KR20010012962A

KR20010012962A - 유디피-갈락토스 에피머라제 안티센스 알엔에이의 발현에의한 구아 내의 갈락토만난 생체내 변형

Info

Publication number: KR20010012962A
Application number: KR1019997010932A
Authority: KR
Inventors: 모르텐 조르스보에; 잔네 부룬스테드트; 스틴 굴다제르 페테르젠
Original assignee: 부쳐-랄슨 에이.; 대니스코 에이/에스
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 2001-02-26
Also published as: NZ500951A; WO1998054335A1; GB2342920A; AU7446398A; CN1264428A; GB9710990D0; GB9927197D0; CA2291449A1; JP2002500515A; GB2342920B; EP0983369A1; BR9809493A; AU733483B2

Abstract

생체내 변형 방법에 대한 기술이다. 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스 포함한 화합물의 만노스-대-갈락토스의 비율에 영향을 주고, (a) 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 구성성분인 만노스와 갈락토스의 만노스-대-갈락토스 비율; 및/또는 (b)만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 위한 만노스와 갈락토스 전구체의 만노스-대-갈락토스 비율에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 포함하는 생체내 변형 방법으로, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부와 안티센스임을 포함함을 특징으로 하는 생체내 변형 방법이다.

Description

유디피-갈락토스 에피머라제 안티센스 알엔에이의 발현에 의한 구아 내의 갈락토만난 생체내 변형{In vivo modification of galactomannans in guar by expression of UDP-galactose epimerase antisense RNA}

＜110＞ DANISCO A/S

＜120＞ In vivo modification galactomannans in guar by expression of UDP-

galactose epimerase antisense RNA

＜130＞ FP-1104

＜150＞ GB 9710990.4

＜151＞ 1997-05-28

＜160＞ 2

＜170＞ KOPATIN 1.5

＜210＞ 1

＜211＞ 381

＜212＞ DNA

＜213＞ E. coli

＜400＞ 1

gaattcctga aatctgaagt gtgaagaaga ataataataa ggaacagtga gtgggatttg 60

aagggaaaga agaagaagaa gaagatggtg tcgtcgagga tggcgtcagg ggaaacaatt 120

ctggtaactg gaggagctgg attcatcgga tctcacacgg tggttcagct tctgaagcaa 180

gggtttcacg tatccatcat cgacaatctc tacaactccg tcatcgacgc cgtccatagg 240

gttcgccttt tggtgggtcc actcctctcc agcaacctcc atttccatca cggcgacctc 300

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갈락토만난(galactomannans)은 굉장히 많은 수의 α-1-6-갈락토스 사이드 체인을 가지는 β-1-4-연결된 만난(mannan) 골격을 포함하고 있는 세포벽 다당류의 이형 그룹이다.

산업적으로 중요하게 사용되는 이 갈락토만난은 레검스 구아(Cyamopsis tetragonolobus)와 로커스트 빈(Ceratonia siliqua)의 배유(endosperm)에서 얻어진다. 이 갈락토만난은 갈락토스 함량이 서로 다른데, 구아에서는 갈락토스와 만노스(mannose)의 적정비율은 1 : 1.6이고, 이에 비해 로커스트 빈 검(LBG)에서는 적정한 비율이 1 : 3.4이다.

갈락토스의 함량이 다른 것은 구아 검과 LBG의 기능적 특성에 중요한 역할을 한다. 2 개의 갈락토만난은 낮은 농도(1∼2%)에서 점성이 높은 용액을 형성하지만 LBG는 잔탄(xanthan), 카라게난(carrageenan) 및 아가로스(agarose)와 같은 다른 다당류와 견고한 겔을 형성할 수 있게 하는 또 다른 특성을 지니고 있다. LBG는 유제품(아이스크림 등), 샐러드 드레싱, 소스, 저칼로리 식품 및 애완용 먹이 등 식품산업에서 광범위하게 사용된다. 그러나, 이 LBG의 사용은 높은 가격과 불확실한 공급 등의 문제에 의해서 제한된다.

그러므로, 갈락토스와 만노스의 비율(LBG에서도 비슷한)의 증가된 결과와 같은 개선된 기능적 특성을 가진 갈락토스만난의 대규모의 생산이 바람직하다.

구아 검과 LBG은 화학적 유사성을 지니고 구아 검의 낮은 가격 때문에 구아 검을 LBG와 비슷한 구성의 LBG 유사 특성의 갈락토만난으로 생체외 전환이 시도되어졌다. 이러한 생체외 처리의 예로 α-갈락토시다제(α-galactosidase)의 사용을 포함하고 있다. 이에 대해서는 McCleary 등의 1983년 문헌과 EP-A-0255153에서 나타내고 있다.

구아 종자로부터 정제된 α-갈락토시다제의 사용에 의해서, 구아 검의 갈락토스 함량을 10∼34 % 얻었다.(Bulpin et al. 1990) 변형된 구아 검의 겔화(gelation) 반응의 분석에서 LBG와 유동학적(rheological) 특성이 유사하게 나타나는 카라게난과 혼합된 겔에서 형성된 갈락토스 성분은 24%로 제조되는 것을 보여준다. 비교해 보면, 아무 처리를 하지 않은 구아 검의 갈락토스 조성은 LBG에 대해 38% 및 23%였다.

그러나, 산업적인 관점에서의 구아 검의 생체외 디갈락토실레이션 (degalactosylation)은 많은 문제점을 야기하게 한다.

첫째로 막대한 양의 α-갈락토시다제는 구아 검에서 제거되어진 갈락토스로부터 약 40% 제조되어졌다.

둘째로 배양하는 동안에 만난 골격이 가수분해되지 않게 하기 위해 만난 분해효소(mannanase) 활성도의 트레이스(trace)가 결여된 고도로 정제된 α-갈락토시다제 제조의 사용이 필요성의 제안이 매우 중요하다. 구아 종자로부터 α-갈락토시다제 이형(heterologous)의 생산 절차는 발표되었다.(Overbeeke et al. 1986) 그러나 해결되야 할 만난 분해효소의 문제점을 제안하는 구아 검에 대한 연구가 있기 전에, 시험된 종(species)으로부터 α-갈락토시다제의 생산은 정제되었다.

셋째로 갈락토만난의 생산량은 감소되는데, 이는 변형된 구아 검에서 대략 15% 이하에 상응하는 갈락토스 함량의 40% 감소 때문이다. 이 방출된 갈락토스는 마지막 생산에서 바람직하지 않을 것이고 제거되어질 것이다.

넷째로 α-갈락토시다제를 가지고 배양하는 동안 갈락토만난의 디폴리머리제이션(depolymerisation)은 상당히 큰 위험이 있다.

또한, 엔도-베타-만난(endo-β-mannan) 분해효소를 방출하는 반응 혼합의 콜로니화에 미생물 오염의 위험성이 있다.

마지막으로 물은 반응 혼합에서 제거되어 진다. 또한 이 과정의 비용은 버퍼의 농도의 결과 역시 최적의 반응 조건을 얻기 위해 사용할 것이다.

이 예들은 구아 검의 변형을 위한 본 방법은 문제점, 상당한 비용과 연계되어 있음을 설명하고 있다.

그러므로 구아 검의 변형을 위한 개선된 방법이 필요하다.

이런 점에 있어서 우리는 만노스/갈락토스를 포함한 혼합물(구아 검처럼)의 변형을 벌써 제안하였고 어떤 점에서 변형은 구아 식물과 같은 식물 생체내에서 발생하고 재조합 DNA 기술을 사용한다. 특히 1996년 12월 2일 출원된 PCT/EP96/05581을 참조하였다(참조문헌으로 여기에 통합된 목록).

넓은 의미에서, PCT/EP96/05581은 재조합 DNA 기술을 사용하는 방법과 같이 유기체에서는 네이티브(native)하지 않은 방법에 의해 화합물 합성의 가능성이 있는 유기체(또는 그 일부)의 만노스/갈락토스를 포함한 혼합물 -구아 검처럼-의 생체내 변형과 관계가 있다. 이 변형은 하나 또는 그 이상의 화합물의 전구체(예를 들면 만노스 및/또는 갈락토스)와 관계가 있으며 또는 그 화합물 자체(즉, 화합물 구성이 동일한 단위의 만노스 및/또는 갈락토스)와의 관계에서 발생할 수도 있다.

특히, PCT/EP96/05581은 생체내 변형 방법은 만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 어느 것이든지 만노스-대-갈락토스의 비율의 바람직하게 증가에 작용할 것이다. 이 생체내 변형 과정은 자연적으로 발생하는 과정은 아니다.

이에, PCT/EP96/05581의 생체내 방법은 유기체 및/또는 만노스/갈락토스 화합물의 만노스-대-갈락토스의 비율의 내부 생체내 만노스-대 갈락토스의 비율을 바꿀 가능성이 있다.

생체내 변형된 구아 검의 생산을 위한 요구의 하나는 구아에서 적절한 유전자의 도입을 위한 방법의 유용성이다. 이는 변형 방법의 발전을 위해 사용된 스크린할 수 있고 선택할 수 있는 유전자의 전환을 한 Jorsboe와 Okkels(1994)에 의해 제한된 범위에서 완성되었다. 이들 저자는 만노스와 갈락토스의 비율의 작용에 관련한 유전자 변형에 대해서는 보고하고 있지 않았다. 이는 중요한 점으로서, 생물공학적 관점에서 생체내 변형된 구아 검의 생산을 위한 주요 장애는 갈락토만난의 생체합성의 지식이 부족하다는 것이다. 지금까지에서, 생체내 구아 검의 생합성의 억제 유전자 또는 유전자 생성물은 분리되고 특성화되어지지 않았다. 게다가, PCT/EP96/05581에서 우리는 생체내 구아 검 변형할 수 있는 생체내 구아 검 생합성을 조절하는 억제 유전자 또는 유전자 생성물을 결정하였다.

본 발명은 변형 방법에 관한 것으로, 상세히는 생체내 변형 방법에 관한 것이다.

지금까지는 새로운 만노스/갈락토스를 포함한 화합물(구아 검처럼)의 변형 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면에서, 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스 포함한 화합물의 만노스-대-갈락토스의 비율에 영향을 주고, (a) 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 구성성분인 만노스와 갈락토스의 만노스-대-갈락토스 비율; 및/또는 (b)만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 위한 만노스와 갈락토스 전구체의 만노스-대-갈락토스 비율에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 포함하는 생체내 변형 방법으로, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스인 뉴클레오타이드 서열의 발현을 포함함을 특징으로 하는 생체내 변형 방법이다.

본 발명의 두 번째 측면에서, 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스 포함한 화합물의 생체내 만노스-대-갈락토스 비율에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열의 용도로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스이고, 뉴클레오타이드 서열은 (a) 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 구성성분인 만노스와 갈락토스의 만노스-대-갈락토스 비율; 및/또는 (b)만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 위한 만노스와 갈락토스 전구체의 만노스-대-갈락토스 비율에 영향을 줌을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열의 용도를 제공한다.

바람직한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 코딩 서열의 일부에 안티센스이다.

"만노스/갈락토스를 포함한 화합물(mannose/galactose containing compound)"의 용어는 적어도 하나의 만노스 그룹과 적어도 하나의 갈락토스 그룹으로 구성된 화합물을 의미한다.

만노스/갈락토스를 포함한 화합물은 갈락토만난이 바람직하다.

만노스/갈락토스를 포함한 화합물은 구아 검이 더욱 바람직하다.

만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 생산할 수 있는 유기체는 구아 식물이고 만노스/갈락토스를 포함한 화합물은 갈락토만난이 더 바람직하다. 게다가, 다른 갈락토만난 생성 식물들은 호로파종자(fenugeek)와 자주개자리(lucerne) 등이 포함된다. 갈락토만난의 적당한 생산량을 고려하지 않은 식물들에는 가지(Solanacea)과와 담배(Nicotiana tabacum)종이 속한다.

"만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부)"의 용어는 역시 내부 생체내 유기체의 만노스와 갈락토스의 비율이 변경하도록 만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 생산할 수 있는 어떤 적합한 유기체 중 특히 식물을 포함한다. 이 용어 역시 일부의 만노스와 갈락토스의 비율이 변경하도록 만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 생산할 수 있는 유기체의 어떤 부분을 포함한다. 이 용어는 유기체 또는 살아있는 배양 배지의 경우의 일부를 포함한다. 바람직하게는 유기체의 경우이다. 예를 들면 종자이다.

"만노스와 갈락토스 전구체(mannose and galactose precursors)"의 용어는 만노스/갈락토스를 포함한 화합물, 바람직하게는 갈락토만난의 생합성을 위한 전구체인 만노스 또는 파생된 것 및/또는 갈락토스 또는 파생된 것을 포함한다. 게다가, 이 용어는 만노스/갈락토스를 포함한 화합물, 바람직하게는 갈락토만난의 생합성을 위한 전구체로서 사용되어진 것으로 만노스 또는 파생된 것 및/또는 갈락토스 또는 파생된 것을 포함한다. 바람직하게, 이 용어는 만노스 또는 파생된 것(만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate) 또는 GDP-만노스(GDP-mannose)처럼) 및/또는 갈락토스 또는 파생된 것으로서 갈락토만난, 바람직하게는 구아 갈락토만난의 생합성을 위한 전구체를 의미한다.

바람직하게는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 생체내 만노스-대-갈락토스 비율은 구아 식물 또는 그 갈락토만난의 것보다 높다.

좀더 바람직하게는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 생체내 만노스-대-갈락토스의 비율은 로커스트 빈 또는 갈락토만난과 대체로 비슷하다.

바람직하게 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스를 포함한 화합물은 구아 식물 또는 검이다.

본 발명에서 역시 본 발명의 방법에 의해 제조할 때에 만노스/갈락토스를 포함한 화합물은 포함한다. 이 만노스/갈락토스를 포함한 화합물은 본 발명에 의하여 만노스/갈락토스를 포함한 화합물로 간주될 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의한 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 식품 역시 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의한 다른 다당류가 혼합된 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 조성물-식품처럼-을 역시 포함한다. 바람직하게는 다른 당류는 하나 또는 그 이상의 잔탄, 카라게난 및 아가로스이다.

또한, 본 발명은 다른 적당한 성분을 가진 본 발명에 의한 만노스/갈락토스를 포함한 화합물과 혼합하여 본 발명에 의해 포함된 식품 또는 그의 제조 방법을 포함하고 있다.

폭넓은 관점에서, 본 발명은 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부와 안티센스인 뉴클레오타이드 서열을 사용함으로서 이룰 수 있다. UDP-갈락토스 에피머라제 효소는 UDP-글루코스를 갈락토만난에 결합된 UDP-갈락토스로 변하게 한다. 이런 방법에서, UDP-갈락토스 에피머라제의 안티센스 발현은 에피머라세 활성도를 감소시키고 갈락토만난처럼 만노스를 포함한 화합물의 생합성을 위한 만노스와 갈락토스 전구체의 생체내 만노스-대-갈락토스 비율을 증가시킨다.

바람직한 측면에서 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현 또는 포함하는 구조체와 관련이 있다.

또 다른 바람직한 측면에서 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 구조체를 발현시키거나 포함하는 벡터와 관련이 있다.

또 다른 바람직한 측면에서 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 구조체, 벡터의 발현 또는 포함하는 플라스미드와 관련이 있다.

또 다른 바람직한 측면에서 본 발명은 플라스미드의 발현 또는 구조체(construct)에 의해 전환된 유기체와 관련이 있다.

다른 바람직한 측면에서 본 발명은 그 자체의 생성물과 같이 어떤 뉴클레오타이드 서열, 구조체, 플라스미드, 벡터, 세포, 기관 또는 유기체의 발현 할 수 있는 또는 형질전환하는 발현의 방법을 포함하고 있다.

좀더 바람직한 측면에서 본 발명은 제조된 또는 동물의 사료를 포함하는 처리한 식품을 위해서 본 발명에 의한 안티센스 뉴클레오타이드 서열의 사용을 포함하고 있다.

본 발명의 이점의 하나는 안티-센스 서열의 사용에 있는데, 이는 유기체 또는 만노스를 포함한 화합물, 특히 생체내 변형된 구아 검에서의 만노스-대-갈락토스 비율의 증가를 가능하게 한다.

이 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열을 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 바람직하게 제작된 하나 또는 그 이상의 다른 뉴클레오타이드와 결합되어 생체내에서 사용되어질 것이다.

마찬가지로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 만노스-대-갈락토스 비율의 좀더 영향을 주는 유전자 생성물, 바람직하게는 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 제작된 유전자 생성물의 하나 또는 그 이상의 결합이 사용되어질 것이다. 여기서, 이 유전자 생성물은 펩타이드(peptide), 폴리펩타이드(polypeptide), 단백질, 효소들 및 RNA 중 하나 또는 그 이상이 될 수 있다. 바람직하게, 적어도 유전자 생성물의 하나는 자연의 뉴클레오타이드 서열이 아닌 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의한 효소이다. 여기서, 이 "자연의 뉴클레오타이드 서열(a natural nucleotide sequence)"이란 용어는 자연적인 환경에서 그리고 효과적으로 관련이 있는 본래의 환경과 연관된 완전한 프로모터의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 의미하고 이 프로모터 역시 자연적 환경 안에 있다.

실시예에 있어서, 일부의 예는 본 발명에 따른 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 하나 또는 그 이상의 GDP-만노스의 생합성에 필요한 유전자 코딩 효소 즉, 효소 포스포만노스 이소머라제(phosphomannose isomerase : PMI) 및/또는 효소 포스포만노스 뮤타제(phosphomannose mutase) 및/또는 효소 GDP-만노스 피로포스포릴라제(GDP-mannose pyrophosphorylase) 및/또는 하나 또는 그 이상의 α-갈락토시다제를 코딩하는 유전자와 관련하여 사용되는 것이 바람직하다.

좀더 바람직한 경우에서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 PMI를 코딩하는 유전자 및/또는 α-갈락토시다제를 코딩하는 유전자와 함께 사용되어진다. 바람직하게는 PMI와 α-갈락토시다제는 PCT/EP96/05581( 참고문헌으로 여기에 통합된 목록)에서 논의되고 발표되었다.

본 발명에 본 발명에 의한 뉴클레오타이드 서열의 상이한, 동형 또는 단편의 사용을 포함하고 있다. 여기에서 뉴클레오타이드 서열과 관련이 있는 "변형체(variant)", "상동체(homologue)" 또는 "단편(fragment)"의 용어는 하나(또는 그 이상)의 핵산, 또는 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자의 일부에 안티센스하고 합성된(resultant) 뉴클레오타이드 서열은 만노스-대-갈락토스 비율의 특징에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오타이드 서열과 비슷한 합성된 뉴클레오타이드 서열에서 공급된 서열의 치환되는, 상이한, 변형된, 복위(replacement)되는, 삭제(deletion)되는 또는 첨가를 포함한다. 이 용어는 서열의 대립형질의 변이와 동이어이다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 유전자 서열과 안티센스한 UDP-갈락토스 에피머라제 효소는 어느 적당한 UDP-갈락토스 에피머라제 효소일 것이다. 바람직하게는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 유전자 서열과 안티센스한 UDP-갈락토스 에피머라제 효소는 내생적(endogenous) UDP-갈락토스 에피머라제 효소 또는 그 서열이 비슷한 효소(적어도 85% 서열 유사도, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 유사도, 더 바람직하게는 적어도 95%의 서열 유사도, 더 바람직하게는 적어도 98%의 서열 유사도를 보이는)이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 유전자 서열과 안티센스한 UDP-갈락토스 에피머라제 효소는 서열 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2, 또는 그의 변형체, 상동체 또는 단편에 나타난 아미노산을 포함하거나 그것일 것이다.

본 발명의 더 바람직한 실시태양에서, 뉴클레오타이드 서열의 유전자 서열과 안티센스한 UDP-갈락토스 에피머라제 효소는 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2로 나타난 아미노산을 포함하거나 그것일 것이다.

또한, 본 발명의 좀더 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2로 나타난 UDP-갈락토스 에피머라제 효소 코딩 서열과 안티센스하다.

상기에 나타난 것처럼, 바람직한 UDP-갈락토스 에피머라제 효소 와 비교하여 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열의 아미노산 서열과 관련된 "변형체", "상동체" 또는 "단편"의 용어는 하나(또는 그 이상)의 아미노산, 또는 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도를 가진 합성된 효소, 바람직하게는 적어도 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2로 보여진 서열을 포함하는 효소의 동일한 활성도를 가지는 서열의 치환되는, 상이한, 변형된, 복위되는, 삭제되는 또는 첨가를 포함한다. 특히, "상동체"의 용어는 구조적 및/또는 기능적인 관점에서의 상동성을 의미한다. 서열의 일치도의 관점에서 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2로 나타난 효소 구성 서열과의 상동성은 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 85%, 더 바람직하게는 90%이다. 더 바람직하게는 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2로 나타난 효소 구성 서열과의 상동성은 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98%이다.

UDP-갈락토스 에피머라제 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열에서 "변형체", "상동체" 또는 "단편"의 용어는 하나(또는 그 이상)의 핵산, 또는 합성된 뉴클레오타이드 서열 코드 또는 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도를 가진 효소를 코딩할 수 있는, 바람직하게는 적어도 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2에서 나타난 서열로 구성된 효소의 동일한 활성도를 공급하는 서열의 치환되는, 상이한, 변형된, 복위되는, 삭제되는 또는 첨가를 포함한다. 특히, "상동체"의 용어는 합성된 뉴클레오타이드 서열 코드 또는 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도를 가진 효소를 코딩할 수 있는 구조적 및/또는 기능적인 관점에서 상동성을 의미한다. 서열의 상동성의 관점에서 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2에서 나타난 서열로 구성된 서열과는 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%의 상동성이다. 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2에서 나타난 서열로 구성된 서열과는 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98%의 상동성이다.

본 발명에 따른 안티센스 뉴클레오타이드 서열 즉 UDP-갈락토스 에피머라제를 코딩하는 안티센스한 서열과 관련하여 "변형체", "상동체" 또는 "단편"의 용어는 하나(또는 그 이상) 핵산으로부터 또는 바람직하게는 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2에 나타난 서열로 구성된 효소와 적어도 같은 효소의 활성도를 지니는 UDP-갈락토스 에피머라제 활성의 효소를 코딩할 수 있는 서열 코드와 안티센스한 합성된 뉴클레오타이드 서열을 공급하는 서열의 치환되는, 상이한, 변형된, 복위되는, 삭제되는 또는 첨가를 포함한다. 특히, "상동체"의 용어는 UDP-갈락토스 에피머라제 활성을 지니는 효소를 코딩할 수 있는 서열 코드와 안티센스한 합성된 뉴클레오타이드 서열이 주는 구조적 및/또는 기능적인 관점에서의 상동성을 의미한다. 서열의 상동성의 관점에서, 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2에 나타난 서열과 안티센스하게 구성된 서열과 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%의 상동성이다. 염기서열 No.1 또는 염기서열 No.2에 나타난 서열과 안티센스하게 구성된 서열과 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98%의 상동성이다.

본 발명에 따른 형질전환 유기체는 본 발명에 따른 유기체를 구성하는 어떤 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 플라스미드, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 조직, 또는 그것의 결합을 포함한 생산물로 구성된다. 형질전환 유기체의 경우에는 하나 또는 그 이상의 이형적 프로모터들의 조절 아래에 있는 본 발명의 어떤 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

매우 바람직한 실시태양에서, 형질전환 유기체(또는 그 일부)는 프로모터와 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열의 결합을 포함하지 않는데 이 프로모터와 뉴클레오타이드 서열 모두 자연의 유기체이고 자연의 환경 안에 있다.

"프로모터"의 용어는 예를 들면 유전자 발현의 Jabcob-Mond 이론에 의한 RNA 폴리머라제(polymerase) 결합 위치와 같은 분야의 표준 의미로 사용된다. 프로모터는 부가적으로 하나 또는 그 이상의 특색을 확보하고 또는 적당한 숙주에서 발현하여 증가시킴을 포함할 수 있다. 예를 들면, 특색은 프리브노우 박스(Pribnow Box) 또는 TATA 박스(TATA box)와 같은 보존 영역이 될 수 있다. 이 프로모터는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현 수준에 영향(유지, 증가, 감소처럼)을 주는 다른 서열을 포함할 것이다. 예를 들면 적당한 다른 서열은 Sh1-인트론(intron) 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열들은 온도, 화학적, 빛 또는 스트레스 유도 요소(inducible elements)들처럼 유도 요소를 포함한다.

또한, 전사 또는 번역을 증가시킬 적당한 요소는 존재한다. 이후의 실시예에서 요소는 TMV 5' 신호 서열(Sleat Gene 217[1987]와 Dawson Plant Mol. Biol. 23[1993] 97)이다.

그러므로 이 측면에서, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 프로모터의 조절아래 놓여있다. 이런 측면에서, 프로모터는 세포 또는 조직 특이적 프로모터일 것이다. 만약, 예를 들어 유기체인 식물에서, 프로모터는 하나 또는 그 이상의 종자, 줄기, 싹 및 잎의 조직에서 뉴클레오타이드 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다.

실시예에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 위한 프로모터는 PCT/EP95/02195에서 서술된 α-Amy 1 프로모터(한편 Amy 1 프로모터로 알려진 Amy 637 프로모터 또는 α-Amy 637 프로모터)일 수 있다.

선택에 있어서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 위한 프로모터는 PCT/EP95/02196에서 서술된 α-Amy 3 프로모터(한편 α-Amy 3 프로모터로 알려진 Amy 351 프로모터 또는 α-Amy 351 프로모터)일 수 있다. Amy 351 프로모터는 하나의 특이적 조직 형태 또는 기관에서처럼 더 특이적인 방법의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 부분적으로 불활성화된(inactivated) 프로모터의 한 일부를 불활성화할 수 있다. "불활성화된"의 용어는 프로모터의 발현 패턴이 변형되나 프로모터로서의 기능이 여전히 남아있는 불활성화된 프로모터로서 부분적 불활성을 의미한다. 게다가 상기에서 언급한 것처럼, 변형된 프로모터는 원형 프로모터의 적어도 하나(모두가 아닌)의 특이적 조직의 뉴클레오타이드 서열이 발현을 할 수 있다. 다른 부분적 프로모터 서열(반드시 Amy 351 프로모터는 아닌)의 불활성의 예는 프로모터 서열의 폴딩(folding) 패턴, 또는 뉴클레오타이드 서열의 부분적 결합 특이성의 개선을 포함하는데 뉴클레오타이드 서열의 일부는 예를 들어, 특이적 RNA 폴리머라제에 대해서는 보고되어지지 않았다. 또한 바람직하게는 부분적으로 불활성 Amy 351 프로모터는 단편의 형태로 잘린다. 또 다른 방법으로 적어도 RNA 폴리머라제는 일부 또는 다른 일부와 결합할 수 없는 서열의 일부로 변형되어진다.

또 다른 변형은 카타볼라이트(catabolite) 억제에 영향을 미치고 본래의 프로모터의 카타볼라이트 억제는 제거된 섬유상의 곰팡이로부터 알려진 CreA 단백질과 같은 조절 단백질과 결합하는 위치의 변형이다.

본 발명은 재조합 DNA 기술을 이용한 만노스-대-갈락토스 비율의 영향에 관한 것이다.

재조합 DNA 기술의 일반적인 내용은 Sambrook, J., Fritsh, E. F. 및 Maniatis T.(편집인)의 분자 클로닝(Molecular Cloning. A laboratory. Second edition. Cold Spring Horbour Laboratory Press. New York 1989)에서 찾을 수 있다.

본 발명은 형질전환 식물의 제조에 의한 식물에서 만노스-대-갈락토스 비율의 영향에 관한 것이다. 비록 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 효소가 EP-B-0470145와 CA-A-2006454에서 발표되었지만, 두 개의 문헌은 본 발명에 따른 형질전환 식물 제조에 사용될지도 모르는 기술의 유형에 대한 어떤 유용한 배경 설명을 제공한다. 이들 배경 내용의 적용은 현재 다음에 따르는 기술을 포함하고 있다.

유전자 변형 식물의 제조에 관한 기초적 이론은 삽입된 유전적 재료의 안정적 보존을 이루기 위해서 식물의 게놈으로 삽입되는 유전 정보에 관한 것이다.

유전 정보의 삽입에 대한 알려진 몇몇 기술로, 유전 정보의 직접적인 도입과 벡터 시스템을 사용한 유전 정보의 도입의 두 가지 주요한 이론이 있다. 일반적인 기술의 개요는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991] 42:205∼225)와 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17∼27)의 논문에서 찾을 수 있다.

그러나, 이러한 측면에서, 본 발명은 뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명에 따른 제조의 운반체로서 벡터 시스템과 관련이 있고 식물과 같은 유기체의 게놈으로 뉴클레오타이드 서열 또는 구조의 도입을 할 수 있다. 벡터 시스템은 벡터 하나로 구성되어 있을 수도 있으나, 두 개의 벡터로 구성되어 있을 수도 있다. 두 개의 벡터의 경우, 벡터 시스템은 보통은 이원(binary) 벡터 시스템이 바람직하다. 이원 벡터 시스템은 Gynheung An등의 1980년 문헌인 Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3,1∼19에서 좀더 자세하게 설명하고 있다.

프로모터 또는 뉴클레오타이드 서열 또는 제조에서 얻어진 세포의 형질전환을 위해 널리 사용되는 시스템의 하나는 An 등의(1986), Plant Physiol. 81, 301-305와 Butcher D. N. 등의 1980년, Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.:D. S. Ingrams and J. P. Helgeson, 203∼208에서 나타난 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)의 Ri 플라스미드의 사용에 기초를 두고 있다.

몇 개의 다른 Ti 플라스미드와 Ri 플라스미드는 식물 또는 위에서 설명된 식물 세포 제조의 구조에 적당한 구조를 가지고 있다.

뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 제조는 T-DNA 또는 T-DNA 보더(border)를 둘러싸인 가까운 서열의 분열을 피하기 위해서 T-DNA 서열에 인접한 터미널(terminal) 서열 사이로 Ti 플라스미드가 바람직하게 삽입되고 적어도 이 영역의 하나는 식물 게놈 안으로 변형된 T-DNA의 삽입을 위해 나타난다.

상기 설명에서 이해할 수 있는 것으로, 유기체가 식물이라면, 본 발명의 벡터 시스템은 식물의 감염에 필요한 서열과 적어도 하나의 T-DNA 보더 일부 서열 즉 유전적 구조로서 동일한 벡터 상에 위치하는 보더(border) 일부를 포함하는 것이 바람직하다.

게다가, 벡터 시스템은 아그로박테리움 튜메파시엔스의 Ti 플라스미드 또는 아그로박테리움 리조게네스의 Ri 플라스미드 또는 그것에서 유도된 것이 바람직하고 이들 플라스미드는 잘 알려져 있고 형질전환 식물의 제조에 광범위하게 사용되며 많은 벡터 시스템이 이들 플라스미드 또는 이에 유도된 것에 기초하여 존재한다.

형질전환 식물 뉴클레오타이드 서열의 제조 또는 본 발명의 제조는 벡터를 복제할 수 있고 식물 안으로 삽입하기 전에 쉽게 조작할 수 있는 미생물에서 첫 번째로 제조되었다. 사용할 수 있는 미생물의 예는 대장균이나 상기 특징을 지니고 있는 다른 미생물이 사용될 수도 있다. 상기에서 정의한 벡터 시스템의 벡터는 대장균에서 제조될 수 있으며, 만약 필요하다면, 적당한 아그로박테리움 균주(strain) 예를 들면 아그로박테리움 튜메파시엔스로 전이된다. Ti 플라스미드 하버링(harbouring) 뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 제조는 적당한 아그로박테리움 균주 예를 들면 아그로박테리움 튜메파시엔스로 전이되는 것이 바람직하고, 아그로박테리움 세포 하버링 뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 제조에서 얻어진 DNA는 변형된 식물 세포로 후에 전이된다.

CA-A-2006454에서 공지된, 대량의 클로닝 벡터는 대장균에서의 복제 시스템에서 얻어지고 변형 세포의 선택을 위한 표지(marker)로 이용할 수 있다. 이 벡터는 예를 들어 pBR 322, pUC 시리즈, M13 mp 시리즈, pACYC 184 등이 포함된다.

이와 같은 방법에서, 뉴클레오타이드 또는 본 발명의 제조는 벡터의 적당한 제한 위치로 도입될 수 있다. 포함된 플라스미드는 대장균에서 변형을 위해 사용된다. 대장균 세포는 적당한 영양배지에서 배양되고 그후 얻어지고 용출된다. 그 후에 플라스미드는 회수된다. 분석 방법에는 서열 분석, 제한 분석, 전기영동 및 그 이상의 생화학적-분자 생물학적 방법이 보통 사용된다. 각 조작 후, 사용된 DNA 서열은 다음 DNA 서열의 분리와 연결에 사용된다. 각 서열은 동일한 또는 다른 플라스미드에 클론될 수 있다.

제조의 방법 또는 식물에서 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열의 도입 후 근접 및/또는 더 먼 DNA 서열의 삽입이 필요할 수도 있다. 실시예에서, 식물 세포의 Ti 또는 Ri 플라스미드가 변형을 위해서 사용되고, 적어도 오른쪽 경계(boundary)와 종종 Ti 및 Ri 플라스미드 T-DNA의 오른쪽 및 왼쪽 경계 즉, 도입된 유전자의 플랭킹(flanking) 영역으로 연결할 수 있다. 식물 세포의 변형을 위한 T-DNA의 사용은 집약적으로 연구되었고 EP-A-120516; Hoekema, in : The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Alblasserdam, 1985, Chapter Ⅴ; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci.,4:1∼46; An et al., EMBO J. (1985) 4:277∼284에 설명되었다.

아그로박테리움에 의한 식물 조직의 직접적인 감염은 Butcher D. N. 등 (1980)의 Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, D. S. Ingrams and J. P. Henlgeson, 203∼208에서 설명된 폭넓게 쓰이는 간단한 기술이다. 이 주제의 그 이상의 정보를 위해서는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Biol[1991] 42:205∼225)와 Christou(Agro-Food-industry Hi-Tech march/April 1994,17∼27)를 보면 된다. 이 기술에서, 식물의 감염은 어떤 일부 또는 예를 들면 잎, 뿌리, 줄기 또 다른 식물의 일부와 같은 식물의 조직상에서 행해질 것이다.

일반적으로, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 운반하는 아그로박테리움의 식물 조직의 직접적인 감염은 예를 들면 면도칼을 이용한 식물의 베어내기 또는 바늘을 이용한 식물의 구멍 뚫기 또는 연마재를 이용한 식물의 마찰과 같은 상처에 의해 감염된다. 상처로 아그로박테리움이 접종(inoculate)된다. 접종된 식물 또는 식물의 일부는 적당한 배양배지에서 생장하고 성숙한 식물로 발육하게 된다.

식물 세포가 제조될 때, 세포는 예를 들어 필수 성장 요소인 아미노산, 식물 호르몬, 비타민 등과 같은 적당한 배양 배지에서 배양되는 잘 알려진 조직 배양법에 따라 성장하고 부양하게 된다.

유전적으로 변형된 세포의 재생은 예를 들면 항생물질을 사용한 선택되는 변형된 발아와 적당한 영양, 식물 호르몬 등을 포함한 배지에서 발아한 2차 배양(subculture)등에서처럼 식물의 세포 또는 조직 배양으로부터의 재생을 위해 알려진 방법을 사용하여 이루게 된다.

식물의 변형의 그 이상의 정보를 위해서는 EP-A-0449375에서 찾아보면 된다.

식물 변형의 그 이상의 정보를 위해서는 덴마크 특허 출원 제940662호(1994년 6월 10일자로 출원) 및/또는 영국 특허 출원 제9702592.8호(1997년 2월 7일자로 출원)를 찾아보면 알 수 있다.

참고문헌은 이 저자들이 유전자전이 식물의 제조상 일반적인 개관을 나타내는 것으로서 Spongstad et al(1995 Plant Cell Tissue Organ Culture 40 pp1∼15)로 구성되었다.

예에서, 본 발명에 따른 형질전환 구아 식물은 아그로박테리움 튜메파시엔스 LBA 4404를 사용한 Joersb와 Okkels(PCT/DK95/00221)에 따른 방법에 의한 구아 코틸레도너리(cotyledonary) 체외이식조직(explant)에 의해 이루어질 수 있다.

다음은 부다페스트 조약에 따라 AB2 1RY, 영국 스코틀랜드 마벨딘 마쳐 드라이브 23 스트리트에 위치한 The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)에 1997년 5월 23일자로 기탁되었다.

1. E. coli DH5αpGEPI42. 기탁번호는 NCIMB 40881이다. NCIMB 40881은 염기서열 1을 포함한 클론 GEPI42를 포함하고 있다.

2. E. coli DH5αpGEPI48. 기탁번호는 NCIMB 40882이다. NCIMB 40882는 염기서열 2를 포함한 클론 GEPI48을 포함하고 있다.

그러나, 바람직한 실시태양에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 기탁번호 NCIMB 40881 또는 NCIMB 40882로부터 얻어진 또는 변형체, 상동체 또는 그것의 단편인 UDP-갈락토스 에피머라제 효소를 코딩하는 서열에 안티센스이다.

더 바람직한 실시태양에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 기탁번호 NCIMB 40881 또는 NCIMB 40882로부터 얻어진 UDP-갈락토스 에피머라제 효소를 코딩하는 서열에 안티센스이다.

본 발명은 지금의 실시예에 의해 기술되어진다.

구아(Cyamopsis tetragonolobus)의 UDP-갈락토스 에피머라제 유전자의 일부 특성과 클로닝

구아의 UDP-갈락토스 4-에피머라제(EC 5.1.3.2.)의 생화학적 연구에서 이 효소의 아주 높은 활성도를 발견하였지만, UDP-갈락토스 에피머라제 단백질의 양은 아미노산 분석을 통해 예비 정제가 매우 적게 나타남을 보인다. 그러므로 선택의 클로닝 방법은 galE E.coli.변이주에서 기능 상보적인 것에 의한다.

cDNA 라이브러리(library)

미성숙 구아 종자 mRNA의 표현 cDNA 발현 라이브러리는 플라스미드 pcDNAⅡ(인비트로겐 사)에서 제조되고 대장균 균주 Top10F로 형질전환된다. 이 cDNA 라이브러리의 특성은 무작위로 고른 다수의 분리 Top10F 콜로니(colonies)로부터 플라스미드의 정제에 의해 조절된다. 제한 효소 분석은 플라스미드이 재조합 검사를 나타내고 있다.

UDP-갈락토스 에피머라제 결핍 대장균 균주

대장균 균주 PL-2는 두 개의 다른 유전자인 gal-오페론(gal-operon), galT의 손상(Buttin, J Mol Biol, 7,164∼182(1963); Wu and Kalckae, Proc Nat Acad Sci, USA 55, 622∼629(1966))에 의한 galE-유전자의 결핍으로 인해서 갈락토스 대사를 할 수 없다. 그러나 PL-2 안으로 활성 UDP-갈락토스 에피머라제 유전자의 삽입은 이 균주의 갈락토스의 증대를 가져올 것이다.

PL-2의 형질전환과 선택

PL-2 세포는 Hanahan(Techniques for transformation of E. coli. IRL Press, Oxford(ISBN 0-947946-18-17), 109∼135(1985))의 방법에 의해서 반응력있게(competent) 만들어졌다. 적정농도 5×10⁶형질전형된 세포/㎍의 라이버리 플라스미드를 얻었다.

이 선택 배지는 0.05 g/l 트레오닌(threonine), 0.05 g/l 루신(leucine), 0.05 g/l 메티오닌(methionine), 1.0 g/l 티아민-HCl(thiamin-HCl), 50 mg/l 암피실린(ampicillin), 0.8 g/l 과당(fructose), 0.9 g/l 아가로스 및 6 또는 8 g/l 갈락토스가 첨가된 M9 염(Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, New York(ISBN 0-87969-136-0),1982)에 필수적인 갈락토스가 첨가된 최소배지이다.

반응력있는 PL-2 세포는 구아 cDNA 라이브러리를 가지고 형질전환하였고 선택적 기질 M9-ES6 또는 M9-ES8로 도말하였다. 37 ℃상에서 2일 후, 콜로니가 나타났다(대략 형질전환된 총 개체의 0.1 %). 총 48 콜로니를 선택하였다.

선택된 콜로니의 UDP-갈락토스 에피머라제 분석

갈락토스 생성을 위해 얻어된 능력은 UDP-갈락토스 활성도의 표현에 있어서 모든 선택된 콜로니는 초음파에 의한 분쇄(sonication)에 의해 생성된 조 추출물과 다음으로 원심분리에 의한 정제 방법을 사용하여 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도를 측정하였다. UDP-갈락토스 에피머라제 분석은 Dey(Phytochem, 23,729∼732(1984))에 따라서 실시하였다. PL-2 추출물의 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도는 0(음성 대조구)이고 반면 의미있는 활성도의 수준으로 예상되는 것으로 DH5a(양성 대조구)에서 찾을 수 있다. UDP-갈락토스 에피머라제 활성도가 높은 수준으로 나타난 형질전환된 PL-2 콜로니는 그 이상의 분석을 위하여 선택하였다.

콜로니 42 및 48로부터 플라스미드 DNA 형질전환

콜로니 42 및 48로부터 플라스미드는 정제되고 M9-ES6 또는 M9-ES8로 도말된 반응력있는 PL-2로 재형질전환되었다. 두 재형질전환 실험에서, 37 ℃상에서 2일 후에 많은 수의 콜로니가 나타났다. 각각으로부터 약 10 개의 독립적인 콜로니는 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도를 분석되었고 모든 추출물은 본 콜로니 42 및 48에서 찾은 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도와 비슷하게 높은 수준을 포함하고 있다. 이 실험은 UDP-갈락토스 에피머라제 활성도가 PL-2에서 cDNA 삽입에 의해 암호화되어 얻어진 콜로니 42 및 48에서 발견됨을 설명하고 있다.

콜로니 42 및 48로 삽입된 DNA 서열 분석

콜로니 pGEPI42 및 pGEPI48에 포함된 UDP-갈락토스 4-에피머라제의 뉴클레오타이드 서열 일부는 열 시쿼나제 형광 사이클 서열 키트(Termo sequenase fluorescent cycle sequencing kit : 아머샴사)와 ALF DNA 시퀀서(ALF DNA sequencer : 파마시아사)를 사용하여 측정하였다.

염기 서열 번호 1 및 2는 콜로니 42 및 48에 삽입된 뉴클레오타이드 서열 일부에서 유래된 아미노산 서열임을 보여준다.

안티센스 실험

상기 언급된 삽임 콜로니의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 상기 언급된 기술에 따른 형질전환 구아 검에 제조되고 사용된다.

합성물 분석은 하나 또는 그 이상의 이들 안티센스 서열의 삽입에 의한 구아 검의 만노스-대-갈락토스 비율 증가의 가능성이 있음을 밝히고 있다. 그러므로 본 발명은 안티센스 뉴클레오타이드 서열인 뉴클레오타이드 서열 삽입에 의한 구아 검의 만노스-대-갈락토스 비율 증가 가능성의 놀라운 발견에 근거를 둔다.

본 발명의 다른 변형은 문헌에서 이들의 기술에 의해서 명백해질 것이다.

Claims

만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스 포함한 화합물의 만노스-대-갈락토스의 비율에 영향을 주고, (a) 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 구성성분인 만노스와 갈락토스의 만노스-대-갈락토스 비율; 및/또는 (b)만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 위한 만노스와 갈락토스 전구체의 만노스-대-갈락토스 비율에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 포함하는 생체내 변형 방법으로, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스인 뉴클레오타이드 서열의 발현을 포함함을 특징으로 하는 생체내 변형 방법
만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스 포함한 화합물의 생체내 만노스-대-갈락토스 비율에 영향을 주는 뉴클레오타이드 서열의 용도로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스이고, 뉴클레오타이드 서열은 (a) 만노스/갈락토스를 포함한 화합물의 구성성분인 만노스와 갈락토스의 만노스-대-갈락토스 비율; 및/또는 (b)만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 위한 만노스와 갈락토스 전구체의 만노스-대-갈락토스 비율에 영향을 줌을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열의 용도
제1항 또는 제2항에 있어서, 만노스/갈락토스를 포함한 화합물은 갈락토만난임을 특징으로 하는 발명
제1항 내지 3항의 어느 하나에 있어서, 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체는 구아 식물임을 특징으로 하는 발명
제1항 내지 제4항의 어느 하나에 있어서, 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스 포함한 화합물의 생체내 만노스-대-갈락토스의 비율은 구아 식물 또는 그것의 갈락토만난보다 높음을 특징으로 하는 발명
제1항 내지 제5항의 어느 하나에 있어서, 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 생산할 수 있는 유기체(또는 그 일부) 또는 만노스/갈락토스 포함한 화합물의 생체내 만노스-대-갈락토스의 비율은 로커스트 빈 또는 그것의 갈락토만난과 대체로 비슷한 비율임을 특징으로 하는 발명
적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함한 구조체
적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함한 벡터
적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함한 플라스미드
적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 유전자 일부에 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함한 형질전환 유기체(또는 그 일부)
제10항에 있어서, 형질전환 유기체는 구아 식물임을 특징으로 하는 형질 전환 유기체(또는 그 일부)
상기 청구항의 어느 하나에 있어서, 적어도 UDP-갈락토스 에피머라제 효소의 코딩 서열 일부에 안티센스 뉴클레오타이드 서열임을 특징으로 하는 발명
제1항 또는 그 종속항에 의한 방법에 따라 제조된 만노스/갈락토스를 포함한 화합물
제13항에 있어서, 만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 포함하는 식품
제13항에 있어서, 다당류와 혼합된 만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 포함한 조성물
제13항에 있어서, 잔탄, 카라게난 및 아가로스의 하나 또는 그 이상과 혼합된 만노스/갈락토스를 포함한 화합물을 포함한 조성물
제13항에 있어서, 다른 적당한 원료와 만노스/갈락토스를 포함한 화합물 혼성을 포함한 식품 또는 그 조성물의 제조 방법
실질적으로 여기에 기술된 것과 방법