JP2000502252A

JP2000502252A - 改変プロセス

Info

Publication number: JP2000502252A
Application number: JP9521002A
Authority: JP
Inventors: ジョーズビュー，モルテン; ブランステッド，ジェーン; ガルジャーペーターセン，ステン
Original assignee: ダニスコエイ／エス
Priority date: 1995-12-04
Filing date: 1996-12-02
Publication date: 2000-02-29
Also published as: CN1207772A; WO1997020937A3; AU1193997A; EP0866869A2; MX9804483A; BR9612773A; GB9524752D0; WO1997020937A2

Abstract

(57)【要約】インビボ改変プロセスが、記載される。そのインビボ改変プロセスは、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）もしくはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比に影響を与える。

Description

【発明の詳細な説明】改変プロセス本発明は、改変プロセスに関する。特に、本発明は、インビボ改変プロセスに関する。ガラクトマンナンは、多様な数のα-1-6結合ガラクトース側鎖を有するβ-1-4 結合マンナン骨格からなる細胞壁多糖類の異質性の群である。最も重要な産業的な使用のガラクトマンナンは、豆果のグアール（legumes gu ar）(Cyamopsis tetragonolobus)およびイナゴマメ（Ceratonia siliqua）の内乳から得られる。これらのガラクトマンナンは、それらのガラクトース含有量において異なる。グアールは、約1:1.6のガラクトース対マンノースの比を有しているが、一方、イナゴマメゴム（LBG）は約1:3.4である。ガラクトース含有量における相違は、グアールガムおよびLBGの機能的な特性において有意な効果を有する。両ガラクトマンナンは、低濃度（１〜２％）で高度に粘性のある溶液を形成するが、LBGは、他の多糖類（例えば、キサンタン、カラゲナン（carrageenan）およびアガロース）と共に硬いゲルを形成し得るさらなる特性を有する。LGBは、乳製品（特に、アイスクリーム）、サラダドレッシング、ソース、低カロリー製品およびペットフードにおける食品産業によって広く使用される。しかし、LGBの使用は高い価格および不規則な供給によって制限される。それゆえ、改善された機能的特性を有するガラクトマンナンの大規模製造、例えばその結果として増加したマンノース対ガラクトース比（例えば、LBGと同様な比）が望まれる。グアールゴムとLBG間の特有の化学的類似性およびグアールゴムの非常に低い価格によって、グアールゴムをLBG様特性およびLBGと類似する化学的組成を有するガラクトマンナンにインビトロで変換することが試みられてきた。そのようなインビトロ処理の例は、α−ガラクトシダーゼの使用を含む。この点に関しては、McClearyら、1983およびEP-A-0255153を参照のこと。グアール種子から精製したα−ガラクトシダーゼを使用することによって、10 〜34％のガラクトース含有量を有するグアールゴムが得られた（Bulpinら、1990 ）。改変されたグアールゴムのゲル化挙動の分析は、24％のガラクトース含有量を有する調製物は、LBGと類似する流体力学的な特性を示すカラゲナンと混合ゲルを形成することを示した。比較すると、未処理のグアールゴムのガラクトース含有量は、38％であり、そしてLBGについては23％であった。しかし、産業上の観点から、グアールゴムのインビトロ脱ガラクトース化には、多くの問題が付随する。第１に、グアールゴム中のガラクトースの約40％が除去されなければならないので、大量のα−ガラクトシダーゼが、調製される必要がある。第２に、インキュベーションの間、マンナン骨格の加水分解が全く生じないことが非常に重要であり、このことは、いかなる微量のマンナナーゼ活性もない高度に精製されたα−ガラクトシダーゼ調製物の使用を必要とする。グアール種子由来のα−ガラクトシダーゼの異種産生手順が、公表されている（Overbeekeら、1986）。しかし、グアールゴムに対する作用を調べる前に、試験された種からの産生されたα−ガラクトシダーゼが精製された。このことは、マンナナーゼ問題が解決されるべきままであることを示唆する。第３に、ガラクトース含有量における40％減少は、約15％少ない改変されたグアールゴムに対応するので、ガラクトマンナンの収量は減少する。放出されたガラクトースは、最終生産物において所望され得ず、そして除去される必要があり得る。第４に、α−ガラクトシダーゼとのインキュベーションの間、ガラクトマンナンの脱重合化のかなりの危険性がある。また、endo-β-マンナナーゼを放出する反応混合物にコロニーをつくる微生物が混入する危険性がある。最後に、水が反応混合物から除去される必要がある。このプロセスのコストに加えて、それはまた、最適な反応条件を得るために使用され得る緩衝液の濃度を生じる。これらの例は、グアールゴムの改変の現在の方法には問題が付随していることを示し、そのいくつかは、相当なコストを伴う。それゆえ、グアールゴムの改変のための改善された方法を有する必要性がある。この点に関して、本発明者らは、現在、もしマンノース／ガラクトース含有化合物（例えば、グアールゴム）の改変が、組換えDNA技術の使用によって植物（例えば、グアール植物）においてインビボで生じるならば、有益であることを理解している。従って、最も広い意味において、本発明は、その生物に天然でない方法によって（例えば、組換えDNA技術を使用する方法によって）化合物を合成し得る生物（またはその一部）においてマンノース／ガラクトース含有化合物−（例えば、グアールゴム）−のインビボ改変に関する。改変は、化合物の任意の１つ以上の前駆体（例えば、マンノースおよび／またはガラクトース）に関係してまたは化合物それ自体（すなわち、マンノースおよび／またはガラクトースを含む化合物のマンノースおよび／またはガラクトース単位の改変）に関係して生じ得る。特に、本発明は、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比に影響を与える、好ましくは、増加するインビボ改変プロセスに関する。このインビボ改変プロセスは、天然に存在するプロセスではない。従って、本発明のインビボプロセスを用いて、生物内のマンノース対ガラクトースの内在性インビボ比、および／またはそのマンノース／ガラクトース化合物のマンノース対ガラクトースの比を変えることが可能である。インビボで改変されたグアールゴムの産生のために必要条件の一つは、グアールへの適切な遺伝子の導入のための方法の利用可能性である。これは、形質転換方法の開発ために使用される選択可能なおよびスクリーニング可能な遺伝子を移入したJφrsboeおよびOkkels(1994)によって限定された程度で達成されてきた。これらの著者は、マンノース対ガラクトース比に影響を与える遺伝子を用いる形質転換を報告していなかった。インビボで改変されたグアールゴムの産生のための主要な障壁はガラクトマンナン生合成の知識の欠如であるので、これは生物工学的な観点から重要な点である。現在に至るまで、インビボでグアールゴムの生合成を制御する遺伝子または遺伝子産物は、全く単離されておらず、そして特徴づけられてきていない。しかし、本発明者らは、現在インビボでグアールゴムの生合成を制御する遣伝子または遺伝子産物のいくつかを決定してきた−従って、これは本発明者らがインビボでグアールゴムを改変することを可能にする。一つの好ましい局面において、本発明は、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比に影響を与える、好ましくは、増加するインビボ改変プロセス、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を発現する工程を含むインビボ改変プロセスに関し、遺伝子産物は以下に対して効果を有する：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノースおよびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および/または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；ここでヌクレオチド配列は、生物（またはその一部）に天然であるヌクレオチド配列ではない。別の好ましい局面において、本発明は、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比に影響を与える、好ましくは、増加するインビボ改変プロセスに関し、インビボ改変プロセスは、以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対する効果を有するために、以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対する効果を有し得る、遺伝子産物を供与する工程を含み、ここで遺伝子産物は、生物（またはその一部）に天然なヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によって発現されない。本発明の別の広い局面は、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比にインビボで影響を与える、好ましくは、増加するヌクレオチド配列の使用に関し、ここでヌクレオチド配列は以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対して効果を有する遺伝子産物をコードし、ここでヌクレオチド配列は、生物（またはその一部）に天然であるヌクレオチド配列ではない。本発明の別の広い局面は、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比にインビボで影響を与える、好ましくは、増加する遺伝子産物の使用に関し、ここで遺伝子産物は以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対して効果を有し、ここで遺伝子産物は、生物（またはその一部）に天然であるヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によって発現されない。用語「マンノース／ガラクトース含有化合物」は、少なくとも１つのマンノース基および少なくとも１つのガラクトース基を含む化合物を意味する。これらの好ましい局面の各々において、マンノース／ガラクトース含有化合物は、ガラクトマンナンであることが望ましい。これらの好ましい局面の各々において、マンノース／ガラクトース含有化合物は、グアールゴムであることがより望ましい。これらの好ましい局面の各々において、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物はグアール植物であり、かつそのマンノース／ガラクトース含有化合物は、ガラクトマンナンであることがより望ましい。しかし、他のガラクトマンナン産生植物は、例えば、コロハおよびルーセル（lucerne）を含む。適切な量のガラクトマンナンを産生しないと考えられている植物は、Solanacea科およびNicotiana tabacum種に属する。用語「マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）」はまた、その生物のマンノース対ガラクトースの内部インビボ比を変化するようにマンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る任意の適切な生物− 特に、植物−を含む。その用語はまた、その一部のマンノース対ガラクトースの比を変化するように、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物の任意の部分を含む。その用語はまた、生物内の部分または生存培養培地中の部分を含む。好ましくは、一部は、本質的に生物内の一部である。一部の例は、種子である。用語「生物にとって天然のヌクレオチド配列」は、その天然の環境下において存在し、そしてそのヌクレオチドが天然に結合される完全なプロモーターに作動可能に連結される完全なヌクレオチド配列を意味する。そのプロモーターもまたその天然の環境下において存在する。用語「マンノース前駆体およびガラクトース前駆体」は、マンノース／ガラクトース含有化合物（好ましくは、ガラクトマンナン）の生合成のための前駆体としてマンノース自体もしくはその誘導体および／またはガラクトース自体もしくはその誘導体を含む。さらに、その用語は、マンノース／ガラクトース含有化合物（好ましくは、ガラクトマンナン）の生合成のための前駆体として、次に使用されるマンノース自体もしくはその誘導体および／またはガラクトース自体もしくはその誘導体の前駆体を含む。好ましくは、その用語は、ガラクトマンナン（好ましくは、グアールガラクトマンナン）の生合成のための前駆体としてのマンノース自体もしくはその誘導体（例えば、マンノース-6-リン酸またはGDP-マンノース）および／またはガラクトース自体もしくはその誘導体を意味する。用語「遺伝子産物」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、および RNAを含む。好ましくは、この用語は酵素を意味する。好ましくは、生物（もしくはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のインビボマンノース対ガラクトース比は、グアール植物またはそのガラクトマンナンのインビボマンノース対ガラクトース比より高い。より好ましくは、生物（もしくはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のインビボマンノース対ガラクトース比は、イナゴマメまたはそのガラクトマンナンのインビボマンノース対ガラクトース比と実質的に類似する。好ましくは、生物（もしくはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物は、グアール植物またはそのゴムである。本発明はまた、本発明のプロセスによって調製された場合、マンノース／ガラクトース含有化合物を含む。このマンノース／ガラクトース含有化合物は、本発明によるマンノース／ガラクトース含有化合物をいう。さらに、本発明はまた、本発明によるマンノース／ガラクトース含有化合物を含む食料品を含む。さらに、本発明はまた、組成物（例えば、別の多糖類を混合した本発明によるマンノース／ガラクトース含有化合物を含む食料品）を含む。好ましくは、他の糖類は任意の一つ以上のキサンタン、カラゲナン、およびアガロースである。さらに、本発明は、本発明による組成物または食料品を調製するための方法を含み、これは、本発明によるマンノース／ガラクトース含有化合物と別の適切な成分を混合する工程を包含する。本発明の広い局面は、一つ以上の適切な戦略によって達成され得、ここで各々の戦略は、本発明の好ましい実施態様を構成する。第１の戦略は、一つ以上の遺伝子産物またはそれをコードするヌクレオチド配列の使用に関し、ここで遺伝子産物は、GDP-マンノースの生合成において有用である。この戦略は、GDP-マンノースの生合成にとって必要とされる酵素−すなわち酵素ホスホマンノースイソメラーゼ（PMI）および/または酵素ホスホマンノースムターゼおよび／または酵素GDP-マンノースピロホスホリラーゼ−をコードする一つ以上の遺伝子の形質転換を含む。この点に関して、GDP-マンノースの生合成において有用である一つ以上の遺伝子産物は、マンノース-6-リン酸のレベルを増加し、そしてそれは次に、マンノース／ガラクトース含有化合物（例えば、ガラクトマンナン）のマンノース対ガラクトース比を増加すると考えられている。第１の戦略の好ましい局面は、少なくともPMIの使用および／またはそれをコードするヌクレオチド配列に関する。この点に関し、PMI遺伝子産物は、マンノース-6-リン酸のレベルを増加し、それは次にマンノース／ガラクトース含有化合物（例えば、ガラクトマンナン）のマンノース対ガラクトース比を増加すると考えられている。PMIは、植物性PMIであることがさらに好ましい。第２の戦略は、α−ガラクトシダーゼおよびそれをコードするヌクレオチド配列の使用に関する。この戦略を用いれば、マンノース／ガラクトース含有化合物（例えば、ガラクトマンナン）のマンノース対ガラクトース比をインビボで変えるα−ガラクトシダーゼ（例えば、センナからのα−ガラクトシダーゼまたはコーヒー豆からのα−ガラクトシダーゼ）を利用することが可能である。第３の戦略は、第２の戦略と第１の戦略の組合せに関し、戦略は任意の順序でまたは同時に使用され得る。本発明の好ましい局面は、本発明の任意の１つ以上のヌクレオチド配列を含むかまたは発現する構築物に関する。本発明の別の好ましい局面は、本発明の任意の１つ以上の構築物またはヌクレオチド配列を含むかまたは発現するベクターに関する。本発明の別の好ましい局面は、本発明の任意の１つ以上のベクター、構築物、またはヌクレオチド配列を含むかまたは発現するプラスミドに関する。本発明の別の好ましい局面は、本発明の任意の１つ以上のプラスミド、ベクター、構築物、またはヌクレオチド配列を含むかまたは発現するトラスジェニック生物（またはその一部）に関する。本発明の他の好ましい局面は、任意の１つ以上のヌクレオチド配列、構築物、プラスミド、ベクター、細胞、組織、器官、または生物ならびにその産物を発現するかもしくは発現を可能にするかまたは形質転換する方法を包含する。本発明のさらに好ましい局面は、食料品（動物の飼料を含む）を調製するかまたは処置する遺伝子産物の使用を包含する。本発明はまた、本発明の方法によって調製されたグアールゴムを単離することに関する。本発明はまた、本発明の方法によって調製されたグアールゴムに関する。本発明の第１の戦略は、本発明のさらに好ましい局面への参照のために詳細に記載される。本発明のこの局面の第１の好ましい局面によれば、図１に示されるアミノ酸配列もしくは変異体、ホモログ、またはそのフラグメントを含む酵素が提供される。本発明のこの局面の第２の好ましい局面によれば、第１の局面の酵素をコードするヌクレオチド配列またはそれに対して相補的な配列が提供される。本発明のこの局面の第３の好ましい局面によれば、図１に示される配列を含むヌクレオチド配列もしくはその変異体、ホモログ、またはフラグメント、あるいはそれに対して相補的な配列が提供される。本発明のこの局面の第４の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つによる発明を含むかまたは発現する構築物が提供される。本発明のこの局面の第５の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つの発明を含むかまたは発現するベクターが提供される。本発明のこの局面の第６の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つの発明を含むかまたは発現するプラスミドが提供される。本発明のこの局面の第７の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つの発明を含むかまたは発現するトランスジェニック生物（またはその一部）が提供される。好ましくは、本発明のこの局面のこれらの好ましい局面において、ヌクレオチド配列または酵素は、本発明の上記の局面において定義されるかまたはその範囲内に含まれるかまたはそれによって発現されるクレオチド配列または酵素である。本発明のこの局面の他の好ましい局面は、任意の１つのヌクレオチド配列、構築物、プラスミド、ベクター、細胞、組織、器官、または生物ならびにその産物を発現する工程または発現を可能にする工程または形質転換する工程を包含する。本発明のこの局面のさらなる好ましい局面は、食料品（動物の飼料を含む）を調製するかまたは処理するための酵素の使用を包含する。本発明のこの局面の好ましい局面は、酵素ホスホマンノースイソメラーゼ（「 PM」）およびその酵素をコードするヌクレオチド配列に関する。特に、本発明の好ましい局面は、組換えPMIに関する。さらに、本発明の好ましい局面は、生物（またはその一部）および／またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース対ガラクトース比（特に、ガラクトマンナンのマンノース対ガラクトース比）を変化するためのその組換え PMIの使用に関する。本発明の重要な利点の一つは、組換えPMIを使用することによって、生物（またはその一部）および／またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物（特に、インビボで改変されたグアールゴム）のマンノース対ガラクトース比を増加させることを可能にすることである。この利点に富む局面は、マンノース／ガラクトース含有化合物（例えば、マンノース-6-リン酸）の生合成に関与する遺伝子産物をコードする遺伝子の挿入によって達成され、遺伝子は、最も好ましくは本発明のヌクレオチド配列である。他の重要な利点は、組換え酵素が容易にそして大量に調製され得ることである。また、ヌクレオチド配列は、生物（またはその一部）のゲノムに挿入された（好ましくは、安定に挿入された）場合、マンノース対ガラクトースレベルのインビボ比を変えるために使用され得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、DNA配列である。高度に好ましい実施態様において、ヌクレオチド配列は組換えDNA配列である。好ましくは、ヌクレオチド配列は、寄託番号第NCIMB40774号から入手される。高度に好ましい局面において、酵素は組換えDNA技術を使用して発現される。好ましくは、酵素は、寄託NCIMB40774号から入手されるヌクレオチド配列によて発現される。好ましくは、生物は植物である。より好ましくは、植物はグアール植物である。好ましくは、マンノース／ガラクトース含有化合物はグアールゴムである。酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列は、１つ以上の他の酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列と組合せてインビボで使用され得る。酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、組換えDNA技術を使用することによって調製される。PMI酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列はまた、インビトロで使用され得る。PMI酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列はまた、１つ以上の他の酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列と共に使用され得る。酵素またはそれをヌクレオチド配列は、好ましくは、組換えDNA技術を使用することによって調製される。酵素に関連する用語「変異体」、「ホモログ」、または「フラグメント」は、もし得られるアミノ酸配列がPMI活性を有する、好ましくは図１に示される酵素と少なくとも同じ活性を有するならば、配列からの、または、配列に対する一つ（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、改変、代替（replacemnt）、欠失、または付加を含む。特に、用語「ホモログ」は、もし得られる酵素がPM I活性を有するならば、構造および／または機能に関する相同性を含む。配列相同性に関して、図１に示される配列に対して好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％の相同性が存在する。より好ましくは、添付された図１に示された配列に対して少なくとも95％、より好ましくは98％の相同性が存在する。酵素をコードするヌクレオチド配列に関連する用語「変異体」、「ホモログ」、または「フラグメント」は、もし得られる酵素をコードするヌクレオチド配列がPMI活性を有する、好ましくは図１に示される酵素の少なくとも同じ活性を有するならば、配列からの、または、配列に対する一つ（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、改変、代替、欠失、または付加を含む。特に、用語「ホモログ」は、もし得られる酵素をコードするヌクレオチド配列がPMI活性を有する酵素をコードするならば、構造および／または機能に関する相同性を含む。配列相同性に関して、図１に示される配列に対して好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％の相同性が存在する。より好ましくは、図１に示された配列に対して少なくとも95％、より好ましくは98％の相同性が存在する。上記の用語は、配列の対立遺伝子変異と同義である。用語「相補的」は、本発明がまた、本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことを意味する。本発明の第２の戦略は、本発明のさらにこのましい局面への参照のために詳細に記載される。本発明のこの局面の第１の好ましい局面によれば、図４に示されるアミノ酸配列もしくはその変異体、ホモログ、またはフラグメントを含む酵素が提供される。本発明のこの局面の第２の好ましい局面によれば、第１の局面の酵素をコードするヌクレオチド配列またはそれに対して相補的な配列が提供される。本発明のこの局面の第３の好ましい局面によれば、図４に示される配列を含むヌクレオチド配列もしくはその変異体、ホモログ、またはフラグメント、あるいはそれに対して相補的な配列が提供される。本発明のこの局面の第４の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つによる発明を含むかまたは発現する構築物が提供される。本発明のこの局面の第５の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つの発明を含むかまたは発現するベクターが提供される。本発明のこの局面の第６の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つの発明を含むかまたは発現するプラスミドが提供される。本発明のこの局面の第７の好ましい局面によれば、初期の局面の任意の１つの発明を含むかまたは発現するトランスジェニック生物（またはその一部）が提供される。好ましくは、本発明のこの局面のこれらの好ましい局面において、ヌクレオチド配列または酵素は、本発明の上記の局面によって定義されるかまたは含まれるかまたは発現されるヌクレオチド配列または酵素である。本発明のこの局面の他の好ましい局面は、任意の１つのヌクレオチド配列、構築物、プラスミド、ベクター、細胞、組織、器官、または生物ならびにその生成物を発現する工程または発現を可能にする工程または形質転換する工程を含む。本発明のこの局面のさらなる好ましい局面は、食料品（動物の飼料を含む）を調製するかまたは処理するための酵素の使用を含む。従って、本発明のこの局面の好ましい局面は、酵素α−ガラクトシダーゼおよびその酵素をコードするヌクレオチド配列に関する。特に、本発明の好ましい局面は、組換えα−ガラクトシダーゼに関する。さらに、本発明の好ましい局面は、生物（またはその一部）および／またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース対ガラクトース比（特に、ガラクトマンナンのマンノース対ガラクトース比）を変化するその組換えα−ガラクトシダーゼの使用に関する。本発明の重要な利点の一つは、組換えα−ガラクトシダーゼを使用することによって、生物（またはその一部）および／またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物（特に、インビボで改変されたグアールゴム）のマンノース対ガラクトース比を増加することを可能にすることである。他の重要な利点は、組換え酵素が容易にそして大量に調製され得ることである。また、ヌクレオチド配列は、生物（またはその一部）のゲノムに挿入された（好ましくは、安定に挿入された）場合、マンノース対ガラクトースレベルのインビボ比を変えるために使用され得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、DNA配列である。高度に好ましい実施態様において、ヌクレオチド配列は組換えDNA配列である。好ましくは、ヌクレオチド配列は、寄託番号第NCIMB40831号から入手される。高度に好ましい局面において、酵素は組換えDNA技術を使用して発現される。好ましくは、酵素は、寄託番号第NCIMB40831号から入手されるヌクレオチド配列によって発現される。好ましくは、生物は植物である。より好ましくは、植物はグアール植物である。好ましくは、マンノース／ガラクトース含有化合物はグアールゴムである。酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列は、１つ以上の他の酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列と組合せてインビボで使用され得る。酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、組換えDNA技術を使用することによって調製される。α−ガラクトシダーゼ酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列はまた、インビトロで使用され得る。α−ガラクトシダーゼ酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列はまた、１つ以上の他の酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列と共に使用され得る。酵素またはそれをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、組換えDNA技術を使用することによって、調製される。酵素に関連する用語「変異体」、「ホモログ」、または「フラグメント」は、もし得られるアミノ酸配列がα−ガラクトシダーゼ活性を有する、好ましくは図４に示される酵素と少なくとも同じ活性を有するならば、配列からの、または、配列に対する一つ（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、改変、代替、欠失、または付加を含む。特に、用語「ホモログ」は、もし得られる酵素が α−ガラクトシダーゼ活性を有するならば、構造および／または機能に関する相同性を含む。配列相同性に関して、図４に示される配列に対して好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％の相同性が存在する。より好ましくは、添付された図４に示された配列に対して少なくとも95％、より好ましくは98％の相同性が存在する。酵素をコードするヌクレオチド配列に関連する用語「変異体」、「ホモログ」、または「フラグメント」は、もし得られる酵素をコードするヌクレオチド配列がα−ガラクトシダーゼ活性を有する、好ましくは図４に示される酵素の少なくとも同じ活性を有するならば、配列からの、または、配列に対する一つ（またはそれ以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、改変、代替、欠失、または付加を含む。特に、用語「ホモログ」は、もし得られる酵素をコードするヌクレオチド配列がα−ガラクトシダーゼ活性を有するならば、構造および／または機能に関する相同性を含む。配列相同性に関して、図４に示される配列に対して好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90 ％の相同性が存在する。より好ましくは、図４に示された配列に対して少なくとも95％、より好ましくは98％の相同性が存在する。上記の用語は、配列の対立遺伝子変異と同義である。用語「相補的」は、本発明がまた、本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含むことを意味する。本発明に関する用語「ヌクレオチド」は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、および RNAを含む。好ましくは、それは、DNAを意味し、より好ましくは、本発明のコード配列のcDNAを意味する。用語「構築物」−これは、用語「コンジュゲート」、「カセット」、および「ハイブリッド」と同義である−は、直接的または間接的にプロモーターに付着されているまたは融合されているヌクレオチド配列を含む。間接的な付着の例は、適切なスペーサー基（例えば、イントロン配列（例えば、Sh1イントロンまたはA DHイントロン）、プロモーターとヌクレオチドと間に介在する配列）の提供である。各々の場合において、この用語は、通常野生型遺伝子プロモーターに結合し、かつそれら両方が、天然の環境下に存在する場合、酵素をコードする野生型遺伝子の天然の組合せを含まないことが非常に望ましい。それゆえ、本発明の１つの非常に好ましい実施態様は、異種プロモーターに作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列をいう。構築物は、例えば、遺伝子が移入されている植物（例えば、グアール）において遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーをさらに含み得るか、または発現し得る。使用され得る種々のマーカー（例えば、マンノース-6-リン酸（特に、植物の）をコードするマーカーまたは除草剤耐性もしくは抗生物質耐性（例えばG4 18、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対して耐性）を提供するマーカー）が存在する。用語「ベクター」は、発現ベクターおよび形質転換ベクターを包含する。用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロ発現の可能な構築物を意味する。用語「形質転換ベクター」は、１つの種から別の種（例えば、E．coliプラスミドからAgrobacteriumにそして植物に）に移入され得る構築物を意味する。用語「組織」は、組織それ自体および器官を包含する。本発明の関連において用語「生物」は、本発明による酵素および／またはそれから得られる産物をコードするヌクレオチド配列を含み得る、および／または、ここで本発明によるヌクレオチド配列が、生物中に存在する場合に発現され得る、任意の生物を包含する。好ましくは、生物はグアール植物である。本発明の関連において用語「トランスジェニック生物」は、本発明による酵素および／またはそれから得られる産物をコードするヌクレオチド配列を含む、および／または、ここで本発明によるヌクレオチド配列が生物内で発現され得る、任意の生物を包含する。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中に取り込まれる。好ましくは、トランスジェニック生物は植物であり、より好ましくはグアール植物である。本発明のトランスジェニック生物は、本発明による酵素をコードする任意の１つ以上のヌクレオチド配列、本発明による構築物、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織、またはその産物（それらの組み合わせを含む）を含む生物を包含する。例えば、トランスジェニック生物はまた、１つ以上の異種プロモーターの制御下で本発明の酵素をコードする任意の１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。高度に好ましい実施態様において、トランスジェニック生物（または、その一部）は、プロモーターおよび本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列の組み合わせを含まない。ここで、プロモーターおよびヌクレオチド配列の両方はその生物（またはその一部）にとって天然であり、そしてそれらの天然環境にある。従って、この高度に好ましい実施態様において、本発明は、それもまた天然環境にあるその天然プロモーターの制御下にある場合、その天然環境にある本発明による天然ヌクレオチドコード配列をカバーしない。さらに、この高度に好ましい実施態様において、本発明は、それがその天然環境にある場合、およびそれもまた天然環境にあるその天然ヌクレオチドコード配列により発現されている場合、およびそのヌクレオチド配列がそれもまた、その天然環境にあるその天然プロモーターの制御下にある場合、本発明による天然酵素をカバーしない。用語「プロモーター」は、当該分野の通常の意味（例えば、遺伝子発現のJaco b-Mond説におけるRNAポリメラーゼ結合部位）で使用される。プロモーターはさらに、適切な宿主における発現を確実にするまたは増加させるための１つ以上の特徴を含み得る。例えば、特徴は、保存領域（例えば、Prib nowボックスまたはTATAボックス）であり得る。プロモーターさらに、本発明のヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を及ぼす（例えば、維持する、増強する、減少させる）ための他の配列を含み得る。例えば、適切な他の配列としては、 Shl-イントロンまたはADHイントロンが挙げられる。他の配列としては、誘導性エレメント（例えば、温度、化学物質、光またはストレス誘導性エレメント）が挙げられる。また、転写または翻訳を増強するための適切なエレメントが存在し得る。後者のエレメントの例は、TMV 5'シグナル配列である（Sleat Gene 217［1987］217- 225；およびDawson Plant Mol．Biol．23［1993］97を参考のこと）。従って、１つの局面において、本発明によるヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の発現を可能にするプロモーターの制御下にある。この局面において、プロモーターは、細胞または組織特異的プロモーターであり得る。例えば、生物が植物である場合、プロモーターは、種子、茎、芽、根および葉組織の任意の１つ以上におけるヌクレオチド配列の発現に影響するプロモーターであり得る。例として、本発明のヌクレオチド配列のためのプロモーターは、PCT/EP95/021 95に記載のような、α-Amy１プロモーター（そうでなければ、Amy１プロモーター、Amy637プロモーターまたはα-Amy637プロモーターとして知られる）である。あるいは、本発明のヌクレオチド配列のためのプロモーターは、PCT/EP95/021 96に記載のような、α-Amy３プロモーター（そうでなければ、Amy３プロモーター、Amy351プロモーターまたはα-Amy351プロモーターとして知られる）である。Amy351プロモーターついて、その一部を不活化して、部分的に不活化されたプロモーターがヌクレオチド配列をより特異的な様式で（例えば、まさに１つの組織型または器官において）発現するようにすることが可能である。用語「不活化された」は、プロモーターの発現パターンは改変されるが、ここで、部分的に不活化されたプロモーターはなおプロモーターとして機能するという意味での部分的な不活化を意味する。しかし、上記のように、改変されたプロモーターは、もとのプロモーターの少なくとも１つ（しかし全てではない）の特定の器官においてヌクレオチド配列を発現させ得る。プロモーター配列の他の部分的不活化（そしてまさに必ずしもAmy351プロモーターの配列の部分的不活化ではない）の例は、ヌクレオチド配列の一部が、例えば、RNAポリメラーゼによって認識されないような、プロモーター配列の折り畳みパターン、またはヌクレオチド配列の部分への結合種を変化させることを含む。別の、そして好ましい、Amy351プロモーターを部分的に不活化する方法は、それを短縮化してそのフラグメントを形成することである。別の方法は、RNAポリメラーゼがその一部または別の一部に結合し得ないように、配列の少なくとも一部を変異させることである。別の改変は、調節タンパク質（例えば、糸状菌由来の炭素カタボライトリプレッションを発揮することが知られているCreAタンパク質）のための結合部位を変異させ、従って天然プロモーターのカタボライトリプレッションをなくすことである。組換えDNA技術の一般的教示は、Sambrook,J.，Fritsch,E.F.，Maniatis T.（編）Molecular Cloning．A laboratory manual．第２版．Cold Spring Harbour Laboratory Press．New York 1989に見出され得る。本発明の酵素およびヌクレオチド配列は、EP-B-0470145およびCA-A-2006454には開示されていないが、これらの２つの文書は、本発明によるトランスジェニック植物を調製するために用いられ得る技術の型についてのいくらかの有用な背景の注解を提供する。これらの背景の教示のいくつかの適応は、ここで以下の注解に含まれる。遺伝的に改変された植物の構築における基本的な原理は、挿入された遺伝物質の安定な維持を得るように、植物ゲノム中に遺伝情報を挿入することである。遺伝情報を挿入するためのいくつかの技術が存在し、２つの主要な原理は、遺伝情報の直接導入およびベクター系の使用による遺伝情報の導入である。一般的技術の概説は、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol［1991］42: 205-225)およびChristou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27 )による論文に見出され得る。従って、１つの局面において、本発明は、本発明によるヌクレオチド配列または構築物を有し、そしてヌクレオチド配列または構築物を生物（例えば、植物）に導入可能なベクター系に関連する。ベクター系は、１つのベクターを含み得るが、それは２つのベクターを含み得る。２つのベクターの場合、ベクター系は、通常バイナリーベクター系と呼ばれる。バイナリーベクター系は、さらに詳細にGynheung Anら(1980)、Binary Vect ors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19に記載される。所定のプロモーターまたはヌクレオチド配列または構築物での植物細胞の形質転換のための広範に用いられる１つの系は、Agrobacterium tumefaciens由来のT iプラスミドまたはAgrobacterium rhizogenes由来のRiプラスミドの使用に基づく（Anら、（1986），Plant Physiol．81，301-305およびButcher D.N.ら（1980 ），Tissue Culture Methods for Plant Pathologists、編：D.S．IngramsおよびJ.P. Helgeson，203-208）。上記の植物または植物細胞構築物の構築のために適切ないくつかのTiおよびRi プラスミドが構築されている。そのようなTiプラスミドの非制限的な例は、pGV3 850である。本発明のヌクレオチド配列または構築物は、T-DNA境界を隣接して囲む配列の破壊を避けるように、好ましくはTiプラスミド中に、T-DNAの末端配列の間またはT-DNA配列に近接して挿入されるべきである。なぜなら、これらの領域の少なくとも１つが改変T-DNAの植物ゲノムへの挿入のために必須であるようであるからである。上記の説明から理解されるように、生物が植物である場合、本発明のベクター系は、好ましくは、植物を感染するために必要な配列（例えば、vir領域）および少なくとも１つのT-DNA配列の境界部分を含むベクター系であり、境界部分は遺伝子構築物と同じベクター上に配置される。さらに、ベクター系は、好ましくはAgrobacterium tumefaciens TiプラスミドもしくはAgrobacterium rhizogenes Riプラスミドまたはそれらの誘導体である。なぜなら、これらのプラスミドは周知であり、そしてトランスジェニック植物の構築に広範囲に用いられており、これらのプラスミドまたはその誘導体に基づく多くのベクター系が存在するからである。トランスジェニック植物の構築において、本発明のヌクレオチド配列または構築物は、最初に、その中でベクターが複製し得、そして植物への挿入の前に容易に操作される微生物中で構築され得る。有用な微生物の例はE．coliであるが、上記の性質を有する他の微生物が使用され得る。上記で定義されるようなベクター系のベクターがE．coliにおいて構築された場合、必要であれば、それは適切なAgrobacterium株（例えば、Agrobacterium tumefaciens）に移される。従って、本発明のヌクレオチド配列または構築物を有するTiプラスミドは、本発明のヌクレオチド配列または構築物を有するAgrobacterium細胞を得るために、好ましくは適切なAgrobacterium株（例えば、A．tumefaciens）に移され、このDNAは続いて改変されるべき植物細胞中に移される。 CA-A-2006454に報告されるように、E．coliにおける複製系および形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む、多量のクローニングベクターが入手可能である。ベクターは、例えば、pBR 322、pUCシリーズ、M13 mpシリーズ、pACYC1 84などを含む。この方法において、本発明のヌクレオチドまたは構築物は、ベクター中の適切な制限部位中に導入され得る。、含まれるプラスミドは、E．coliにおける形質転換のために使用される。E．coli細胞は、適切な栄養培地中で培養され、次いで収集されそして溶解される。次いで、プラスミドは回収される。分析方法としては、一般に使用される配列分析、制限分析、電気泳動およびさらなる生化学的 -分子生物学的方法が存在する。各操作の後、使用されるDNA配列は制限され得そして次のDNA配列と連結され得る。各配列は、同じまたは異なるプラスミド中にクローン化され得る。植物における本発明による構築物またはヌクレオチド配列の各々の導入方法の後に、さらなるDNA配列の存在および／または挿入が必要であり得る。例えば、形質転換のために植物細胞のTiプラスミドまたはRiプラスミドが使用される場合、導入される遺伝子の隣接する領域として、TiおよびRiプラスミドT-DNAの少なくとも右境界ならびにしばしば右および左境界が、連結され得る。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は熱心に研究されており、そしてEP-A-120516; Hoek ema: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Albla sserdam，1985，第Ｖ章；Fraleyら、Crit．Rev．Plant Sci.，4:1-46；およびAn ら、EMBO J．（1985）4:277-284に記載される。 Agrobacteriumによる植物細胞の直接感染は、広範囲に用いられておりそしてB utcher D.N.ら(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists、編： D.S．IngramsおよびJ.P．Helgeson，203-208に記載されている単純な技術である。この論題についてのさらなる教示のためには、Potrykus（Annu Rev Plant Phy siol Plant Mol Biol[1991] 42:205-225)およびChrlstou Agro-Food-Industry H i-Tech March/April 1994 17-27)を参考のこと。この技術を用いて、植物の感染が植物の特定の部分または組織に対して（すなわち、植物の葉、根、茎の部分または別の部分に対して）なされ得る。代表的には、本発明のヌクレオチド配列を有するAgrobacteriumによる植物組織の直接感染については、例えば、植物を剃刀を用いて切断する、または植物を針で穿剌する、または植物を研磨剤でこすることにより、感染されるべき植物は損傷される。次いで、損傷に、Agrobacteriumが接種される。接種された植物または植物部分は、次いで適切な培養培地で増殖され、そして成熟植物へ発達させられる。植物細胞が構築される場合、これらの細胞は、周知の組織培養方法（例えば、必要な増殖因子（例えば、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなど）が供給された適切な培養培地中で細胞を培養することによる）に従って増殖および維持され得る。形質転換細胞の遺伝的に改変された植物への再生は、細胞または組織培養物からの植物の再生のための公知の方法を用いて、例えば、抗生物質を用いて形質転換されたシュートを選択することにより、そして適切な栄養、植物ホルモンなどを含む培地上でシュートを継代培養することにより、達成され得る。植物形質転換についてのさらなる教示は、EP-A-0449375に見出され得る。グアール植物の形質転換についてのなおさらなる有用な教示は、デンマーク国特許出願第940662(1994年６月10日出願)に見出され得る。従って、本発明は、生物（またはその一部）のマンノース対ガラクトース比またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物を増加させるための遺伝子産物（例えば、マンノースの生合成に関与するPMI酵素）の使用に関する。さらに、本発明は、そのヌクレオチド配列およびそれがコードする遺伝子産物に関する。本発明は、グアールガムのマンノース対ガラクトース比を、マンノース／ガラクトース含有化合物（例えば、マンノース-６-リン酸、すなわちPMI）の生合成に関与する遺伝子産物（単数または複数）をコードする遺伝子（単数または複数）を挿入することにより増加させることが可能であるという驚くべき知見に基づく。本発明のこの知見は、当該分野の知見の観点から予期されていたこととは対照的である。これに関して、コロハおよびグアール由来の発達中の内乳の非精製調製物の分析から、Edwardsは、GDP-マンノースがガラクトマンナンの生合成のための前駆体であり得ることを示唆した(Edwardsら，1989，ReidおよびEdwards 19 95）。反応混合物中の種々の量のGDP-マンノースの分析を通して、著者らは、マンノース対ガラクトース比の制御は、ガラクトマンナン合成グリコシルトランスフェラーゼそれ自体の特異性のレベルにあり得ると結論を下した。このことは、グリコシルトランスフェラーゼが、グアールガムのインビボ改変のための遺伝子操作のための重要な標的であり得ることを示唆し得る。従って、要約すると、本発明のこの好ましい局面は、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子の植物（好ましくは、グアール）中への挿入に関する。このストラテジーの背後の原理は、グアールガラクトマンナン中に取り込まれるマンノースが、GDP-マンノースに由来するという本発明者らの理解に基づく。しかし、グアール中でGDP-マンノースが合成される方法は未知である。古典的な方法は、GDP-グルコースの異性化によるが、いくつかの予備的なデータは、いくつかの豆果において少なくともGDP-マンノースがフルクトース-６-リン酸のマンノース-６リン酸（これはマンノース-１-リン酸へ異性化され、これは次にGDP- マンノースへ異性化される）への異性化により合成され得ることを示唆する。しかし、たとえ後者の経路がPMI活性の増加に作用するとしても、ガラクトマンナン組成に影響すること自体は予期されない。なぜなら、第１にフルクトース-６- リン酸からマンノース-６リン酸への異性化は完全に可逆的な反応であり、そして第２にReidおよびEdwards (1995)はマンノース対ガラクトース比がガラクトマンナン合成酵素の特異性により決定されることを予期しているからである。このストラテジーを用いて、そして明らかとなるように、本発明者らは、グアールにおいて弱く発現されるプロモーターを用いる場合でさえもマンノース対ガラクトース比の増加を得ている。しかし、より強力なプロモーターを用いることにより、より高い比率のレベルが達成され得る。本発明はまた、グアールまたはその前駆体の生合成に関与する遺伝子産物（単数または複数）をコードする遺伝子（単数または複数）の挿入により、グアールガムのマンノース対ガラクトース比を増加させることが可能であるという、驚くべき知見に基づく。まさに記載したように、本発明の１つの好ましい局面において、遺伝子はPMIをコードする。別の好ましい局面において、遺伝子はα-ガラクトシダーゼ、好ましくはコーヒー豆α-ガラクトシダーゼまたはセンナα-ガラクトシダーゼ、より好ましくはセンナα-ガラクトシダーゼをコードする。本発明のPMI遺伝子を含む以下のサンプルは、23 St．Machar Drive，Aberdeen ， Scotland，United Kingdom，AB2 1RYの公認された寄託機関The National Col lections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)へ、1995年11月９日に、ブダペスト条約に従って寄託された：プラスミドpPMI-60を含むE．coli K12。寄託番号は、NCIMB 40774である。本発明はまた、その寄託物から得られ得るヌクレオチド配列およびそれによってコードされる産物をカバーする。本発明のαガラクトシダーゼ遺伝子を含む以下のサンプルは、23 St．MacharD rive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1RYの公認された寄託機関The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) へ、1996年11月28日に、ブダペスト条約に従って寄託された：プラスミドpT7-SEcDNA5を含むE．coli K12。寄託番号は、NCIMB 40831である。本発明はまた、その寄託物から得られ得るヌクレオチド配列およびそれによってコードされる産物をカバーする。本発明をここで例により説明する。以下の実施例において添付の図面に言及する。ここで：図１は、本発明による１つの酵素のアミノ酸配列および本発明による１つのヌクレオチド配列の配列を示す；図２は、pcDNAIIのプラスミドマップである；図３は、pSG-Man5のプラスミドマップである；図４は、本発明による別の酵素のアミノ酸配列および本発明による別のヌクレオチド配列の配列を示す；図５は、pPS48のプラスミドマップである；図６は、pPS48SEGALのプラスミドマップである；図７は、pBKL4のプラスミドマップである；図８は、pBKL4SEGALのプラスミドマップである；図９は、pPS48-GALIIIのプラスミドマップである；そして図10は、pBKL4GALIIIのプラスミドマップである。PMI 遺伝子を用いるグアールガムのインピボ改変グアールからのホスホマンノースイソメラーゼ(PMI)遺伝子のクローニング未成熟グアール内乳からのmRNAを代表するcDNA発現ライブラリーを、プラスミドpcDNAII(Invitrogen Corporation)において構築し、そしてE．coli Top1OF〜株(Invitrogen Corporation)に形質転換した。cDNAライブラリーの品質を、ランダムにひろった多数の別々のコロニーからのプラスミドの精製により管理した。プラスミドの制限酵素消化は、全てが少なくとも500 bpのインサートを含むことを示した。 E coli CD1 man-株は、不活性PMI遺伝子を含み、従ってマンノースを代謝し得ない(Darzinsら、1985)。この株を、以下の相補研究のために使用した。 CD1 man-細胞を、Hanahan (1985)の方法によりコンピテントにした。３〜４× 10⁶形質転換細胞／μｇライブラリープラスミドcDNAの力価が得られた。同様の力価が、細胞をBluescriptコントロールプラスミドで形質転換した場合に見出された。相補研究の前に、形質転換細胞を0.05g/lロイシン、0.05g/Iメチオニン、0.05 g/l スレオニン、1.0g/l チアミン-HCl、50mg/l アンピシリン、6.0g/l マンノースおよび9.0g/l アガロースを加えたM9-塩（Maniatlsら、1982）を含む選択培地上にプレートする多数のコントロール実験を行った。この培地を、以下M9-S GPと呼ぶ。１つの実験において、CD1 man-コンピテント細胞をその天然プロモーターの制御下のE coli PMI遺伝子(MillsおよびGuest 1984)で形質転換し、そして別の実験において、細胞を植物プロモーターCaMV 35Sの制御下のE coli PMI遺伝子(pSG MAN1，Bojsenら 1993を参考のこと)で形質転換した。両方の実験において、形質転換細胞のM9-SGP上のプレーティングは、多数の大きいコロニーを生じた。コンピテントCD1 man-細胞が形質転換されない場合またはそれがBluescriptコントロールプラスミドで形質転換された場合は、大きなコロニーは得られなかったが、多数の非常に小さくほとんど見えないコロニーが観察された。従って、M9-SGP選択培地は、活性PMI遺伝子を含む細胞を選択するために適切である。コンピテントCD1 man-細胞を、グアール内乳cDNAライブラリーから単離したプラスミドDNAで形質転換した。形質転換されたCD1 man-細胞を選択的基質M9-SGP 上にプレートした。37℃で２日間のインキュベーション後、プレートされた細胞の大部分が非常に小さいコロニーとして出現したが、0.1％未満のコロニーは顕著により大きかった。より大きいコロニーからのプラスミドを精製し、そしてコンピテントCD1 man- 細胞へ再形質転換した。20の異なる再形質転換されたコロニーを、粗抽出物におけるPMI活性についてアッセイした。PMI活性を、Gillら(1986)により記載された共役酵素アッセイにより測定した。試験したクローンの１つは、非常に高いPMI 活性を含んだ。このクローンを、PMI-60と呼び、そしてこれは寄託番号NCIMB 40 774の対象である。 PMI-60中のインサートがグアール由来であるかどうかを試験するために、ゲノムグアールDNAをDellaportaら (1983)に従って葉から精製し、制限酵素消化し、サザンブロットし、そしてFeinbergおよびVogelstein (1983)に従ってP-32で標識したPMI-60由来のプラスミドDNAでプローブした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、それぞれ68℃、６×SSC、および68℃、0.2×SSC(Maniatisら)1982) で行った。PMI-60プローブは、消化したグアールゲノムDNAの多くのフラグメントにハイブリダイズした。 PMI-60のプラスミド(pPMI-60と呼ぶ)中のインサートを、プライマーウォーキングを適用するジデオキシ配列決定(SangerおよびCoulson 1977)により、最初にフルオレセイン標識されたプライマー（リバースおよびユニバーサル）により、続いてフルオレセインdATPを使用する内部標識により、配列決定した。 cDNAクローンの大きさは、1.66 kbであり、そのうちPMI遺伝子は1.29kbをカバーした。PMIの開始コドンおよび終止コドンは、それぞれ0.09kbおよび1.38kbに位置した。インサートは、推定ポリアデニル化シグナルを終止コドンから0.11kb 下流に含み、そしてポリ-Ａ終結されている。インサートの正体(identity)を、他の公知のPMI配列に対する比較によりさらに特徴付けた。翻訳開始から137〜145アミノ酸下流において、保存領域が見出された：DGNHKPEM（これは、ホスホマンノースイソメラーゼの活性PMI部位に関与すると考えられている(Coullnら 1993)）。従って、PMI-60におけるインサートの存在は、選択的マンノース含有培地上の迅速な増殖、高いPMI活性、およびグアールDNAへのハイブリダイゼーションを生じる。さらに、他のPMI遺伝子からのいくつかの配列に対する相同性が存在する。これらのデータは、PMI-60におけるインサートがグアール由来のPMI遺伝子であることを実証する。このPMI配列は、これまでに植物からクローン化され、そして配列決定された最初のPMI配列である。ホスホマンノースイソメラーゼ(PMI)遺伝子を用いる形質転換以下の形質転換研究は、ホスホマンノースイソメラーゼ(PMI)（例えば、E．co liまたはグアール由来の）の挿入によりグアールガムのマンノース対ガラクトース比を増加することが可能であることを示す。組換えPMIは、基質の入手に依存してフルクトース-６-リン酸のマンノース-６-リン酸またはマンノース-６-リン酸のフルクトース-６-リン酸への変換を触媒する。グアールの形質転換トランスジェニックグアール植物を、J_φrsboeおよびOkkels（1994）（この内容は、本明細書中に参考として援用される）により記載されたようにAgrobacter ium tumefaciens媒介された遺伝子転移により得た。好ましいAgrobacterium tum ef aciens株は、これらの研究においてLBA 4404であった。 pDO18と呼ばれるプラスミドにおけるT-DNAにおけるインサートは、３つの遺伝予（右境界から左境界へ）を含んだ：β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子、ホスホマンノースイソメラーゼ(PMI)遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)遺伝子。各遺伝子の発現を、Bojsenら (1993)により詳細に記載される35Sプロモーターにより駆動した。 HPLCによるグアールガムの分析胚および種皮がない純粋なグアール内乳を手で調製し、Edwardsら (1992)に従って、ホモジェナイズの間70％エタノールで繰り返して処置した。エタノール沈殿物に２ml ２Ｎトリフルオロ(trifluor)酢酸(TFA)を添加し、そして加水分解を 120℃で２時間行った。TFAを、50℃での蒸発により除去した。乾燥した沈殿物を 500μl HPLC等級H₂Oに溶解し、そして25μlサンプルをAminex HPX-87Pカラム(30 0×7.8mm)上にのせた。カラムを、カラムオーブン中で80℃へ熱し、そしてH₂Oで溶出した。糖類の溶出を、RI検出器で追跡した。この系を用いて、マンノースおよびガラクトースをベースラインで分離した。各々のピーク域を決定し、そしてマンノース対ガラクトース比を計算した。SigmaからのグアールガムおよびLBGを、非トランスジェニックグアール植物からの内乳サンプルと共に標準として使用した。得られたマンノース対ガラクトース比は、Sigmaグアールガムおよび非トランスジェニック内乳の両方について1.6：１、そしてSigma LBGについて3.5：１であった。これらの比は、一般に受容されているこれら(ReidおよびEdwards 1 995)とよく一致した。 PMI形質転換グアールにおけるマンノース対ガラクトース比 PMI遺伝子を有するいくつかの別々のグアール形質転換体を、内乳ガラクトマンナンにおけるマンノース対ガラクトース比に関して分析した、以下の表を参考のこと。各々の形質転換体は、グアールガムのマンノース対ガラクトース比を増加した。グアールからのホスホマンノースイソメラーゼ(PMI)遺伝子の挿入で同様の研究を行う。この点については、グアールPMIは、基質の入手に依存してフルクトース-６-リン酸のマンノース-６-リン酸へのまたはマンノース-６-リン酸のフルクトース-６-リン酸への変換を触媒すると考えられる。α-ガラクトシダーゼ遺伝子を用いるグアールガムのインピボ改変以下の実施例において、α-ガラクトシダーゼ遺伝子のグアールへの挿入は、グアールガムのインビボにおける改変を生じ得ることが示される。センナα-ガラクトシダーゼcDNAのクローン化および配列決定センナ内乳からのα-ガラクトシダーゼのcDNAクローンを、PCRにより以下のように単離した。センナ内乳から、（Logemannら，Anal．Biochem．163（1987）16-20)の方法に従って全RNAを精製した。逆転写に続き、PCRをPerkin ElmerからのRT-PCRキットで、そのプロトコルに従って行った。簡潔には、約１mgの全RNAおよび１mgオリゴ-dTを逆転写酵素と42℃で45分間インキュベートし、続いて99℃で５分間および5℃で５分間インキュベートした。以下のPCRのために、グアールα-ガラクトシダーゼcDNA配列(Overbeekeら、Pl ant Mol．Biol 13（1989）541-550)由来の２つのオリゴヌクレオチドを使用した： P1（5'-CAACGGGGCTTGCTGCTTTAGG）および P2（5'-GCCTATGTCA-GACCAGGATGC）、グアールα-ガラクトシダーゼcDNA配列のそれぞれ415-437位および1248-1270位に位置する。 PCR条件は：94℃で１分、55℃で２分、72℃で２分を35サイクルに続き、72℃ で10分であった。 PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして１つの850 bpの産物を得た。 DNA産物（SEGALと呼ぶ）を、pT7Blueベクター(Novagen)にクローン化し、そしてヌクレオチド配列をTermo sequenase蛍光サイクル配列決定キット(Amersham) およびALF DNAシークエンサー(Pharmacia)を用いて決定した。センナα-ガラクトシダーゼcDNAの3'および5'末端を、以前記載(Nielsenら、P lant Mol．Biol 31（1996）539-552)された3'および5'RACEと呼ばれる方法により得た。簡潔には、3’RACEのために、約１mgの上記全RNAおよび2.5 pmolのプライマー： QT（5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T)₁₇）を逆転写酵素と42℃で45分間、続いて99℃で５分間および5℃で５分間インキュベートした。 cDNAを２回のPCRにより増幅した。１回目のPCRの下流プライマーは： Q₀(5'-CCAGTGAGCAGAGTGACG) であり、そして上流プライマーは: 3'GSP1（5'-GTCCTCTGAGTGATAACAGAGTGG）であり、センナα-ガラクトシダーゼcDNA（図４）において1096-1118位の、フラグメントSEGALの850 bpヌクレオチド配列由来の遺伝子特異的プライマーであった。第２回目のPCRにおける下流プライマーは： Q₁(5'-GAGGACTCGAGCTCAAGC) であり、そして上流プライマーは： 3'GSP2(5'-GGTGTTGTGGAATAGAAGTTCATC) であり、センナα-ガラクトシダーゼcDNA（図４）における1123-1146位の、フラグメントSEGALの850 bpヌクレオチド配列由来の遺伝子特異的プライマーであった。１回目のPCRについての条件は：94℃で１分、60℃で２分、72℃で２分を35サイクルに続き、72℃で10分であった。２回目のPCRについての条件は：94℃で１分、50℃で２分、72℃で２分を35サイクルに続き、72℃で10分であった。２回目のPCR後のPCR産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、１つの53 0bpの産物を得た。 DNA産物を（3'SEGALと呼ぶ）、pT7Blueべクター(Novagen)へクローン化し、そしてヌクレオチド配列をTermo sequenase蛍光サイクル配列決定キット(Amersham )およびALF DNAシークエンサー(Pharmacia)を用いて決定した。 5’RACEのために、Gibco BRLからの5'RACE系をフラグメントSEGALの850bpヌクレオチド配列から構築した３つの遺伝子特異的プライマーと共に用いた。簡潔には、約１mgの上記のように使用する同じ全RNA、および2.5pmolの遺伝子特異的プライマー： 5'GSP1(5'-TTGCACCTTGGTCTTCATGTCC)、センナα-ガラクトシダーゼcDNA（図４）における561-582位を、70℃で10分インキュベートし、次いで逆転写酵素を添加しそして42℃で30分間、70℃で15分間、そしてRNaseHを添加しそしてさらに55℃で10分間インキュベートした。 cDNAを、Gibco BRLのプロトコールに従ってdC-テイル化した。テイル化cDNAを、２回のPCRに供した。１回目のPCRにおいて、上流ANKERプライマー(5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGG GGGG)を、遺伝子特異的下流プライマー： 5'GSP2(5-CATAGCTTTACTGCATGTTTGGTTTCC)、センナα-ガラクトシダーゼcDNA（図４）における510-536位と共に用いた。２回目のPCRにおいて、上流UNIプライマー：（5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACG) を、遺伝子特異的下流プライマー： 5'GSP3(5'-CAGCCAGAGCCTTAATTCCTGAAGG)、センナα-ガラクトシダーゼcDNA（図４）における438-462位と共に用いた。１回目のPCRについてのPCR条件は：94℃で１分、51℃で２分、72℃で２分を10 サイクルに続き、94℃で１分、59℃で２分、72℃で２分を25サイクルに続き、72 ℃で10分であった。２回目のPCRについての条件は：94℃で1分、59℃で２分、72℃で２分を35サイクルに続き、72℃で10分であった。２回目のPCR後のPCR産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、１つの48 0bpの産物を得た。 DNA産物（5'SEGALと呼ぶ）を、pT7Blueベクター(Novagen)へクローン化し、そしてヌクレオチド配列をTermo sequenase蛍光サイクル配列決定キット(Amersham )およびALF DNAシークエンサー(Pharmacia)を用いて決定した。上記から得られた３つのPCRクローン、5'SEGAL，SEGAL、3'SEGALから組合せた、1630bpからなるセンナα-ガラクトシダーゼcDNAの完全ヌクレオチド配列を、図４に示す。ヌクレオチド配列の分析（図４）は、最初のメチオニンがヌクレオチド93位、および翻訳終止コドンがヌクレオチド1311位の、406アミノ酸残基をコードするオープンリーディングフレームを示す。推定アミノ酸配列を、図４においてヌクレオチド配列の上方に示す。センナα-ガラクトシダーゼを含む植物形質転換ベクターの構築センナα-ガラクトシダーゼのコード配列を含む発現ベクターを以下のように構築した。ベクターpPS48（図５）を、-90〜-420領域の複製を含む0.75kbカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S RNAプロモーター(E35S)(Kayら、Science 236(1987)12 99-1302)、CaMV 35S RNAポリアデニル化配列を含む0.21kbフラグメント(Odellら、Nature 313（1985）810-812)および合成オリゴヌクレオチドリンカー(pstI- BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI)をpUC8(VieiraおよびMessing，Gene 19（1982）259 -268)へ挿入することにより構築した。３つのDNAフラグメント、5'SEGAL、SEGAL、および3'SEGALをPCRにより共に連結し、コード配列および翻訳されない5'末端のほとんどを含む、センナα-ガラクトシダーゼcDNAのクローンを再構成した。フラグメント5'SEGALを、プライマー5'GSP3およびB255、（5'-ATTGGATCCACTCACAC-GTATACACTACAC） BamHI部位に加えセンナα-ガラクトシダーゼcDNA（図４）におけるヌクレオチド 14-36位を含むを用いて再増幅した。フラグメント3'SEGALを、プライマー3'GSP2およびB254、（5'-TTAGCATGCCCTTGGGATTGTATT-TCCTC） SphI部位およびセンナα-ガラクトシダーゼcDNA（図４）におけるヌクレオチド1 353-1373位を含むを用いて再増幅した。これらのPCRフラグメントを、フラグメントSEGALと混合し、連結された配列をフランキングプライマーB254およびB255を用いることにより増幅した。 PCR条件は：5'SEGALについては、94℃で１分、57℃で２分、72℃で２分を35サイクルに続き、72℃で10分であった。3'SEGALについては、94℃で１分、48℃で２分、72℃で２分を35サイクルに続き、72℃で10分であった。３つのフラグメントを連結するための最終PCRについては、94℃で１分、58℃で２分、72℃で２分を35サイクルに続き、72℃で10分であった。最終PCRのPCR産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、１つの1380bpの産物を得た。 DNA産物を、pT7Blueベクター(Novagen)へクローン化し、そしてヌクレオチド配列をTermo sequenase蛍光サイクル配列決定キット(Amersham)およびALF DNAシークエンサー(Pharmacia)を用いて決定した。 DNAフラグメントを、BamHIおよびSphIでの消化により単離し、そして発現ベクターpPS48へクローン化し、pPS48SEGAL（図６）を生じた。センナα-ガラクトシダーゼのための発現カセットを含む植物形質転換ベクターを、以下のように構築した。ベクターpBKL4（図７）を、pBI121(Clontec Laboratories)から、NPTIIカセットを欠失することにより、そして合成オリゴヌクレオチドリンカー(EcoRI-ClaI- SalI-HindIII-SpeI-Kpn-BamHI)ならびにCaMV 35S RNAプロモーター(Odellら、Na ture 313（1985）810-812)およびオクトピンシンターゼ遺伝子からのポリアデニル化配列(Caplanら、Science 222（1983）815-812)が隣接するNPTII遺伝子を含む新しいNPTIIカセットをGUSカセットとその左境界との間に挿入することにより構築した。センナα-ガラクトシダーゼ発現カセットを、pPS48SEGALから切り出し、そしてpBKL4へ挿入した。生じたプラスミドpBKL4SEGAL（図８）を、植物形質転換のためにAgrobacteriu m tumefaciens株LBA4404(Hockemaら、Nature 303（1983）179-180)へ形質転換した。センナα-ガラクトシダーゼでのグアールの形質転換センナからのα-ガラクトシダーゼ遺伝子を、J_φrsboeおよびOkkels（1994）（この内容は、本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載されるように Agrobacterium tumefaciens形質転換を用いてグアールへ形質転換した。センナα-ガラクトシダーゼ遺伝子で形質転換したグアール植物からの内乳のマンノース対ガラクトース比の分析センナα-ガラクトシダーゼ遺伝子で形質転換したグアール植物の純粋な内乳を２Ｎトリフルオロ酢酸における加水分解後HPLCにより分析した（詳細は上記を参照のこと）。以下の表に示す結果は、センナα-ガラクトシダーゼ遺伝子を有する４つの別々のグアール形質転換体からの内乳の分析に由来する。結果を、形質転換されなかったコントロール内乳に関してマンノース対ガラクトース比の％増加として示す。コーヒー豆α-ガラクトシダーゼを含む植物形質転換ベクターの構築コーヒー豆α-ガラクトシダーゼコード配列を含む発現ベクターを、以下のように構築した。ベクターpPS48（図５）を、-90〜-420領域の複製を含む0.75kbカリザイクウイルス(CaMV) 35S RNAプロモーター(E35S)(Kayら、Science 236(1987)1299-1302) 、CaMV 35S RNAポリアデニル化配列を含む0.21kbフラグメント(Odellら、Nature 313（1985）810-812)および合成オリゴヌクレオチドリンカー(pstI-BamHI-SmaI -SacI-SalI-SphI)をpUC8(VieiraおよびMessing，Gene 19（1982）259-268)へ挿入することにより構築した。コーヒー豆α-ガラクトシダーゼコード配列を含むDNAフラグメントを、プラスミドpCR-BZ(ZhuおよびGoldstein Gene 140（1994）227-231)から上流プライマー： 5'-TTGGATCCACCCAAAA-GCTGGTGCTCC （コーヒー豆α-ガラクトシダーゼcDNA配列における15-35位）および下流プライマー： 5'-TTAGCATGCCTGTTAATCACTGTGGG （コーヒー豆α-ガラクトシダーゼcDNA配列における1229-12446位）を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により単離し、α-ガラクトシダーゼ遺伝子の5'末端においてBamHI部位および3'においてSphI部位を含む1,2kb DNAフラグメントを生じた。 DNAフラグメントを、pT7Blueベクター(Novagen)へクローン化し、そしてヌクレオチド配列をTermo sequenase蛍光サイクル配列決定キット(Amersham)およびA LF DNAシークエンサー(Pharmacia)を用いて決定した。 DNAフラグメントを、BamHIおよびSphIでの消化により単離し、そしてベクター pPS48へクローン化し、pPS48-GALIIIを生じた（図９）。コーヒー豆α-ガラクトシダーゼのための発現カセットを含む植物形質転換ベクターを、以下のように構築した。ベクタ−pBKL4（図７）を、pBI121(Clontec Laboratories)から、NPTIIカセットを欠失することにより、そして合成オリゴヌクレオチドリンカー(EcoRI-ClaI- SalI-HindIII-SpeI-Kpn-BamHI)ならびにCaMV 35S RNAプロモーター(Odellら、Na ture 313（1985）810-812)およびオクトピンシンターゼ遺伝子からのポリアデニル化配列(Caplanら、Science 222（1983）815-821)が隣接するNPTII遺伝子を含む新しいNPTIIカセットをGUSカセットとその左境界との間に挿入することにより構築した。コーヒー豆α-ガラクトシダーゼ発現カセットを、pPS48GALIIIからXbaIでの消化により切り出し、そしてSpeI消化したpBKL4へ挿入した。生じたプラスミドpBKL4-GALIII（図10）を、植物形質転換のためにAgrobacter ium tumefaciens株LBA4404(Hockemaら、Nature 303（1983）179-180)へ形質転換した。コーヒー豆α-ガラクトシダーゼでのグアールの形質転換コーヒー豆からのα-ガラクトシダーゼ遺伝子を、J_φrsboeおよびOkkels（199 4)により詳細に記載されるようにAgrobacterium tumefaciens形質転換を用いてグアールへ形質転換した。コーヒー豆α-ガラクトシダーゼ遺伝子で形質転換したグアール植物からの内乳のマンノース対ガラクトース比の分析コーヒー豆α-ガラクトシダーゼ遺伝子で形質転換したグアール植物の純粋な内乳を、２Ｎトリフルオロ酢酸における加水分解後HPLCにより分析した（詳細は上記を参照のこと）。以下の表に示す結果は、コーヒー豆α-ガラクトシダーゼ遺伝子を有する４つの別々のグアール形質転換体からの内乳の分析に由来する。結果を、形質転換されなかったコントロール内乳に関してマンノース対ガラクトース比の％増加として示す。グアールガムのインビボ改変の考察上記の２つの実施例において、α-ガラクトシダーゼ遺伝子のグアールへの挿入は、トランスジェニックガラクトマンナンのマンノース対ガラクトース比が非トランスジェニックコントロールガラクトマンナンの比より高かった事実により実証されるように、グアールガムのインビボ改変を生じ得ることが示される。ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子での実施例（上記を参照のこと）に加えて、これらは、植物細胞壁貯蔵多糖類のインビボ改変においてこれまでに示された最初のデータである。要約この結果は、マンノース対ガラクトース比が影響されるようなグアールガムを形成することが可能であるトランスジェニック植物を形成することが可能であることを示す。この点については、PMI形質転換株、コーヒー豆α-ガラクトシダーゼ形質転換株、およびセンナα-ガラクトシダーゼ形質転換株は、非形質転換株よりも、マンノース対ガラクトースのより高い比を得た。例えば、コーヒー豆α-ガラクトシダーゼ形質転換株は、1.75までのマンノース対ガラクトースの比を有し（非形質転換株についての1.65に比較して）、そしていくつかのセンナα-ガラクトシダーゼ形質転換株は、２までさえのマンノース対ガラクトースの比を有した。これらの結果は、非常に驚くべきことである。当業者に明白なように、インビボ改変が生じる程度は、グアールへ形質転換された遺伝子によりコードされたガラクトマンナン関連酵素の活性に依存する。従って、プロモーターまたは他の制御ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の置換または改変は、上記の実施例において記載されたこれらとは異なるガラクトマンナンのインビボ改変を導き得る。本発明の他の改変は、当業者に明白である。上記したように、図１は、PMI酵素をコードするヌクレオチド配列およびそのP MI酵素のアミノ酸配列の両方を示す。疑問を避けるために、そのヌクレオチド配列は、配列番号１と呼ばれ得、そしてそのアミノ酸配列は、配列番号２と呼ばれ得る。上記したように、図４は、α-ガラクトシダーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列およびそのα-ガラクトシダーゼ酵素のアミノ酸配列の両方を示す。疑問を避けるために、そのヌクレオチド配列は、配列番号３と呼ばれ得、そしてそのアミノ酸配列は、配列番号４と呼ばれ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 19/20 Ｃ１２Ｐ 19/24 19/24 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 9/40 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ペーターセン，ステンガルジャーデンマーク国ディーケイ―2720 コペンハーゲンバンローゼ，３．ティーブイ．，グロンダルズパークベー２ベー

Claims

【特許請求の範囲】１．インビボ改変プロセスであって、マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比に影響を与える、インビボ改変プロセス。２．マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比に影響を与えるインビボ改変プロセスであって、該インビボ改変プロセスが、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を発現する工程を包含し、ここで該遺伝子産物が、以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノースおよびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物に対するマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対して効果を有し、ここで該ヌクレオチド配列は該生物（またはその一部）にとって天然なヌクレオチド配列ではない、インビボ改変プロセス。３．マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比に影響を与えるインビボ改変プロセスであって、該インビボ改変プロセスが、以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物に対するマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対する効果を有するために、以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物に対するマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対する作用を有し得る、遺伝子産物を供与する工程を包含し、ここで該遺伝子産物は該生物（またはその一部）にとって天然なヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によって発現されていない、インビボ改変プロセス。４．マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比にインビボで影響を与えるためのヌクレオチド配列の使用であって、ここで該ヌクレオチド配列は、以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物に対するマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対して効果を有する遺伝子産物をコードし、ここで該ヌクレオチド配列は、該生物（またはその一部）にとって天然なヌクレオチド配列でない、使用。５．マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のいずれかのマンノース対ガラクトース比にインビボで影響を与えるための遺伝子産物の使用であって、ここで該遺伝子産物は、以下：（ａ）マンノース／ガラクトース含有化合物のマンノース成分およびガラクトース成分のマンノース対ガラクトース比；および／または（ｂ）マンノース／ガラクトース含有化合物に対するマンノース前駆体およびガラクトース前駆体のマンノース対ガラクトース比；に対して効果を有し、ここで該遺伝子産物は、該生物（またはその一部）にとって天然なヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列によって発現されない、使用。６．前記マンノース／ガラクトース含有化合物がガラクトマンナンである、請求項１〜５のいずれかに記載の発明。７．前記マンノース／ガラクトース含有化合物を産生し得る生物がグアール植物である、請求項１〜６のいずれかに記載の発明。８．前記生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のインビボマンノース対ガラクトース比が、グアール植物またはそのガラクトマンナンの比よりも高い、請求項１〜６のいずれかに記載の発明。９．前記生物（またはその一部）またはそのマンノース／ガラクトース含有化合物のインビボマンノース対ガラクトース比が、イナゴマメまたはそのガラクトマンナンの比と実質的に類似する、請求項１〜８のいずれかに記載の発明。１０．前記遺伝子産物が、GDPマンノースの生合成において有用な、少なくとも１つの遺伝子産物である、請求項２〜９のいずれかに記載の発明。１１．前記遺伝子産物が、図１に示されるタンパク質であるか、またはその変異体、ホモログ、もしくは誘導体である、請求項１０に記載の発明。１２．前記遺伝子産物が、図１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその変異体、ホモログ、もしくは誘導体であるか、および／あるいはNCIMB40774から入手し得る、請求項１０または請求項１１に記載の発明。１３．前記遺伝子産物が、α−ガラクトシダーゼ酵素である、請求項２〜９のいずれかに記載の発明。１４．前記遺伝子産物が、図４に示されるタンパク質であるか、またはその変異体、ホモログ、もしくは誘導体である、請求項１３に記載の発明。１５．前記遺伝子産物が、図４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるか、またはその変異体、ホモログ、もしくは誘導体であるか、および／あるいはNCIMB40831から入手し得る、請求項１３または請求項１４に記載の発明。１６．図１に示される前記アミノ酸配列、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメントを含む酵素。１７．請求項１６に記載の前記酵素をコードするヌクレオチド配列、もしくはそれに相補的な配列、および／またはNCIMB 40774から入手し得る配列。１８．前記ヌクレオチド配列がDNA配列である、請求項１７に記載のヌクレオチド配列。１９．図１に示される配列、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメント、またはそれに相補的な配列、および／あるいはNCIMB 40774から入手し得る配列を含む、ヌクレオチド配列。２０．請求項１６〜１９のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、構築物。２１．請求項１６〜２０のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、ベクター。２２．請求項１６〜２１のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、プラスミド。２３．請求項１６〜２２のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、トランジェニック生物（またはその一部）。２４．前記生物がグアール植物である、請求項２３に記載のトランジェニック生物（またはその一部）。２５．前記遺伝子産物が請求項１６〜２４のいずれかによって発現されるか、または請求項１６〜２４のいずれかに記載の前記発明である、請求項１０に記載の発明。２６．図４に示される前記アミノ酸配列、またはその変異体、ホモログもしくはフラグメントを含む、酵素。２７．請求項２６に記載の酵素をコードするヌクレオチド配列、もしくはそれに相補的なヌクレオチド配列、および／またはNCIMB 40831から入手し得る配列。２８．前記ヌクレオチド配列がDNA配列である、請求項２７に記載のヌクレオチド配列。２９．図４に示される前記配列を含むヌクレオチド配列、またはその変異体、ホモログ、もしくはフラグメント、あるいはそれに相補的な配列、および／あるいはNCIMB 40831から入手し得る配列。３０．請求項２６〜２９のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、構築物。３１．請求項２６〜３０のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、ベクター。３２．請求項２６〜３１のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、プラスミド。３３．請求項２６〜３２のいずれかに記載の前記発明を含むかまたは発現する、トランスジェニック生物（またはその一部）。３４．前記生物が、グアール植物である、請求項３３に記載のトランスジェニック生物（またはその一部）。３５．前記遺伝子産物が、請求項２６〜３４のいずれかによって発現されるか、または請求項２６〜３４のいずれかに記載の発明である、請求項９に記載の発明。３６．請求項１〜３のいずれか、またはこれらに従属する任意の請求項に記載のプロセスによって調製される、マンノース／ガラクトース含有化合物。３７．請求項３６に記載のマンノース／ガラクトース含有化合物を含む食料品。３８．別の多糖類と混合された請求項３６に記載のマンノース／ガラクトース含有化合物を含む組成物。３９．キサンタン、カラゲナン、およびアガロースのいずれか一つ以上と混合された、請求項３６に記載のマンノース／ガラクトース含有化合物を含む組成物。４０．別の適切な成分と請求項３６に記載のマンノース／ガラクトース含有化合物を混合する工程を包含する、組成物または食料品を調製するための方法。４１．本明細書中に実質的に記載される、プロセス。４２．本明細書中に実質的に記載され、そして図１に関連する、ヌクレオチド配列。４３．本明細書中に実質的に記載され、そして図１に関連する、酵素。４４．本明細書中に実質的に記載され、そして図４に関連する、ヌクレオチド配列。４５．本明細書中に実質的に記載され、そして図４に関連する、酵素。