ES2332690B1 - Promotor constitutivo de solanum lycopersicum. - Google Patents
Promotor constitutivo de solanum lycopersicum. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2332690B1 ES2332690B1 ES200802207A ES200802207A ES2332690B1 ES 2332690 B1 ES2332690 B1 ES 2332690B1 ES 200802207 A ES200802207 A ES 200802207A ES 200802207 A ES200802207 A ES 200802207A ES 2332690 B1 ES2332690 B1 ES 2332690B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- promoter
- plant
- fruit
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 title claims abstract description 57
- 235000002560 Solanum lycopersicum Nutrition 0.000 title claims abstract description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 124
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims abstract description 121
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 106
- 101100113507 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cnh-1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 39
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 241000207763 Solanum Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 19
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 9
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 abstract description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 abstract description 5
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 abstract description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 abstract description 3
- -1 sense Proteins 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 33
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 31
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 31
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 31
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 31
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 28
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 26
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 5
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 101100448444 Caenorhabditis elegans gsp-3 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000747028 Cestrum yellow leaf curling virus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 235000019568 aromas Nutrition 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100437104 Drosophila melanogaster AttB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000005078 fruit development Effects 0.000 description 2
- 229940068517 fruit extracts Drugs 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 229940096329 human immunoglobulin a Drugs 0.000 description 2
- 101150026046 iga gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenoxy)-3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-one Chemical compound C1=NC=NN1C(C(=O)C(C)(C)C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 WURBVZBTWMNKQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100438060 Arabidopsis thaliana TZF6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 101150006015 CHN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150092780 GSP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035751 GSP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100393821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GSP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108700006291 Sucrose-phosphate synthases Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002953 anti-rotaviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 101150113908 cnh gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005687 cnh-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 101150094341 gsp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N herniarin Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N herniarin Natural products C1CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- ZLQJVGSVJRBUNL-UHFFFAOYSA-N methylumbelliferone Natural products C1=C(O)C=C2OC(=O)C(C)=CC2=C1 ZLQJVGSVJRBUNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/08—Fruits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Promotor constitutivo de Solanum
lycopersicum.
La presente invención se refiere a una secuencia
promotora (SEQ ID NO:2), derivada de un gen de Solanum
lycopersicum, de función desconocida y denominado CNH1. La
invención está dirigida a las construcciones nucleotídicas,
vectores, células de plantas y plantas transgénicas que comprenden
el promotor de la invención, así como a sus semillas. El promotor
constitutivo de la invención es útil para la expresión génica
sentido, miRNA, antisentido o RNAi de las secuencias de DNA a las
que se fusiona, en todos los órganos de la planta, con niveles
especialmente elevados en el fruto. El promotor es de especial
interés cuando niveles de expresión similares a los obtenidos por el
promotor CaMV 35S son deseados en el fruto durante diferentes
estadios de su desarrollo, pero no de forma tan elevada en el resto
de la planta, especialmente dentro de
Solanaceae/Solanum, permitiendo evitar el empleo de
promotores heterólogos.
Description
Promotor constitutivo de Solanum
lycopersicum.
La presente invención se refiere a una secuencia
del promotor CNH1 (SEQ ID NO:2) derivada de un gen de tomate
Solanum lycopersicum con función desconocida, denominado
CNH1 -de Constitutive No Hits number 1. La invención también
se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores, células de
plantas y plantas transgénicas que comprenden el promotor así como
a las semillas de las mismas. El promotor es de utilidad cuando se
fusiona a secuencias de DNA apropiadas para dirigir la expresión
génica sentido, miRNA, antisentido o RNAi en todos los órganos de la
planta y especialmente con niveles altos en el fruto.
Los promotores son elementos reguladores que
dirigen la expresión de genes. Tanto los promotores constitutivos
como los reguladores se usan para dirigir la expresión génica en
organismos transgénicos incluyendo plantas.
Los promotores constitutivos dirigen la
expresión en la mayoría o en todos los tejidos, y son de utilidad
cuando niveles altos de producción de un producto génico son
deseados en toda la planta. El promotor 35S de virus del mosaico de
la coliflor (VMC) es el promotor que se usa más frecuentemente para
dirigir niveles altos de expresión constitutiva en plantas.
Los promotores reguladores, tales como
promotores inducibles y específicos de tejido, se usan para dirigir
la expresión espacial o temporalmente específica o la expresión en
respuesta a factores ambientales.
Con respecto a promotores constitutivos, de
lejos el promotor CaMV35S es el promotor usado más
frecuente-
mente en biotecnología de plantas (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition,
http://www.cfsan.fda.qov/\simIrd/biocon.html). Diferentes versiones derivadas de este promotor (incluyendo las sintéticas) han sido empleadas (Fang, R.X., Nagy, F., Sivasubramaniam, S. y Chua, N.H. 1989. Multiple cis regulatory elements for maximal expression of the cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenics plants. Plant Cell 1: 141-150; patente US Patent 6072050; patente US Patent 6555673). Se ha demostrado que este promotor es de utilidad para dirigir buenos niveles de expresión cuando es clonado frente a un gen de interés, en casi todas las plantas dicotiledóneas en las que ha sido testado (incluyendo Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Lycopersicon esculentum, Zea mays y Oryza sativa, etc.) (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition, http://www.cfsan.fda.qov/\simIrd/biocon.html). En monocotiledóneas/gimnospermas este promotor 35S no ha sido ampliamente usado, y la preferencia es para el promotor ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA, Quail PH(1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol 18: 675, 689) o el "superpromotor" (Ni M, Cui D, Einstein J, Narasimhulu S, Vergara C, Gelvin S (1995) Strength and Tissue specificity of chimeric promotors derived from octopine and mannopine synthase genes. Plant J 7, 651-676). Se han descrito otros promotores en plantas para conferir niveles moderados de expresión constitutiva, pero no han sido ampliamente usados. Este es el caso del promotor CmYLCV (Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) promoter: a new strong constitutive promoter for heterologous gene expression in a wide variety of crops, Stavolone et al. (2003) Plant molecular biology 53, pp. 663-673) y del promotor constitutivo de tabaco en patente US Patent 5824872, entre otros.
mente en biotecnología de plantas (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition,
http://www.cfsan.fda.qov/\simIrd/biocon.html). Diferentes versiones derivadas de este promotor (incluyendo las sintéticas) han sido empleadas (Fang, R.X., Nagy, F., Sivasubramaniam, S. y Chua, N.H. 1989. Multiple cis regulatory elements for maximal expression of the cauliflower mosaic virus 35S promoter in transgenics plants. Plant Cell 1: 141-150; patente US Patent 6072050; patente US Patent 6555673). Se ha demostrado que este promotor es de utilidad para dirigir buenos niveles de expresión cuando es clonado frente a un gen de interés, en casi todas las plantas dicotiledóneas en las que ha sido testado (incluyendo Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Lycopersicon esculentum, Zea mays y Oryza sativa, etc.) (US Food and Drug Administration for Food Safety and Nutrition, http://www.cfsan.fda.qov/\simIrd/biocon.html). En monocotiledóneas/gimnospermas este promotor 35S no ha sido ampliamente usado, y la preferencia es para el promotor ubiquitina 1 de maíz (Christensen AH, Sharrock RA, Quail PH(1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol 18: 675, 689) o el "superpromotor" (Ni M, Cui D, Einstein J, Narasimhulu S, Vergara C, Gelvin S (1995) Strength and Tissue specificity of chimeric promotors derived from octopine and mannopine synthase genes. Plant J 7, 651-676). Se han descrito otros promotores en plantas para conferir niveles moderados de expresión constitutiva, pero no han sido ampliamente usados. Este es el caso del promotor CmYLCV (Cestrum yellow leaf curling virus (CmYLCV) promoter: a new strong constitutive promoter for heterologous gene expression in a wide variety of crops, Stavolone et al. (2003) Plant molecular biology 53, pp. 663-673) y del promotor constitutivo de tabaco en patente US Patent 5824872, entre otros.
En el género Solanum (incluye tomate,
patata, pimiento, tabaco, etc.) casi todas las expresiones llevadas
a cabo bajo promotores constitutivos hicieron uso del promotor
CaMV35S. En algunos casos puede ser deseable diseñar mediante
ingeniería una secuencia de DNA o un gen de interés sometido a un
promotor que un menor nivel en los tejidos vegetativos de modo que
no compromete el crecimiento de la planta, siendo el promotor capaz
de dirigir niveles altos de expresión en el fruto para producir la
modificación deseada en este órgano (es decir afectando a las
características del fruto o acumulación de una proteína extraña).
También han sido descritos promotores específicos de fruto de
tomate, tal como E8 (Nicholass et al, 1995), PG (Bañaren
et al, 1991), 2A11 (Deikman et al, 1992), que dirigen
la expresión génica en el fruto. Sin embargo funcionan de modo
preferencial durante el desarrollo tardío del fruto, especialmente
durante la maduración, y por tanto no cubren los estadios de
desarrollo del fruto restantes en los que dirigir la expresión de un
gen recombinante podría ser deseable.
Por tanto, la identificación de un promotor
alternativo que preferentemente confiera altos niveles de expresión
en el fruto durante diferentes estadios de desarrollo, pero con un
nivel de expresión menor en los tejidos vegetativos es altamente
deseable.
Casos especiales son los promotores obtenidos a
partir de las mismas especies que van a ser modificadas o de
especies sexualmente compatibles. Esto resulta particularmente
importante cuando se desea un enfoque de "cisgenesis" o
"intragenesis" en vez de un enfoque transgénico. Por
"Cisgenesis" se entiende una modificación genética (= GM;
normalmente mediante técnicas de DNA recombinante) de plantas con
una secuencia de DNA o gen de la misma planta de cultivo que va a
ser transformada o de plantas donadoras sexualmente compatibles que
pueden usarse en el cultivo de plantas tradicionales. En la
práctica, se restringe a genes que codifican para características
heredadas de modo dominante. El gen pertenece al conjunto de genes
del cultivador. La planta modificada genéticamente con cisgenes es
una planta cisgénica (Cisgenic plants are similar to
traditionnally bred plants. Schouten, H.J., Krens, F.A., Jacobsen,
E., 2006. EMBO Reports 7: 750-753; "Cisgenic"
as a product designation, Schubert D & Williams D. 2006.
Nature Biotechnology 24: 1327-1329. A diferencia de
un transgén, que se define como un gen o secuencia de DNA de
especies no sexualmente compatible o una secuencia de DNA o gen
sintético. La planta modificada genéticamente correspondiente que
contiene transgenes es una planta transgénica.
Por tanto, la identificación de un promotor
constitutivo de tomate que preferiblemente funcione en el fruto en
diferentes estadios de su desarrollo es altamente deseable ya que
facilitaría enfoques cis o intragénicos eficientes. Esto resultaría
especialmente interesante cuando se requieren niveles altos de
expresión en el fruto en estadios de desarrollo diferentes de la
maduración.
El promotor descrito en el presente documento
puede ser usado en todas las especies de plantas como alternativa a
CaMV35S pero es de especial aplicación en el género Solanum
para conferir expresión constitutiva de genes o secuencias de DNA
de interés con niveles particularmente altos en el fruto, en todos
los estadios de desarrollo. En el caso de cisgenesis o
intragenesis, cualquier característica deseada debido a un alelo
dominante disponible en el conjunto génico en las especies
sexualmente compatibles puede ser aislada, posteriormente sometida
al control del promotor CNH y ser introducida en tomate o especies
relacionadas para conferir la característica de interés.
La presente invención proporciona un promotor
que dirige niveles altos de expresión de genes o secuencias de DNA
en plantas, especialmente altos en el fruto. Este promotor deriva
de un gen de función desconocida de Solanum lycopersicum que
se expresa de modo ubicuo en toda la planta. Este promotor de tomate
puede ser de especial interés para dirigir la expresión de genes o
secuencias de DNA de interés de especies relacionadas dentro de
Solanaceae/Solanum (el tomate pertenece a este
género) de modo que pueden lograrse niveles altos de expresión
(similares a CaMV35S en el fruto) sin necesidad de usar promotores
heterólogos y por tanto es de interés para la introducción dirigida
de genes" dentro de Solanaceae/Solanum usando una
estrategia en la que todas las secuencias son de
Solanaceae/Solanum".
Adicionalmente, según la presente invención, el
promotor de la invención, derivado de CNH1, puede dirigir niveles
altos de expresión constitutiva de secuencias de DNA o genes
heterólogos en plantas, especialmente cuando los niveles más altos
son deseados en el fruto. El promotor de la presente invención es de
utilidad cuando niveles de expresión similares a los obtenidos por
el promotor CaMV 35S son deseados en el fruto durante diferentes
estadios de su desarrollo, pero no de forma tan elevada en el resto
de la planta.
La presente invención se refiere a un promotor
aislado derivado de un gen de tomate Solanum lycopersicum
con función desconocida. En una realización particular este gen es
el gen CNH. En otra realización particular, el promotor presenta al
menos el 70% de identidad con la secuencia de SEQ ID NO:2. Este
promotor es de especial utilidad fusionado a secuencias de DNA
apropiadas, para dirigir la expresión génica constitutiva sentido,
miRNA, antisentido o RNAi en la mayoría de los tejidos de plantas
principales durante todos sus ciclos de vida, pero con niveles
especialmente altos en el fruto.
Este promotor de tomate puede ser de especial
interés para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de
interés de especies relacionadas dentro de la especie
Solanaceae/Solanum a la que pertenece el tomate,
pudiendo obtenerse altos niveles de expresión (similares a los
obtenidos en el fruto a través del promotor CaMV35S, pero menores a
los obtenidos a través del mismo en el resto de tejidos de la
planta), sin la necesidad de emplear promotores heterólogos. Es
decir, el promotor de la invención presenta interés en la producción
de "targeted introgression of genes" en
Solanaceae/Solanum empleando "the all
Solanaceae/Solarium strategy".
Adicionalmente, el promotor de la invención
derivado de CN1H, permite la expresión en plantas, con preferencia
en el fruto, no sólo de genes o secuencias de DNA endógenas sino
también de genes heterólogos o secuencias de DNA, en orientación
sentido o antisentido, para conseguir sobreexpresión o
silenciamiento de la expresión de dichos genes. Estos genes pueden
ser genes o secuencias de DNA de plantas, específicos del fruto, o
genes o secuencias hetorólogas cuya expresión se desea en el
fruto.
El promotor CNH1 de la invención es efectivo en
la planta Tomato lycopersicum de la cual deriva, en otras
especies del género Solanaceae/Solanum, así como en
otras plantas que presentan frutos.
Así, el promotor de la invención es ideal para
aplicaciones en las que una expresión ubicua de un gen o una
secuencia de DNA (endógenos o heterólogos) es deseada en la planta,
pero con niveles más altos en el fruto, cuando niveles de expresión
similares a los obtenidos por el promotor CaMV35S son deseados en el
fruto pero no de forma tan elevada en el resto de la planta, y
cuando más de un promotor constitutivo es necesario para expresar
dos o más proteínas recombinantes en una planta de forma concertada
y preferentemente en el fruto.
El promotor de la invención es útil en
estrategias del tipo "plantas biofactoría" en las que el fruto
se utiliza como plataforma para la producción recombinante de
proteínas que albergan por sí mismas actividad biológica o
terapéutica al ser administradas por vía oral, o que regulan o
catalizan la producción de otros compuestos metabólicos con
actividad biológica o terapéutica por vía oral (vacunas orales,
tolerógenos, biocidas, anticuerpos neutralizantes, adyuvantes,
compuestos antioxidantes, vitaminas, aromas, suplementos
dietéticos); en la producción de complejos multiproteicos que
requieran expresar de forma concertada dos o más genes con
distintos promotores constitutivos para evitar reordenaciones
génicas y/o procesos de silenciamiento génico; en la adquisición de
fenotipos de resistencia a patógenos, para la modificación de la
arquitectura del fruto otorgando a la planta y al fruto distintas
propiedades en función del gen o secuencia nucleotídica que se
exprese bajo su control.
1. Promotor es un elemento regulador que
dirige la expresión de genes.
2. Promotor constitutivo se refiere a
aquellos promotores que dirigen expresión en la mayoría o todos los
tejidos y son de utilidad cuando niveles altos de producción de un
producto génico son deseados en toda la planta.
3. Promotores regulados, promotores
específicos de tejido e inducibles, son aquellos empleados para
dirigir la expresión específica espacial o temporalmente, o la
expresión en respuesta a factores ambientales.
4. Genes y secuencias de DNA de interés
se refiere a aquellos genes y secuencias que codifican para
péptidos de interés que pueden ser usados junto con el promotor
CNH1 de la invención. Se refieren a secuencias y genes de plantas de
Solanum lycopersicum, de plantas del género Solanum o
cualquier gen o secuencia heterólogos, o sintéticos. Dichos genes y
secuencias incluyen, pero no se limitan a genes implicados en la
modificación de la maduración; genes implicados en conferir
resistencia a hongos; genes relacionados con patogénesis de plantas;
genes implicados en conferir resistencia frente a insectos; genes
que son efectivos en la modulación de la floración, aroma,
modificación de color, enzimas u otros productos catalíticos (tales
como: ribozimas o anticuerpos catalíticos que modifican procesos
celulares en plantas), producción de etileno (tal como: moléculas
antisentido, enzimas que degradan precursores de la biosíntesis de
etileno, productos catalíticos o moléculas de silenciamiento),
genes para el control de hongos, producción o niveles de hormonas
de planta, el ciclo celular o la división celular, y acumulación de
sacarosa (tal como el gen de la sacarosa fosfato sintasa). Genes y
secuencias de interés se refiere también a aquellos genes y
secuencias que codifican para péptidos o proteínas que pueden ser
usados en "molecular pharming" para la producción recombinante
de proteínas que albergan por sí mismas actividad biológica o
terapéutica o que regulan o catalizan la producción de otros
compuestos metabólicos con actividad biológica o terapéutica
(vacunas orales, tolerógenos, biocidas, anticuerpos neutralizantes,
adyuvantes, compuestos antioxidantes, vitaminas, aromas, suplementos
dietéticos).
5. Gen o Secuencia Heteróloga: Gen o
secuencia nucleotídica de origen sintético u obtenido del genoma de
animales o vegetales de género distinto a Solanum.
6. Gen o Secuencia Endógena: Gen o
secuencia nucleotídica contenida originalmente en todo o en parte
en el genoma de una o más especies del Género Solanum.
7. Planta transformada genéticamente se
refiere a aquellas plantas de Solanum lycopersicum, del
género Solanum, o cualquier planta de fruto que haya sido
transformada con una construcción génica que comprenda el promotor
de la invención fusionado al gen o secuencia de DNA de interés.
8. Plantas Biofactorías (Molecular
pharming) se refiere a la modificación, mediante técnicas de
ingeniería genética, del contenido substancial de las plantas con
objeto de enriquecerlo en uno o más compuestos que les confieran
valor añadido. Entre las secuencias de DNA cuya expresión puede
estar dirigida por el promotor de la invención, para su posterior
empleo en molecular pharming se incluyen subunidades vacunales de
origen vírico o bacteriano, péptidos o proteínas con actividad
tolerogénica, péptidos, proteínas con actividad adyuvante o
inmunomoduladora, biocidas, inmunoglobulinas, enzimas o proteínas
reguladoras que catalicen o potencien la producción de metabolitos
con actividad biológica o terapéutica, etc.
El objeto de la presente invención se refiere al
promotor del gen CNH1, que comprende la secuencia SEQ.ID.NO.2 o al
menos una secuencia que presenta el 70% de identidad con
SEQ.ID.NO.2, que dirige la expresión de secuencias o genes de
interés en altos niveles en todos los tejidos de la planta,
especialmente en el fruto, durante los distintos estadios de
desarrollo. En una realización particular, la expresión dirigida
por este promotor en el fruto es similar a la proporcionada por el
promotor constitutivo CaMV35S, y al menos un orden de magnitud
inferior, preferentemente de 3 a 6 veces menor, en el resto de la
planta.
Otro objeto de invención se refiere a
construcciones nucleotídicas que comprenden el promotor de la
invención operativamente fusionado a un gen o secuencia de DNA que
codifica para un péptido de interés.
En una realización particular dicho péptido de
interés tiene aplicación en "molecular pharming". En otra
realización particular el péptido de interés tiene aplicación en la
producción de un medicamento. En otra realización particular, dicho
gen o secuencia de DNA codifica proteínas o péptidos endógenos de la
especie Solanum. En otra realización particular, dicho gen o
secuencia de DNA codifica para proteínas o péptidos heterólogos a
la especie Solanum (proteínas vegetales, animales o
sintéticas). En otra realización particular, dicho gen o secuencia
de DNA codifica para inmunoglobulinas, concretamente para la
Inmunoglobulina A.
Otro objeto de invención se refiere a los
vectores que contienen la secuencia nucleotídica de la
invención.
Otro objeto de invención está dirigido a las
células de plantas que contienen la construcción nucleotídica de la
invención.
Otro objeto de invención se refiere a las
plantas modificadas genéticamente que comprenden la construcción de
la invención.
En una realización particular dichas plantas son
plantas de Solanum lycopersicum, o plantas del género
Solanum.
En otra realización particular, dichas plantas
comprenden cualquier planta de fruto.
Otro objeto de invención se refiere a las
semillas de las plantas modificadas genéticamente.
Otro objeto de invención se refiere al fruto de
las plantas modificadas genéticamente.
Otro objeto de la invención se refiere al uso
del promotor para dirigir la expresión de genes de interés en
plantas caracterizado porque dicha expresión se produce en altos
niveles en toda la planta, con niveles mayores en el fruto durante
los distintos estadios de desarrollo.
Otro objeto de invención se refiere al uso del
promotor para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de
interés en plantas cuando más de un promotor constitutivo es
necesario para expresar dos o más proteínas recombinantes de forma
concertada y preferentemente en el fruto.
Otro objeto de invención se refiere al uso del
promotor en estrategias de tipo "plantas biofactoría".
Otro objeto de invención se refiere a
SEQ.ID.NO:2.
La invención proporciona los métodos para
obtener las plantas transgénicas y la progenie de las mismas que
comprenden la construcción y partes de tales plantas,
Figura 1. Muestra los valores de expresión
relativos del mRNA de CNH1 en diferentes tejidos de la planta de
tomate, calculados mediante PCR cuantitativa. En esta
representación, a los niveles de mRNA observados en ovarios en el
estadio de antesis se les asignó arbitrariamente un valor igual a
uno.
Figura 2. Representa el vector de expresión
pCNH1::GFPGUS. El vector de expresión incluye el promotor CNH1 en
sentido 5' de las secuencias fusionadas GFP-GUS y
resistencia a kanamicina para selección de semilla entre los bordes
derecho e izquierdo (RB y LB respectivamente). La resistencia a la
espectinomicina es para la selección de cultivos.
Figura 3. Muestra los valores resultantes de la
cuantificación de la actividad específica glucuronidasa (GUS)
conferida por la construcción pCNH1: GFPGUS en diferentes órganos
de la planta de tomate. Se comparan estos valores con la actividad
específica conferida por la construcción 35S::GFPGUS en otra planta
de la misma especie. La actividad específica de la glucuronidasa
(GUS) presente en los extractos crudos de tejido vegetal se
representa como nanomoles del producto
metil-umbeliferona generadas por el enzima GUS por
minuto y por miligramo de proteína total presente en el
extracto.
Figura 4. Muestra una tinción histoquímica de
actividad GUS en secciones de tomates en diferentes estadios de
desarrollo. De izda a dcha se muestran frutos en expansión (15 días
post-antesis), frutos en estadio
verde-maduro (35 días post antesis), frutos en
estadio pintón y frutos rojos respectivamente. En el apartado A se
muestran frutos transformados con la construcción pCNH1::GFPGUS. En
el apartado B se muestran frutos transformados con la construcción
CaMV35S::GFPGUS.
Figura 5. Muestra en valores relativos y
mediante experimentos de expresión transitoria en fruto, la
potencia del promotor CNH1 para dirigir la acumulación de la
proteína fluorescente verde (GFP) en fruto verde y maduro y la
compara con la actividad del promotor 35S en los mismos órganos y
estadios fisiológicos. Se agroinyectaron los frutos o bien con una
mezcla (1:1) de las construcciones CaMV35S:GFP/GUS y CaMV35S:DsRed
(muestras etiquetadas 35S) o bien con una mezcla (1:1) de las
construcciones pCNH1:GFPGUS y CaMV35S:DsRed (muestras etiquetadas
CNH1). (Figura 5A) Imagen de escaneo de muestras de frutos 35S y NH
que presentan fluorescencia verde como resultado de una
transformación transitoria. (Figura 5B) Ratio de fluorescencia
verde/roja de muestras diferentes como medida de la fuerza relativa
del promotor en cada estadio fisiológico. (MG) frutos recogidos en
el estadio verde-maduro; (Br) frutos recogidos en
el estadio pintón.
Figura 6. Representa una construcción
nucleotídica en la que se emplea el promotor CNH1 para la
producción recombinante en tomate, preferentemente en frutos y en
estadios previos a la maduración, de una inmunoglobulina A con
actividad de unión frente al péptido VP8* de rotavirus. La
inmunoglobulina A consta de dos cadenas polipeptídicas, ligera y
pesada. La cadena pesada se sitúa bajo el control de un promotor
constitutivo derivado de CaMV35S, mientras que el promotor CNH1
dirige la expresión de la cadena ligera. La construcción consta de
un vector derivado de pK7GW con resistencia a Spectinomicina
(Sm/SpR) y que incluye los siguientes elementos: RB: borde derecho;
LB: borde izquierdo; KanR: gen de resistencia a kanamicina como
marcador de selección en el proceso de transformación; attB1,
attB4, attB3 y attB2: pequeñas secuencias de recombinación
subproducto del mecanismo de clonación empleado en la construcción
del fragmento (recombinación homóloga mediada por clonasa LR); 35S:
doble promotor constitutivo derivado de CaMV35S; SP: péptido señal
para dirigir la entrada de la proteína subsiguiente en el sistema
de endomembrana celular, donde resultan más estables las
inmunoglobulinas; IgH: secuencia nucleotídica de una cadena pesada
de una inmunoglobulina humana con afinidad frente a VP8*, NosT:
terminador de la trascripción del gen de la nopalina sintasa; CNH1:
el promotor de la presente invención; IgL: la secuencia nucleotídica
de una cadena ligera de inmunoglobulina A humana. Las flechas
indican marcos de lectura abiertos.
Figura 7. Western blot en condiciones
desnaturalizantes, no reductoras de extractos crudos de frutos de
tomate agroinfectados con el fragmento de T-DNA de
la figura 6 (carril 1); frutos agroinfectados con una construcción
no relacionada (carril 2); hojas agroinfectadas con el fragmento de
T-DNA descrito (carril 3).
Figura 8. Actividad Anti-VP8*
extractos crudos de tomates agroinyectados con el fragmento de
T-DNA de la figura 6. Se incubaron placas de ELISA
cubiertas con VP8 con diluciones de extractos crudos y se
desarrollaron con anticuerpo
anti-IgA-HRP humano. Barras
blancas: CNH1 que contiene construcción de T-DNA.
Barras negras: construcción de T-DNA no
relacionada.
Figura 9. Secuencia del fragmento del promotor
CNH1 empleado para la construcción de
pCNH1-GUS/GFP. La figura muestra como la secuencia
del cebador GSP3 usada para la amplificación sin el fragmento de
recombinación está destacada.
Los avances en ingeniería genética han
proporcionado las herramientas necesarias para trasformar plantas
que contengan genes extraños. Ahora es posible producir plantas que
tienen características únicas de importancia en el procesamiento
agronómico y la cosecha. La capacidad de elegir los tejidos en los
que se expresan tales genes extraños y el tiempo durante el
crecimiento de la planta para obtener expresión resulta posible
mediante la elección del promotor, la secuencia reguladora que
activa el gen.
Para seleccionar el gen putativo a partir del
cual obtener el promotor constitutivo de la invención, se construyó
una biblioteca de cDNA de fruto de tomate usando el kit de
construcción de biblioteca de cDNA lambda ZAPII (Stratagene,
LaJolla, Calif.). Se convirtió la biblioteca de cDNA en una
biblioteca de plásmido mediante escisión en masa, y se sembraron en
placa clones bacterianos y réplicas de esta biblioteca
correspondientes a alrededor de 5.000 clones se obtuvieron sobre
filtros (siguiendo Maniatis, Sambrook y Fritsch 1982).
Cada filtro de réplica se hibridó entonces con
sondas de cDNA preparadas a partir de dos muestras que
representaban frutos reunidos en diferentes estadios de desarrollo
y tejidos vegetativos reunidos de Solanum lycopersicum. Se
usó la técnica de cebador de secuencia aleatoria PCR
(RP-PCR - random primed PCR) descrita por Li
Z y Thomas TL. (PEI1, an Embryo-Specific Zinc
Finger Protein Gene Required for Heart-Stage Embryo
Formation in Arabidopsis, 1998, Plant Cell 10:383) para marcar
las sondas de cDNA. Se usó la hibridación de cada colonia a cada
sonda para determinar las colonias que representan genes
constitutivos o específicos de tejido putativos. Se identificaron
los clones constitutivos putativos y se sometieron a
caracterización adicional. Se determinó la identidad de cada clon
mediante secuenciación de DNA y búsquedas en bases de datos.
El clon denominado CNH1 fue seleccionado entre
los clones constitutivos putativos elegidos para caracterización
adicional basándose en sus altos niveles de expresión, revelados
mediante el análisis RNA dot blot. El análisis Northern blot mostró
que CNH1 se expresa en altos niveles en el conjunto de muestras
tanto vegetativas como de fruto. La RT-PCR
cuantitativa confirmó que CNH1 se expresó en todos los tejidos
analizados, pero especialmente en el fruto (figura 1). La figura 1
muestra los niveles de expresión relativos de CNH1 en distintos
tejidos, tomando como referencia los niveles de expresión en
ovarios en antesis. Se observan niveles de expresión similares en
raíces, hojas, plántulas, y ``ovarios a 5 días
post-antesis (5dpa), y fruto rojo, mientras que los
niveles son especialmente altos en el fruto verde, similares a los
que se obtienen con el promotor Ca35S (entre 3 y 6 veces más altos
que en los tejidos vegetativos).
El análisis de secuencia indicó que CNH1
codificó para un gen de función desconocida, y que CNH1 corresponde
a un gen identificado como no positivo en un proyecto de
secuenciación de cDNA denominado SGN-U212704.
Con el fin de aislar el promotor CNH1, fue
necesario emplear un método simple para clonar secuencias de DNA
genómico desconocidas adyacentes a una secuencia conocida, y en
este caso se llevó a cabo una aproximación de "paseo genómico",
usando el kit universal GenomeWalker^{TM} (Clontech). Usando los
fragmentos de DNA genómico, la primera etapa fue construir
conjuntos de fragmentos de DNA genómico ligado a adaptador, no
clonado, denominadas "bibliotecas Genome Walker". Para ello,
el DNA de partida debe estar bien limpio y presentar un peso
molecular promedio alto, dado que se consideró como el método más
adecuado para obtener este DNA a partir de tejidos jóvenes como los
presentes en plántulas de tomate.
Alícuotas separadas de DNA fueron completamente
digeridas con enzimas de restricción diferentes que dejaron
extremos romos y posteriormente, cada lote de DNA genómico digerido
se ligó por separado a un adaptador diseñado. En este caso, los
adaptadores fueron proporcionados por el kit.
\newpage
Después de que se construyeran las bibliotecas,
se realizaron dos amplificaciones mediante PCR. La primera o PCR
primaria requirió un cebador de adaptador externo (AP1, SEQ. ID.
NO.O: 4) que se proporcionó en el kit, y un cebador específico de
gen externo (GSP1, SEQ. ID. NO.O: 5) diseñado a partir de la
secuencia de gen conocida 5'UTR. Entonces se diluyó la mezcla de
PCR primaria y se usó como molde para una PCR secundaria o
"anidada" con el cebador adaptador anidado (AP2, SEQ. ID.
NO.O: 6) también proporcionado en el kit, y un cebador específico
para gen "anidado" (GSP2, SEQ. ID. NO.O: 7), que se diseñó
tomando una parte de secuencia GSP1 (SEQ. ID. NO.: 5) y yendo en el
sentido 5' a través del gen 5'UTR. El producto más grande (en
tamaño) de esta PCR secundaria, que comprende una secuencia
conocida en el extremo 5' de GSP2 (SEQ. ID. NO. 7) y que se extiende
en el DNA genómico desconocido adyacente, se clonó en el vector pCR
2.1 -TOPO. Como sistema de clonaje, se propuso el empleo de un
sistema clásico usando enzimas de restricción para colocar el
fragmento de promotor aislado en el sentido 5' de o bien el gen
indicador GUS o bien GFP lo que hubiera permitido comprobar la
actividad del promotor. En lugar de esto, se usó el sistema Gateway
que permite transferir fácilmente el fragmento de promotor en una
variedad de diferentes sistemas de análisis a través de reacciones
de recombinación de alta eficiencia. Los sistemas de clonaje
Gateway, basados en recombinación homóloga, se han vuelto una
alternativa popular a los métodos tradicionales de clonaje basados
en ligasa T4 para la construcción de casetes de expresión de planta
("GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated
plant transformation", Karimi M, Inzé D y Depicker A.,
Trends Plant Sci, 2002, 7: 192-195). En este
caso, se realizó una reacción PCR usando dos cebadores altamente
purificados y largos (attB1-GSP3 (SEQ. ID. NO.O: 8,
10) y attB2-GSP2 (SEQ.ID.NO: 9, 7)) conteniendo
cada uno de ellos una secuencia de recombinación especifica. Tras
una primera reacción de recombinación denominada "reacción BP"
usando el vector pDONR221, se formó un vector que contiene la
secuencia de promotor flanqueada por los sitios de recombinación
attL1 y attL2, y denominado "vector pEntry". En este momento
una segunda reacción de recombinación denominada "reacción LR"
se realizó entre el vector pEntry y el vector pKGWFS7,0 (Plant
Systems Biology, Ghent University), dando lugar al vector que se
denominó vector "pDestination" y que contiene los sitios de
recombinación específicos attR1 y attR2.
Tras esta segunda reacción, se logró un vector
denominado vector "pExpression" que contiene el fragmento de
promotor en el sentido 5' de una secuencia GFP-GUS.
Usando como vector de destinación pKGWFS7,0 que contiene un
fragmento fusionado de GFP-GUS SEQ.ID.NO: 11 pudo
comprobarse la actividad tanto de GFP como de GUS usando el mismo
vector pExpression, lo cual también permitió seleccionar plantas de
tomate transformadas debido a su resistencia a kanamicina de la
semilla. Finalmente, se introdujo el vector pExpression
(pCNH1::GFPGUS, SEQ. ID. NO: 12) en A. tumefaciens LBA4404
para la transformación estable de la planta de tomate (Ellul P,
Garcia-Sogo B, Pineda B, Ríos G, Roig LA, Moreno V.
(2003), The ploidy level of transgenics plants in
Agrobacterium-mediated transformation of tomato
cotyledons (Lycopersicon esculentum Mill.) is
genotype and procedure dependent, Theor Appl Genet. 2003 Jan;
106(2):231-8.
El ensayo fluorométrico de GUS confirmó el
patrón de expresión de este promotor, demostrando la expresión de
GUS, en todos los tejidos de plantas, pero especialmente en tejidos
de fruto.
En paralelo, para acortar el tiempo para el
análisis de la actividad del promotor en frutos, se eligió la
expresión génica transitoria mediada por Agrobacterium
mediante agroinyección en frutos de tomate (Orzaez D, Mirabel S,
Wieland WH, Graneil A. (2006), Agroinjection of tomato fruits. A
tool for rapid funtional analysis of transgenes directly in
fruit, Plant Physiol. 2006 Jan;
140(1):3-11.). Con este fin se introdujo
pCNH1::GFPGUS en A. tumefaciens C58 para estos ensayos de
expresión transitoria y se inyectó conjuntamente con disolución de
pBIN 35S: DsRed transformada por Agrobacterium. Se
exploraron pedazos de diferentes frutos para obtener valores
relativos de fluorescencia GFP/DsRed.
Este ensayo de agroinyección de
pCNH1-GUS/GFP confirmó de nuevo el patrón de
expresión mediado por el promotor CNH1, mediante la detección de
fluorescencia de GFP, en todos los tejidos de plantas, pero
especialmente en tejidos de fruto.
Estos ejemplos demuestran la capacidad del
promotor CNH1 para dirigir la expresión de genes o secuencias de
DNA de interés en plantas.
Para la transformación de la planta, un DNA de
doble cadena que contenga el promotor de la invención puede ser
introducido en el genoma de la planta por cualquier metodología
adecuada. Ello incluye la infección de tejido vegetal con cultivos
de Agrobacterium transformados con plásmidos derivados de
Agrobacterium tumefaciens. También incluye el uso de
liposomas, electroporación, tratamientos químicos, bombardeo de
partículas u otros métodos alternativos para introducir DNA en el
interior de las células, o la transformación mediada por virus o
polen.
Un vector especialmente útil es pKGWO (Karamini
et al, 2002), derivado de pPZP200 (Hajdukiewicz et
al, 1994), que incluye un marcador de resistencia a Kanamicina
(Hellens et al, 2000) y un cassette gateway (Invitrogen life
technologies) para facilitar el clonaje por recombinación homóloga,
todo ello comprendido entre las secuencias conocidas como right
border y left border y que delimitan el fragmento de integración en
el genoma de la planta. Otros vectores conocidos en el estado de la
técnica podrían ser empleados.
Cuando se obtiene un número suficiente de
células que han integrado un gen de interés dirigido por el
promotor de la presente invención, las células son regeneradas en
plantas enteras usando un protocolo de regeneración apropiado a la
planta huésped.
El promotor de la invención es de utilidad en
aplicaciones en las que la expresión constitutiva fuerte de un gen
o una secuencia de DNA (endógenos o heterólogos) es deseada en
todos los tejidos de la planta, especialmente en el fruto en
diferentes estadios de desarrollo, cuando niveles de expresión
similares a los obtenidos por el promotor 35 S son deseados en el
fruto pero no de forma tan elevada en el resto de la planta.
En función del gen o secuencia de DNA de interés
cuya expresión sea dirigida a través del promotor CNH1, dicho
promotor puede ser útil en "molecular pharming approaches"
para inmunización oral, como factoría de proteínas que albergan por
sí mismas actividad biológica o terapéutica por vía oral o que
regulan o catalizan la producción de otros compuestos metabólicos
con actividad biológica o terapéutica por vía oral (vacunas orales,
tolerógenos, biocidas, anticuerpos neutralizantes, adyuvantes,
compuestos antioxidantes, vitaminas, aromas, suplementos
dietéticos); en la producción de complejos multiproteicos que
requieran expresar de forma concertada dos o más genes con
distintos promotores constitutivos para evitar reordenaciones
génicas y/o procesos de silenciamiento génico; en la adquisición de
fenotipos de resistencia a patógenos, para la modificación de la
arquitectura del fruto otorgando a la planta y al fruto distintas
propiedades en función del gen o secuencia nucleotídica que se
exprese bajo su control.
Tal como se indicó, el procedimiento se inició
aislando DNA genómico de plántulas de tomate crecidas en la
oscuridad. Se llevó a cabo la extracción de DNA genómico usando el
minikit Dneasy Plant (Qiagen) y siguiendo el protocolo del
fabricante.
A partir de este DNA genómico, se hicieron
varios grupos de DNA unidos a adaptadores y denominados
"bibliotecas". Con este fin se realizaron cuatros digestiones
de DNA separadas usando cuatro enzimas de restricción diferentes,
EcoRV, DraI, PvulI y SspI. Se realizó la digestión de DNA a 37ºC
durante la noche usando 80 unidades de cada enzima de restricción,
2,5 \mug de DNA genómico, 1x tampón de enzima de restricción en
un volumen total de 100 \mul. Se purificaron los fragmentos
digeridos usando un volumen igual de fenol, transfiriendo la fase
acuosa a un tubo nuevo y aplicando un volumen igual de cloroformo.
Se aisló la fase acuosa resultante y dos volúmenes de etanol al 95%
frío, 1/10 volumen de NaOAc 3 M (pH 4,5) y se añadieron 20 \mug
de glicógeno. Tras centrifugar a 14000 rpm durante 15 minutos, se
lavó el sedimento obtenido usando etanol al 80% helado y tras el
secado al aire, se disolvió el sedimento en 20 \mul de TE (10/0,1,
pH 7,5). Se ligaron los fragmentos de DNA de cada grupo de
digestión a adaptadores de 48 pb (SEQ.ID.NO: 3) a ambos lados. Se
llevaron a cabo las ligaciones de DNA usando una ligasa T4 en una
reacción durante la noche a 16ºC y se pararon las reacciones a 70ºC
durante 5 minutos.
Tras la construcción de las bibliotecas, se
realizaron dos reacciones de PCR para cada biblioteca usando dos
cebadores diseñados a partir del adaptador, un primer cebador
denominado AP1 (SEQ.ID.NO: 4) y un segundo cebador anidado
denominado AP2 (SEQ.ID.NO: 6). La primera reacción de PCR requirió
el cebador AP1 y un primer cebador específico de gen (GSP1)
(SEQ.ID.NO: 5) que se diseñó de modo que su secuencia empezó en la
posición -4 y contenía el codón ATG de CNH1.
Se diluyó el producto de PCR 1:50 y se usó para
una segunda reacción de PCR usando el cebador adaptador anidado
(AP2) (SEQ.ID.NO: 6) y un segundo cebador específico para gen
(GSP2) diseñado a partir de la posición -37 (SEQ.ID.NO: 7).
Se usó la mezcla Advantage Genomic Polymerase
(Clontech) para reacciones de PCR. Primera serie de reacciones de
PCR: (94ºC, 25 s/72ºC, 3 min.) x 5 ciclos, (94ºC, 25 s/67ºC, 3
min.) x 32 ciclos, (67ºC, 7 min.) x 1 ciclo. Tras esta serie, se
usaron 5 \mul para comprobar fragmentos haciendo pasar un gel de
agarosa al 1,5% TAE1x, y sólo en aquellos casos sin producto de PCR
se realizaron 5 ciclos adicionales (94ºC, 25 s/67ºC, 3 min.). Se
diluyó este primer producto de PCR 1:50 y una segunda serie de
reacciones de PCR siguieron: (94ºC, 25 s/72ºC, 3 min.) x 5 ciclos,
(94ºC, 25 s/67ºC, 3 min.) x 20 ciclos, (67ºC, 7 min.) x 1 ciclo.
Como resultado de esta reacción de PCR
secundaria usando el cebador AP2 (SEQ.ID.NO: 6) y el cebador GSP2
(SEQ.ID.NO: 7), se observó el mayor producto de PCR (3,7 kb) en la
biblioteca EcoRV, que se comprobó haciendo pasar en un gel de
agarosa al 1,2% TAE1x y se extrajo. Se llevó a cabo la purificación
de la banda resultante usando el kit de extracción en gel MinElute
(Qiagen) y siguiendo el protocolo del fabricante, así se obtuvo un
volumen final eluido de 10 \mul. Se clonó el fragmento en un TOPO
TA vector de clonaje pCR 2.1-TOPO (Invitrogen) y se
usó el cebador AP2 (SEQ.ID.NO: 6) para la secuenciación de la
región 5' del fragmento clonado. Se obtuvo un fragmento genómico de
3,7 kb y tras la secuenciación se encontró que presenta 97 pares de
bases de la región transcrita en sentido 5'
SGN-U212704 así como sus secuencias promotoras
novedosas. Esto confirmó que de hecho, se ha aislado una secuencia
de DNA en sentido 5' del gen CHN1. SEQ ID NO: 1 muestra un
fragmento de 3711 pb que oscila desde la posición -7 (esto es, a 7
pares de bases en sentido 5') del sitio de inicio de traducción
putativo de CNH1. La secuencia que corresponde al adaptador Genome
Walker también se ha destacado en la secuencia.
Para facilitar el clonaje de un fragmento de
promotor necesario para ser usado posteriormente para dirigir la
expresión de genes endógenos o heterólogos o secuencias de DNA se
siguió una estrategia de clonaje Gateway. Para esto se diseñó un
oligocebador GSP3 adicional en el sentido de 3' de la secuencia de
adaptador para añadir la secuencia de recombinación attB1
(SEQ.ID.NO: 8) a la secuencia autentica en el sentido 5'. La SEQ ID
NO: 2 muestra la secuencia resultante de 3657 pb del fragmento de
promotor usado en la construcción de pCNH1-GUS/GFP
para dirigir la expresión de genes endógenos o heterólogos o
secuencias de DNA en plantas tal como sigue.
Se amplificó el fragmento de promotor de 3657 pb
mediante PCR usando una parte del cebador GSP2 unido a una
secuencia de recombinación attB2 (SEQ.ID.NO: 9) y GSP3 (SEQ.ID.NO:
10). La secuencia de cebador GSP3 usada para amplificación sin el
fragmento de recombinación está destacada en la Figura 9. Se
recombinó el fragmento así obtenido en una reacción BP con el vector
pDONR221 para proporcionar un vector pEntry. Para hacer esto, se
realizó una reacción a 25ºC según las instrucciones del fabricante
(Invitrogen), usando entre 15 y 150 ng del producto de PCR, 1
\mul de pDONR221, tampón TE y 1X mezcla de reacción BP Clonasell.
Tras una hora, se añadió 1 \mul de proteinasa K y se incubó la
reacción a 37ºC durante 10 minutos. Se trasformaron células
competentes de E. coli TOP 10 y se sembraron en placa en un
medio de agar más Kanamicina LB y tras una incubación durante la
noche a 37ºC se observaron colonias. Tras controlar varias
minipreparaciones de las colonias candidatas obtenidas, se obtuvo el
vector pEntry y las positivas se comprobaron posteriormente
mediante análisis de restricción de endonucleasa, y
secuenciación.
Se realizó la reacción LR según el fabricante a
25ºC, usando 200 ng del vector pEntry y 300 ng del vector
pDestination, tampón TE y IX mezcla de reacción LR Clonasell. Se
usó el vector binario pKGWFS7,0 (Karimi et al, 2002) como
vector pDestination, que se consideró más adecuado para un ensayo
de actividad de promotor debido al GFP-GUS dual
(SEQ.ID.NO:11) que se fusionó en el sentido de 3' del sitio de
recombinación attR2. Se realizó la selección de los clones
transformados en un medio de agar más estreptomicina LB selectivo.
La construcción de expresión resultante pCNH1::
GFP-GUS se muestra en la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCNH1::GUS/GFP tal como se describió
en el ejemplo 1, se usó para transferir el casete CNH1::GUS/
GFP (SEQ.ID.NO 13) en un genoma de tomate de tipo natural Solanum lycopersicum mediante el método de transformación de disco de hoja (Horsch, y modificado tal como en Ellul et al. 1993.). Se recogieron las plantas transgénicas y se sometieron a ensayo para expresión GUS según Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6:390. La figura 3 muestra los niveles de actividad enzimática GUS obtenidos en diferentes órganos de una planta transformada con el T-DNA CNH1::GUS/GFP y donde por tanto el gen GUS se encuentra regulado por el promotor de la invención (barras blancas). Estos niveles se comparan con los conferidos por un promotor constitutivo de referencia CaMV35S, fusionado de forma similar frente al gen GUS e introducido en la planta como casete de expresión 35S::GUSIGFP (SEQ.ID. NO. 14) (barras negras). Como se puede observar en la figura 3, CNH1 confiere expresión a GUS en todos los órganos de la planta, sin embargo esta expresión es mucho más fuerte en el fruto a lo largo de su desarrollo, siendo en este órgano sus niveles de expresión muy similares a los que confiere el promotor de referencia CaMV 35S. Es decir, la expresión que el promotor constitutivo CNH1 confiere en el resto de la planta es de al menos un orden de magnitud inferior que la expresión en el fruto, concretamente dicha expresión en el resto de la planta es de 3 a 6 veces menor que en el fruto. Los niveles máximos de actividad GUS conferidos por CNH1 son de 24 nanomoles de metilumbeliferona producida por minuto y miligramo de proteína total en los extractos crudos de fruto de tomate en estadio verde-maduro. Se puede concluir que los promotores CaMV 35S y CNH1 difieren en su capacidad de discriminación entre el fruto y el resto de tejidos de la planta. Por tanto se concluye que el promotor CNH1 es útil para conseguir la expresión de genes de forma ubicua en toda la planta pero especialmente alta (similar a CaMV35S) en el fruto.
GFP (SEQ.ID.NO 13) en un genoma de tomate de tipo natural Solanum lycopersicum mediante el método de transformación de disco de hoja (Horsch, y modificado tal como en Ellul et al. 1993.). Se recogieron las plantas transgénicas y se sometieron a ensayo para expresión GUS según Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6:390. La figura 3 muestra los niveles de actividad enzimática GUS obtenidos en diferentes órganos de una planta transformada con el T-DNA CNH1::GUS/GFP y donde por tanto el gen GUS se encuentra regulado por el promotor de la invención (barras blancas). Estos niveles se comparan con los conferidos por un promotor constitutivo de referencia CaMV35S, fusionado de forma similar frente al gen GUS e introducido en la planta como casete de expresión 35S::GUSIGFP (SEQ.ID. NO. 14) (barras negras). Como se puede observar en la figura 3, CNH1 confiere expresión a GUS en todos los órganos de la planta, sin embargo esta expresión es mucho más fuerte en el fruto a lo largo de su desarrollo, siendo en este órgano sus niveles de expresión muy similares a los que confiere el promotor de referencia CaMV 35S. Es decir, la expresión que el promotor constitutivo CNH1 confiere en el resto de la planta es de al menos un orden de magnitud inferior que la expresión en el fruto, concretamente dicha expresión en el resto de la planta es de 3 a 6 veces menor que en el fruto. Los niveles máximos de actividad GUS conferidos por CNH1 son de 24 nanomoles de metilumbeliferona producida por minuto y miligramo de proteína total en los extractos crudos de fruto de tomate en estadio verde-maduro. Se puede concluir que los promotores CaMV 35S y CNH1 difieren en su capacidad de discriminación entre el fruto y el resto de tejidos de la planta. Por tanto se concluye que el promotor CNH1 es útil para conseguir la expresión de genes de forma ubicua en toda la planta pero especialmente alta (similar a CaMV35S) en el fruto.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, el casete CNH1::GUS/GFP (SEQ.
ID. NO. 13) introducido en plantas de tomate tal y como se describe
en el ejemplo 1, es detectado mediante tinción histoquímica en el
fruto siguiendo el protocolo descrito por Jefferson et al.,
id., con el objetivo de determinar la distribución de la actividad
GUS conferida por CNH1 en los distintos tejidos del fruto. De izda
a dcha, la figura muestra un fruto en expansión (15 días
post-antesis), un fruto en estadio
verde-maduro (35 días post antesis), un fruto en
estadio pintón y un fruto rojo respectivamente. En la figura 4a se
aprecia que la distribución de la tinción GUS dirigida por CNH1 se
extiende a todos los tejidos y todos los estadios de desarrollo
estudiados. En la figura 4b se muestra, en una imagen similar, la
actividad GUS conferida por el promotor constitutivo CaMV35S en el
fruto incluido en la construcción 35S::GUS/GFP (SEQ.ID. NO. 14). La
comparación de ambas imágenes prueba que CNH1 puede ser utilizado de
forma análoga a CaMV35S como promotor constitutivo en el fruto de
tomate. De lo expuesto en la figura 4 se concluye que el promotor
CNH1 resulta ideal como promotor endógeno para la expresión de
proteínas recombinantes en el fruto cuando se pretende una
expresión ubicua y constitutiva en este órgano, ya que su expresión
incluye a todos los tejidos y a los diferentes estadios de
desarrollo, de forma análoga a lo que se observa con el uso de un
promotor constitutivo de referencia como CaMV35S. El uso del
promotor CNH1 resulta por tanto muy conveniente cuando se requiere
un promotor que facilite una acumulación continuada y a altos
niveles de un producto génico en el fruto, especialmente si este
promotor ha de ser un promotor endógeno.
\newpage
El promotor CNH1 es útil para dirigir la
expresión de proteínas recombinantes, y en particular de la
proteína fluorescente verde (GFP), en ensayos de expresión
transitoria en fruto. Los ensayos de expresión transitoria,
descritos por Orzáez et al (2006), son útiles para
determinar la viabilidad de una determinada construcción génica
para su expresión en fruto. Los ensayos de expresión transitoria
tienen una eficiencia de transformación limitada y por tanto
requieren construcciones con promotores que confieran fuerte
expresión en los distintos tejidos del fruto, dado que de otra
forma no se podrá detectar el producto del gen recombinante. Una
prueba de la idoneidad de un promotor para su uso en ensayos de
expresión transitoria en fruto consiste en determinar su capacidad
para dirigir niveles de expresión detectables y cuantificables de
la proteína fluorescente verde. La capacidad para dirigir la
expresión de otra proteína indicadora, la proteína fluorescente
verde (GFP), de la nueva secuencia de promotor, se demostró en
tejidos de fruto usando el ensayo de agroinyección transitoria en el
modo que se describe en Orzaez et al. (2006). Se cultivó una
suspensión de agrobacterias que llevaba la construcción
CNH1-GUS/GFP en LB hasta DO 0,5 y luego se diluyó
en MS hasta DO 0,05. Se inyectaron doscientos microlitros de la
suspensión de bacterias en frutos de tomate en desarrollo a través
del pedúnculo del fruto. Se cosecharon los frutos cuatro días tras
la agroinyección y se siguió la expresión de la GFP indicadora
dirigida por el CNH1 detectando la fluorescencia de pedazos de
frutos usando un escáner Typhon (figura 5a). La expresión
transitoria de GFP conferida por CNH1 fue detectada en un escáner de
fluorescencia (figura 5a izda), y comparada con la conferida por
CaMV35 en la construcción CaMV35-GUS/GFP (figura 5a
dcha). Para corregir las variaciones debidas a la eficiencia de
cada transformación, se utilizó como estándard interno la
construcción CaMV35:DsRed, que dirige la expresión constitutiva de
una proteína fluorescente roja. Esta construcción se usó como
estandar interno para normalizar las variaciones en fluorescencia
verde debidas a la eficiencia de la transformación transitoria. La
fluorescencia emitida por los frutos agroinyectados se midió a los
cuatro días post inyección (verde-maduro) u ocho
días post inyección (representando estadios de pintón). Para ello,
secciones ecuatoriales de frutos se escanearon en un escáner de
fluorescencia usando dos canales de excitación diferentes de 488 nm
(para detección de GFP) y de 532 nm (para detector DsRed),
calculándose los ratios verde/rojo de intensidad entre ambos
canales medidos en 4 posiciones diferentes de cada fruto. Para cada
promotor ensayado, los valores absolutos detectados en el canal de
fluorescencia verde se dividieron frente a los valores absolutos
detectados en el canal rojo, obteniéndose así una estimación de la
actividad relativa de cada promotor. En la figura 5b se muestran
los resultados de dicha comparación: el promotor CNH1 rindió
niveles cuantificables de GFP, el rango de los obtenidos con CaMV35S
en estadio verde (etiqueta MG), aunque inferiores en estadio pintón
(etiqueta Br). Este ejemplo permite concluir que el promotor
endógeno CNH1 confiere niveles de expresión de GFP detectables en
fruto y que dichos niveles son suficientes para realizar en ensayos
de expresión transitoria en fruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra el uso conjunto de los
promotores 35S y el promotor de la invención CNH1 para la expresión
conjunta en el mismo T-DNA de una immunoglobulina A
(IgA) humana frente a rotavirus. La IgA realiza una función de
inmunoprotección pasiva en las mucosas. Los frutos comestibles
pueden ser una excelente plataforma para la producción de IgAs
recombinantes frente a virus enteropatogénicos, reduciendo los
costes tanto de producción como de purificación. Las IgAs están
formadas por dos cadenas polipeptídicas, ligera y pesada, y por
tanto su producción en fruto requiere la expresión concertada de
ambos genes en el fruto a altos niveles. La inclusión de secuencias
repetitivas en las construcciones génicas destinadas a la producción
recombinante de proteínas en plantas da lugar a pérdidas de
eficiencia debido a procesos de recombinación, deleción y
silenciamiento génico. Por tanto, para producir complejos
multiproteicos como IgA en fruto, resulta importante disponer de más
de un promotor constitutivo con actividad en el fruto. En este
ejemplo se describe la construcción y expresión transitoria en fruto
de un T-DNA para la expresión de IgA humana frente a
rotavirus en fruto de tomate. En esta construcción se utiliza
promotor de la invención CNH1 para dirigir la expresión de la cadena
ligera, mientras que la expresión de la cadena pesada es dirigida
por el promotor CamV35S.
El T-DNA del presente ejemplo se
construye incorporando secuencialmente las construcciones de la
cadena pesada y ligera al vector de expresión pK7GW (Karimi et
al 2002). En primer lugar las secuencias nucleotídicas de la
región constante de la cadena pesada de la immunoglobulina A humana
isotipo alpha 1 (SEQ ID N. 15) (IgHalpha1) y de la región constante
de la cadena ligera humana isotipo lambda (Iglambda1) (SEQ ID N. 16)
se introducen por recombinación homóloga en el vector pDNOR221
(Invitrogen), generando los vectores pENTRIgHalpha y pENTRIgLambda
respectivamente. Sobre este vector se injertan por digestión con
enzimas de restricción y posterior ligación las secuencias variables
pesada (SEQ ID N. 17) y ligera (SEQ ID N. 18) del anticuerpo de
cadena sencilla 2A1 frente a rotavirus descrito por Monedero et
al (2004), generando los vectores pENTRIgHalpha2A1 y
pENTRIgLambda2A1 respectivamente. Por recombinación homóloga entre
pENTRIgHalpha2A1 y el vector de destino pK2GW7,0 (Karimi et
al 2002) se generó en vector de expresión pK235S_
IgHalpha2A1_NosT. En paralelo, y mediante triple recombinación
homóloga entre un vector de entrada conteniendo al promotor CNH1, el
vector pENTRIgLambda2A1 y un tercer vector de entrada conteniendo el
terminador T-Nos y el vector de destino pKGW,0
(Karimi et al 2002) se generó el vector de expresión pKNH_
IgLlambda2A1_NosT que contiene un cassette de expresión con el
promotor CNH1, la cadena ligera Llambda2A1 y el terminador
T-Nos. Finalmente, dicho cassette de expresión se
incorporó en el vector pK235S_ IgHalpha2A1_NosT por digestión con
enzimas de restricción y posterior ligación. El vector resultante
contiene un T-DNA que se muestra en la Figura 6
(SEQ.ID.NO.19) y que incorpora los elementos necesarios para la
expresión en fruto de una IgA humana frente a rotavirus: Se
construyó un fragmento de T-DNA de Agrobacterium
tumefaciens que contenía los siguientes elementos desde 5'
hasta 3': (1) el left border integrativo (SEQ.ID.N 20) (2) un
casete completo para resistencia a kanamicina en plantas (SEQ.ID.N
21) (3) un sitio de recombinación attBl (SEQ. ID. NO: 22) como
subproducto de recombinación LR (SEQ.ID.NO: 22) (4) un promotor 35S
doble (SEQ.ID.NO: 23); (5) un sitio de recombinación attB4 (SEQ.
ID. NO: 24) como subproducto de recombinación LR (SEQ.ID.NO: 24);
(6) el péptido señal pectato liasa de tomate para dirigir la
expresión de inmunoglobulina para el sistema de endomembrana de
estabilización (SEQ.ID.NO: 25); (7) una región variable de
inmunoglobulina humana de cadena pesada con afinidad frente al
péptido VP8* de la cepa de rotavirus SA11 (SEQ.ID.NO: 17); (8) el
dominio constante de inmunoglobulina alfa humana de cadena pesada;
(SEQ.ID.NO: 15) (9) un sitio de recombinación attB3; (SEQ.ID.NO:
26) (10) el terminador nopalina sintasa para terminación de
trascripción eficiente; (SEQ.ID.NO: 27) (11) y un sitio de
recombinación attBl (SEQ.ID.NO: 22); (12) el promotor CNH1
(SEQ.ID.NO: 2); (13) un sitio de recombinación attB4 (SEQ.ID.NO:
24); (14) el péptido señal pectato liasa de tomate (SEQ.ID.NO: 25);
(15) una región variable de inmunoglobulina humana de cadena ligera
con afinidad frente al péptido VP8* de la cepa de rotavirus SA11
(SEQ.ID.NO: 18); (16) la región constante de inmunoglobulina lambda
humana de cadena ligera (SEQ.ID.NO: 10); (17) un sitio de
recombinación attB3 (SEQ.ID.NO: 26) (18) el terminador nopalina
sintasa (SEQ.ID.NO: 27); (19) y un sitio de recombinación attB2
(SEQ.ID.NO: 28). (20) el right border de T-DNA
(SEQ.ID.NO.29) (figura 7).
La presencia de promotor CNH1 dirigiendo la
expresión de inmunoglobulina humana de cadena ligera actúa como
factor limitante, garantizando que se produzcan niveles altos de
IgA humana recombinante funcional anti rotavirus sólo en tejidos en
el que CNH1 es activo (es decir principalmente en el fruto).
Se transfirió de manera transitoria el
T-DNA descrito anteriormente a células de fruto de
tomate usando el procedimiento de agroinyección (Orzaéz et al
2006). Se detectó la presencia de IgA humana recombinante frente a
rotavirus en extractos brutos de frutos de tomate en Western blot y
ELISA. La figura 8a muestra la detección en fruto (línea 1)
mediante Western blot de las cadenas pesada y ligera de IgA. No se
detectó IgA en frutos control agroinfiltrados sólo con
CamV35S:GFP/GUS, mientras que la expresión de ambas cadenas fue
indetectable en hoja de tomate agroinfiltrada con el mismo
T-DNA. Se demuestra de esta forma que ambas cadenas
de IgA se expresan en el fruto y que el promotor CNH1 es eficiente
para la producción de complejos IgA en el fruto cuando se necesita
el concurso de más de un promotor constitutivo en el fruto. La
ausencia de IgA detectable en hoja se interpreta como resultado de
los niveles bajos de expresión de IgL conferidos por CNH1 en hoja y
la inestabilidad de IgH en ausencia de IgL.
La figura 8b muestra cómo los extractos crudos
de tomates agroinfiltrados con el T-DNA de la
figura 7 son capaces de unir específicamente el antígeno de
rotavirus contra el que fueron inicialmente seleccionados (VP8*).
Extractos sin diluir y diluciones 1:10 de los extractos
reaccionaron fuertemente frente al antígeno en ensayos ELISA
(barras blancas), mientras que extractos de frutos control
agroinyectados con la construcción 35S:GFP/GUS muestran sólo una
señal basal en placas tapizadas con el antígeno. Se demuestra por
tanto que el concurso de CNH1 permite la expresión de complejos
proteicos funcionales en el fruto.
<110> FUNDACIÓN PARA EL DESARROLLO DE LA
INVESTIGACIÓN EN GENÓMICA Y PROTEÓMICA (GENOMA ESPAÑA)
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Promotor Constitutivo de Solanum
Lycopersicum
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Promotor Constitutivo de Solanum
Lycopersicum
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3711
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum Lycopersicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> promotor CNH1 con adapatores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3675
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum Lycopersicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de promotor CNH1 empleado
para la construcción de pCNH1-GUS/GFP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Adaptador Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer AP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer específico del gen GSP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer AP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer específico del gen GSP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de recombinación attB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de recombinación attB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer específico del gen GSP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fusion GFP/GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14723
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del vector
pCNH1::GFPGUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6532
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cassette CNH1::GFPGUS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cassette 35S::GFPGUS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región constante de Ig H alpha 1
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Region constante Ig Lamda humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia variable pesada del
anticuerpo de cadena sencilla 2a1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia variable ligera del
anticuerpo de cadena sencilla 2a1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cassette de expresión de IgA
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Borde Izquierdo integrador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1397
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de resistencia a la
kanamycina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de recombinación attB1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 737
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Doble promotor 35S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de recombinación attbB4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido señal de la pectato liasa
del tomate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de recombinación attB3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Señal de terminación de la Nopalina
Sintasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de recombinación attB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Borde derecho de
T-DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
Claims (29)
1. Promotor constitutivo CNH1 que comprende la
secuencia SEQ ID NO: 2 o al menos una secuencia que presenta el 70%
de homología con SEQ.ID.NO.2.
2. Construcción nucleotídica
caracterizada por comprender el promotor según
reivindicación 1 operativamente unido a un gen o secuencia de DNA de
interés que da lugar a la producción de una secuencia de RNA que
codifica para una proteína o péptido de interés.
3. Construcción nucleotídica según
reivindicación 2 caracterizada porque dicha secuencia de DNA
o gen de interés es homólogo o heterólogo al promotor según
reivindicaciones 1 a 2.
4. Construcción nucleotídica según
reivindicaciones 2-3 caracterizada porque
dicha proteína o péptido de interés presenta utilidad en plantas
biofactoría (molecular pharming).
5. Construcción nucleotídica según
reivindicaciones 2-4 caracterizada porque
dicha proteína o péptido de interés es de utilidad en la producción
de medicamentos.
6. Construcción nucleotídica según
reivindicaciones 2-5 caracterizada porque
dicha proteína o péptido de interés es una inmunoglobulina.
7. Construcción nucleotídica según
reivindicación 6 caracterizada porque dicha inmunoglobulina
es IgGA.
8. Vector que comprende la construcción
nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.
9. Célula de planta que comprende la
construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a
7.
10. Célula de planta según la reivindicación 9
donde dicha planta pertenece al género Solanum.
11. Célula de planta según reivindicación 10
donde dicha planta es Solanum lycopersicum.
12. Célula de planta según reivindicación 11
donde dicha planta pertenece a cualquier especie de plantas que
presenten fruto.
13. Célula de planta según cualquiera de las
reivindicaciones 9-12 donde la proteína o péptido
de interés es heterólogo a dicha planta.
14. Célula de planta según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13 donde dicha proteína o péptido pertenece a
la especie Solanum.
15. Célula de planta según reivindicación 14
donde dicha proteína o péptido de interés pertenece a Solanum
lycopersicum.
16. Planta transgénica que comprende la
construcción nucleotídica según reivindicaciones 2 a 7.
17. Planta transgénica según reivindicación 16
caracterizada por pertenecer al género Solanum.
18. Planta transgénica según reivindicación 17
caracterizada por ser Solanum lycopersicum.
19. Planta transgénica según reivindicación 16
caracterizada por pertenecer a cualquier especie de plantas
que den fruto.
20. Semilla de planta según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19.
21. Fruto de la planta según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19.
22. SEQ ID NO: 2.
23. Uso del promotor según reivindicación 1 para
dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de interés en
plantas caracterizado porque dicha expresión se produce en
altos niveles en toda la planta, con niveles mayores en el
fruto.
24. Uso del promotor según reivindicación 23
caracterizado porque dicha expresión en el fruto es similar
a la obtenida en toda la planta al emplear promotor 35 S.
25. Uso del promotor según reivindicaciones
23-24 caracterizado porque los niveles de
expresión en el resto de la planta aproximadamente un orden de
magnitud inferior que en el fruto.
26. Uso del promotor según reivindicación 25
caracterizado porque dicha expresión en el resto de la
planta es de 3 a 6 veces inferior que en el fruto.
27. Uso del promotor según reivindicaciones
24-26 caracterizado porque la expresión de
los genes de interés que dirige, se produce durante todos los
diferentes estadíos de desarrollo de la planta y del fruto.
28. Uso del promotor según reivindicaciones 23 a
27 para dirigir la expresión de genes o secuencias de DNA de
interés en plantas cuando más de un promotor constitutivo es
necesario para expresar dos o más proteínas recombinantes de forma
concertada y preferentemente en el fruto.
29. Uso del promotor según reivindicaciones 23 a
28 en estrategias de tipo "plantas biofactoría".
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802207A ES2332690B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Promotor constitutivo de solanum lycopersicum. |
| PCT/ES2009/000375 WO2010010207A1 (es) | 2008-07-24 | 2009-07-17 | Promotor constitutivo de solanum lycopersicum |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802207A ES2332690B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Promotor constitutivo de solanum lycopersicum. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2332690A1 ES2332690A1 (es) | 2010-02-10 |
| ES2332690B1 true ES2332690B1 (es) | 2011-01-28 |
Family
ID=41570048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200802207A Expired - Fee Related ES2332690B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Promotor constitutivo de solanum lycopersicum. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2332690B1 (es) |
| WO (1) | WO2010010207A1 (es) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6127179A (en) * | 1996-04-17 | 2000-10-03 | Dellapenna; Dean | Gene promoter for tomato fruit |
| GB9611981D0 (en) * | 1996-06-07 | 1996-08-07 | Zeneca Ltd | Enhancement of gene expression |
| US6340748B1 (en) * | 1999-09-28 | 2002-01-22 | Seungil Ro | Promoter of the tomato expansin gene LeExp-1 |
-
2008
- 2008-07-24 ES ES200802207A patent/ES2332690B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-07-17 WO PCT/ES2009/000375 patent/WO2010010207A1/es active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010010207A1 (es) | 2010-01-28 |
| ES2332690A1 (es) | 2010-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5655947B2 (ja) | 成葉特異的プロモーター | |
| JP5519192B2 (ja) | 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法 | |
| BRPI0613726A2 (pt) | molécula de ácido nucléico de café (coffea spp), molécula de mrna e cdna, oligonucleotìdeo, vetor, método para modular o sabor ou aroma de grãos de café, promotor, gene quimérico | |
| BRPI0607378A2 (pt) | cassetes de expressço, seqÜÊncia nucleotÍdica isolada, vetor, cÉlula hospedeira transgÊnica ou organismo nço humano, cÉlula de planta ou planta transgÊnica, mÉtodos para identificar e/ou isolar uma seqÜÊncia nucleotÍdica reguladora da transcriÇço, para prover ou produzir um cassete de expressço transgÊnica, e para prover uma seqÜÊncia nucleotÍdica reguladora de transcriÇço sintÉtica, e, seqÜÊncia reguladora de transcriÇço sintÉtica | |
| CN110229818B (zh) | 蜡梅CpSNAC1基因启动子及其应用 | |
| CN110857316A (zh) | 花青素合成相关蛋白及其在调控植物花青素含量中的应用 | |
| JP3571639B2 (ja) | さつまいも由来の新規ぺルオキシダーゼ遺伝子及びそのプロモーター | |
| Wu et al. | Cloning and functional analysis of the promoter of a maize starch synthase III gene (ZmDULL1) | |
| ES2289529T3 (es) | Casetes de expresion para la expresion transgenica bi-direccional de los acidos nucleicos en vegetales. | |
| CN109811005A (zh) | 株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因在调控水稻叶倾角中的应用 | |
| ES2332690B1 (es) | Promotor constitutivo de solanum lycopersicum. | |
| ES2223533T3 (es) | Promotor que permite la expresion de transgenes en toda la planta excepto en la semilla. | |
| ES2332691B1 (es) | Promotor especifico del fruto de solanum lycopersicum. | |
| KR100859988B1 (ko) | 지상부 특이적 프로모터 및 이를 이용한 목적 단백질의지상부 특이적 발현 방법 | |
| ES2614649T3 (es) | Mejoras en o relacionadas con compuestos orgánicos | |
| ES2336550T3 (es) | Elementos de regulacion favorables a la inflorescencia precoz y sus usos. | |
| AU2005229721A1 (en) | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants | |
| JP4228072B2 (ja) | アビジンをコードする人工合成遺伝子 | |
| KR101101774B1 (ko) | 토마토 히스티딘 디카르복실라제 유전자 유래 열매 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도 | |
| JP4776216B2 (ja) | 新規な植物細胞死誘導因子ＮｂＣＤ１ | |
| JP4439844B2 (ja) | 植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメント | |
| KR101784162B1 (ko) | 식물체의 개화기 또는 성숙기를 촉진하는 유전자 및 이의 용도 | |
| JP4474542B2 (ja) | 構成的発現プロモーター | |
| JP6274161B2 (ja) | 薬剤誘導性プロモーター及びこれを用いた遺伝子発現誘導方法 | |
| JP5845306B2 (ja) | 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20100210 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2332690 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20110118 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20210915 |