JP2001501810A - 遺伝子発現の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 共抑制を回避または軽減しながら、生物において選択された遺伝子の発現を増強する方法は、ヌクレオチド配列において改変され、生物内にすでに存在するDNAによりすでに発現されたタンパク質それと理想的には同一であるタンパク質の発現を可能にするDNAの合成を含有する。この方法は、共抑制現象を排除するのに十分な程に２遺伝子間の配列の類似性を減少させ、特定のタンパク質の過剰発現を可能にすることを保証する。この方法は、植物において特に適切である。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子発現の増強 本発明は、生物、特に植物において遺伝子発現を増強させる方法および材料に 関する。本発明の一つの特定の、しかし排他的でない適用は、トマト（Lycopers icon spp.）のような植物におけるカロチノイドの生合成の増強である。 生物によるタンパク質産生を増加させるため、遺伝子形質転換によって標的生 物のゲノム中に、タンパク質をコードする遺伝子の１またはそれ以上の付加的な コピーを挿入することは、公知の実施である。このようなコピーは、通常はその 植物にすでに存在する遺伝子と同一であるか、あるいは、外来遺伝子と同一のコ ピーであり得る。理論的には、多数の遺伝子コピーは、発現に際して通常より大 量の選択されたタンパク質を生物に産生させ、これを「過剰発現」という。しか し、いくつかの実験により、遺伝子のコピーが多数存在する場合、特定の遺伝子 が低い発現を示し得るか、または発現し得ないことが示されている（Napoliら、 1990およびDorlhac de Borneら、1994）。この現象を、共抑制という。これは、 ヌクレオチド配列において類似の遺伝子をすでに含む植物に、組換え遺伝子が導 入された場合に最も頻繁に起きる。このことは、内因性の植物遺伝子および転移 性エレメントにおいてもまた観察されている。共抑制の効果はいつも即時的であ るとは限らず、一次形質転換体またはその後の世代における発達因子および環境 因子により影響を受け得る。 一般的な原則では、コドンの使用が、植物により頻繁に使用されるコドンの使 用にほぼ等しいようなDNA配列で植物を形質転換する。実験的分析から、植物の ゲノムにすでに存在する遺伝子と配列が同一である遺伝子の２つ目のコピーを導 入すると、その結果（いくつかの場合に）トランスジーン、内因性遺伝子、また はその不活性化された両方の遺伝子の発現が生じ得る（共抑制）。共抑制が正確 にどうやって起きるのかについての機構は不明であるが、前および後遺伝子転写 ブロックの両方を組み込んだいくつかの理論は存在する。 原則として、挿入された遺伝子のヌクレオチド配列は２点において「最適化」 される。挿入された遺伝子のコドン使用は、遺伝子が挿入されるべき種の好まし いコドン使用にほぼ等しくなるように修飾される。挿入遺伝子はまた、ピリミジ ンに対するプリンの比を標的種に一般的に見い出される比に近づける目的で、ヌ クレオチド使用に関してもまた最適化され得る。例えば、細菌起源の遺伝子が植 物に移入されるとき、翻訳の終結を特定するポリアデニル化シグナルとして真核 生物の発現機構により誤読され得、その結果ポリペプチドの切断を生じ得る、細 菌遺伝子に一般的な高度にアデニル化された領域を避けるために、ヌクレオチド 使用が変化されなければならないことは周知である。最適発現のために、挿入さ れた配列が標的生物のコドン使用およびヌクレオチド使用を模倣するべきである ことは、すべて慣行であり、完全に合理的である。 本発明の目的は、共抑制を除去、または緩和し得るための手段を提供すること である。 本発明に従って、選択されたタンパク質を産生する遺伝子を有する生物による 上記のタンパク質の発現を増強する方法が提供され、この方法は、その生物のゲ ノムヘDNAを挿入する工程を包含する。このDNAのヌクレオチド配列は、転写に際 して生成されるRNAは異なるが、翻訳に際して産生されるタンパク質はゲノムに すでに存在する遺伝子により発現されるものと同一である。 本発明はまた、その構築物のヌクレオチド配列が、転写に際して産生されるRN Aは異なるが、翻訳に際して産生されるタンパク質は、ゲノムにすでに存在する 遺伝子により発現されるものと同一であるという点で特徴付けられる、標的生物 において作動可能なプロモーター、タンパク質をコードするコード領域、および 終結シグナルを、配列に含む遺伝子構築物を提供する。 挿入された配列は、構成プロモーターまたは組織または発生選択プロモーター を有し得る。 挿入された構築物で使用されたプロモーターは、標的ゲノム中にすでに存在す る遺伝子により使用されたものと異なることが好ましい。しかし、本発明者らの 証拠は、「5'介入領域」といわれることもある転写の開始コドンと翻訳の開始コ ドン間の領域が異なれば十分であり得ることを示唆する。換言すれば、共抑制現 象は、おそらく翻訳工程よりむしろ発現の転写工程に随伴する：共抑制はDNAレ ベルまたはRNAレベルまたはその両方に起こる。 本発明はさらに、選択された遺伝子を発現する増強された能力を有するトラン スジェニック植物および種子および上記植物由来の増殖物質を提供する。 本発明は遺伝子の発現に一般的に適用されるが、本発明のある特定の実施態様 においてフィトエン合成酵素遺伝子の発現を増強する方法により例証される。こ の遺伝子は植物においてカロチノイドの生合成に必須であり、内因性配列と異な るヌクレオチド配列を有する改変されたトランスジーンの使用により上記の過剰 発現が達成される。 好ましくは、上記の改変フィトエン合成酵素遺伝子は配列番号１の配列を有す る。 本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド１〜417を含む改変された葉緑体標 的化配列を提供する。 簡潔に言えば、本発明は、コードされたタンパク質の同一性を維持したままヌ クレオチド使用の相違点を最大化することにより、ゲノムにすでに存在する遺伝 子について改変される遺伝子構築物を挿入することにより、タンパク質の発現が 増強されことを要求する。換言すれば、コンセプトは、コード領域中に、および 好ましくはプロモーター領域中においても、異なるヌクレオチド配列を有する遺 伝子から、同一のタンパク質を発現させるということである。挿入される遺伝子 のヌクレオチド使用（プリン対ピリミジンの割合）を、ゲノムにすでに存在する 遺伝子の使用に近づけることが望ましい。本発明者らはまた、標的生物において 希少である挿入された遺伝子でのコドン中での使用を避けること、および全コド ン使用を標的ゲノムについて報告されたコドン使用に近づけることが望ましいと 考える。 配列が改変され得る程度は、縮重コドンの頻度に依存する。いくつかの場合に は、高い割合の変化が、特にトリプレットの第３ヌクレオチドになされ得、その 結果、挿入される遺伝子とすでに存在する遺伝子との間のDNA（および結果的にR NA）配列のホモロジーが低くなる。一方、別の場合には、唯一コドンの存在のた めに、有用な変化の数が低いことがあり得る。有用な変化の数は、縮重において すでに存在する遺伝子配列の研究により容易に決定され得る。 本発明に従って挿入のための遺伝子を得るには、それを合成することが必要で あり得る。合成遺伝子のヌクレオチド配列が、すでに存在する遺伝子と比較して 選択され得る一般的なパラメーターは： １．合成遺伝子と植物ゲノム中にすでに存在する遺伝子との間のヌクレオチド配 列類似性を最小化する； ２．コード領域によりコードされるタンパク質の同一性を維持する； ３．標的ゲノムについて示された、ほぼ最適なコドン使用を維持する； ４．ピリミジン塩基に対するプリン塩基の比をほぼ同じ割合に保持し；そして ５．プロモーター、または少なくとも5'介入領域を変化させる。 本発明者らは、トマトのフィトエン合成酵素遺伝子を用いて研究してきた。内 因性フィトエン配列のDNA配列は、公知である（EMBL受託番号Y00521）：そして この遺伝子は3'末端方向に２つの配列エラーを含んでいることが見出された。こ れらのエラーを、以下の方法で修正した（１）1365位のシトシンを削除し、そし て（２）1421位にシトシンを挿入する。修正されたフィトエン合成酵素配列（Ba rtleyら、1992）は、本明細書中で配列番号２として記載される。その天然の配 列から始めて、本発明者らは上記で引用したパラメーターに従って改変を選択し 、本発明者らがMTOM5と称し、そして配列番号１の配列を有する改変された遺伝 子を合成した。本明細書中の図１は、天然および合成遺伝子の配列を、保持され たヌクレオチドにはドットを付し、改変にはダッシュを付して示す。改変された 遺伝子MTOM5はDNAレベルで63%、タンパク質レベルにおいては100%のホモロジー を有し、そしてアデニンとチミジン（つまりプリン）の割合は、天然の配列で58 %であるのに対して、改変された遺伝子においては54%である。 本明細書中に提供された配列表において、配列番号１は、図１でMTOM5と呼ぶ 合成（修飾TOM5）遺伝子のDNA配列であり、配列番号２は、図１でGTOM5と呼ばれ る天然のゲノムフィトエン合成酵素（PsyI）遺伝子であり、配列番号３はGTOM5 およびMTOM5の両方の翻訳産物である。 トマト（Lycopersicon esculentum）では、リコピンというカロチノイドが、 果実が熟するときの赤色発色の主な原因であることが示されている（Birdら、19 91）。本明細書中でPsyIと称する酵素であるフィトエン合成酵素の産生は、リコ ピンの前駆体であるフィトエン産生における重要な触媒である。 PsyIはゲラニルゲラニルジホスフェートのフィトエンへの変換を触媒する。こ れは、カロチノイド生合成における第１の専用工程である。 活性PsyI遺伝子の調節および発現は、リコピンの産生に必要であり、そして結 果的に果実が熟する間の赤色発色に必要となる。これは、PsyI遺伝子が不活性で ある天然に存在する変異体において観察される、トマト果実の黄色果肉表現型に よって例証され得る。さらに、PsyI発現を特異的にダウンレギュレートする、ア ンチセンスPsyIトランスジーンを含むトランスジェニック植物もまた、成果実の 黄色果肉熟表現型を産生した。 PsyI遺伝子の別のコピー（TOM5と呼ぶ）を発現し、構成プロモーター（カリフ ラワーモザイクウィルス35Sプロモーターである）の制御下に置かれたトランス ジェニック植物を産生した場合、約30%の一次形質転換体が、共抑制現象を示す 成熟黄色果実を産生した。いくつかの産生された一次形質転換体は、カロチノイ ド含量が増加したが、その後の世代はこの表現型を表さず、従って共抑制は必ず しも即時的でなく、後世代において起こり得るという証拠を提供する。 PsyIの配列は公知であり、従ってそのアミノ酸配列が決定された。 公開されているGenbank遺伝子配列データ（Ken-nosuke Wadaら、1992）に参照 して、ヌクレオチド配列を、トマトでのコドンの使用頻度がまだ十分な、PsyIの アミノ酸配列を保持するヌクレオチド配列に改変することによって合成DNAを産 生した。２コドンの選択しかない場合、コドン間の簡単な交換を行ったが、その 他の場合には、トマトのコドン使用バイアスの中でコドンを変えた。ヌクレオチ ド配列分析は、合成DNAは、PsyI（TOM5 Bartleyら、1992）と63%のヌクレオチド 類似性を有し、100%のアミノ酸配列類似性を有することを示した。 次いで、35Sプロモーターの制御下で、合成遺伝子を植物形質転換ベクター中 にクローニングした。次いで、これらをトマト植物中にAgrobacterium形質転換 により移入させ、内因性遺伝子および合成遺伝子の両方がタンパク質を発現する ようである。一次形質転換体の分析から、２遺伝子間の共抑制を示すような、黄 色果実の産生のような証拠はないことが例証される。 ここで、以下の実施例において、例証によって本発明を記載する。 実施例１ トマトフィトエン合成酵素をコードするcDNAのコード領域であるTOM5（EMBL受 託番号Y00521）を改変した。なぜなら、元の配列は、配列の3'末端方向に２つの エラーを含んでいたからである。従って、TOM5 cDNAホモログに関してBartleyら 、1992（J Biol Chem 267:5036-5039）により報告された配列は、TOM5（EMBL受 託番号Y00521）と異なる。合成遺伝子を産生する目的で使用された配列は、TOM5 cDNAの修正型であり、PsyI（Bartleyら、1992）と同一である。 配列の設計。 １．可能性を有する制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、アミノ酸配列の制約を 与えられたと考えられた。予想される標的配列切断部位周辺の有用な部位を導入 し、リーダーのその後の操作を補助した。 ２．２コドンのみが選択可能な場合（例えば、リジン）、コドン間の簡単な交換 を使用した。その他の場合、コドンは、Ken-nosuke Wadaら（Genbank遺伝子配列 データ、1992．Nucleic Acids research 20:S2111-2118から表にしたコドン使用 ）により提供されるトマトのコドン使用バイアスの範囲内で変えた。コドン使用 の代表的な広がりを産生することよりむしろ、ホモロジーを減少しそして希少な コドンを回避することを優先した。 ３．配列のいずれかの末端にBamHI部位を導入し、イニシャル（initial）へのク ローニングを容易にした。双子葉植物開始部位コンセンサス配列（Cavenerおよ びRay 1991、Eukaryotic start and stop translation sites．NAR 19:3185-319 2）に従って、5'末端で、4AをATGの上流に配置した。 ４．SP6を用いて翻訳され得るように、合成遺伝子をベクターpGEM4Z中にクロー ニングした。 ５．制限部位、ステムループ、およびコドン使用の分析を実施し、結果は全て満 足のいくものであった。 ６．改変されたTOM5配列を、CGS48またはMTOM5と名付けた。 配列分析 CGS48 AT含量＝54% TOM5 AT含量＝58% TOM5とCGS48との間のヌクレオチドホモロジーは63%である。 アミノ酸配列ホモロジーは100%である。 まとめると、TOM5配列（受託番号Y00521）をGenbankデータベースより抽出し 、そして修飾して以下の修正を組み込んだ：1365位におけるＣを欠失させ、1421 位にＣを挿入した。CGS48は、改変されたY00521のCDSおよび元の配列に基づく一 方で、翻訳産物ホモロジーを維持し、そしで至適トマトコドン使用を維持しよう としている。 CGS48のアセンブリ CGS48は、３部分に分けられた： CGS48A：BamHI/KpnI CGS48B：KpnI/SacI CGS48C：SacI/BamHI ３部分は全て、EcoRI/HindIIIフラグメント上にクローニングされるように設 計した。配列を、オリゴヌクレオチドフラグメントへと分割し、その後コンピュ ーター分析で遺伝子アセンブリに使用した重複領域におけるユニークな相補性を 示した。 Applied Biosystems 380B DNAシンセサイザーで、標準的なシアノエチルホス ホアミダイト化学法を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオ チドをゲルで精製し、そして本発明者らの手順を用いて全長フラグメントへと組 立てた。 そのEcoRI/HindIII突出部（オーバーハング）を介して、組立フラグメントをp UC18にクローニングした。 「前方向」および「逆方向」配列プライマーを、上部鎖および底部鎖の適切な 「構造」プライマーと共に用いて、プラスミドDNAについてのジデオキシ媒介鎖 終結法によってクローンを２方向で配列決定した。 適正なCGS48A、BおよびCクローン由来の挿入物を、それぞれBamHI/KpnI、KpnI /SacI、SacI/BamHIで消化することにより単離した。BamHI/KpnIフラグメントお よびSacI/BamHIフラグメントのKpnI末端およびSacI末端をホスファターゼ処理し た。３フラグメントは全て、BamHI切断およびリン酸分解（ホスファターゼ処理 ）したpGEM4Zに共連結した。SmaI部位に隣接した挿入物の5'末端に配向した正し い大きさの挿入物を有するクローンを、単離されたコロニーのPCR増幅および精 製プラスミドDNAの選択した制限酵素での消化により同定した。 これらのクローンの一つから、CsCIによる精製プラスミドDNAの調製物を作っ た。「前方向」および「逆方向」配列プライマーを、上部鎖および底部鎖の適切 な「構造」プライマーと共に用いて、プラスミドDNAについてのジデオキシ媒介 鎖終結法によって、このクローン（CGS48）を２方向で配列決定した。 実施例２ CaMVの35Sプロモーターを有するMTOM5ベクターの構築 実施例１に記載されたフラグメントMTOM5（CGS48）を、pJR1Riベクター（図２ ）にクローニングし、pRD13クローン（図３）を生じた。CGS48クローンを、SmaI およびXbaIで消化し、次いでSmaIおよびXbaIで切断されたpJR1Riにクローニング し、pRD13クローンを生じた。 実施例３ pRD13ベクターで形質転換された植物の世代および分析 pRD13ベクターをAgrobacterium tumefaciens LBA4404（植物バイオテクノロジ ー研究者の間で広く利用される微生物）に移入し、そしてトマト植物の形質転換 に使用した。トマト茎部の形質転換は、標準的なプロトコル（例えば、Birdら、 Plant Molecular Biology 11，651-662，1988）に従った。抗生物質であるカナ マイシンを含む培地での生育能力によって、形質転換された植物を同定した。49 の植物個体を再生し、そして成熟まで生長させた。これらの植物のうちで、熟し たときに赤色ではなく黄色に変化した果実を産生したものはなかった。全植物に おけるpRD13構築物の存在を、ポリメラーゼ連鎖反応分析により確認した。全植 物のDNAブロット分析から、挿入されたコピー数は１から７の間にあることが示 された。一植物由来の果実のノーザンブロット分析から、MTOM5遺伝子が発現さ れていることが示された。６つの形質転換植物を自家受粉させ、子孫を生じた。 子孫の植物のうち、熟する間に赤色ではなく黄色に変化した果実を産生したもの はなかった。 結果を以下の表１にまとめる。黄色果実、もしくは黄色／赤色混合（例えば、 縞の）果実は、フィトエン合成の抑制を示す。従って、正常なGTOM5構築物で、2 8%のトランスジエニック植物が共抑制を受けた表現型を示した。本発明の改変さ れたMTOM5構築物を有する全ての植物は、赤色果実を有し、これらのいずれにも フィトエン合成の抑制が起こらなかったことを実証する。 図１ 合成MTOM5を有する改変されたTOM5の配列表

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 バード，コリン ロジャー イギリス国 アールジー42 ６イーティー バークシャー，ブラックネル，ジェロッ ツ ヒル リサーチ ステーション（番地 なし) (72)発明者 シューフ，ボルフガング バルター イギリス国 アールジー42 ６イーティー バークシャー，ブラックネル，ジェロッ ツ ヒル リサーチ ステーション（番地 なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．選択されたタンパク質を産生する遺伝子を有する生物による、該タンパク質 の発現を増強する方法であって、該生物のゲノム中へDNAを挿入する工程を包含 し、該DNAのヌクレオチド配列は、転写に際して産生されるRNAは異なるが、翻訳 に際して産生されるタンパク質は、すでにゲノム中に存在する遺伝子により発現 されるものと同一であるようなヌクレオチド配列である、方法。 ２．前記生物が植物である、請求項１に記載の方法。 ３．前記植物がトマト植物である、請求項２に記載の方法。 ４．前記選択された遺伝子が、フィトエン合成酵素をコードする遺伝子である、 請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５．前記挿入遺伝子のコード領域が、配列番号１の配列を有する、請求項４に記 載の方法。 ６．配列中に、標的生物において作動可能なプロモーター、タンパク質をコード するコード領域、および終結シグナルを含む遺伝子構築物であって、該構築物の ヌクレオチド配列が、転写に際して産生されるRNAは異なるが、翻訳に際して産 生されるタンパク質は、すでにゲノム中に存在する遺伝子により発現されるもの と同一であることによって特徴付けられる、遺伝子構築物。 ７．植物におけるカロチノイドの発現を増強する方法であって、該植物における カロチノイドの生合成に必須な酵素を特定する遺伝子の過剰発現を含み、該過剰 発現は、内因性の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する改変されたトランス ジーンの使用により達成される、方法。 ８．前記改変された遺伝子が、フィトエン合成酵素を特定する、請求項７に記載 の方法。 ９．配列番号１のヌクレオチド１〜417を含む、改変された葉緑体標的配列。