L., Nockwang) 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토 (피트모스 (peat moss) : 펄라이트 (perlite) : 질석 (vermiculite) = 5 : 3 : 2, v/v/v)를 파종하였다. 이후, 식물은 하루에 16시간 동안 백색 형광등 세기 80 μ㏖ photons m^-2s^{- 1} 로 하여 빛을 비추고, 16 시간 낮/8 시간 밤 사이클의 27 ± 1 ℃ 생육실에서 성장시켰다. 애기장대 (Arabidopsis thaliana: ecotype Col-0) 종자는 1% 수크로오스 및 Microagar (Duchefa Biochemie)가 보충된 MS (Murashige and Skoog) salt에서 발아시켜, 16시간 낮/8시간 밤 사이클, 24 ℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대 묘목은 증기 소독된 배합토 (피트모스 (peat moss) : 펄라이트 (perlite) : 질석 (vermiculite) = 9:1:1, v/v/v)에서 24 ℃ 온도, 60 % 습도, 16 시간 낮/8 시간 밤 사이클의 조건으로 형광등 (130 μmol photons m^-2·s^-1) 빛에서 성장시켰다. 모든 종자는 챔버에 파종하기 전에 2 일 동안 4 ℃에서 춘화처리 (vernalized)를 하였다.

1-2. 재조합 단백질의 정제

박테리아 세포에서 말토오스 결합 단백질 (MBP; maltose-binding protein), GST 및 히스티딘 (His; histidine) 재조합 단백질의 발현을 위해, 각각 pMAL-c2X (New England Biolabs), pGEX-4T-3 (GE Healthcare) 또는 pDEST17 (Invitrogen) 벡터를 사용하였다. 전장 CaAIPP1 cDNA 서열을 포함하는 각각의 벡터를 대장균 (Escherichia coli.) 균주 c + 세포에 도입하였다. 융합 단백질을 제조자의 지시에 따라 유도하고 정제하였으며, pull-down assay를 위해 5 ㎍의 MBP-RSL1DTM 또는 MBP 및 5 ㎍의 His-CaAIPP1 또는 MBP-CaAIRF1을 1 시간 동안 4 ℃에서 배양한 다음, 0.5 ㎖의 결합완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 % Tween-20)으로 세척하였다. 단백질은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 순차적으로 정제하고 SDS-PAGE를 사용하여 용출 및 분석한 다음 anti-MBP 및 anti-His 항체로 웨스턴블롯 및 면역 검출을 수행하였다.

1-3. CaAIPP1 유전자가 과발현된 (CaAIPP1-OX) 형질전환 애기장대 제조

아그로박테리움(Agrobacterium) 매개된 형질전환 애기장대를 제조하고자, 전장 CaAIPP1 cDNA(1,200 bp)를 pK2GW7 binary vector에 삽입하였다. 본 발명에서 이용된 모든 돌연변이는 Col-0을 기반으로 하여, 애기장대에서 CaAIPP1 유전자의 과발현을 유도하고, Pro35S:CaAIRF1 형질전환체를 제조하였다. CaAIPP1 과발현 형질전환체를 선별하기 위해, 형질전환된 것으로 추정되는 식물로부터 종자를 얻어 Kanamycin 50 ㎍/㎖을 함유하는 MS 한천 플레이트상에 플레이팅하였다. 이후 동형접합 T₃ 세대 종자를 얻기 위하여 PCR 분석을 통해 CaAIRF1 및 CaADIP1 유전자가 함께 증폭되는 F2 세대의 식물을 성장시켰다. T₃ homozygous line은 추가적인 표현형 분석을 위해 사용되었다. semi-quantitative PCR 분석에 기초하여, CaAIPP1의 T₂ 식물을 선발하고 성장시켜 추가 분석을 위한 동형 접합체 T₃ 종자를 얻었다.

1-4. ABA, 건조 스트레스, NaCl 처리 및 표현형 분석

고추 식물에서 CaAIPP1 유전자의 발현 패턴 변화를 관찰하기 위해, six-leaf stage의 고추 식물에 100 μM ABA, 건조 스트레스, 또는 200 mM NaCl을 처리하였다. 처리 후 다양한 시점에서 고추 잎을 수확하여 RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 실시하였다. 대조군 (야생형) 및 CaAIPP1-OX 형질전환 식물의 3 주 된 식물을 무작위로 심고, 각각 10 일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 준 후 2 일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 식물체의 생존율을 계산함으로써 분석하였다 또한 증발하는 물 손실량을 측정함으로써 건조 저항성을 정량적으로 확인하였다. 3 주 된 애기장대로부터 회수한 잎을 페트리 접시 (petri-dish)에 놓고 상기 페트리 접시를 40% 상대 습도의 성장 챔버에 두고 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.

1-5. 기공개도 (Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도 생물학적 검정을 위해, 3 주된 애기장대 식물의 잎에서 채집된 잎의 껍질을 수확하여 빛이 있는 조건으로 기공 개구 용액 (stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 μM CaCl₂) 위에 띄웠다. 3 시간 동안 배양한 후, 상기 용액을 다양한 농도의 ABA가 함유된 SOS 용액으로 교체하고, 잎 껍질을 추가로 2.5 시간 동안 더 배양하였다. 이후 각각의 개별 샘플에서 기공을 측정하였으며, 100개의 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경을 이용하여 무작위로 관찰하였다. 각 기공의 그 넓이와 길이는 Image J 1.46r을 이용해 기록되었다.

1-6. 열 영상법 (Thermal imaging)

3주 된 애기장대 식물에 50 μM ABA를 처리하여 건조 스트레스를 주었다. 열 영상은 infrared camera(FLIR systems; T420)을 이용하여 얻었으며, 식물의 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.2 software를 이용하여 측정하였다.

1-7. RNA 분리 및 qRT-PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)

건조 스트레스를 주거나 ABA를 처리한 애기장대 및 고추 식물의 잎으로부터 총 RNA를 분리하여 qRT-PCR을 실시하였다. 모든 분리된 RNA 샘플은 유전체 DNA를 제거하기 위해 RNA-free DNase를 이용해 용해시켰고, 분광광도계를 사용하여 정량한 후, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 총 RNA (1 ㎍)를 사용하여 cDNA를 합성 하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 Ex-taq (Takara Bio, Shiga, Japan), iQ ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 하기 표 1에 나타낸 특이적 프라이머와 함께 Semi-quantitative RT PCR을 수행하였다. 고추 액틴 1 유전자 (CaACT1) 및 애기장대 액틴 8 유전자 (Actin8)는 각각 고추 및 애기장대 유전자 발현량의 정규화를 위해 사용되었다.

Gene	For	Direction	Primer sequence (5'-3')
CaAIPP1	Gene cloning	F	ATGGCTGGCATGTGTTGTGGTGTTA
		R (w/o stop codon)	TAGCTTTCTCAAATCAACCACGACG
		R	TTATAGCTTTCTCAAATCAACCACGAC
	RT-PCR	F	ATGGCTGGCATGTGTTGTGGT
		R	CTACATATAACCCAATTGAGTAGTACC
CaACT1 (CA12g08730)	RT-PCR	F	GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT
		R	CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT

1-8. 통계적 분석

통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test 또는 ANOVA (Fisher's LSD test)를 이용하여 수행되었다. P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다.

실시예 2. CaAIRF1 및 CaAIPP1의 상호작용 확인

CaAIRF1은 CaADIP1 단백질 안정성 및 CaADIP1 유전자 전사의 조절을 통해 가뭄 스트레스 반응 및 ABA 신호 전달의 양성조절자로서 기능한다. CaAIRF1 유전자는 일반적으로 표적 단백질과의 물리적 상호작용을 통해 단백질 분해를 촉진하는 RING finger type E3 ligase를 코딩하며, 몇몇 E3 ligase는 하나 이상의 기질을 가지고 있으며, CaAIRF1 단백질 분해에 관여하는 단백질들을 확인하기 위하여, yeast 2-hybrid (Y2H) screen assay를 수행하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, CaAIRF1 단백질과과 상호작용하는 단백질로 CaAIPP1 (Capsicum annuum AIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1)를 분리하였으며, 효모 세포가 CaAIRF1과 CaAIPP1이 함께 발현되는 경우에만 선택배지(SC-AHLW)에서 자라는 것을 확인하였으며, 이는 두 단백질 사이의 상호작용이 일어났음을 의미하는 것이다(도 1A). one-by-one Y2H 및 2분자 형광 상보성 분석(bimolecular fluorescence complementation; BiFC)을 추가적으로 수행하여 CaAIRF1과 CaAIPP1 단백질간의 상호작용을 분석한 결과, 담배 잎 표피세포의 핵에서 노란색 형광이 발광하는 것을 통해 CaAIRF1과 CaAIPP1 단백질이 상호작용 함을 확인하였다(도 1B). 또한, 풀다운 분석을 통해 CaAIRF1과 CaAIPP1의 in-vitro 상호 작용을 확인하였으며(도 1C), 또한, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, CaADIP1은 고추 및 애기장대의 ABA 수용체의 CaRLP1 및 AtRCAR과 상호 작용하였다.

실시예 3. CaAIRF1-매개된 유비퀴틴화 및 CaAIPP1 분해 확인

상기 실시예 2에서 기재된 바와 같이, CaAIPP1 단백질은 RING type E3 ligase CaAIRF1 단백질과 상호작용함을 확인하였으며, 본 발명자들은 CaAIRF1 단백질이 유비퀴틴화 (ubiquitination) 및 분해 (degradation)를 통해 CaAIPP1의 안정성을 조절한다고 가정하였다. 보다 구체적으로, CaAIRF1 단백질이 CaAIPP1 단백질 분해에 관여할 것이라고 판단하여, CaAIPP1 단백질을 CaAIRF1의 기질로 이용하여 in vitro ubiquitination assay를 실시하였다. 앱시스산 (ascisic acid; ABA) 처리 전후에 담배 (Nicotiana benthamiana)의 잎에서 35S:CaAIPP1-HA 및 35S:CaADIP1-HA (양성대조군)를 발현시켰다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ABA가 없는 경우, CaAIPP1 단백질은 poly-ubiquitination 되었지만, ABA 처리 후, CaAIPP1 poly-ubiquitination의 수준은 증가하였다(도 3A).

또한, ABA가 CaAIPP1 단백질 분해에 영향을 주는 메커니즘을 조사하기 위해 말토오스 결합 단백질에 CaAIPP1 단백질이 표지된 융합 단백질을 이용하여 (MBP-CaAIPP1) in vivo free degradation assay를 수행하였다, 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 융합단백질 (MBP-CaAIPP1)은 ABA 처리된 식물의 추출물 (crude extracts)과 함께 배양한 경우, ABA 미처리 식물의 추출물을 배양한 경우보다 더 불안정하였다(도 3B).

나아가 CaAIPP1 단백질의 분해가 26S 프로테아좀(proteasome)에 의해 매개되는 것인지 알아보기 위해, 상기와 동일한 조건에서 26S 프로테아좀 매개 단백질분해(proteolysis) 억제제인 MG132를 배양 혼합액에 첨가하고 60분 동안 배양한 후 분석하였다. 그 결과, MG132가 CaAIPP1 단백질의 분해를 억제하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 ABA 처리에 의해 촉진되는 CaAIPP1 단백질의 분해가 26S 프로테아좀에 의해 매개되는 것임을 알 수 있었다.

또한, CaAIRF1 단백질이 CaAIPP1 단백질의 유비퀴틴화와 직접적으로 연관되어 있는지 확인하기 위해, MBP-AIRF1 및 glutathione-S-transferase가 표지된 CaAIPP1 (GST-CaAIPP1) 단백질을 이용하여 in vitro에서 유비퀴틴 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, E1 또는 E2의 존재 하에서, CaAIFR1는 CaAIPP1의 유비퀴틴화를 유도하지 못하였다. E3 ligase 활성을 잃어버리도록 RING 도메인 내 His-863 (863번째 히스티딘) 및 Cys-867 (867번째 시스테인)을 각각 Tyr-863 (863번째 티로신) 및 Ser-867 (867번째 세린)으로 치환하였으며, 그 결과로 생성된 CaAIRF1 단백질 돌연변이는 CaAIPP1의 유비퀴틴화를 유도하지 못하였다(도 3C).

실시예 4. CaAIPP1 유전자의 서열 분석

CaAIPP1 유전자의 서열을 분석한 결과, CaAIPP1 cDNA 서열은 263-bp의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 420개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하며, 도 3에 나타낸 바와 같이 단백질은 5.02 등전점 (pI) 및 45.4 kDa의 분자량을 갖는 것으로 확인되었다. PROSITE (http://expasy.ch/prosite) 및 SMART (htttp://smart.embl-heidelberg.de) 프로그램을 이용한 결과, C 말단 (120-419 residues) 영역에 PP2C 도메인을 나타내는 것을 확인하였으며, 상기 영역은 단백질 인산 가수 분해 효소 활성에 필수적으로, 계통수 (phylogenetic tree)로 확인한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CaAIPP1 단백질은 애기장대 및 고추의 group A PP2Cs와 군집되어 있는 것을 확인하였다(도 5A). 다중 서열 정렬 분석 결과는, 도 4에 나타낸 바와 같이, CaAIPP1 유전자는 Solanum lycopersicum (accession no. XP_004239911.1, 66.3%), Nicotiana tabacum (accession no. NP_001312664.1, 64.5%), Daucus carota (accession no. XP_017223599.1, 51.8%), 및 Brassica rapa (accession no. XP_009146731.1, 48.7%)의 다른 PP2Cs 영역과 매우 높은 단백질 상동성을 나타내었으며, CaAIPP1의 PP2C 도메인은 다른 식물 PP2C 단백질과 88 내지 93 %의 동일성을 나타내었다.

실시예 5. CaAIPP1 단백질의 세포 내 위치 및 발현 확인

CaAIPP1 단백질의 세포 내 위치를 알아보기 위해, 담배 (Nicotiana benthamiana) 잎의 상피세포에서 GFP가 연결된 CaAIRF1 단백질이 일시적으로 발현되도록 한 후 현미경으로 GFP 형광을 관찰하였으며, 대조염색으로 DAPI 염색을 통해 세포핵을 염색하였다. 현미경 관찰 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 핵에서 GFP 형광이 발현되는 것을 관찰하였다. 이를 통해 CaAIPP1 단백질이 핵에서 기능함을 확인하였다(도 5B).

또한, CaAIPP1와 상호작용하는 것으로 확인된 CaAIRF1 유전자는 이전 연구를 통해 ABA, 건조, 고염 처리 시 발현이 현저히 증가하며, ABA 감수성 및 건조 스트레스 저항성을 변화시키는 것을 확인하였는바, CaAIPP1 유전자 또한 ABA 신호전달 및 비생물적 스트레스 반응과 관련이 있는지 알아보고자 하였다. ABA, 건조 스트레스 및 고염 등 다양한 비생물적 스트레스 조건으로 식물을 처리한 후, CaAIPP1 단백질의 발현 양상을 조사하였다. 6 잎 고추 식물로부터 분리된 전체 RNA를 사용하여, Semi-quantitative RT-PCR 분석을 수행한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 정상 성장 조건 및 ABA 처리 후, CaAIPP1 발현량이 약하게 검출되었으며, 6 시간 후에 가장 높은 발현 수준을 나타내었고, 건조 스트레스 처리에서는 CaAIPP1 발현이 2 시간 이내에 유도되었으며, 6 시간 이후에 강하게 발현되었다. 또한, 염 (NaCl) 처리 결과, CaAIPP1 발현은 6 시간 이내에 유도되었고 12 시간 후에 최대 수준에 도달하였으며, 이 후에는 점차적으로 감소하였다(도 5C).

실시예 6. CaAIPP1 유전자 과발현 (CaAIPP1-OX) 식물의 ABA 감수성 감소 효과 확인

CaAIRF1 유전자는 ABA 및 가뭄 스트레스 반응의 양성조절자로서 기능한다. 따라서, 본 발명자들은 CaAIPP1 과발현 (CaAIPP1-OX) 애기장대 형질전환 식물을 제조하여, CaAIPP1 유전자의 생체 내 기능을 조사하였다. Semi-quantitative RT PCR 분석 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, CaAIPP1 유전자는 CaAIPP1-OX T₃ 동형 접합(homozygous) 식물에서 강하게 발현되었지만 대조군(야생형) 식물에서는 발현이 제대로 이루어지지 않았으며, 정상적인 성장 조건에서 대조군 및 CaAIPP1-OX 식물간에 표현형 차이를 확인하지 못하였다.

또한, 고추 및 애기장대 식물에서 ABA 음성조절 인자로서 작용하는 CaAIPP1-OX 및 pp2ca 돌연변이 식물을 이용하여, CaAIPP1-OX 식물의 표현형을 조사하였다. 보다 구체적으로, 애기장대 식물에서 CaAIPP1 유전자의 과발현이 ABA 반응에 영향을 주는지 확인하기 위해, ABA 처리에 따른 발아율, 뿌리 성장 및 묘목 형성을 조사하였다. 그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 다양한 농도의 ABA가 포함된 Murashige and Skoog (MS) 배지에서 CaAIPP1-OX 종자를 발아시켰다. ABA를 처리하지 않은 경우, 발아율은 대조군과 CaAIPP1-OX 종자 간에 유의한 차이가 없었으며, ABA를 처리한지 2 일 내지 4일 후에, CaAIPP1-OX 종자는 ABA에 대한 감수성이 감소되었다. 또한, 대조군 및 CaAIPP1-OX 식물의 차이점은 묘목 단계에서도 구별할 수 있었다(도 7A).

다양한 농도의 ABA가 포함된 MS 배지에서 대조군, CaAIPP1-OX, CaADIP1-OX 및 pp2ca 돌연변이 식물의 뿌리 길이를 분석하였다. 그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, 뿌리 형태와 뿌리 길이는 대조군, CaAIPP1-OX, CaADIP1-OX 및 pp2ca 돌연변이 식물간에 유의미한 차이가 없었으며, ABA를 처리하여 성장시킨 결과, CaAIPP1-OX 및 CaADIP1-OX 식물의 뿌리는 대조군 식물의 뿌리보다 유의하게 길었다(도 6A 및 도 6B, 도 7B 및 도 7C).

또한, 대조군, CaAIPP1-OX, CaADIP1-OX 및 pp2ca 돌연변이 식물의 ABA 처리에 따른 묘종 성장을 평가한 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, 자엽이 확장된 모종의 수는 대조군, CaAIPP1-OX, CaADIP1-OX 및 pp2ca 돌연변이 식물간에 유의미한 차이가 없었으며, ABA를 처리하였을 때, 자엽이 확장된 모종의 수는 대조군, 식물보다 CaAIPP1-OX 및 CaADIP1-OX 식물에서 더 높게 나타났다. 대조군, 식물과 비교하여, pp2ca 돌연변이 식물은 ABA에 대해 훨씬 더 높은 감수성을 나타내었고, 이는 뿌리 성장 및 묘목 형성의 감소에 의해 나타났다(도 6C, 도 6D, 및 도 7D).

실시예 7. CaAIPP1 유전자 과발현 (CaAIPP1-OX) 식물의 건조 저항성 감소 효과 확인

일반적으로 비생물적 스트레스, 특히 가뭄 및 ABA 신호 전달은 공통 신호 전달 경로를 공유한다. 상기 실시예 6에서는 CaAIPP1-OX 식물의 ABA-감수성 감소 효과를 확인하였으나, 가뭄 스트레스 신호는, ABA 신호에 의존하지 않기 때문에, 상기 식물들의 가뭄 스트레스에 대한 표현형 변화를 조사하였다. 대조군(야생형) 및 CaAIPP1-OX 식물에 10 일 동안 급수를 중단하였으며, 2 일 동안 재급수 함으로써, 건조 스트레스를 유발한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 물을 충분히 공급한 조건에서는 대조군 및 CaAIPP1-OX 식물 사이에 표현형의 차이를 관찰하지 못하였다. 그러나 가뭄 스트레스 처리 후, CaAIPP1-OX 식물은 대조군 식물보다 더 시든 표현형을 보였다. 또한, CaAIPP1-OX 식물의 생존율을 확인한 결과, 재급수 2 일 후에 대조군 식물의 생존율은 98.5 %인 반면, CaAIPP1-OX #2 및 #4의 생존율은 각각 18.3 % 및 8.1 %로 현저하게 낮은 것을 확인하였다(도 8A).

또한, 식물의 건조 내성 및 건조 저항성은 증발 수분 손실, 기공 구배 및 잎 온도와 같은 몇 가지 세포 및 분자 매개 변수에 의해 결정되는바, CaAIPP1-OX 식물의 건조 표현형이 변화된 잎의 수분 보유량으로부터 유래되었는지 여부를 결정하기 위해, 로제트 잎의 무게를 측정함으로써 증발 수분 손실을 평가하였다. 그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 수분 손실은 대조군 잎보다 과발현 형질전환 식물의 잎에서 더 높게 나타났으며, CaAIPP1-OX 식물의 감소된 건조 내성(저항성)은 더 높은 수분 증발률에 기인한 것으로 나타났다(도 8B).

기공개도에 따른 CaAIPP1의 기능을 확인하기 위해, 기공개도 및 잎 온도를 측정한 결과, ABA를 처리하지 않은 경우, 대조군 (야생형) 및 CaAIPP1-OX 식물의 기공개도 및 잎 온도에 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 그러나, ABA를 처리하였을 때, CaAIPP1-OX 식물은 대조군 식물보다 더 큰 기공개도 및 낮은 잎 온도를 나타내었다. 상기 결과로부터 CaAIPP1 유전자의 과발현이 ABA 매개 시그널링을 통한 가뭄 내성 (저항성)을 감소시키는 것을 확인하였다(도 8C 및 도 8D).

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to drought stress using pepper RING Finger E3 ligase CaDIR1 in plants <130> MP17-034 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1293 <212> DNA <213> Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1 - CaDIR1 <400> 1 atgacgaatc aagtagtgaa ggtgaagagg agaacgattg cggcatgcat gacatgccca 60 atttgccata aactcttcag agatgccacc actatttccg agtgtcttca tacgttttgc 120 aggaaatgca tctacaagaa gctgtctggt gaagaaacag aatgctgtcc aatttgcaat 180 attgacttgg gatgtgttcc tctagagaaa ctgaggccag atcataatct gcaagatgtg 240 agagcaaagg tattccctta taagaggcga aaggtgaatg cacttgaaat tgtgccttca 300 gttgcattgc cagtaaggag aaaggagaga tcactctcat cacttgtggt ctgcactcca 360 agagtatcta cacaaactgg aatgacagga agaagatcaa aatcggtggc aagaaaatca 420 ttacagggtt cgaccttttc aattgagaaa actcccaaga aagaagacgg ttctggggaa 480 gatcagttgg atggctctag ctcacctgaa acttcgaaca agctcactca gaatataagg 540 ctgaattctt ccagtactga gccttctagc caccctacac cggataaaga aactgagaat 600 ggcagtgaac agtgggatgg taaagttgat ttgtggaagc ctttaaattg tttggtggaa 660 gcagcaaaca ggagcaaatc ttcgaggttt acatcacagg gttctactgt taagtcagaa 720 ggtctgtatt cccatgaccg tgagggtcat gtccgtaaaa ctaaagtcaa acaaaatgga 780 cagaaattga agatcaagga tgacaataat ggtgatcctg cttctccaga ttttgataaa 840 cctaaaaagt cgcgtagaat ttgcaaaaaa aaggcatcag cttttggaga gtttaatatt 900 tcaccgcaaa ctgtactgga tggaaccact gccagatgtg aaaggagaat ctatccaata 960 tggttctcat tggcagcgtc ggaagaccag gagggagatg cacctttgcc acagatttct 1020 gcaagttact tgagaataaa ggacggtaat attccagttt cttttatcca aaaatacctg 1080 atgcggaagt tggatcttaa aagcgaagat gaggttgaga ttagatgtat gggccaatca 1140 gtaatcccca gtttaccact gaacagtttg attgatatgt ggcttcaaac tactacatcg 1200 gaaagaatat cagcaattat tggttcatca gcaaaggatt ttgttatggg gttagcttat 1260 gctcgaagga taccaggcat tccggcttct tga 1293 <210> 2 <211> 430 <212> PRT <213> Capsicum annuum Drought Induced RING type E3 Ligase 1 - CaDIR1 <400> 2 Met Thr Asn Gln Val Val Lys Val Lys Arg Arg Thr Ile Ala Ala Cys 1 5 10 15 Met Thr Cys Pro Ile Cys His Lys Leu Phe Arg Asp Ala Thr Thr Ile 20 25 30 Ser Glu Cys Leu His Thr Phe Cys Arg Lys Cys Ile Tyr Lys Lys Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Glu Thr Glu Cys Cys Pro Ile Cys Asn Ile Asp Leu Gly 50 55 60 Cys Val Pro Leu Glu Lys Leu Arg Pro Asp His Asn Leu Gln Asp Val 65 70 75 80 Arg Ala Lys Val Phe Pro Tyr Lys Arg Arg Lys Val Asn Ala Leu Glu 85 90 95 Ile Val Pro Ser Val Ala Leu Pro Val Arg Arg Lys Glu Arg Ser Leu 100 105 110 Ser Ser Leu Val Val Cys Thr Pro Arg Val Ser Thr Gln Thr Gly Met 115 120 125 Thr Gly Arg Arg Ser Lys Ser Val Ala Arg Lys Ser Leu Gln Gly Ser 130 135 140 Thr Phe Ser Ile Glu Lys Thr Pro Lys Lys Glu Asp Gly Ser Gly Glu 145 150 155 160 Asp Gln Leu Asp Gly Ser Ser Ser Pro Glu Thr Ser Asn Lys Leu Thr 165 170 175 Gln Asn Ile Arg Leu Asn Ser Ser Ser Thr Glu Pro Ser Ser His Pro 180 185 190 Thr Pro Asp Lys Glu Thr Glu Asn Gly Ser Glu Gln Trp Asp Gly Lys 195 200 205 Val Asp Leu Trp Lys Pro Leu Asn Cys Leu Val Glu Ala Ala Asn Arg 210 215 220 Ser Lys Ser Ser Arg Phe Thr Ser Gln Gly Ser Thr Val Lys Ser Glu 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Ser His Asp Arg Glu Gly His Val Arg Lys Thr Lys Val 245 250 255 Lys Gln Asn Gly Gln Lys Leu Lys Ile Lys Asp Asp Asn Asn Gly Asp 260 265 270 Pro Ala Ser Pro Asp Phe Asp Lys Pro Lys Lys Ser Arg Arg Ile Cys 275 280 285 Lys Lys Lys Ala Ser Ala Phe Gly Glu Phe Asn Ile Ser Pro Gln Thr 290 295 300 Val Leu Asp Gly Thr Thr Ala Arg Cys Glu Arg Arg Ile Tyr Pro Ile 305 310 315 320 Trp Phe Ser Leu Ala Ala Ser Glu Asp Gln Glu Gly Asp Ala Pro Leu 325 330 335 Pro Gln Ile Ser Ala Ser Tyr Leu Arg Ile Lys Asp Gly Asn Ile Pro 340 345 350 Val Ser Phe Ile Gln Lys Tyr Leu Met Arg Lys Leu Asp Leu Lys Ser 355 360 365 Glu Asp Glu Val Glu Ile Arg Cys Met Gly Gln Ser Val Ile Pro Ser 370 375 380 Leu Pro Leu Asn Ser Leu Ile Asp Met Trp Leu Gln Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Glu Arg Ile Ser Ala Ile Ile Gly Ser Ser Ala Lys Asp Phe Val Met 405 410 415 Gly Leu Ala Tyr Ala Arg Arg Ile Pro Gly Ile Pro Ala Ser 420 425 430

Claims (8)

1. 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 유전자.
   
2. 제1항에 기재된 CaAIPP1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열의 펩티드.
   
3. 제1항에 기재된 CaAIPP1 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터.
   
4. CaAIPP1 (Capsicum annuum CaAIRF1 Interacting Protein Phosphatase 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 CaAIPP1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. CaAIPP1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법으로서, 상기 CaAIPP1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법.
   
7. 제6항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 고추 또는 애기장대인 것을 특징으로 하는, 식물체.

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