CN1207772A - 修饰方法 - Google Patents

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M·约斯波伊
J·布伦斯特德特
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Abstract

描述一种体内修饰方法。该体内修饰方法影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比。

Description

修饰方法
本发明涉及一种修饰方法。
特别是，本发明涉及体内修饰方法。
半乳甘露聚糖是一类异源细胞壁多糖，它们由具有不同数目α-1-6连接的半乳糖侧链的β-1-4连接方式甘露聚糖主链组成。
最主要工业使用的半乳甘露聚糖得自豆类瓜尔豆(Cyamopsistetragonolobus)和长角豆(Ceratonia siliqua)的胚乳。这些半乳甘露聚糖的半乳糖含量不同，瓜尔豆半乳糖与甘露糖之比大约为1∶1.6，而长角豆树胶(LBG)的该比率大约为1∶34。
半乳糖含量的差异对瓜尔豆胶和LBG的功能性质具有显著影响。这两种半乳甘露聚糖低浓度(1-2％)下形成高粘度溶液，但LBG具有的另一性质是能够形成具有其它多糖(诸如吨胶、角叉菜胶和琼脂糖)的坚硬凝胶。食品工业将LBG广泛用于乳制品(主要是冰淇淋)、色拉调料、调味汁、低卡路里产品和宠物食品。然而，LBG的使用由于价格高和供应不规律而受限制。
因此，希望大规模生产诸如因为提高甘露糖与半乳糖之比(诸如类似于LBG)而具有改进功能性质的半乳甘露聚糖。
由于瓜尔豆胶和LBG之间种属化学的相似性，并且瓜尔豆胶的价格低得多，因此已经试图在体外将瓜尔豆胶转化为具有类LBG性质和具有类似于LBG相似化学组成的半乳甘露聚糖。
这样一种体外处理的实例包括使用α-半乳糖苷酶。在该方面，参见McCleary等1983和EP-A-0255153。
通过使用由瓜尔豆种子纯化的α-半乳糖苷酶，获得半乳糖含量为10-34％的瓜尔豆胶(Bulpin等1990)。改性瓜尔豆胶胶凝行为的分析表明，将凝胶与角叉菜胶混合形成的半乳糖含量为24％的制剂表现出的流变学性质与LBG相似。相比之下，未处理瓜尔豆胶的半乳糖含量为38％，LBG的半乳糖含量为23％。
然而，从工业观点来看，瓜尔豆胶的体外脱半乳糖基涉及许多问题。
首先，由于必须除去瓜尔豆胶中大约40％的半乳糖，因此必须制备大量的α-半乳糖苷酶。
第二，在保温期间，非常重要的是甘露聚糖主链不发生水解，必需使用高度纯化的α-半乳糖苷酶制剂，以避免任何微量的甘露聚糖酶活性。已经公布了从瓜尔豆胶种子异源生产α-半乳糖苷酶的方法(Overbeeke等1986)。然而，在研究对瓜尔豆胶作用之前，纯化来自测试物种生产的α-半乳糖苷酶，提示甘露聚糖酶的问题仍有待解决。
第三，半乳甘露聚糖的产量降低，因为半乳糖含量降低40％相当于减少大约15％的改性瓜尔豆胶。在成品中，释放的半乳糖可能是不希望有的，可能必须除去。
第四，在与α-半乳糖苷酶保温期间有相当大的半乳甘露聚糖解聚风险。
此外，有污染微生物在释放内源β-甘露聚糖酶的反应混合物上形成菌落的风险。
最后，必须从反应混合物中除去水。除该方法的费用外，也导致可以用来获得最适反应条件的缓冲液浓缩。
这些实例证明，修饰瓜尔豆胶的现行方法牵涉多个问题，其中一些与相当大的费用有关。
因此，需要改进的瓜尔豆胶修饰方法。
在该方面，我们现在认识到，如果利用重组DNA技术在植物(诸如瓜尔豆植株)体内修饰含甘露糖/半乳糖的化合物(诸如瓜尔豆胶)将是有益的。
因此，广义来讲，本发明涉及在能够合成该化合物的生物(或其部分)中含甘露糖/半乳糖化合物(诸如瓜尔豆胶)的体内修饰，其中该生物所用的方法对该生物为非天然的方法，诸如利用DNA技术的方法。发生的修饰可以与该化合物(例如甘露糖和/或半乳糖)的一个或多个前体有关，或与该化合物本身有关(即包含该化合物的一个化合物的甘露糖和/或半乳糖单元的修饰)。
特别是，本发明涉及一个体内修饰方法，它影响，最好是提高能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比。该体内修饰方法不是天然产生的方法。
因此，使用本发明的体内修饰方法，可以改变生物体内内部甘露糖与半乳糖之比和/或其甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比。
体内改性瓜尔豆胶生产的一个要求是将合适基因导入瓜尔豆的方法的实用性。这由Jrsboe和Okkels(1994)在有限程度上完成，他们转移了一个可选择或可筛选的用来开发转化方法的基因。这些作者没有报道用一个基因转化影响甘露糖与半乳糖之比。从生物技术的观点来看，这是重要的一点，生产体内改性的瓜尔豆胶的主要障碍是缺乏半乳甘露聚糖生物合成的知识。至今尚未分离并表征体内控制瓜尔豆胶生物合成的基因或基因产物。然而，我们现在已经确定了控制瓜尔豆胶体内生物合成的某些基因或基因产物，因此我们能够使瓜尔豆胶体内改性。
在一个推荐方面，本发明涉及一个体内修饰方法，它影响(最好是提高)能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，该体内修饰方法包括表达编码一个基因产物的核苷酸序列，该基因产物具有的影响是：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳
糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半乳
糖之比；并且其中该核苷酸序列对该生物(或其部分)而言不是天然的核苷酸序列。
在另一推荐方面，本发明涉及一个体内修饰方法，它影响(最好是提高)能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，该体内修饰方法包括提供一个基因产物，该基因产物能够影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳
糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
乳糖之比；该方法影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳
糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
乳糖之比；其中该基因产物尚未用对该生物(或其部分)为天然核苷酸序列的核苷酸序列表达。
本发明的另一广义方面涉及使用一种核苷酸序列，以在体内影响(最好是提高)能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比，或含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中编码一基因产物的核苷酸序列影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳
糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
乳糖之比；并且其中该核苷酸序列对该生物(或其部分)而言不是天然的核苷酸序列。
本发明的另一广义方面涉及使用一种基因产物，以在体内影响(最好是提高)能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比，或含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中该基因产物影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳
糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
乳糖之比；其中该基因产物尚未用对该生物(或其部分)为天然核苷酸序列的核苷酸序列表达。
“含甘露糖/半乳糖化合物”一词是指包含至少一个甘露糖基团和至少一个半乳糖基团的化合物。
在这些推荐方面中的每个方面，该含甘露糖/半乳糖化合物最好为半乳甘露聚糖。
在这些推荐方面中的每个方面，更优选该含甘露糖/半乳糖化合物为瓜尔豆胶。
在这些推荐方面中的每个方面，更优选能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物为瓜尔豆植株，其含甘露糖/半乳糖化合物为半乳甘露聚糖。然而，包括其它产生半乳甘露聚糖的植物，诸如葫芦巴和苜蓿。被认为不产生适量半乳甘露聚糖的植物属于茄科和烟草种。
“能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)”也包括能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的任何合适生物，特别是植物，使得该生物甘露糖与半乳糖体内内部之比改变。该术语也包括能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物的任何部分，使得该部分的甘露糖与半乳糖之比改变。该术语也包括在生物内或在组织培养基中的部分。该部分最好是在该生物本身内。一个部分的一个实例是种子。
“对该生物而言为天然核苷酸序列”是指在其天然环境中并且操作性地连接与其天然相关的启动子的整个核苷酸序列，该启动子也在其天然环境中。
“甘露糖和半乳糖前体”包括作为含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成前体的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物。另外，该术语包括随后用作含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成前体的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物。该术语最好是指用作含甘露糖/半乳糖化合物(最好是瓜尔豆半乳甘露聚糖)生物合成前体的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物(诸如甘露糖-6-磷酸盐或GDP-甘露糖)。
“基因产物”包括肽、多肽、蛋白质、酶和RNA，该术语最好是指酶。
该生物体(或其部分)内甘露糖与半乳糖之比或该生物的含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比最好高于该瓜尔豆植株或其半乳甘露聚糖的甘露糖与半乳糖之比。
该生物体内甘露糖与半乳糖之比或该生物的含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比更优选大致类似于长角豆或其半乳甘露聚糖的甘露糖与半乳糖之比。
该生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物最好为瓜尔豆植株或瓜尔豆胶。
本发明也涉及用本发明方法制备的含甘露糖/半乳糖化合物。该含甘露糖/半乳糖化合物将称为按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物。
此外，本发明也包括包含按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物的食料。
另外，本发明也包括包含按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物与另一种多糖混合的组合物，诸如一种食料。该另一种糖最好是任何一种或多种吨胶、角叉菜胶和琼脂糖。
另外，本发明包括制备按照本发明组合物或食料的方法，它包含将按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物与另一合适组分混合。
用一种或多种合适策略，可以达到本发明的广义方面，其中每种策略组成本发明的一个推荐实施方案。
第一种策略涉及一种或多种基因产物或其编码核苷酸序列，其中这些基因产物可用于GDP-甘露糖的生物合成中。该策略涉及一种或多种编码酶的基因的转化，这些酶是GDP-甘露糖生物合成所需的，这些酶即为磷酸甘露糖异构酶(PMI)和/或GDP-甘露糖焦磷酸化酶。
在该方面，据信可用于GDP-甘露糖生物合成的一种或多种基因产物提高甘露糖-6-磷酸的水平，它随后提高含甘露糖/半乳糖化合物(诸如半乳甘露聚糖)的甘露糖与半乳糖之比。
第一种策略的推荐方面涉及至少使用PMI和/或其编码核苷酸序列。据信该PMI基因产物提高甘露糖-6-磷酸的水平，它随后提高含甘露糖/半乳糖化合物(诸如半乳甘露聚糖)的甘露糖与半乳糖之比。更优选该PMI为植物PMI。
第二种策略涉及使用α-半乳糖苷酶及其编码核苷酸序列。用该策略，可以利用α-半乳糖苷酶，诸如来自番泻树或咖啡豆的α-半乳糖苷酶，以在体内改变含甘露糖/半乳糖化合物(诸如半乳甘露聚糖)的甘露糖与半乳糖之比。
第三种策略涉及第一种策略与第二种策略的组合，这些策略可以以任何顺序使用或同时使用。
本发明的推荐方面涉及包含表达任何一种或多种本发明核苷酸序列的构建物。
本发明的另一推荐方面涉及包含或表达任何一种或多种本发明核苷酸序列的载体。
本发明的另一推荐方面涉及包含或表达任何一种或多种本发明的载体、构建物或核苷酸序列的质粒。
本发明的另一推荐方面涉及包含或表达任何一种或多种本发明的质粒、载体、构建物或核苷酸序列的转基因生物(或其部分)。
本发明的其它推荐方面包括表达或允许表达或转化任何一种或多种核苷酸序列、构建物、质粒、载体、细胞、组织、器官或生物以及他们的产物的方法。
本发明的其它推荐方面包括使用这些基因产物制备或处理食料，包括动物饲料。
本发明也涉及分离用本发明方法制备的瓜尔豆胶。
本发明也涉及用本发明方法制备的瓜尔豆胶。
现在通过参看本发明的其它推荐方法，更详细地描述本发明的第一种策略。
按照本发明该方面的第一个推荐方面，提供包含图1所示氨基酸序列的酶或其变异体、同源物或其片段。
按照本发明该方面的第二个推荐方面，提供第一个方面的酶的编码核苷酸序列或与其互补的序列。
按照本发明该方面的第三个方面，提供包含图1所示序列的核苷酸序列或其变异体、同源物或其片段，或与其互补的序列。
按照本发明该方面的第四个方面，提供包含或表达按照先前方面中任一方面发明的构建物。
按照本发明该方面的第五个方面，提供包含或表达按照先前方面中任一方面发明的载体。
按照本发明该方面的第六个方面，提供包含或表达按照先前方面中任一方面发明的质粒。
按照本发明该方面的第七个方面，提供包含或表达按照先前方面中任一方面发明的转基因生物(或其部分)。
在本发明该方面的这些推荐方面中，该核苷酸序列或该酶最好是本发明上述方面定义的或其中含有的或通过上述方面表达的核苷酸序列或酶。
本发明该方面的其它方面包括表达或允许表达或转化任何一种核苷酸序列、构建物、质粒、载体、细胞、组织、器官或生物及其产物的方法。
本发明该方面的其它方面包括使用该酶制备或处理食料，包括动物饲料。
因此，本发明该方面的一个推荐方面涉及磷酸甘露糖异构酶(“PMI”)和编码该酶的核苷酸序列。特别是，本发明的推荐方面涉及重组PMI。
此外，本发明的推荐方面涉及使用该重组PMI改变生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，尤其是半乳甘露聚糖的甘露糖与半乳糖之比。
本发明的一个主要优点在于，通过使用该重组PMI，可以提高生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，特别是体内改性的瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比。通过插入参与含甘露糖/半乳糖化合物(诸如甘露糖-6-磷酸)生物合成的一个或多个基因产物的一个或多个编码基因，达到该优点，该基因最优选为本发明的核苷酸序列。
其它主要优点在于，该重组酶可以容易地大量制备。此外，该核苷酸序列当插入(最好是稳定插入)生物(或其部分)的基因组时，可以用来改变体内甘露糖与半乳糖浓度之比。
该核苷酸序列最好为DNA序列。
在一个高度推荐的实施方案中，该核苷酸序列为重组DNA序列。
该核苷酸序列最好得自保藏物NCIMB 40774。
在一个高度推荐的实施方案中，用重组DNA技术表达该酶。
该酶最好用得自保藏物NCIMB 40774的核苷酸序列表达。
该生物最好为植物。
该植物更优选为瓜尔豆植株。
该含甘露糖/半乳糖化合物最好为瓜尔豆胶。
该酶或编码该酶的核苷酸序列可以在体内与一种或多种其它酶或其编码核苷酸序列一起使用，这些其它酶或其编码核苷酸序列最好用重组DNA技术制备。PMI酶或编码PMI酶的核苷酸序列也可以在体外使用。该PMI酶或其编码核苷酸序列也可以与一种或多种其它酶或其编码核苷酸序列一起使用，这些酶或其编码核苷酸序列最好用重组DNA技术制备。
与该酶有关的“变异体”、“同源物”或“片段”包括该序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或加入，只要产生的氨基酸序列具有PMI活性，最好至少具有图1所示酶的相同活性。具体地说，“同源物”一词包括结构和/或功能同源，只要产物的酶具有PMI活性。关于序列同源性，最好至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％与图1所示序列同源。更优选至少95％，更优选至少98％与图1所示序列同源。
与编码该酶的核苷酸序列有关的“变异体”、“同源性”或“片段”包括该序列的一个(或多个)核酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或加入，只要产生的核苷酸序列编码的酶具有PMI活性，最好至少具有图1所示酶的相同活性。具体地说，“同源性”一词包括结构和/或功能同源性，只要产物的核苷酸序列编码的酶具有PMI活性。关于序列同源性，优选至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％与图1所示序列同源。更优选至少95％，更优选至少98％与图1所示序列同源。
上述术语与该序列的等位变异同义。
“互补”一词是指本发明也包括可以与本发明核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
现在通过参考本发明其它推荐方面，更详细地描述本发明的第二种策略。
按照本发明该方面的第一个推荐方面，提供包含图4所示氨基酸序列的酶或其变异体、同源物或其片段。
按照本发明该方面的第二个推荐方面，提供第一个方面的酶的编码核苷酸序列或与其互补的序列。
按照本发明该方面的第三个推荐方面，提供包含图4所示序列的核苷酸序列或其变异体、同源物或其片段，或与其互补的序列。
按照本发明该方面的第四个推荐方面，提供包含或表达按照前述任一方面发明的构建物。
按照本发明该方面的第五个推荐方面，提供包含或表达前述任一方面发明的载体。
按照本发明该方面的第六个推荐方面，提供包含或表达前述任一方面发明的质粒。
按照本发明该方面的第七个推荐方面，提供包含或表达前述任一方面发明的转基因生物(或其部分)。
在本发明该方面的这些推荐方面中，该核苷酸序列或该酶最好是本发明上述方面中定义或包含或通过上述方面表达的核苷酸序列或酶。
本发明该方面的其它推荐方面包括表达或允许表达或转化任一核苷酸序列、构建物、质粒、载体、细胞、组织、器官或生物及其产物。
本发明该方面的其它推荐方面包括使用该酶制备或处理食料，包括动物饲料。
本发明该方面的一个推荐方面因此涉及α-半乳糖苷酶和编码该酶的核苷酸序列。
特别是，本发明的推荐方面涉及重组α-半乳糖苷酶。
另外，本发明的推荐方面涉及使用该重组α-半乳糖苷酶，以改变或者生物(或其部分)和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，尤其是半乳甘露聚糖的甘露糖与半乳糖之比。
本发明的一个主要优点是：通过利用该重组α-半乳糖苷酶，可能提高一种生物(或其部分)和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，特别是体内修饰的瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比。
其它主要优点是：该重组酶可以容易地大量制备。此外，该核苷酸序列当插入(最好是稳定插入)一种生物(或其部分)的基因组时，可以用来改变体内甘露糖与半乳糖浓度之比。
该核苷酸序列最好是一种DNA序列。在高度推荐的实施方案中，该核苷酸序列是重组DNA序列。
该核苷酸序列最好得自保藏物NCIMB 40831。
在一个高度推荐的实施方案中，使用重组DNA技术表达该酶。
该酶最好用得自保藏物NCIMB 40831的核苷酸序列表达。
该生物最好是一种植物。
该植物更优选是瓜尔豆植株。
该含甘露糖/半乳糖化合物最好是瓜尔豆胶。
该酶或编码该酶的核苷酸序列可以在体内与一种或多种其它酶或其编码核苷酸序列一起使用，这些酶或其编码核苷酸序列最好用重组DNA技术制备。α-半乳糖苷酶或编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列也可以在体外使用。该α-半乳糖苷酶或其编码核苷酸序列也可以与一种或多种其它酶或其编码核苷酸序列一起使用，这些酶或其编码核苷酸序列最好用重组DNA技术制备。
与该酶有关的“变异体”、“同源物”或“片段”包括该序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或加入，只要产生的氨基酸序列具有α-半乳糖苷酶活性，最好至少具有图4所示酶的相同活性。具体地说，“同源物”一词包括结构和/或功能同源物，只要产物的酶具有α-半乳糖苷酶活性。关于序列同源物，最好至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％与图4所示序列同源。更优选至少95％，更优选至少98％与图4所示序列同源。
与编码该酶的核苷酸序列有关的“变异体”、“同源物”或“片段”包括该序列的一个(或多个)核苷酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或加入，只要产生的核苷酸序列编码的酶具有α-半乳糖苷酶活性，最好至少具有图4所示酶的相同活性。具体地说，“同源物”一词包括结构和/或功能同源物，只要产物的核苷酸序列编码的酶具有α-半乳糖苷酶活性。关于序列同源物，最好至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％与图4所示序列同源。更优选至少95％，更优选至少98％与图4所示序列同源。
上述术语与该序列的等位变异同义。
“互补”一词是指本发明也包括可以与本发明核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
与本发明有关的“核苷酸”一词包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。它最好是指DNA，更优选为本发明编码序列的cDNA。
与诸如“结合物”、“盒”和“杂种”之类术语同义的术语“构建物”包括直接或间接与一个启动子连接或融合的核苷酸序列。间接连接的实例是提供适当的间隔基团，诸如内含子序列，诸如Shl内含子或ADH内含子，置于该启动子和该核苷酸序列中间。在所有情况下，都非常推荐该术语不包括通常相连该酶野生型编码基因与该野生型基因启动子当它们两者处于其天然环境中发生的天然重组。因此，本发明一个高度推荐实施方案涉及操作性地与异源启动子连接的本发明核苷酸序列。
该构建物甚至可以含有或表达一种标记，后者允许在转移遗传构建物的植物中(诸如瓜尔豆)中选择该遗传构建物。存在可以使用的各种标记，它们例如为编码甘露糖-6-磷酸异构酶(尤其对于植物)的那些标记或提供除草剂抗性或抗生素抗性(例如抗G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素)的那些标记。
“载体”一词包括表达载体和转化载体。
“表达载体”一词是指能够体内或体外表达的构建物。
“转化载体”一词是指能够从一种物种转移到另一种物种的构建物，诸如质粒从大肠杆菌转移至农杆菌转移到植物。
“组织”一词包括组织本身和器官。
与本发明有关的“生物”包括可以包含编码按照本发明酶的核苷酸序列和/或得自它的产物的任何生物，和/或其中按照本发明的核苷酸序列存在于该生物中时可以表达。
该生物最好是瓜尔豆植株。
本发明有关的“转基因生物”包括包含编码按照本发明酶的核苷酸序列和/或得自它的产物的任何生物，和/或其中按照本发明的核苷酸序列在该生物中可以表达。该核苷酸最好整合到该生物的基因组中。
该转基因生物最好是一种植物，更优选是瓜尔豆植株。
本发明的转基因生物包括包含任何一种或多种按照本发明酶的编码核苷酸序列、按照本发明的构建物、按照本发明的载体、按照本发明的质粒、按照本发明的细胞、按照本发明的组织或其产物，包括其组合。例如该转基因生物也可以包含任何在一种或多种异源启动子控制下的一种或多种编码本发明酶的核苷酸序列。
在一个高度推荐的实施方案中，该转基因生物(或其部分)不包含启动子和编码按照本发明酶的核苷酸序列的组合，其中该启动子和该核苷酸序列对该生物(或其部分)都是天然的，并处于其天然环境中。因此，在该高度推荐的实施方案中，当按照本发明的天然核苷酸编码序列在也处于其天然环境中的天然启动子控制下时，本发明不包括处于其天然环境中的按照本发明的天然核苷酸编码序列。另外，在该高度推荐的实施方案中，当按照本发明的天然酶处于其天然环境中并它由也处于其天然环境中的天然核苷酸序列编码时，而且该核苷酸序列在也处于其天然环境中的其天然启动子控制下时，本发明不包括该按照本发明的天然酶。
“启动子”以本领域的通常意义使用，例如在Jacob-Mond基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
该启动子还包括一个或多个特征，以确保或提高在合适宿主中的表达。例如，这些特征可以是诸如Pribnow框或TATA框之类的保守区。启动子甚至可以含有影响(诸如保持、增强、降低)本发明核苷酸序列表达水平的其它序列。例如，合适的其它序列包括Shl内含子或ADH内含子。其它序列包括诱导型元件，诸如温度、化学药品、光或应激反应诱导型元件。
此外，可以存在提高转录或翻译的合适元件。后一种元件的实例是TMV 5’信号序列(参见Sleat Gene 217[1987]217-225；和DawsonPlant Mol.Biol.23[1993]97)。
因此，一方面，按照本发明的核苷酸序列在允许该核苷酸序列表达的启动子控制下。在该方面，该启动子可以是细胞和组织特异性启动子。例如，如果该生物是一种植物，那么该启动子可以是影响该核苷酸序列在一个或多个种子、茎、芽、根和叶组织中表达的启动子。
作为实例，本发明核苷酸序列的启动子可以是PCT/EP95/02195中描述的α-Amy 1启动子(或者已知为Amy 1启动子、Amy 637启动子或α-Amy 637启动子)。
或者，本发明核苷酸序列的启动子可以是PCT/EP95/02196中描述的α-Amy 3启动子(或者已知为Amy 3启动子、Amy 351启动子或α-Amy 351启动子)。关于该Amy 351启动子，可以失活其一部分，使得该部分失活的启动子以更特异性的方式，诸如仅在特定组织类型或器官中表达该核苷酸序列。“失活”一词是指修饰该启动子的表达方式，但其中该部分失活的启动子仍作为启动子起作用的意义上的部分失活。然而，如上所述，该修饰启动子能够在至少一种(但不是全部)原始启动子的特定组织表达该核苷酸序列。其它启动子序列部分失活的实例(不必是Amy 351启动子的部分失活)包括改变该启动子序列、或与该核苷酸序列部分的结合物质的折叠方式，使得该核苷酸的一部分不被例如RNA聚合酶识别。部分失活Amy 351启动子的另一种优选方式是缩短它，形成其片段。另一种方式可能突变至少一部分该序列，使得RNA聚合酶不能与该部分或另一部分结合。
另一种修饰是使调节蛋白(例如已知来自丝状真菌的CreA蛋白)的结合位点突变，以发挥碳分解代谢物抑制作用，因此消除该天然启动子的分解代谢物的抑制作用。
在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis T.(编辑)Molecular Cloning.A laboratory manual.第二版，冷泉港实验室出版，纽约，1989中可以发现重组DNA技术的一般内容。
即使在EP-B-0470145和CA-A-2006454中没有公开本发明的酶和核苷酸序列，但那两个文献确实提供了一些可以用来制备按照本发明的转基因植物的有用的技术背景评论。现在在以下评论中包括一些这些背景评论的改编。
构建遗传修饰植物的基本原理是在该植物基因组中插入遗传信息，以便获得该插入遗传物质的稳定保持。
存在几种插入该遗传信息的技术，两种主要的原理是直接导入该遗传信息和采用载体系统导入该遗传信息。在Potrykus(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的论文中可以发现一般技术的综述。
因此，一方面本发明涉及一种载体系统，它携带按照本发明的核苷酸序列或构建物，并能够将该核苷酸序列或该构建物导入生物(诸如一种植物)的基因组中。
该载体系统可以包含一种载体，但它可以包含两种载体。在两种载体的情况下，该载体系统通常称为双载体系统。在Gynheung An等，(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19中详细地描述了双载体系统。
用给定启动子或核苷酸序列或构建物转化植物细胞的一个广泛使用的系统基于使用来自根癌农杆菌的Ti质粒或来自毛根农杆菌的Ri质粒，An等，(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。
已经构建了几种不同的Ti质粒和Ri质粒，它们适用于构建上述植物或植物细胞构建物。这样一种Ti质粒的非限制性实例是pGV3850。
本发明的核苷酸序列或构建物应该最好插入该Ti质粒的T-DNA末端序列之间或邻近T-DNA序列，以便避免恰好在T-DNA边界周围的序列断裂，这些区中的至少一个区似乎是修饰T-DNA插入该植物基因组中所必需的。
正如从上述解释所理解的，如果该生物为一种植物，那么本发明的载体系统最好是含有感染该植物必需的序列(例如vir区)和至少一个T-DNA序列边界部分的载体系统，其中该边界部分位于同一载体上作为遗传构建物。
另外，该载体系统最好是根癌农杆菌Ti质粒或毛根农杆菌Ri质粒或它们的衍生物，这些质粒是众所周知的，并广泛用于转基因植物的构建，存在基于这些质粒或其衍生物的许多载体系统。
在转基因植物的构建中，本发明的核苷酸序列或构建物在插入该植物中之前，可以首先在可以复制该载体并易于操作的微生物中构建。一种有用的微生物实例是大肠杆菌，但可以使用具有上述性质的其它微生物。当在大肠杆菌中已经构建了上面限定的载体系统的载体时，必要时可以将其转移到合适的农杆菌菌株中，例如根癌农杆菌中。因此，最好将含有本发明核苷酸序列或构建物的Ti质粒转移到合适的农杆菌菌株(例如根癌农杆菌)中，以便获得含有本发明核苷酸序列或构建物的农杆菌细胞，随后将该DNA转移到待修饰的植物细胞中。
正如CA-A-2006454中报道的，可利用大量的克隆载体，它们含有在大肠杆菌中的复制系统和一种允许筛选转化细胞的标记。这些载体包括例如pBR322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。
这样，本发明的核苷酸序列或构建物可以导入该载体中的合适限制位置中。含有的质粒用来在大肠杆菌中转化。在合适的营养培养基中培养大肠杆菌细胞，然后收获这些细胞，并将其裂解。然后回收该质粒。一种分析方法是一般使用的序列分析、限制分析、电泳和进一步的生化分子生物学方法。每次操作后，可以限制性酶切所用的DNA序列，并将其与下一个DNA序列连接。可以在同一质粒或不同质粒中克隆每种序列。
在每次将按照本发明的构建物或核苷酸序列导入植物中后，可能必需存在和/或插入其它DNA序列。例如如果使用植物细胞的Ti质粒或Ri质粒转化，那么作为导入基因的侧翼区，可以连接至少Ti质粒和Ri质粒的T-DNA的右边界，然而通常可以连接T-DNA的右边界和左边界。已经广泛研究了使用T-DNA转化植物细胞，并在EP-A-120516；Hoekema：The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第V章，；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，4：1-46；和An等，EMBO J.(1985)4：277-284中进行了描述。
用农杆菌直接感染植物组织是一种简单的技术，它已经广泛使用，并在Butcher，D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods for PlantPathologists，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中进行了描述。关于该主题的其它内容参见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-TechMarch/April 1994 17-27)。用该技术，可以在植物的某些部分或某些组织上感染该植物，这些部分或组织例如为叶、根、茎的一部分或该植物的另一部分。
用携带本发明核苷酸序列的农杆菌直接感染植物组织，该感染植物通常是受伤的，例如通过用剃刀切割该植物或用针将该植物穿孔，或用研磨剂摩擦该植物。然后用农杆菌接种伤口。然后让接种的植物或植物部分在合适的培养基上生长，并让其发育为成熟植株。
构建植物细胞时，可以按照众所周知的组织培养方法生长并保持这些细胞，这些方法诸如在合适的添加诸如氨基酸、植物激素、维生素之类的必需生长因子的培养基中培养细胞。
可以采用由细胞或组织培养物再生植株的已知方法，例如通过采用抗生素筛选转化苗和通过在含有合适营养物、植物激素等的培养基中亚培养苗，完成转化细胞再生为遗传修饰的植株。
可以在EP-A-0449375中发现植物转化的其它内容。
在丹麦专利申请第940662号(于1994年6月10日申请)中可以发现甚至其它有用的转化胎儿动植物的内容。
因此，本发明涉及使用基因产物(例如参与甘露糖生物合成的PMI酶)提高生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比。另外，本发明涉及该核苷酸序列和它编码的基因产物。
本发明基于该令人惊讶的发现：通过插入编码下述基因产物的一个或多个基因，可以提高瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比，其中这些基因产物参与含甘露糖/半乳糖化合物(诸如甘露糖-6-磷酸，即PMI)的生物合成。
本发明的发现与根据本领城内容预期的相反。在该方面，由来自葫芦巴和瓜尔豆发育中的胚乳未纯化制剂的分析，Edwards提示GDP-甘露糖可能是半乳甘露聚糖生物合成的前体(Edwards等，1989，Reid和Edwards 1995)。通过反应混合物中不同量的GDP-甘露糖的分析，作者总结出甘露糖与半乳糖之比的控制可能在于合成半乳甘露聚糖的糖基转移酶本身特异性的水平。这可能启示，糖基转移酶可能是瓜尔豆胶体内修饰的遗传操作的关键靶。
因此，总之，本发明的该推荐方面涉及将磷酸甘露糖异构酶基因插入植物中，最好插入瓜尔豆中。
该策略的基本原理基基于我们对插入瓜尔豆半乳甘露聚糖中的甘露糖得自GDP-甘露糖的理解。然而，在瓜尔豆中合成该GDP-甘露糖的方式是未知的。典型方法是通过GDP-葡萄糖异构化，但某些初步数据提示，在某些豆类中，至少可以通过将果糖-6-磷酸异构化为甘露糖-6-磷酸，而甘露糖-6-磷酸异构化为甘露糖-1-磷酸，随后它转化为GDP-甘露糖来合成GDP-甘露糖。但甚至如果后一种途径应该是可操作的，那么PMI活性的提高本身预期不能影响半乳甘露聚糖组合物，因为第一，果糖-6-磷酸到甘露糖-6-磷酸的异构化是完全可逆反应，第二，Reid和Edwards(1995)已经预言，该甘露糖与半乳糖之比由半乳甘露聚糖合成酶的特异性决定。关于该策略，正如可明显看出的，甚至当在瓜尔豆中采用弱表达启动子时，我们已经得到甘露糖与半乳糖之比的提高。但是，采用较强的启动子，甚至可以达到更高的比率水平。
本发明也基于下述令人惊讶的发现：通过插入一种或多种参与瓜尔豆或其前体生物合成的基因产物的一种或多种编码基因，可以提高瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比。如上所述，在本发明的一个推荐方面中，该基因编码PMI。在另一个推荐方面，该基因编码α-半乳糖苷酶，最好是咖啡豆α-半乳糖苷酶或番泻树α-半乳糖苷酶，更优选番泻树α-半乳糖苷酶。
包含本发明PMI基因的以下样品按照布达佩斯条约通过识别保藏于1995年11月9日保藏在在工业和海洋细菌有限公司的国家保藏中心(NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1 RY)：
含有质粒pPMI-60的大肠杆菌K12。
保藏号为NCIMB 40774。
本发明也包括得自该保藏物的核苷酸序列及其编码产物。
包含本发明α-半乳糖苷酶基因的以下样品按照布达佩斯条约通过识别保藏于1996年11月28日保藏在工业和海洋细菌有限公司的国家保藏中心(NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，英国，AB21 RY)：
含有质粒pT7-SEcDNA5的大肠杆菌K12。
保藏号为NCIMB 40831。
本发明也包括得自该保藏物的核苷酸序列及其编码产物。
现在通过实施例描述本发明。在以下实施例中，参考附图，其中：
图1表明按照本发明的一个酶的氨基酸序列和按照本发明的一个核苷酸序列的序列；
图2是pcDNAII的质粒图谱；
图3是pSG-Man5的质粒图谱；
图4表明另一种按照本发明的酶的氨基酸序列和另一种按照本发明的核苷酸序列的序列；
图5是pPS48的质粒图谱；
图6是pPS48SEGAL的质粒图谱；
图7是pBKL4的质粒图谱；
图8是pBKIASEGAL的质粒图谱；
图9是pPS48-GALIII的质粒图谱；以及
图10是pBKL4GALIII的质粒图谱。
               采用PMI基因体内修饰瓜尔豆胶
           来自瓜尔豆的磷酸甘露糖异构酶的克隆
在质粒pcDNAII(Invitrogen公司)中构建代表来自未成熟瓜尔豆胚乳的mRNA的cDNA表达文库，将其转化到大肠杆菌菌株Top10F～(Invitrogen公司)中。通过从大量随机挑出的分离菌落中纯化质粒，控制cDNA文库的质量。这些质粒的限制酶消化表明全部含有至少500bp的一种插入。
大肠杆菌菌种CD1 man-含有一个失活PMI基因，因此不能代谢甘露糖(Darzins等1985)。该菌种用于以下互补研究。
用Hanahan(1985)的方法，将CD1 man-细胞制成感受态。获得效价为3-4×106个转化细胞/μg的文库质粒cDNA。当用Bluescript对照质粒转化细胞时，发现相似的效价。
在互补研究之前，进行大量的对照实验，其中将转化细胞平板接种到含有M9盐(Maniatis等1982)、加入0.05g/l亮氨酸、0.05g/l甲硫氨酸、0.05g/l苏氨酸、1.0g/l盐酸硫胺素、50mg/l氨苄青霉素、6.0g/l甘露糖和9.0g/l琼脂糖的选择培养基上。该培养基下文称为M9-SGP。
在一个实验中，用在其天然启动子(Mils和Guest 1984)控制下的大肠杆菌PMI基因转化CD1 man-感受态细胞，而在另一个实验中，用在植物启动子CaMV 35S(pSGMAN1，参见Bojsen等1993)控制下的大肠杆菌PMI基因转化这些细胞。在这些两个实验中，将转化细胞平板接种到M9-SGP上，产生大量的大菌落。当感受态CD1 man-细胞不用或用Bluescript对照质粒转化时，没有获得大菌落，但观察到大量非常小的几乎不可见的菌落。因此，该M9-SGP选择培养基适用于筛选含有活性PMI基因的细胞。
用从该瓜尔豆胚乳cDNA文库中分离的质粒DNA转化感受态CD1 man-细胞。将转化的CD1 man-细胞平板接种到选择底物M9-SGP上。于37℃培养2天后，大多数平板接种的细胞似乎是非常小的菌落，而少于0.1％的菌落则大得多。
纯化来自较大菌落的质粒，将其再次转化到感受态CD1 man-细胞中。分析20个不同再次转化菌落粗提取物的PMI活性。通过Gill等(1986)描述的偶联酶促分析测定PMI活性。其中一个检测的菌落含有非常高的PMI活性。该克隆命名为PMI-60，其保藏号为NCIMB40774。
为了测试是否该插入物来源于瓜尔豆的PMI-60中，按照Dellaporta等(1983)的方法，从叶中纯化瓜尔豆基因组DNA，用限制酶消化，按照Feinberg和Vogelstein的方法(1983)进行Southern印迹分析，并用得自PMI-60、用P-32标记的质粒DNA进行探测。分别于68℃用6×SSC和于68℃用0.2×SSC进行杂交和洗涤(Maniatis等1982)。PMI-60探针与大量消化的瓜尔豆基因组DNA片段杂交。
通过应用引物步查的双脱氧测序法(Sanger和Coulson 1977)，首先用荧光素标记的引物(反向引物和通用引物)，随后用荧光素-dATP进行内部标记，对质粒PMI-60(称为pPMI-60)的插入物进行测序。
cDNA克隆的大小为1.66kb，其中PMI基因包括1.29kb。PMI的起始密码子和终止密码子分别位于0.09kb和1.38kb处。该插入含有的假定多腺苷酸化信号位于终止密码子下游的0.11kb处，为poly A终止的。
通过与其它已知PMI序列的比较，进一步找出该插入的鉴定的特征。在翻译起始下游的137-145氨基酸处发现一个保守区：DGNHKPEM，它被认为涉及磷酸甘露糖异构酶的活性PMI位点(Coulin等1993)。
因此，PMI-60中插入物的存在导致在含有甘露糖的选择培养基上的快速生长、PMI活性高和与瓜尔豆DNA杂交。此外，与来自其它PMI基因的某些序列有同源性。这些数据证明，PMI-60中的该插入物是来自瓜尔豆的PMI基因。
该PMI序列是第一个从植物中克隆和测序的PMI序列。采用磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因的转化
以下转化研究表明，通过插入磷酸甘露糖异构酶(PMI)(诸如来自大肠杆菌或瓜尔豆的磷酸甘露糖异构酶)，可以提高瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比。根据可利用的底物，重组PMI催化果糖-6-磷酸转化为甘露糖-6-磷酸，或催化甘露糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸。瓜尔豆的转化
通过Jrsboe和Okkels(1994)描述的根癌农杆菌介导的基因转移，获得转基因瓜尔豆植株，上述论文的内容通过引用结合到本文中。推荐的根癌农杆菌菌种是这些研究中的LBA 4404。
称为pDO18的质粒中T-DNA中的插入含有3个基因(右边界至左边界)：β-葡糖苷酸酶(GUS)基因、磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因和新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因。用Bojsen等(1993)中详细描述的35S启动子驱动每种基因的表达。用HPLC分析瓜尔豆胶
手工制备无胚和种皮的纯胚乳，按照Edwards等(1992)的方法，在匀浆期间用70％乙醇重复处理。将乙醇沉淀加入2ml 2 N三氟乙酸(TFA)中，于120℃水解2小时。通过于50℃蒸发除去TFA。将干燥的沉淀溶于500μl HPLC级H2O，将25μl样品加到Aminex HPX-87P柱(300×7.8mm)上。在层析柱烘箱中将该柱加热至80℃，用H2O洗脱。用RI检测器检测糖洗脱液。使用该系统，基线分离甘露糖和半乳糖。测定各个峰面积，并计算甘露糖与半乳糖之比。得自Sigma的瓜尔豆胶和LBG与来自非转基因瓜尔豆植株的胚乳样品一起用作标准。获得的Sigma瓜尔豆胶和非转基因胚乳的甘露糖与半乳糖之比都为1.6∶1，而Sigma的LBG的甘露糖与半乳糖之比为3.5∶1。这些比率与一般接受的那些比率非常一致(Reid和Edwards 1995)。在PMI转化的瓜尔豆中的甘露糖与半乳糖之比
分析了含有PMI基因的几种独立的瓜尔豆转化体在胚乳半乳甘露聚糖中的甘露糖与半乳糖之比，参见下表。
样品来源 甘露糖与半乳糖之比
来自Sigma的瓜尔豆胶 1.60
来自Sigma的LBG 3.44
瓜尔豆转化体123-1 1.64
瓜尔豆转化体123-2 1.63
瓜尔豆转化体124-1 1.74
每个转化体都提高了瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比。
通过插入来自瓜尔豆的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，进行相似的研究。在该方面，据信根据可利用的底物，该瓜尔豆PMI催化果糖-6-磷酸转化为甘露糖-6-磷酸，或催化甘露糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸。采用α-半乳糖苷酶基因体内修饰瓜尔豆胶
在以下实施例中，表明α-半乳糖苷酶基因插入瓜尔豆可以导致瓜尔豆胶的体内修饰。番泻树α-半乳糖苷酶cDNA的克隆和测序
如下通过PCR分离来自番泻树胚乳的α-半乳糖苷酶cDNA克隆。
按照Logemann等(Anal.Biochem.163(1987)16-20)的方法，从番泻树胚乳中纯化总RNA。在PCR后，用Perkin Elmer的RT-PCR试剂盒，按照该试剂盒的方法进行逆转录。简单地说，将大约1mg总RNA和1mg寡聚dT与逆转录酶一起于42℃保温45分钟后，于99℃保温5分钟，于5℃保温5分钟。
为了进行以下PCR，使用两种得自瓜尔豆α-半乳糖苷酶cDNA序列(Overbeeke等，Plant Mol.Biol.13(1989)541-550)的寡核苷酸：P1(5’-CAACGGGGCTTGCTGCTTTAGG)和P2(5’-GCCTATGTCA-GACCAGGATGC)，它们在瓜尔豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中分别位于位置415-437和1248-1270。
PCR条件为：于94℃ 1分钟，于55℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行35个循环，然后于72℃ 10分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳，分析PCR产物，获得850bp的单一产物。
将命名为SEGAL的DNA产物克隆到pR7Blue载体(Novagen)中，采用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amershem)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测定该核苷酸序列。
通过先前描述的称为3’和5’RACE方法(Nielsen等，Plant Mol.Biol.31(1996)539-552)，获得番泻树α-半乳糖苷酶cDNA的3’和5’端。简而言之，关于3’RACE，将大约1mg上述总RNA和2.5pmol下述引物与逆转录酶一起，于42℃保温45分钟，QT(5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T)17)然后于99℃保温5分钟，于5℃保温5分钟。
通过2轮PCR扩增该cDNA。
第一次PCR的下游引物为：
Q0(5’-CCAGTGAGCAGAGTGACG)，而上游引物为：
3’GSP1(5’-GTCCTCTGAGTGATAACAGAGTGG)，该上游引物为一种基因特异性引物，得自番泻树α-半乳糖苷酶cDNA(图4)中位置1096-1118的片段SEGAL的850bp核苷酸序列。
在第二次PCR中，下游引物为：
Q1(5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC)而上游引物为：
3’GSP2(5’-GGTGTTGTGGAATAGAAGTTCATC)，该上游引物为一种基因特异性引物，得自番泻树α-半乳糖苷酶cDNA(图4)中位置1123-1146的片段SEGAL的850bp核苷酸序列。
第一次PCR的PCR条件为：于94℃ 1分钟，于60℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行35个循环，然后于72℃ 10分钟。第二次PCR的条件为：于94℃ 1分钟，于50℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行35个循环，然后于72℃ 10分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析第二次PCR后的PCR产物，获得530bp的单一产物。
将命名为3’SEGAL的DNA产物克隆到pT7Blue载体(Novagen)中，采用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测定该核苷酸序列。
关于5’RACE，使用来自Gibco BRL的5’RACE系统与由片段SEGAL的850bp核苷酸序列构建的3重基因特异性引物。简而言之，将大约1mg上述所用的相同总RNA和2.5pmol番泻树α-半乳糖苷酶cDNA(图4)中位置561-582的该基因特异性引物，于70℃保温10分钟，5’GSP1(5’-TTGCACCTTGGTCTTCATGTCC)，然后加入逆转录酶，于42℃保温30分钟，于70℃保温15分钟，加入RNA酶H，再于55℃保温10分钟。
按照Gibco BRL方法将该cDNA加dC尾。该加尾cDNA进行两轮PCR。
在第一轮PCR中，使用上游ANKER引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG)与番泻树α-半乳糖苷酶cDNA(图4)中位置510-536的下述基因特异性下游引物一起使用：
5’GSP2(5-CATAGCTTTACTGCATGTTTGGTTTCC)，
在第二轮PCR中，使用上游UNI引物
(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACG)和番泻树α-半乳糖苷酶cDNA(图4)中位置438-462的下述基因特异性下游引物：
5’GSP3(5’-CAGCCAGAGCCTTAATTCCTGAAGG)，
第一轮PCR的PCR条件为：于94℃ 1分钟，于51℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行10个循环，然后于94℃ 1分钟，于59℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行25个循环，然后于72℃ 10分钟。
第二轮PCR的条件为：于94℃ 1分钟，于59℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行35个循环，然后于72℃ 10分钟，
通过琼脂糖凝胶电泳分析第二轮PCR后的PCR产物，获得480bp的单一产物。
将命名为5’SEGAL的DNA产物克隆到pT7Blue载体(Novagen)中，采用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测定该核苷酸序列。
由上述获得的3个PCR克隆5’SEGAL、SEGAL和3’SEGAL组合包含1630bp的番泻树α-半乳糖苷酶的完整核苷酸序列，示于图4中。该核苷酸序列的分析揭示(图4)一个编码406个氨基酸残基的开放读框，第一个甲硫氨酸位于第93核苷酸位置，翻译终止密码子位于第1311核苷酸位置。得出的氨基酸序列示于图4中的核苷酸序列之上。含有番泻树α-半乳糖苷酶的植物转化载体的构建
如下构建包含番泻树α-半乳糖苷酶的表达载体。
通过在pUC8(Vieira和Messing，Gene 19(1982)259-268)中插入含有双份-90至-420区的0.75kb的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S RNA启动子(E35S)(Kay等，Science 236(1987)1299-1302)、含有CaMV 35SRNA多腺苷酸化序列(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一个合成寡核苷酸接头(PstI-BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI)的0.21kb片段，构建载体pPS48(图5)。
通过PCR将3个DNA片段5’SEGAL、SEGAL和3’SEGAL连接在一起，重建一个番泻树α-半乳糖苷酶cDNA克隆，它含有该编码序列和非翻译的5’端的大多数。
采用引物5’GSP3和B255，再扩增片段5’SEGAL，它含有一个BamHI位点加上番泻树α-半乳糖苷酶cDNA(图4)中位置14-36的核苷酸：
(5’-ATTGGATCCACTCACAC-GTATACACTACAC)
采用引物3’GSP2和B254，再扩增片段3’SEGAL，它含有一个SphI位点加上番泻树α-半乳糖苷酶cDNA(图4)中位置1353-1373的核苷酸：
(5’-TTAGCATGCCCTTGGGATTGTATT-TCCTC)，
将这些PCR片段与片段SEGAL混合，通过采用邻接引物B254和B255扩增连接的序列。
PCR的条件为：对于5’SEGAL，于94℃ 1分钟，于57℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行35个循环，然后于72℃ 10分钟。对于3’SEGAL，于94℃ 1分钟，于48℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行35个循环，然后于72℃ 10分钟。对于最后连接3个片段的PCR，于94℃ 1分钟，于58℃ 2分钟，于72℃ 2分钟，进行35个循环，然后于72℃ 10分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析最后一轮PCR的PCR产物，获得1380bp的单一产物。
将该DNA产物克隆况pT7Blue载体(Novagen)中，采用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪测定该核苷酸序列。
通过用BamHI和SphI消化，分离该DNA片段，并将其克隆到表达载体pPS48中，产生pPS48SEGAL(图6)。
如下构建包含番泻树α-半乳糖苷酶表达盒的植物转化载体。
通过缺失NPTII盒，并插入一个合成寡核苷酸接头(EcoRI-ClaI-SalI-HindIII-SpeI-KpnI-BamHI)和一个在GUS盒和左边界之间含有邻接CaMV 35S RNA启动子(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一个来自章鱼碱合成酶基因的多腺苷酸化序列(Caplan等，Science 22(1983)815-821)的NPTII基因的新NPTII盒，由pBI121(Clontec Laboratories)构建载体pBKL4(图7)。
从pPS48SEGAL切下番泻树α-半乳糖苷酶表达盒，将其插入pBKL4中。
将产生的质粒pBKL4SEGAL(图8)转化到根癌农杆菌LBA4404菌株(Hockema等，Nature 303(1983)179-180)中，用于植物转化。用番泻树α-半乳糖苷酶转化瓜尔豆
采用根癌农杆菌转化，按照Jrsboe和Okkels(1994)详细描述的方法(其内容通过引用结合到本文中)，将来自番泻树的α-半乳糖苷酶基因转化到瓜尔豆中。分析用番泻树α-半乳糖苷酶基因转化的瓜尔豆植株的甘露糖与半乳糖之比。
将番泻树α-半乳糖苷酶基因转化的瓜尔豆植株的纯胚乳在2N三氟乙酸中水解(参见上述细节)后，用HPLC进行分析。
示于下表中的结果得自4个独立的含有番泻树α-半乳糖苷酶基因的瓜尔豆转化体胚乳的分析。
按相对于未转化对照胚乳而言，以甘露糖与半乳糖之比增加的百分比给出结果。
    转化体     甘露糖与半乳糖之比的相对增加
    26-5-12-1     6.5％
    29-5-08-1     5.3％
    39-5-45-1     18.9％
    40-5-02-1     10.6％
含有咖啡豆α-半乳糖苷酶的植物转化载体的构建。
如下构建包含咖啡豆α-半乳糖苷酶编码序列的表达载体。
通过在pUC8(Vieira和Messing，Gene 19(1982)259-268)中插入含有双份-90至-420区的0.75bp的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S RNA启动子(E35S)(Kay等，Science 236(1987)1299-1302)、含有CaMV 35SRNA多腺苷酸化序列(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一个合成寡核苷酸接头(PstI-BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI)的0.21bp片段。构建载体pPS48(图5)。
通过采用一个上游引物(咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中的位置13-35)
5’-TTGGATCCACCCAAAA-GCTGGTGCTCC和下游引物(在咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中的位置1229-1264)
5’-TTAGCATGCCTGTTAATCACTGTGGG的聚合酶链式反应(PCR)，从质粒pCB-BZ(Zhu和Goldstein Gene 140(1994)227-231)分离含有咖啡豆α-半乳糖苷酶编码序列的DNA片段，产生一个在α-半乳糖苷酶基因5’端含有一个BamHI位点和3’端一个SphI位点的1.2kb DNA片段。
将该DNA片段克隆到pT7Blue(Novagen)中，采用TGermo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测定该核苷酸序列。
通过用BamHI和SphI消化，分离该DNA片段，并将其克隆到载体pPS48中，产生pPS48-GALIII(图9)。
如下构建包含咖啡豆α-半乳糖苷酶表达盒的植物转化载体。
通过缺失NPTII盒，并插入一个合成寡核苷酸接头(EcoRI-ClaI-SalI-HindIII-SpeI-KpnI-BamHI)和一个在GUS盒和左边界之间含有邻接CaMV 35S RNA启动子(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一个来自章鱼碱合成酶基因的多腺苷酸化序列(Caplan等，Science 222(1983)815-821)的NPTII基因的新NPTII盒，由pBIl2l(Clontec Laboratories)构建载体pBKL4(图7)。
通过用XbaI消化从pPS48-GALIII切下咖啡豆α-半乳糖苷酶表达盒，将其插入SpeI消化的pBKL4中。
将产生的质粒pBKL4-GALIII(图10)转化到根癌农杆菌LBA4404菌株(Hockema等，Nature 303(1983)179-180)中，用于植物转化。用咖啡豆α-半乳糖苷酶转化瓜尔豆
采用根癌农杆菌转化，按照Jrsboe和Okkels(1994)详细描述的方法，将来自咖啡豆的α-半乳糖苷酶基因转化到瓜尔豆中。分析用咖啡豆α-半乳糖苷酶基因转化的瓜尔豆植株胚乳的甘露糖与半乳糖之比。
将用咖啡豆α-半乳糖苷酶基因转化的瓜尔豆植株的纯胚乳在2N三氟乙酸中水解(参见上述细节)后，用HPLC进行分析。示于下表中的结果得自4个独立的含有咖啡豆α-半乳糖苷酶基因的瓜尔豆转化体胚乳的分析。按相对于未转化对照胚乳而言，以甘露糖与半乳糖之比增加的百分比给出结果。
    转化体     甘露糖与半乳糖之比的相对增加
    4-2-4-2     4.2％
    4-2-5-5     4.0％
    4-2-8-2     6.0％
    17-3-6-1     4.1％
瓜尔豆胶体内修饰的讨论
在上述两个实施例中，表明将α-半乳糖苷酶基因插入瓜尔豆中，可以导致瓜尔豆胶的体内修饰，这由转基因的半乳甘露聚糖的甘露糖与半乳糖之比高于非转基因对照的半乳甘露聚糖的甘露糖与半乳糖之比的事实证明。
除用磷酸甘露糖异构酶基因的实施例(参见上述)外，这些是在植物细胞壁贮藏多糖体内修饰方面提出的第一个数据。概述
这些结果表明，构建能够形成瓜尔豆胶使得影响甘露糖与半乳糖之比的转基因植物是可能的。
在该方面，PMI转化系、咖啡豆α-半乳糖苷酶转化系和番泻树α-半乳糖苷酶转化系产生的甘露糖与半乳糖之比都高于非转化系。例如，与甘露糖与半乳糖之比之比为1.65的非转化系相比，咖啡豆α-半乳糖苷酶转化体的甘露糖与半乳糖之比高至1.75，而某些番泻树α-半乳糖苷酶转化体的甘露糖与半乳糖之比甚至高至2。这些结果非常令人惊讶。
正如本领域技术人员显而易见的，体内修饰的程度取决于转化到瓜尔豆中的基因编码的半乳甘露聚糖相关酶的活性。因此，该启动子的置换或修饰或其它调节核苷酸序列或氨基酸序列可能导致不同于上述实施例中所述那些半乳甘露聚糖的体内修饰。
本发明的其它修改对本领域技术人员是显而易见的。
如上所述，图1提出了编码PMI酶的核苷酸序列和该PMI酶的氨基酸序列。为了消除疑问，该核苷酸序列可以称为SEQ ID No.1，而该氨基酸序列可以称为SEQ ID No.2。
如上所述，图4提出了编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列和该α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。为了消除疑问，可以将该核苷酸序列称为SEQID No.3，而将该氨基酸序列称为SEQ ID No.4。
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Claims (45)

1.体内修饰方法，它影响能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比。
2.体内修饰方法，它影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比；该体内修饰方法包括表达编码一种基因产物的核苷酸序列，该基因产物影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半
   乳糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
   乳糖之比。其中该核苷酸序列对该生物(或其部分)不是天然核苷酸序列。
3.体内修饰方法，它影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比；该体内修饰方法包括允许一种能够对以下具有影响的基因产物
(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半
   乳糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
   乳糖之比，影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半
   乳糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
   乳糖之比；其中该基因产物不由对该生物(或其部分)为天然核苷酸序列的核苷酸序列表达。
4.一种核苷酸序列的用途，该核苷酸序列在体内影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中该核苷酸序列编码的基因产物影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半
   乳糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
   乳糖之比；并且其中该核苷酸序列对该生物(或其部分)不是天然核苷酸序列。
5.一个基因产物的用途，该核苷酸序列在体内影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中该基因产物影响：
(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半
   乳糖之比；和/或
(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半
   乳糖之比；其中该基因产物不由对该生物(或其部分)为天然核苷酸序列的核苷酸序列表达。
6.按照权利要求1-5中任一项的发明，其中该含甘露糖/半乳糖化合物为半乳甘露聚糖。
7.按照权利要求1-6中任一项的发明，其中能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的该生物为瓜尔豆植株。
8.按照权利要求1-6中任一项的发明，其中该生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的体内甘露糖与半乳糖之比高于该瓜尔豆植株或其半乳甘露聚糖。
9.按照权利要求1-8中任一项的发明，其中该生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的体内甘露糖与半乳糖之比与角豆或其半乳甘露聚糖的甘露糖与半乳糖之比大致相似。
10.按照权利要求2-9中任一项的发明，其中该基因产物为至少一种可用于GDP-甘露糖生物合成的基因产物。
11.按照权利要求10的发明，其中该基因产物为图1所示的蛋白质或其变变异体、同源物或衍生物。
12.按照权利要求10或11的发明，其中该基因产物由图1所示核苷酸序列编码，或是其变异体、同源物或衍生物和/或得自NCIMB40774。
13.按照权利要求2-9中任一项的发明，其中该基因产物为α-半乳糖苷酶。
14.按照权利要求13的发明，其中该基因产物为图4所示的蛋白质或其变异体、同源物或衍生物。
15.按照权利要求13或14的发明，其中该基因产物由图4所示核苷酸序列编码，或为其变异体、同源物或衍生物和/或得自NCIMB40831。
16.一种酶，它包含图1所示氨基酸序列或其变异体、同源物或衍生物。
17.编码权利要求16的酶的核苷酸序列或与其互补和/或可得自NCIMB 40774的序列。
18.按照权利要求17的核苷酸序列，其中该核苷酸序列为DNA序列。
19.一种核苷酸序列，它包含图1所示序列、或其变异体、同源物或片段或与其互补和/或得自NCIMB 40774的序列。
20.一种构建物，它包含或表达按照权利要求16-19中任一项的发明。
21.一种载体，它包含或表达按照权利要求16-20中任一项的发明。
22.一种质粒，它包含或表达按照权利要求16-21中任一项的发明。
23.一种转基因生物(或其部分)，它包含或表达按照权利要求16-22中任一项的发明。
24.按照权利要求23的生物(或其部分)，其中该生物为瓜尔豆植株。
25.按照权利要求10的发明，其中该基因产物由按照权利要求16-24中任一项的发明表达或为按照权利要求16-24中任一项的发明。
26.一种酶，它包含图4所示氨基酸序列或其变异体、同源物或其片段。
27.编码权利要求26的酶的核苷酸序列、或与其互补的和/或可得自NCIMB 40831的序列。
28.按照权利要求27的核苷酸序列，其中该核苷酸序列为DNA序列。
29.一种核苷酸序列，它包含图4所示序列或其变异体、同源物或其片段、或与其互补的和/或得自NCIMB 40831的序列。
30.一种构建物，它包含或表达按照权利要求26-29中任一项的发明。
31.一种载体，它包含或表达按照权利要求26-30中任一项的发明。
32.一种质粒，它包含或表达按照权利要求26-31中任一项的发明。
33.一种转基因生物(或其部分)，它包含或表达按照权利要求26-32中任一项的发明。
34.按照权利要求33的转基因生物(或其部分)，其中该生物为瓜尔豆植株。
35.按照权利要求9的发明，其中该基因产物由按照权利要求26-34中任一项的发明表达或为按照权利要求26-34中任一项的发明。
36.含甘露糖/半乳糖化合物，它用权利要求1-3中任一项或从属于它的任一权利要求的方法制备。
37.一种食料，包含按照权利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
38.一种组合物，它包含与另一多糖混合的按照权利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
39.一种组合物，它包含与吨胶、角叉菜胶和琼脂糖中任一种或多种混合的按照权利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
40.制备一种组合物和一种食料的方法，其中该组合物或该食料包含与另一合适组分混合的按照权利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
41.大致如本文描述的方法。
42.大致如本文描述并参考图1的核苷酸序列。
43.大致如本文描述并参考图1的酶。
44.大致如本文描述并参考图4的核苷酸序列。
45.大致如本文描述并参考图4的酶。
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