BRPI0613726A2 - molécula de ácido nucléico de café (coffea spp), molécula de mrna e cdna, oligonucleotìdeo, vetor, método para modular o sabor ou aroma de grãos de café, promotor, gene quimérico - Google Patents

Abstract

MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO DE CAFé (COFFEA SPP), MOLéCULA DE mRNA e cDNA, OLIGONUCLEOTIDEO, VETOR, MéTODO PARA MODULAR O SABOR OU AROMA DE GRãOS DE CAFé, PROMOTOR, GENE QUIMéRICO. A presente invenção refere-se a polinucleotídeos codificadores de oleosina e esteroleosina de plantas de café. A presente invenção também refere-se a sequências promotoras de genes de oleosina do café e métodos para uso desses polinucleotídeos e promotores para regulação de genes e manipulação de sabor, aroma e outras características de grãos de café.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULADE ÁCIDO NUCLÉICO DE CAFÉ (COFFEA SPP), MOLÉCULA DE mRNAe cDNA, OLIGONUCLEOTÍDEO, VETOR, MÉTODO PARA MODULAR OSABOR OU AROMA DE GRÃOS DE CAFÉ, PROMOTOR, GENE QUIMÉRICO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia agrí-cola. Em particular, a invenção apresenta polinucleotídeos que codifica oleo-sina e esteroleosina de plantas de café, seqüências promotoras de genes deoleosina do café e métodos para uso desses polinucleotídeos e promotorespara regulação de genes e manipulação de sabor, aroma e outras caracte-rísticas de grãos de café.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Várias publicações, incluindo patentes, pedidos publicados eartigos eruditos, são citados neste relatório. Cada uma dessas publicações éaqui incorporada por referência em sua inteireza. Citações não completa-mente expostas no relatório podem ser encontradas no fim do relatório.

O aroma e o sabor do café são componentes-chave na prefe-rência do consumidor por variedades e marcas de café. O aroma e o saborcaracterísticos do café se originam de uma série complexa de reação quími-cas envolvendo precursores de sabor (reações de Maillard) que ocorremdurante a torrefação dos grãos. Precursores de sabor incluem compostosquímicos e biomoléculas presentes no grão de café verde. Até agora, maisde 800 substâncias químicas e biomoléculas já foram identificadas comocontribuindo para o sabor e aroma do café (Montavon et ai, 2003, J. Agric.Food Chem., 51:2328-34; Clarke e Vitzthum, 2001, Coffee: Recent Deve-lopments. Blackwell Science).

Como os consumidores de café estão se tornando cada vezmais requintados, é desejável produzir café com melhores aroma e saborpara atender às preferências dos consumidores. Tanto o aroma, quanto osabor podem ser artificialmente conferidos a produtos de café por meiosquímicos. Veja, por exemplo, a patente norte-americana n° 4.072.761 (aro-ma) e a patente norte-americana n° 3.962.321 (sabor). Uma abordagem al-ternativa seria o uso de técnicas de biologia molecular para adicionar ele-mentos intensificadores de aroma e sabor que não ocorram naturalmente emgrãos de café ou para intensificar os elementos responsáveis pelo sabor earoma que são normalmente encontrados no grão de café. A engenhariagenética é particularmente adequada para atingir esses objetivos. Por e-xemplo, proteínas de café de diferentes espécies de café podem ser troca-das. Alternativamente, a expressão de genes que codificam proteínas decafé de ocorrência natural que contribuam positivamente para o sabor docafé pode ser intensificada. Inversamente, a expressão de genes que codifi-quem proteínas de café de ocorrência natural que contribuam negativamentepara o sabor do café pode ser suprimida.

As proteínas de café endógenas cuja expressão possa ser alvode manipulação genética, e se e em que medida a produção dessas proteí-nas de café devem ser intensificadas ou suprimidas foram empiricamentedeterminadas. A proteína de armazenamento 11S foi identificada como umdesses candidatos à proteína de café. (Montavon et al., 2003, J. Agric. FoodChem. 51:2335-43). A oleosina do café, por causa de seu papel no armaze-namento de óleo, é outro candidato à proteína de café. Os óleos do café sãoconstituintes conhecidos no aroma e do sabor do café. Por exemplo, (E)-2-nonenal e trans-trans-2-4-decadienal são voláteis derivados de lipídios im-portantes para o aroma do café (Akiyama et al., 2003; Variyar et al., 2003).Consequentemente, o aumento ou diminuição das reservas desses óleos nogrão de café deve ter um efeito mensurável sobre o aroma e o sabor do ca-fé. Oleosinas também formam bicamadas lipídicas e também podem contri-buir para o teor de lipídios.

Oleosinas foram detectadas em várias espécies vegetais, inclu-indo colza (Keddie et al., 1992), dendê africano (NCBI), algodão (Hughes etal., 1993), girassol (Thoyts et al., 1995), cevada (Aalen et al., 1994; 1995),arroz (Wu et al., 1998), amêndoa (Garcia-Mas et al., 1995), cacau (Guillote-au etal., 2003) e milho (Qu e Huang, 1990; Lee e Huang, 1994). Em semen-tes de plantas, corpúsculos de óleo, também chamados de oleossomos, sãomantidos por oleosinas. Acredita-se que esses corpúsculos de óleo sirvamde reservatório de triacilgliceróis (TAG) (Tzen et al., 1993). Uma função dasoleosinas é organizar as reservas de lipídios de sementes em estruturas pe-quenas e facilmente acessadas (Huang et ai, 1996). Corpúsculos de óleoem sementes variam em diâmetro de 0,5 a 2 μΜ (Tzen et al., 1993), propor-cionando uma elevada razão de superfície para volume, que se acredita quefacilite a rápida conversão de TAGs em ácidos graxos livres mediante hidró-Iise mediada por lípase na superfície do corpúsculo de óleo (Huang et ai,1996). Em sementes contendo grandes quantidades de óleos, como colza,as oleosinas representam 8% - 20% da proteína total (Li et ai, 2002), e asoleosinas representam 79% das proteínas associadas a corpúsculos de óleode Arabidopsis (Jolivet et ai, 2004). As oleosinas cobre a superfície dessescorpúsculos de óleo (Huang, 1996), onde se acredita que ajudem a estabili-zar o corpúsculo lipídico durante a dessecação da semente, evitando a coa-lescência dos óleos. Partículas contendo lipídios relacionadas também sãoencontradas em certas células especializadas. Por exemplo, o tapete, umaestrutura envolvida no desenvolvimento de pólen, também tem partículaslipídicas do tipo corpúsculo de óleo especificadas, chamadas de tapetosso-mos. Essas partículas do tipo corpúsculo de óleo estão envolvidas no forne-cimento de componentes funcionais requeridos para o desenvolvimento demicrósporos e pólen (Murphy et ai, 1998; Hernandez-Pinzon et ai., 1999).

Proteínas oleosina são compostas por três domínios distintos:um fragmento hidrofóbico conservado central de aproximadamente 72 ami-noácidos, flanqueado por um motivo carboxílico N-terminal altamente variá-vel e uma α-hélice anfipática C-terminal (Huang, 1996; Li et ai, 2002). Oscomprimentos das partes amino e carbóxi são altamente variáveis e, emconseqüência, as oleosinas podem variar em tamanho de 14 a 45 kDa (Taiet al., 2002; Kim et ai, 2002). As partes amino e carboxílica anfipáticas per-mitem que a proteínas resida de maneira estável na superfície de corpúscu-Ios de óleo (Huang, 1996). Os aminoácidos no centro da região hidrofóbicacontêm três prolinas conservadas e uma serina conservada, que formam omotivo prolina knot. Acredita-se que esse motivo permita que o fragmentocentral se dobre como um grampo hidrofóbico, que ancora a oleosina na ma-triz central oleosa (Huang, 1996). O papel do motivo prolina knot na funçãoda proteína foi adicionalmente investigado por Abell et al. (1997), que mos-traram que, se três resíduos prolina fossem substituídos por resíduos Ieuci-na, uma proteína de fusão oleosina-beta-glucuronidase era incapaz de sedirigir para corpúsculos de óleo tanto na expressão transitória em embriões,quanto em sementes transformadas de maneira estável.

As oleosinas foram classificadas como isoformas de alta ou bai-xa Mr (H- e L-oleosina), dependendo das massas moleculares relativas(Tzen et al., 1990). A análise de seqüência mostrou que a principal diferençaentre as H- e L-oleosinas era a inserção de 18 resíduos no domínio C-terminal de H-oleosinas (Tai et al., 2002), e Tzen et al., (1998) demonstra-ram que ambas as formas coexistem em corpúsculos de óleo. Em Zea mays,Lee e Huang (1994) identificaram três genes, OLE16, OLE17 e OLE18, compesos moleculares de 16, 17 e 18 kDa, respectivamente, que são expressa-dos durante a maturação da semente. As razões de proteínas corresponden-tes são de 2:1:1, respectivamente, em corpúsculos de óleo isolados (Lee eHuang, 1994; Ting et al., 1996). Lee et al. (1995) classificaram OLE16 comouma L-oleosina, e OLE17 e OLE18 como H-oleosinas, indicando que cor-púsculos de óleo de Z. mays contêm quantidades iguais de H- e L-oleosinasem corpúsculos de óleo. Além disso, descobriu-se que os corpúsculos deóleo de embriões de arroz contêm uma quantidade similar de duas oleosinasdistintas de massas moleculares 18 e 16 kDa, correspondendo à forma H e àforma L, respectivamente (Tzen et al., 1998; Wu et al., 1998). Duas oleosi-nas também foram identificadas nas sementes de Theobroma cacao (Guillo-teau et al., 2003). Com 15 e 16,1 kDa, essas proteínas representam umaforma L e uma forma H, respectivamente.

Kim et al. (2002) caracterizaram os genes de oleosina em Arabi-dopsis em três grupos. O primeiro grupo consiste em oleosinas expressadasespecificamente nas sementes (S), o segundo expressadas nas sementes enos micrósporos florais (SM), e o grupo final expressadas no tapete de florí-culos (T). Dos dezesseis genes de oleosina identificados no genoma de Ara-bidopsis, demonstrou-se que cinco genes são especificamente expressadosem sementes em maturação, três genes expressados em sementes em ma-turação e micrósporos florais, e oito no tapete floral (Kim et ai., 2002). Ascinco oleosinas específicas de sementes de Arabidopsis foram anteriormen-te classificadas como 3 oleosinas de forma H e 2 oleosinas de forma L porWu et ai. (1999). Também se demonstrou que gergelim, milho e arroz codifi-cam três oleosinas específicas de sementes (Tai et ai., 2002; Ting et ai.,1996; Chuang et ai, 1996; Wu et ai., 1998; Tzen et ai., 1998).

Acredita-se que a expressão de oleosina seja regulada pelo de-senvolvimento e espacialmente, principalmente no nível de transcrição(Keddie et ai., 1994). Wu et ai. (1998) mostraram que transcritos de duasoleosinas de arroz apareciam sete dias após a polinização e desapareciamem sementes maduras. Um resultado similar foi obtido por Guilloteau et ai.(2003), que mostraram que o nível dos dois transcritos de oleosina em cacaudiminuía em sementes maduras. Embora a transcrição do gene da oleosinatenha sido estudada de maneira semiquantitativa em inúmeros tipos de se-mentes, não há nenhum relato em que os níveis de transcrito da maioriadas, ou de todas as, oleosinas em um tipo de semente tenham sido quantita-tivamente determinados durante o desenvolvimento da semente.

A despeito do fato de que os grãos de café têm um teor de óleoentre 10 e 16%, pouco se sabe a respeito de proteínas oleosina no café. Háuma escassez de dados científicos referentes ao número de oleosinas docafé, sua estrutura proteica, seus níveis de expressão e distribuição pelaplanta de café e entre as espécies de café, suas capacidades de armaze-namento de óleo e a regulação de sua expressão no nível molecular. Assim,há necessidade de identificar e caracterizar proteínas, genes e elementosreguladores genéticos de oleosina de café. Essa informação permitirá queproteínas oleosina de café sejam geneticamente manipuladas, com a finali-dade de melhorar uma ou mais características do café, incluindo o teor deóleo e a estabilidade, o que, por sua vez, pode afetar os parâmetros de tor-refação, tendo, por fim, um impacto sobre o aroma e o sabor do café.

Com a finalidade de intensificar ou suprimir a produção de prote-ínas de café, como oleosinas, é desejável ter disponível um conjunto depromotores compatíveis com a planta de café. Além disso, qualquer manipu-lação genética deve, de maneira ideal, estar localizada principal ou unica-mente no grão de café, e não deve afetar de maneira adversa a reproduçãoou propagação da planta de café.

Promotores específicos para sementes foram descritos. Exem-plos desses promotores incluem as regiões reguladoras 5' de genes comode cruciferano (patente norte-americana n° 6.501.004), napina (Kridl et al.,Seed Sei. Res. 1:209:219, 1991), faseolina (Bustos et al., Plant Cell,1(9):839-853, 1989), inibidor da tripsina de soja (Riggs et al., Plant Cell1(6):609-621, 1989), ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2):255-267,1993), estearoil-ACP dessaturase (Slocombe et al., Plant Physiol.104(4): 167-176, 1994), subunidade a' de soja da beta-conglicinina (P-Gm7S,Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sic. 83:8560-8564, 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, pedido de patente norte-americana n° de série 10/429.516). Alémdisso, foi descrito um promotor de oleosina L3 de Zea mays (P-Zm.L3, Honget al., Plant. Mol. Biol., 34(3):549-555, 1997).

Promotores específicos encontraram aplicação na transformaçãode plantas. Por exemplo, grupos usaram a manipulação genética para modi-ficar o nível de constituintes de sementes. Veja Selvaraj et al., patente norte-americana n° 6.501.004, Peoples et al., patente norte-americana n°6.586.658, Shen et al., pedido de patente norte-americana n° de série10/223.646, Shewmaker et al., pedido de patente norte-americana n° de sé-rie 10/604.708, e Wahlroos et al., pedido de patente norte-americana n° desérie 10/787.393. Deve-se notar que promotores de oleosina foram usadoscom sucesso nesses sistemas.

Entretanto, promotores específicos para sementes e, mais espe-cificamente, promotores de oleosina do café não foram usados na transfor-mação de plantas de café. Assim, há necessidade de se ter seqüências re-guladoras de genes adicionais disponíveis para controlar a expressão deproteínas do café. No mesmo senso, há necessidade de se ter seqüênciasreguladoras de genes disponíveis para controlar a expressão de oleosinasem plantas de café. Além disso, há necessidade de se ter seqüências regu-ladoras de genes disponíveis para controlar a expressão de proteínas docafé no grão de café. Com relação a isso, promotores específicos para aexpressão de genes no grão de café são candidatos altamente atraentes, eentre esses promotores estão os promotores de oleosina do café.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção apresenta moléculas de áci-dos nucléicos isoladas do café (Coffea spp.), com seqüências codificadorasque codifiquem oleosinas. Em certas modalidades, as seqüências codifica-doras codificam oleosinas com pesos moleculares entre cerca de 14 kDa ecerca de 19 kDa.

Em certas modalidades, as seqüências codificadoras codificamfragmentos de oleosinas, por exemplo, (a) os resíduos 1 a cerca de 27, cer-ca de 28 a cerca de 109 ou cerca de 110 da terminação C das SEQ ID NOS:8 ou 9; (b) os resíduos 1 a cerca de 15, cerca de 16 a cerca de 89 ou cercade 90 da terminação C da SEQ ID NO: 10; (c) os resíduos 1 a cerca de 30,cerca de 31 a cerca de 114 ou cerca de 115 da terminação C da SEQ IDNO: 11; (d) os resíduos 1 a cerca de 18, cerca de 19 a cerca de 89 ou cercade 90 da terminação C da SEQ ID NO: 12; ou (e) os resíduos 1 a cerca de40, cerca de 41 a cerca de 115 ou cerca de 116 da terminação C da SEQ IDNO: 13. Em certas modalidades, as oleosinas codificadas têm seqüências deaminoácidos mais que 80% idênticas a qualquer uma das SEQ ID NOS: 8 - 13.

Outro aspecto da invenção apresenta uma molécula de ácidonucleico isolada do café (Coffea spp.) com uma seqüência codificadora quecodifica uma esteroleosina. Em certas modalidades, a molécula de ácidonucleico codifica um fragmento de uma proteína esteroleosina, por exemplo,os resíduos 1 a cerca de 50, cerca de 50 a cerca de 80, cerca de 81 a cercade 102, cerca de 103 a cerca de 307, e cerca de 38 da terminação carbóxida SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades, a molécula de ácido nucleicocodifica uma esteroleosina com uma seqüência de aminoácidos mais que80% idêntica à SEQ ID NO: 14.As moléculas de ácidos nucléicos que codificam oleosina ou es-teroleosina do café acima descritas podem estar em uma das várias formas,incluindo (1) um gene com um quadro aberto de leitura que compreende aseqüência codificadora, (2) uma molécula de mRNA produzida por transcri-ção desse gene, (3) uma molécula de cDNA produzida por transcrição rever-sa da de mRNA, ou (4) um oligonucleotídeo entre 8 e 100 bases de compri-mento, que seja complementar a um segmento de qualquer uma das formasprecedentes de moléculas de ácidos nucléicos.

Outros aspectos da invenção apresentam vetores compreen-dendo as moléculas de ácidos nucléicos que codificam oleosina ou esterole-osina de café acima descritas. Em certas modalidades, o vetor é um vetor deexpressão, como um vetor plasmídico, cosmídico, de baculovírus, bacmid,bacteriano, de levedura ou viral. Em certas modalidades, o vetor contém aseqüência codificadora de oleosina ou esteroleosina operacionalmente Iiga-da a um promotor constitutivo. Em outras modalidades, a seqüência codifi-cadora está operacionalmente ligada a um promotor induzível. Em outrasmodalidades, a seqüência codificadora está operacionalmente ligada a umpromotor específico para tecido, que é um promotor específico para sementeem algumas modalidades, e um promotor específico para semente de caféem modalidades particulares. Nessas modalidades, o promotor específicopara semente de café pode ser um promotor do gene da oleosina.

Outro aspecto da invenção apresenta células hospedeiras comum vetor do tipo acima descrito. As células hospedeiras podem ser célulasvegetais, células bacterianas, células fúngicas, células de insetos ou célulasde mamíferos. Em certas modalidades, as células hospedeiras são célulasvegetais, que podem ser de café, tabaco, Arabidopsis, milho, trigo, arroz,soja, cerva, centeio, aveia, sorgo, alfafa, trevo, canola, tomate verde, giras-sol, amendoim, cacau, fisális, batata, pimenta, berinjela, beterraba, cenoura,pepino, alface, ervilha, áster, begônia, crisântemo, delfínio, zínia e turfas. Ainvenção também apresenta plantas férteis produzidas a partir das célulasvegetais.

Outro aspecto da invenção apresenta um método para modularo sabor ou aroma de grãos de café, compreendendo a modulação da produ-ção de uma ou mais oleosinas ou esteroleosinas em sementes de café. Emcertas modalidades, o método envolve o aumento da produção de uma oumais oleosinas ou esteroleosinas, como por aumento da expressão de umou mais genes endógenos de oleosina ou esteroleosina nas sementes decafé, ou por introdução de um transgene codificador de oleosina ou estero-leosina na planta. Em outras modalidades, o método envolve a diminuiçãoda produção de uma ou mais oleosinas ou esteroleosinas, como por introdu-ção de uma molécula de ácido nucleico no café que iniba a expressão dogene de oleosina ou esteroleosina.

Outro aspecto da invenção apresenta um promotor isolado deum gene de planta de café que codifica uma oleosina. Em certas modalida-des, o promotor é isolado de um gene que codifica uma oleosina com umaseqüência de aminoácidos mais de 80% idêntica a uma das SEQ ID NOS: 8-13. Em modalidades particulares, o promotor contém uma ou mais seqüên-cias reguladoras selecionadas do grupo que consiste em TTAAAT, TGTAA-AGT, CAAATG, CATGTG, CATGCAAA, CCATGCA e ATATTTATT. Em umamodalidade específica, o promotor compreende a SEQ ID NO: 15.

Outro aspecto da invenção apresenta um gene quimérico com-preendendo um promotor de oleosina, operacionalmente ligado a uma oumais seqüências codificadoras. Vetores e células hospedeiras e plantastransgênicas férteis compreendendo esses genes quiméricos também sãoapresentados.

Outras características e vantagens da presente invenção serãocompreendidos com referência aos desenhos, descrição detalhada e exem-plos que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Alinhamento ótimo de seqüências de proteínas de Cof-fea. Os alinhamentos foram gerados com o programa Clustal W no pacotede software Lasergene (DNASTAR) e, então, ajustados manualmente paraotimizar o alinhamento. A localização do motivo P-(5S)-SP-(3X)-P prolinaknot conservado é indicada, com prolinas e serinas altamente conservadasmostradas em negrito. Seqüências conservadas estão dentro de caixas. Ainserção de forma H (veja Figura 4) é mostrada na caixa com traços grossos.Os números de acesso das seqüências de oleosina alinhadas são: CaOLE-1(SEQ ID NO: 8; AY928084), CcOLE-1 (SEQ ID NO: 9; AY841271), CcOLE-2(SEQ ID NO: 10; AY841272), CcOLE-3 (SEQ ID NO: 11; AY841273), CcO-LE-4 (SEQ ID NO: 12; AY841274) e CcOLE-5 (SEQ ID NO: 13; AY841275).

Figura 2. Alinhamento ótimo da proteína esteroleosina de Coffeacanephora, seqüência CsSTO-1 com as duas seqüências de banco de da-dos mais próximas. Os números de acesso das seqüências de oleosina ali-nhadas são. CAB39626 para A. thaliana (At) (AtSTOLE-7, SEQ ID NO: 17),AY841276 para Coffea canephora (SEQ ID NO: 14) e AF498264 para Se-samum indicium (Lin e Tzen, 2004) (SiSTO-B, SEQ ID NO: 16). Os alinha-mentos foram gerados com o programa Clustal W no pacote de softwareLasergene (DNASTAR) e, então, ajustados manualmente para otimizar oalinhamento. As regiões conservadas estão dentro de caixas. As localiza-ções do sítio ativo em potencial S-(12S)-Y-(3X)-K conservado e do motivo P-(11X)-P prolina knot estão indicadas, com resíduos altamente conservadosmostrados em negrito (Lin et ai, 2002). As regiões de ligação a NADPH eesterol identificadas por Lin et ai (2002) também estão indicadas.

Figura 3. Filogenia baseada em Clustal W das cinco oleosinasde C. canephora e 16 oleosinas de Arabidopsis. As seqüências de proteínascompletas de cada gene foram alinhadas com o programa Clustal W do pa-cote Lasergene e, então, ajustadas manualmente para otimizar o alinhamen-to. Para ilustrar as relações evolucionárias em potencial entre as várias se-quências, o alinhamento resultante é apresentado na forma de uma árvorefilogenética. A escala representa a distância de ramificação como o númerode alterações de resíduos entre vizinhos. As formas H e L de A. thaliana es-tão indicadas. As localizações das seqüências de Arabidopsis são mostra-das como Semente/Micrósporo (SM), Semente (S) e Tapete (T). Os númerosde acesso das seqüências de oleosina alinhadas são: AAF01542,BAB02690, CAA44225, Q39165, AA022633, AAF69712, BAB02215, A-AC42242, NP196368, NP196369, CAB87942, NP196371, NP196372,ΝΡ196373, ΝΡ196377 e ΝΡ200969 para Arabidopsis S1, S2, S3, S4, S5,SM1, SM2, SM3, T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7 e T8, respectivamente.

Figura 4. Alinhamento ótimo da região contendo o motivo de in-serção de forma H de 18 resíduos no domínio C-terminal de oleosinas. Aregião contendo o sítio da inserção de 18 resíduos de todas as oleosinas decafé foi alinhada com oleosinas selecionadas de outras espécies vegetaisusando-se o programa Clustal Wcom uma etapa de otimização manual sub-sequente. Os resíduos conservados estão dentro de caixas; resíduos com amaior conservação estão em negrito. Os números de acesso das seqüênciasde oleosina alinhadas são: AAF01542, BAB0290, CAA44225, Q39165 eAA02263 para Arabidopsis Semente 1 (S1), S2, S3, S4 e S5 (Kim et ai.,2002; Tai et ai, 2002) (SEQ ID NOS: 18 - 22, respectivamente); AY928084para Coffea arábica OLE-1 (SEQ ID NO: 1); P21641, S52030 e S52029 paramilho H1, H2 e L (SEQ ID NOS: 23 - 25, respectivamente); U43931, U43930e BAD23684 para arroz H, L1 e L2 (SEQ ID NOS: 26 - 28, respectivamente);U9770 (Chen et ai, 1997), AF302807 e AF091840 (Tai et ai, 2002) paraSesamum indicum H2, H1 e L (SEQ ID NOS: 29-31, respectivamente);AF466102 e AF466103 para T. cacao 16.9 e 15.8 (Guilloteau et ai, 2003)(SEQ ID NOS: 32 - 33, respectivamente).

Figura 5. Expressão de genes de oleosina de Coffea canephorae Coffea arabica em diferentes tecidos e durante a maturação da semente.

Os níveis de transcrito para A) OLE-1, B) OLE-2, C) OLE-3, D) OLE-4, E)OLE-5 em vários tecidos e na semente em desenvolvimento e tecidos depericarpo de frutos de café em diferentes estágios foram determinados tantopor RT-PCR convencional (painéis inseridos acima dos histogramas), quantoquantitativa (histogramas). Os níveis de expressão são determinados comrelação à expressão de transcritos do gene RPL39 constitutivamente ex-pressado nas mesmas amostras. F) mostra o transcrito de controle de R-PL39 em todos os tecidos e amostras. SG, grão verde pequeno; LG, grãogrande; YG, grão amarelo; RG1 grão maduro; SP, pericarpo verde pequeno;LP, pericarpo grande; YP, pericarpo amarelo; RP, pericarpo vermelho; St,caule; Le1 folha; Fl1 flor; Rt, raiz.Figura 6. Expressão dos genes de oleosina e esteroleosina docafé. A) Expressão do gene CSP1 que codifica a proteína de armazenamen-to 11S em Coffea canephora e Coffea arabica em diferentes tecidos e duran-te a maturação da semente. A transcrição reversa foi realizada com quanti-dade iguais de RNA total. SG1 grão verde pequeno; LG1 grão grande; YG,grão amarelo; RG1 grão maduro; SGP1 pericarpo verde pequeno; LP1 peri-carpo grande; YP1 pericarpo amarelo; RP, pericarpo vermelho; St, caule; Le,folha; Fl, flor; Rt, raiz. B) Expressão de esteroleosina em vários tecidos de-terminada por PCR quantitativa. C) Expressão de esteroleosina em Coffeaarabica (T-2308) durante a germinação da semente. Os níveis de transcritoforam analisados no grão em cinco estágios de germinação diferentes. Ma-duro (grãos completamente desenvolvido), TO (após embebição), 2DAI (doisdias após a embebição), 5DAI, 30DAI e 60DAI.

Figura 7. Níveis de transcrito de oleosina em Coffea arabica (T-2308) durante a germinação da semente. Os níveis de transcrito foram ana-lisados no grão em cinco estágios de germinação diferentes. TO (após em-bebição), 3DAI (três dias após a embebição), 5DAI, 30DAI e 60DAI.

Figura 8. Seqüência genômica in silico do gene CcOLE-1. Osinciadores usados para GeneWaIker estão sublinhados na seqüência. Análi-se de seqüência do promotor CcOLE-1 (pOLE-1, SEQ ID NO: 15). Seqüên-cia de nucleotídeos e de proteína deduzida de OLE-1 de C. canephora (SEQID NO: 2, SEQ ID NO: 9). Uma seta indica o sítio de início de transcrição. Asuposta caixa TATA está mostrada (===). O motivo RY é indicado por umacaixa. O "motivo de endosperma" (.....), motivo do tipo intensificador rico emAT (—-~) e caixas E (·-·) estão indicados. O número de aceso da seqüênciado promotor CcOLE-1 (pOLE-1, SEQ ID NO: 15) depositado na base de da-dos EMBL/Genebank é AY841277. A seqüência transcrita completa deCcOLE-1 é mostrada em negrito. Os aminoácidos de CcOLE-1 estão indica-dos abaixo da primeira base do códon. O códon de início e o de parada es-tão indicados em caixas. Um sítio de restrição Hindlll está indicado na posi-ção 123 pb a partir do sítio de início de transcrição.

Figura 9. Alinhamento ótimo de cada seqüência de proteína deCoffea canephora com as quatro seqüências de banco de dados mais pró-ximas. figura 9A) CcOLE-1 9AY841271); figura 9B) CcOLE-2 (AY841272);figura 9C) CcOLE-3 (AY841273); figura 9D) CcOLE-4 (AY841274) e figura9E) CcOLE-5 (AY841275). Os alinhamentos foram gerados com o programaClustal W no pacote de software Lasergene (DNASTAR) e, então, ajustadosmanualmente para otimizar o alinhamento. A localização do motivo P-(5X)-SP-(3X)-P prolina knot é indicada por uma linha acima e envolvimento comuma caixa dos resíduos PeS conservados. As seqüências conservadasestão envolvidas com uma caixa; regiões altamente conservadas são mos-tradas em negrito. Os números de acesso das seqüências de oleosina ali-nhadas são: AAF69712 e BAB02215 para Arabidopsis Semente/Micrósporo1 (SM1) e SM2 (Kim et ai, 2002) (SEQ ID NOS: 41, 42, respectivamente);AY928084 para Coffea arabica (Ca) OLE-1 (SEQ ID NO: 1); AA065960 paraCorylus avellana (Cav) OLE-L (SEQ ID NO: 38); T10121 para Citrus sinensisOLE (SEQ ID NO: 36) (Naot et ai, 1995); AAL92479 para Olea europaeaOLE: Q43804 para Prunus dulcis para PdOLE-1 (SEQ ID NO: 37) (Garcia-Mas et ai, 1995); AAG24455, AAG09751, AAG43516 e AAG43517 para Pe-rilla frutescens OLN-Lb, OLN-La e OLN-As (SEQ ID NOS: 39, 40 e 35, res-pectivamente); U97700 (Chen et ai, 1997); AF302807 e AF091840 (Tai etai, 2002) para Sesamum indicum H2, H1 e L (SEQ ID NOS: 29 - 31, respec-tivamente).

Figura 10. Perfis de hidrofobicidade para a família da oleosina deC. canephora. Os gráficos de hidropatia foram gerados de acordo com o mé-todo de Kyte e Doolittle (1982) usando-se o programa apropriado no pacotede software Lasergene (DNASTAR). Valores negativos indicam regiões hi-drofóbicas. A localização do motivo prolina knot é mostrada por uma seta. AFigura 10 (F) é um gráfico de hidrofilicidade.

Figura 11. Análise de Southern Blot do gene CcOLE-1. Avalia-ção do número de cópias de OLE-1 no genoma de C. canephora. DNA ge-nômico de robusta foi cortado com Dral, Sspl1 Notl, Rsal ou Hindlll/Sspl eDral/Rsal. As transferências genômicas foram sondadas com o cDNA decomprimento total marcado com P32, incluindo as regiões não-traduzidas 3' e5', para CcOLE-1. A autorradiografia apresentada foi exposta durante 10dias a -80°C.

Figura 12. Expressão de OLE-1 nas folhas de Coffea arabica(catimor) sob estresse de seca. Os níveis de transcrito para OLE-1 foramdeterminados por RT-PCR quantitativa. Os níveis de expressão foram de-terminados com relação à expressão dos transcritos do gene rpl39 constitu-tivamente expressado nas mesmas amostras. As barras não marcadas emcada caso representam os níveis médios de transcrito em três controles bemaguados. Os níveis de transcrito em três plantas sob estresse de água inde-pendentes são mostrados em barras hachuradas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

Definições:

Vários termos referentes a moléculas biológicas e outros aspec-tos da presente invenção são usados em todo o relatório e nas reivindicações.

"Isolado" significa alterado "pela mão do homem" a partir do es-tado natural. Se uma composição ou substância ocorrer na natureza, foi "iso-lada" se tiver sido alterada ou removida de seu ambiente original, ou ambos.Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídio naturalmente presenteem uma planta ou animal vivo não está "isolado", mas o mesmo polinucleo-tídeo ou polipeptídio separado dos materiais coexistentes de seu estado na-tural está "isolado", como o termo é aqui empregado.

"Polinucleotídeo", também chamado de "molécula de ácido nu-cleico", se refere geralmente a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxir-ribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não-modificado ou RNA ou DNAmodificado. "Polinucleotídeos" incluem, sem limitação, DNA de fita simples edupla, DNA que seja uma mistura de regiões de fita simples e dupla, RNA defita simples e dupla e RNA que seja uma mistura de regiões de fita simples edupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que possa ser de fitasimples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fitasimples e dupla. Além disso, "polinucleotídeo" se refere a regiões de fita tri-pla compreendendo RNA ou DNA ou tanto RNA, quanto DNA. O termo poli-nucleotídeo também inclui DNAs ou RNAs contendo uma ou mais basesmodificadas e DNAs ou RNAs com estruturas principais modificadas por ra-zões de estabilidade ou outras. Bases "modificadas" incluem, por exemplo,bases tritiladas e bases incomuns, como inosina. Várias modificações po-dem ser feitas no DNA e RNA; assim, "polinucleotídeo" engloba formas quí-mica, enzimática ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos con-forme tipicamente encontradas na natureza, assim como as formas químicasde DNA e RNA características de vírus e células. "Polinucleotídeo" tambémengloba polinucleotídeos relativamente curtos, freqüentemente chamados deoligonucleotídeos.

"Polipeptídio" se refere a qualquer peptídio ou proteína compre-endendo dois ou mais aminoácidos unidos entre si por ligações peptídicasou ligações peptídicas modificadas, isto é, isoésteres de peptídios. "Polipep-tídio" se refere tanto a cadeias curtas, comumente chamadas de peptídios,oligopeptídios ou oligômeros, quanto a cadeias mais longas, geralmentechamadas de proteínas. Polipeptídios podem conter aminoácidos diferentesdos 20 aminoácidos codificados por genes. "Polipeptídios" incluem seqüên-cias de aminoácidos modificadas por processos naturais, como processa-mento pós-tradução, ou por técnicas de modificação química que sejam bemconhecidas na técnica. Essas modificações estão bem descritas em textosbásicos e em monografias mais detalhadas, assim como em uma volumosaliteratura de pesquisa. As modificações podem ocorrer em qualquer local emum polipeptídio, incluindo a estrutura principal peptídica, as cadeias colate-rais de aminoácidos e as terminações amino ou carboxila. Deve-se notar queo mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em grausvariáveis em vários sítios em um dado polipeptídio. Da mesma forma, umdado polipeptídio pode conter muitos tipos de modificações. Os polipeptídiospodem ser ramificados como resultado da ubiquitinação e podem ser cícli-cos, com ou sem ramificação. Polipeptídios cíclicos, ramificados e cíclicosramificados podem resultar de processos pós-tradução naturais ou podemser preparados por métodos sintéticos. As modificações incluem a acetila-ção, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, liga-ção covalente de fração heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou deri-vado nucleotídico, ligação covalente de um lipídio ou derivado Iipidico1 liga-ção covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de liga-ção dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formaçãode cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, gli-cosilação, formação de âncora GPI1 hidroxilação, iodação, metilação, miris-toilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, ra-cemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por RNA de transfe-rência de aminoácidos a proteínas, como arginilação e ubiquitinação. Veja,por exemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2a Ed., Τ. E.Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque, 1993, e Wold, F.,Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, p. 1 -12, em Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson,Ed., Academic Press, Nova Iorque, 1983; Seifter et ai, "Analysis for ProteinModifications and Nonprotein Cofactors", Meth Enzymol (1990) 182:626-646,e Rattan et ai, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and A-ging", Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62.

"Variante", conforme o termo é aqui usado, é um polinucleotídeoou polipeptídio que difira de um polinucleotídeo ou polipeptídio de referência,respectivamente, mas retenha propriedades essenciais. Uma variante típicade um polinucleotídeo difere na seqüência de nucleotídeos de outro polinu-cleotídeo de referência. Alterações na seqüência de nucleotídeos da variantepodem ou não alterar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídio codifi-cado pelo polinucleotídeo de referência. Alterações de nucleotídeos podemresultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncamentos de ami-noácidos no polipeptídio codificado pela seqüência de referência, conformediscutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídio diferente na se-qüência de aminoácidos de outro polipeptídio de referência. Em geral, asdiferenças são limitadas, de modo que as seqüências do polipeptídio de re-ferência e da variante sejam globalmente muito similares e, em muitas regi-ões, idênticas. Uma variante e um polipeptídio de referência podem diferir naseqüência de aminoácidos por uma ou mais substituições, adições ou dele-ções, em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácido substituído ouinserido pode ou não ser um codificado pelo código genético. Uma variantede um polinucleotídeo ou polipeptídio pode ser de ocorrência natural, comouma variante alélica, ou pode ser uma variante que não seja conhecida co-mo de ocorrência natural. Variantes de ocorrência não-natural de polinucleo-tídeos e polipeptídios podem ser preparadas por técnicas de mutagênese oupor síntese direta.

Com referência a plantas mutantes, os termos "mutante nulo" ou"mutante de perda de função" são usados para designar um organismo ouseqüência de DNA genômico com uma mutação que faça com que o produtodo gene seja não-funcional ou grandemente ausente. Essas mutações po-dem ocorrer nas regiões codificadoras e/ou reguladoras do gene e podemser alterações de resíduos individuais, ou inserções ou deleções de regiõesde ácidos nucléicos. Essas mutações também podem ocorrer nas regiõescodificadoras e/ou reguladoras de outros genes, que podem, eles mesmos,regular ou controlar um gene e/ou proteína codificada, para fazer com que aproteína seja não-funcional ou grandemente ausente.

O termo "substancialmente a mesma" se refere a seqüências deácidos nucléicos ou aminoácidos com variações de seqüência que não afe-tem materialmente a natureza da proteína (isto é, a estrutura, característicasde estabilidade, especificidade de substrato e/ou atividade biológica da pro-teína). Com referência particularmente a seqüências de ácidos nucléicos, otermo "substancialmente a mesma" pretende se referir à região codificadorae a seqüências conservadas que governem a expressão e se refere princi-palmente a códons degenerados que codifiquem o mesmo aminoácido, ou acódons alternativos que codifiquem aminoácidos substitutos conservadoresno polipeptídio codificado. Com referência a seqüências de aminoácidos, otermo "substancialmente a mesma" se refere geralmente a substituiçõese/ou variações conservadoras em regiões do polipeptídio não envolvidas nadeterminação da estrutura ou função.

Os termos "por cento idêntico" e "por cento similar" também sãoaqui usados em comparações entre seqüências de aminoácidos e de ácidosnucléicos. Quando se referem a seqüências de aminoácidos, "identidade" ou"por cento idêntico" se refere à porcentagem de aminoácidos da presenteseqüência de aminoácidos que tenham correspondido a aminoácidos idênti-cos na seqüência de aminoácidos comparada por um programa de análisede seqüência. "Por cento similar" se refere à porcentagem de aminoácidosda presente seqüência de aminoácidos que tenham correspondido a amino-ácidos idênticos ou conservados. Aminoácidos conservados são aquelesque diferem em estrutura, mas que são similares em propriedades físicas, demodo que a troca de um pelo ouro não altere apreciavelmente a estruturaterciária da proteína resultante. Substituições conservadoras são definidasem Taylor (1986, J. Theor. Biol. 119:205). Quando se referindo a moléculasde ácidos nucléicos, "por cento idêntico" se refere à porcentagem dos nucle-otídeos da presente seqüência de ácido nucleico que tenham correspondidoa nucleotídeos idênticos por um programa de análise de seqüência.

"Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadospor métodos conhecidos. Seqüências de ácidos nucléicos e seqüências deaminoácidos podem ser comparadas usando-se programas de computadorque alinham as seqüências similares dos ácidos nucléicos ou aminoácidos e,portanto, definem as diferenças. Em metodologias preferidas, empregam-seos programas BLAST (NCBI) e os parâmetros nele usados, e o sistemaDNAstar (Madison, Wl) é usado para alinhar fragmentos de seqüência deseqüências de DNA genômico. Entretanto, alinhamentos equivalentes e ava-liações de similaridade/identidade podem ser obtidos mediante uso de qual-quer software de alinhamento padrão. Por exemplo, o Pacote GCG Wiscon-sin versão 9.1, disponível no Genetics Computer Group em Madison, Wis-consin, e os parâmetros padrões usados (penalidade de criação de vão =12, penalidade de extensão de vão = 4) por esse programa também podemser usados para comparar a identidade e similaridade de seqüência.

"Anticorpos", conforme aqui usado, incluem anticorpos policlo-nais e monoclonais, anticorpos quiméricos, de cadeia única e humanizados,assim como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab1, F(ab')2 eFv), incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de Fab ou outraimunoglobulina. Com relação a anticorpos, o termo "imunologicamente es-pecífico" ou "específico" se refere a anticorpos que se liguem a um ou maisepítopos de uma proteína de interesse, mas que não reconheçam substan-cialmente ou se liguem a outras moléculas em uma amostra contendo umapopulação mista de moléculas biológicas antigênicas. Ensaios de triagempara determinar a especificidade de ligação de um anticorpo são bem co-nhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Para uma discussão abran-gente desses ensaios, veja Harlow et al. (Eds.), Antibodies A LaboratoryManual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Ca-pítulo 6.

O termo "substancialmente pura" se refere a uma preparaçãocompreendendo pelo menos 50 - 60% em peso do composto de interesse(por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, proteína e outros). Mais pre-ferivelmente, a preparação compreende pelo menos 75% em peso e, o maispreferivelmente, 90 - 99% em peso do composto de interesse. A pureza émedida por métodos apropriados para o composto de interesse (por exem-plo, métodos cromatográficos, eletroforese em agarose ou gel de poliacrila-mida, análise de HPLC e outros).

Com relação a moléculas de ácido nucleico de fita simples, otermo "hibridizando-se especificamente" se refere à associação entre duasmoléculas de ácido nucleico de fita simples de seqüências suficientementecomplementares para permitir essa hibridização sob condições predetermi-nadas geralmente usadas na técnica (às vezes chamadas de "substancial-mente complementares"). Em particular, o termo se refere à hibridização deum oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementarcontida dentro de uma molécula de DNA ou RNA de fita simples, excluindosubstancialmente a hibridização do oligonucleotídeo com ácidos nucléicosde fita simples de seqüência não-complementar.

Uma "seqüência codificadora" ou "região codificadora" se referea uma molécula de ácido nucleico com informação de seqüência necessáriapara produzir um produto de genes, quando a seqüência é expressada. Aseqüência codificadora pode compreender seqüências não-traduzidas (porexemplo, íntrons ou regiões 5' ou 3' não-traduzidas) dentro de regiões tradu-zidas, ou pode não ter essas seqüências não-traduzidas (por exemplo, comono cDNA).

"Intron" se refere a seqüências polinucleotídicas em um ácidonucleico que não codifiquem informação relacionada à síntese de proteína.Essas seqüências são transcritas em mRNA, mas são removidas antes datradução do mRNA em uma proteína.

O termo "operacionalmente ligado" ou "operacionalmente inseri-do" significa que as seqüências reguladoras necessárias para a expressãoda seqüência codificadora estão colocadas em uma molécula de ácido nu-cleico nas posições apropriadas com relação à seqüência codificadora, parapermitir a expressão da seqüência codificadora. A título de exemplo, umpromotor está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora quan-do o promotor é capaz de controlar a transcrição ou expressão dessa se-quência codificadora. Seqüências codificadoras podem estar operacional-mente ligadas a promotores ou seqüências reguladoras em uma orientaçãoem senso ou antissenso. O termo "operacionalmente ligado" é às vezes apli-cado ao arranjo de outros elementos de controle de transcrição (por exem-plo, intensificadores) em um vetor de expressão.

Seqüências de controle de transcrição e tradução são seqüên-cias reguladoras de DNA, como promotores, intensificadores, sinais de poli-adenilação, terminadores e outras, que garantem a expressão de uma se-qüência codificadora em uma célula hospedeira.

Os termos "promotor", "região promotora" ou "seqüência promo-tora" se referem geralmente a regiões reguladoras de transcrição de um ge-ne, que podem ser encontradas no lado 5' ou 3' da região codificadora, oudentro da região codificadora ou dentro de íntrons. Tipicamente, um promo-tor é uma região reguladora de DNA capaz de se ligar a RNA polimerase emuma célula e iniciar a transcrição de uma seqüência codificadora a jusante(direção 3'). A seqüência promotora 5' típica está ligada em sua terminação3' pelo sítio de início de transcrição e se estende a montante (direção 5') pa-ra incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar atranscrição em níveis detectáveis acima do fundo. Dentro da seqüência pro-motora há um sítio de início de transcrição (convenientemente definido pormapeamento com nuclease S1), assim como domínios de ligação a proteína(seqüências de consenso) responsáveis pela ligação da RNA polimerase.

Um "vetor" é um réplicon, como um plasmídio, fago, cosmídio ouvírus, ao qual outro segmento de ácido nucleico pode ser operacionalmenteinserido para ocasionar a replicação ou expressão do segmento.

O termo "construto de ácido nucleico" ou "construto de DNA" éàs vezes usados para se referir a uma seqüência ou seqüências codificado-ras operacionalmente ligadas a seqüências reguladoras apropriadas e inse-ridas em um vetor para transformação de uma célula. Esse termo pode serusado de maneira intercambiável com o termo "DNA transformador" ou"transgene". Esse construto de ácido nucleico pode conte uma seqüênciacodificadora para um produto de gene de interesse, juntamente com um ge-ne marcador selecionável e/ou gene repórter.

Um "gene marcador" ou "gene marcador selecionável" é um ge-ne cujo produto de gene codificado confira uma característica que permita àcélula contendo o gene ser selecionado dentre células não contendo o gene.Vetores usados para engenharia genética tipicamente contêm um ou maisgenes marcadores selecionáveis. Tipos de genes marcadores selecionáveisincluem (1) genes de resistência a antibióticos, (2) genes de tolerância ouresistência a herbicidas e (3) genes marcadores metabólicos ou auxotróficosque permitam que células transformadas sintetizem um componente essen-cial, normalmente um aminoácido, que as células não possam produzir deoutra forma.

Um "gene repórter" também é um tipo de gene marcador. Tipi-camente, codifica um produto de gene que seja ensaiável ou detectável pormeios laboratoriais padronizados (por exemplo, atividade enzimática, fluo-rescência).

O termo "expressa", "expressado" ou "expressão" de um genese refere à biossíntese de um produto de gene. O processo envolve a trans-crição do gene em mRNA e, então, tradução do mRNA em um ou mais poli-peptídios e engloba todas as modificações pós-tradução de ocorrência natural.

"Endógeno" se refere a qualquer constituinte, por exemplo, umgene ou ácido nucleico ou polipeptídio que possa ser encontrado natural-mente dentro do organismo especificado.

Uma região "heteróloga" de um construto de ácido nucleico é umsegmento (ou segmentos) identificável(eis) da molécula de ácido nucleicodentro de uma molécula maior que não seja encontrado em associação coma molécula maior na natureza. Assim, quando a região heteróloga compre-ende um gene, o gene normalmente será flanqueado por DNA que não flan-queia o DNA genômico no genoma do organismo fonte. Em outro exemplo,uma região heteróloga é um construto em que a própria seqüência codifica-dora não seja encontrada na natureza (por exemplo, um cDNA em que aseqüência codificadora genômica contenham íntrons, ou seqüências sintéti-cas com códons diferentes do gene nativo). Variações alélicas ou eventosmutacionais de ocorrência natural não dão origem a uma região heterólogade DNA, conforme aqui definida. O termo "construto de DNA", conforme a-cima definido, também é usado para se referir a uma região heteróloga, par-ticularmente uma construída para uso na transformação de uma célula.

Uma célula foi "transformada" ou "transfectada" por DNA exóge-no ou heterólogo quando esse DNA tiver sido introduzido dentro da célula. ODNA transformador pode ou não ser integrado (covalentemente ligado) nogenoma da célula. Em procariotas, leveduras e células de mamíferos, porexemplo, o DNA transformador pode ser mantido em um elemento episso-mal, como um plasmídio. Com relação a células eucarióticas, uma célulatransformada de maneira estável é uma em que o DNA transformador tenhase tornado integrado em um cromossomo, de modo que seja herdado pelascélulas filhas mediante replicação de cromossomo. Essa estabilidade é de-monstrada pela capacidade da célula eucariótica de estabelece linhagenscelulares ou clones compostos por uma população de células filhas conten-do o DNA transformador. Um "clone" é uma população de células derivadasde uma única célula ou ancestral comum por mitose. Uma "linhagem celular"é um clone de uma célula primária que seja capaz de crescimento estável invitro por muitas gerações.

"Grão", "semente" ou "fava" se refere à unidade de reproduçãoda planta em florescimento, capaz de se desenvolver em outra planta des-sas. Conforme aqui usado, particularmente com relação a plantas de café,os termos são usados de maneira sinônima ou intercambiável.

Conforme aqui usado, o termo "planta" inclui referência a plantasinteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, rebentos, raízes),sementes, pólen, células vegetais, organelas de células vegetais e sua des-cendência. Partes de plantas transgênicas devem ser entendidas dentro doâmbito da invenção como compreendendo, por exemplo, células vegetais,protoplastos, tecidos, calos, embriões, assim como flores, caules, sementes,pólen, frutos, folhas ou raízes que originem plantas transgênicas ou suadescendência.

Descrição:

Em um de seus aspectos, a presente invenção apresenta molé-culas de ácido nucleico de café que codificam uma variedade de oleosinas,assim como uma esteroleosina. Exemplos representativos de moléculas deácidos nucléicos codificadoras de oleosina e esteroleosina foram identifica-das em bases de dados de mais de 47.000 etiquetas de seqüência expres-sada (ESTs) de várias bibliotecas de cDNA de Coffea canephora (robusta)preparadas com RNA isolado de folhas jovens e dos tecidos de grãos e peri-carpo de frutos colhidos em diferentes estágios de desenvolvimento. ESTssuperpostos foram identificados e "agrupados" em unigenes (contigs) com-preendendo seqüências codificadoras completas. As seqüências de unigeneforam anotadas realizando-se uma busca BLAST de cada seqüência indivi-dual contra a base de dados de proteínas não-reduntantes do NCBI (CentroNacional de Informação em Biotecnologia). Os quadros abertos de leitura decinco dos unigenes expressados durante o desenvolvimento do grão foramanotados como codificando proteínas ricas em glicina, determinadas comosendo oleosinas. Um sexto quadro aberto de leitura foi identificado por análi-se BLAST das bases de dados com uma seqüência de esteroleosina conhe-cida. ESTs representando cDNA de comprimento total para cada unigene deoleosina ou esteroleosina foram isoladas e sequenciadas. Um cDNA decomprimento total para uma das oleosinas (OLE-1) também foi isolado e se-quenciado. Esses cDNAs são aqui chamados de CaOLE-1 (SEQ ID NO: 1) eCcOLE-1 (SEQ ID NO: 2), CcOLE-2 (SEQ ID N0:3), CcOLE-3 (SEQ IDN0:4), CcOLE-4 (SEQ ID N0:5), CcOLE-5 (SEQ ID N0:6) e CcSTO-1 (SEQID NO: 7). ESTs que formam unigenes de oleosina e esteroleosina eram to-das de bibliotecas obtidas de grãos 30 e 46 semanas após a fertilização.

As seqüências de aminoácidos deduzidas de CaOLE-1 e CcO-LE-1 a CcOLE-5, aqui apresentadas como SEQ ID NOS: 8-13, têm massasmoleculares de 15,7, 14,1, 18,6, 15,3 e 17,9 kDa, respectivamente. Cadauma dessas proteínas contém uma região hidrofóbica de 81, 73, 80, 72 e 75aminoácidos, respectivamente, com a assinatura motivo knot contendo trêsprolinas conservadas e uma serina conservada em seu centro. A seqüênciade aminoácidos deduzida de Cc STO-1, aqui apresentada como SEQ ID NO:14, tem uma massa molecular de 40,5 kDa, com um motivo prolina knot den-tro do domínio N-terminal.

Ortólogos próximos das cinco oleosinas e da esteroleosina decafé foram identificados em Arabidopsis e outras plantas com corpúsculosde óleo bem caracterizados, como gergelim, arroz e milho. A análise de ex-pressão quantitativa indica que pode haver pelo menos dois tipos de pa-drões de expressão para oleosinas do tipo semente (S) e micrósporo floral(SM); descobriu-se que um conjunto de genes tem um nível de expressãomais elevado no início da expressão do gene de oleosina, ao passo que sedescobriu que o outro conjunto exibia expressão mais elevada um poucomais tarde no desenvolvimento do grão. Conforme evidenciado por dadosapresentados em maiores detalhes nos exemplos, parece haver diferençassignificativas nos níveis e distribuição de transcritos de oleosina em duasespécies de café, C. arabica e C. canephora (robusta), com o grão de C.arabica que contém mais óleo possuindo um nível global mais elevado detranscritos de oleosina com relação à expressão de uma proteína ribossomalconstitutivamente expressada. Essa variação observada no nível global deproteínas oleosina entre duas espécies de café pode proporcionar a basepara a manipulação do café, mediante técnicas genéticas ou cruzamentostradicionais, para influenciar características comercialmente importantes docafé, como teor e perfil de óleos, tamanho e estrutura de corpúsculos de ó-leo, formação de voláteis derivados de lipídios, (E)-2-nonenal e trans-trans-2-4-decadienal durante a torrefação do café, e a geração de "espuma" du-rante a extração do café expresso.

Outro aspecto da invenção apresenta seqüências promotoras eelementos relacionados que controlam a expressão de genes de oleosina nocafé. Conforme descrito em maiores detalhes nos exemplos, uma seqüênciapromotora, pOLE-1 (contida na SEQ ID NO: 15), de um desses genes foiidentificada por desenvolvimento de iniciador auxiliado por PCR. Demons-trou-se que o promotor pOLE-1 contém vários elementos reguladores espe-cíficos, conforme mostrado na figura 8 e descrito nos exemplos. Usando-seesse promotor ligado ao gene repórter GUS, determinou-se que esse promo-tor é específico para sementes, cotilédones, hipocótilos e primeiras folhasverdadeiras de mudas em desenvolvimento. Também se demonstrou que aexpressão do gene era induzida por estresse de água.

Embora polinucleotídeos que codificam oleosinas e esteroleosi-na de Coffea canephora sejam aqui descritos e exemplificados, esta inven-ção pretende englobar ácidos nucléicos e proteínas codificadas de outrasespécies de Coffea que sejam suficientemente similares para serem usadasde maneira intercambiável com os polinucleotídeos e proteínas de C. cane-phora para os fins descritos abaixo. Portanto, quando os termos "oleosina"ou "esteroleosina" são aqui usados, pretendem englobar todas as oleosinasou esteroleosinas de Coffea com as características físicas, bioquímicas efuncionais genéricas aqui descritas, e polinucleotídeos que as codificam.

Considerados em termos de suas seqüências, polinucleotídeoscodificadores de oleosina e esteroleosina da invenção incluem variantes alé-Iicas e mutantes naturais de SEQ ID NOS: 1 - 7, que provavelmente são en-contrados em diferentes variedades de C. arabica ou C. canephora, e homó-logos das SEQ ID NOS: 1 - 7 provavelmente encontrados em diferentes es-pécies de café. Como se espera que esses variantes e homólogos possuamcertas diferenças nas seqüências de nucleotídeos e aminoácidos, esta in-venção apresenta moléculas de ácidos nucléicos codificadores de oleosinaou esteroleosina isoladas que codificam os respectivos polipeptídios compelo menos cerca de 80% (e, na ordem crescente de preferência, 81 %, 82%,83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98% e 99%) de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS:8 - 14, e compreende uma seqüência de nucleotídeos com faixas equivalen-tes de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 - 7. Por causa davariação natural de seqüências que provavelmente existe entre oleosinas eesteroleosinas, e dos genes que as codificam em diferentes variedades eespécies de café, aqueles versados na técnica esperariam encontrar essenível de variação, enquanto ainda mantendo as propriedades únicas dospolipeptídios e polinucleotídeos da presente invenção. Essa expectativa édevida em parte à degeneração do código genético, assim como ao sucessoevolucionário conhecido de variações de seqüência de aminoácidos conser-vadores, que não alteram apreciavelmente a natureza da proteína codifica-da. Portanto, essas variantes e homólogos são considerados substancial-mente os mesmos entre si e são incluídos dentro do âmbito da presente in-venção.

Vários domínios ou fragmentos dos genes e proteínas de oleosi-na e esteroleosina do café também são considerados dentro do âmbito dainvenção. Por exemplo, os domínios amino e carbóxi terminais hidrofílicos ouanfipáticos dos polipeptídios de oleosina, por exemplo, os cerca de 10-40resíduos N-terminais e os cerca de 30 - 50 resíduos C-terminais, e os poli-nucleotídeos codificadores correspondentes, podem ser usados para distin-guir uma proteína oleosina ou gene codificador de oleosina de outra. Os do-mínios centrais hidrofóbicos conservados e os polinucleotídeos codificadorescorrespondentes podem ser úteis para identificar ortólogos de oleosina deoutras espécies ou gêneros. Da mesma forma, as partes menos conserva-das do polipeptídio de esteroleosina (por exemplo, resíduos 1 a cerca de 50,cerca de 81 a cerca de 102 e cerca de 308 até a terminação carbóxi) e ospolinucleotídeos codificadores correspondentes podem distinguir esteroleo-sinas intimamente relacionadas entre si, ao passo que as partes conserva-das (por exemplo, resíduos 50 a cerca de 80 e cerca de 103 a cerca de 307)podem ser usadas para identificar ortólogos menos intimamente relacionados.

Os domínios centrais hidrofóbicos conservados encontram parti-cular utilidade para direcionar proteínas recombinantes para corpúsculos deóleo de plantas, incluindo café, conforme descrito na patente norte-americana n° 6.137.032. Também conforme descrito na patente norte-americana n° 6.137.032, a associação de proteínas recombinantes compre-endendo um domínio hidrofóbico de oleosina de café com corpúsculos deóleo (estruturas do tipo corpúsculo de óleo naturais ou artificialmente cons-truídas formadas usando-se, por exemplo, um óleo vegetal) pode ser explo-rada para facilitar a purificação dessas proteínas recombinantes (van Rooi-jen e Moloney, 1995, Bio/Technology 13: 72-77).

Conforme mencionado, os inventores demonstraram que a ex-pressão do gene de oleosina é específica para sementes e mudas no café,assim como induzível por estresse de seca. Portanto, seqüências regulado-ras de genes associadas a genes de oleosina são de utilidade prática e sãoconsideradas dentro do âmbito da presente invenção. O promotor OLE-1 deC. canephora é exemplificado aqui. A região a montante da seqüência ge-nômica OLE-1 de C. canephora é aqui apresentada como SEQ ID NO: 5, econtém parte de ou todo um promotor exemplificativo da invenção, emboraoutras partes do promotor possam ser encontradas em outras localizaçõesno gene, conforme exemplificado na definição de "promotor" acima apresen-tada. Entretanto, promotores e outras seqüências reguladoras de genes deoleosina e esteroleosina de qualquer espécie de café podem ser obtidos pe-los métodos descritos abaixo, e podem ser utilizados de acordo com a pre-sente invenção. Os promotores e elementos reguladores que governam aespecificidade de tecido e a especificidade temporal da expressão do genede oleosina e esteroleosina podem ser vantajosamente usadas para alterarou modificar o perfil do corpúsculo de óleo de várias espécies de café, entreoutras utilidades.

As seções a seguir apresentam os procedimentos genéricos en-volvidos na prática da presente invenção. Na medida em que materiais es-pecíficos sejam mencionados, é apenas para fins de ilustração, e não sepretende que limitem a invenção. A menos que especificado de outra forma,usam-se procedimentos bioquímicos e de biologia molecular genéricos, co-mo aqueles apresentados em Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold S-pring Harbor Laboratory (1989) ou Ausubel et al. (eds.), Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons (2005).

Moléculas de Ácidos Nucléicos. Proteínas e Anticorpos:

Moléculas de ácidos nucléicos da invenção podem ser prepara-das por dois métodos gerais: (1) podem ser sintetizadas a partir de trifosfa-tos de nucleotídeos apropriados, ou (2) podem ser isoladas de fontes bioló-gicas. Ambos os métodos utilizam protocolos bem conhecidos na técnica.

A disponibilidade de informações de seqüências de nucleotí-deos, como o cDNA com SEQ ID NOS: 1 - 7 ou a seqüência reguladora deSEQ ID NO: 15, permite a preparação de uma molécula de ácido nucleicoisolada da invenção por síntese de oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos sin-téticos podem ser preparados pelo método de fosforamidita empregado noSintetizador de DNA Applied Biosystems 38A ou dispositivos similares. Oconstruto resultante pode ser purificado de acordo com métodos conhecidosna técnica, como cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Polinu-cleotídeos longos de fita dupla, como uma molécula de DNA da presenteinvenção, têm de ser sintetizados em estágios, devido às limitações de ta-manho inerentes aos atuais métodos sintéticos de oligonucleotídeos. Assim,por exemplo, uma molécula longa de fita dupla pode ser sintetizada comovários segmentos menores de complementaridade apropriada. Segmentoscomplementares assim produzidos podem ser anelados, de modo que cadasegmento possua terminações coesivas apropriadas para fixação de umsegmento adjacente. Segmentos adjacentes podem ser ligados por anela-mento de terminações coesivas na presença de DNA Iigase para construiruma molécula longa de fita dupla inteira. Uma molécula de DNA sintéticaassim construída pode ser, então, clonada e amplificada em um vetor apro-priado.

De acordo com a presente invenção, ácidos nucléicos com onível apropriado de homologia de seqüência com parte das ou todas as regi-ões codificadoras e/ou reguladoras dos polinucleotídeos codificadores deoleosina ou esteroleosina podem ser identificados usando-se condições hi-bridização e lavagem de rigor apropriado. Aqueles versados na técnica per-ceberão que a estratégia acima mencionada, quando aplicada a seqüênciasgenômicas, além de permitir o isolamento de seqüências codificadoras deoleosina ou esteroleosina, também permitirá o isolamento de promotores eoutras seqüências reguladoras de genes associadas aos genes de oleosinaou esteroleosina, mesmo que as próprias seqüências reguladoras possamnão compartilhar homologia suficiente para permitir uma hibridização ade-quada.

Como uma ilustração típica, podem-se efetuar hibridizações, deacordo com o método de Sambrook et ai, usando-se uma solução de hibri-dização que compreenda: 5X SSC1 5X reagente deDenhardt, 1,0% de SDS,100 pg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e fragmentado,0,05% de pirofosfato de sódio e até 50% de formamida. A hibridização é rea-lizada a 37 - 42°C durante pelo menos seis horas. Após a hibridização, osfiltros são lavados da seguinte maneira: (1) 5 minutos à temperatura ambien-te em 2X SSC e 1% de SDS; (2) 15 minutos à temperatura ambiente em 2XSSC e 0,01% de SDS; (3) 30 minutos -1 hora a 37°C em 2X SSC e 0,1% deSDS; (4) 2 horas a 45 - 55°C em 2X SSC e 0,1% de SDS, trocando-se a so-lução a cada 30 minutos.

Uma fórmula comum para calcular as condições de rigor reque-ridas para conseguir a hibridização entre moléculas de ácido nucleico deuma homologia de seqüência especificada (Sambrook et ai, 1989):

Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (% de for-mamida) - 600/n° de pb em dúplex.

Como uma ilustração da fórmula acima, usando-se [Na+] =[0,368] e 50% de formamida, com um teor de GC de 42% e um tamanho desonda médio de 200 bases, a Tm é de 57°C. A Tm de um dúplex de DNAdiminui 1 - 1,5°C a cada 1% de diminuição na homologia. Assim, alvos commais de 75% de identidade de seqüência seriam observados usando-se umatemperatura de hibridização de 42°C. Em uma modalidade, a hibridização éa 37°C, e a lavagem final é a 42°C; em outra modalidade, a hibridização é a42°C, e a lavagem final é a 50°C; em ainda outra modalidade, a hibridizaçãoé a 42°C, e a lavagem final é a 65°C, com as soluções de hibridização e la-vagem acima. Condições de alto rigor incluem hibridização a 42°C na solu-ção de hibridização acima e uma lavagem final a 65°C em 0,1 X SSC e 0,1%de SDS durante 10 minutos.

Ácidos nucléicos da presente invenção podem ser mantidos co-mo DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalidadepreferida, os clones são mantidos em vetores de clonagem/expressão deplasmídios, como pGEM-T (Promega Biotech, Madison, Wl), pBluescript (S-tratagene, La Jolla, CA), pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) oupET28a+ (Novagen, Madison, Wl), todos podendo ser propagados em umacélula hospedeira E. coli adequada.

Moléculas de ácidos nucléicos da invenção incluem cDNA, DNAgenômico, RNA e seus fragmentos, que podem ser de fita simples, dupla oumesmo tripla. Assim, esta invenção apresenta oligonucleotídeos (fitas emsenso e antissenso de DNA ou RNA) com seqüências capazes de se hibridi-zarem com pelo menos uma seqüência de uma molécula de ácido nucleicoda presente invenção. Esses oligonucleotídeos são utilizáveis como sondaspara a detecção de genes codificadores de oleosina ou esteroleosina oumRNA em amostras de teste de tecido vegetal, por exemplo, por amplifica-ção por PCR, ou para a regulação positiva ou negativa da expressão de ge-nes codificadores de oleosina ou esteroleosina na ou antes da tradução demRNA em proteínas. Métodos em que oligonucleotídeos codificadores deoleosina ou esteroleosina possam ser utilizados como sondas para essesensaios incluem, mas não se limitam a, (1) hibridização in situ; (2) hibridiza-ção Southern; (3) hibridização Northern; e (4) reações de amplificação varia-das, como reações em cadeia de polimerase (PCR) (incluindo RT-PCR) ereação em cadeia de Iigase (LCR).

Polipeptídios codificados por ácidos nucléicos da invenção po-dem ser preparados de várias maneiras, de acordo com métodos conheci-dos. Se produzidos in situ, os polipeptídios podem ser purificados de fontesapropriadas, por exemplo, sementes, pericarpos ou outras partes da planta.

Alternativamente, a disponibilidade de moléculas de ácidos nu-cléicos isoladas que codifiquem os polipeptídios permite a produção das pro-teínas usando-se métodos de expressão in vitro conhecidos na técnica. Porexemplo, um cDNA ou gene pode ser clonado em um vetor de transcrição invitro apropriado, como pSP64 ou pSP65, para transcrição in vitro, seguidopor tradução livre de células em um sistema de tradução livre de células a-dequado, como reticulócitos de geme de trigo ou coelho. Sistemas de trans-crição e tradução in vitro são comercialmente disponíveis, por exemplo, naPromega Biotech, Madison, Wl, BRL, Rockville, MD1 ou Invitrogen, Carlsbad,CA.

De acordo com uma modalidade preferida, maiores quantidadesdos polipeptídios oleosina ou esteroleosina podem ser produzidas por ex-pressão em um sistema procariótico ou eucariótico adequado. Por exemplo,parte da ou toda a molécula de DNA, como os cDNAs com SEQ ID NOS: 1 -7, pode ser inserida em um vetor plasmídico adaptado para expressão emuma célula bacteiana (como E. coli) ou uma célula de levedura (como Sac-charomyces cerevisiae) ou em um vetor de baculovírus para expressão emuma célula de inseto. Esses vetores compreendem os elementos regulado-res necessários para expressão do DNA na célula hospedeira, posicionadosde modo a permitir a expressão do DNA na célula hospedeira. Esses ele-mentos reguladores requeridos para a expressão incluem seqüências pro-motoras, seqüências de início de transcrição e, opcionalmente, seqüênciasintensificadoras.

As oleosinas ou esteroleosinas produzidas por expressão degene em um sistema procariótico ou eucariótico recombinante podem serpurificadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em uma modali-dade preferida, pode-se usar um sistema de expressão/secreção comercial-mente disponível, em que a proteína recombinante é expressada e, depoisdisso, secretada da célula hospedeira, para ser facilmente purificada domeio em volta. Se não forem usados vetores de expressão/secreção, umaabordagem alternativa envolve a purificação da proteína recombinante porseparação por afinidade, como por interação imunológica com anticorposque se liguem especificamente à proteína recombinante. Esses métodos sãocomumente usados por aqueles versados na técnica.

As oleosinas e esteroleosinas da invenção, preparadas pelosmétodos acima mencionados, podem ser analisadas de acordo com proce-dimentos padronizados.

Oleosinas e esteroleosinas purificadas do café ou produzidas demaneira recombinante podem ser usadas para gerar anticorpos policlonaisou monoclonais, fragmentos de anticorpos ou derivados conforme aqui defi-nidos, de acordo com métodos conhecidos. Além de preparar anticorposcontra a proteína recombinante inteira, se a análise das proteínas ou análi-ses Southern e de clonagem (veja abaixo) indicar que os genes clonadospertencem a uma família de multigenes, então, podem-se gerar anticorposespecíficos para o membro preparados contra peptídios sintéticos corres-pondentes a regiões não conservadas, por exemplo, as regiões N- ou C-terminais, da proteína.

Kits compreendendo um anticorpo da invenção para qualqueruma das finalidades aqui descritas também estão incluídos dentro do âmbitoda invenção. Em geral, esse kit inclui um antígeno de controle para o qual oanticorpo seja específico.

Oleosinas e esteroleosinas purificadas do café ou produzidas demaneira recorpbinante também podem ser usadas como emulsificadores ou,fazendo uso de sua capacidade inerente de estabilizar pequenas gotículasde óleo dentro de células de grãos de café, podem ser usadas como agentesde encapsulação para moléculas solúveis em óleo. Utilizando essas proprie-dades, oleosinas e esteroleosinas de café encontrarão utilidade prática naindústria alimentar para a preparação de emulsões alimentares padroniza-das, incluindo, mas não limitadas a, queijo, iogurte, sorvete, margarina, mai-onese, molhos para saladas ou produtos para assar. Também serão úteis naindústria cosmética para a produção de sabões, cremes para a pele, pastasde dente, batons e maquiagens e outros.

Vetores. Células. Tecidos e Plantas:

Também se apresentam, de acordo com a presente invenção,vetores e kits para produção de células hospedeiras transgênicas que con-tenham um polinucleotídeo ou oligonucleotídeo codificador de oleosina ouesteroleosina, ou seu homólogo, análogo ou variante, em uma orientaçãoem senso ou antissenso, ou gene repórter ou outros construtos sob controlede promotores de oleosina ou esteroleosina e outras seqüências regulado-ras. Células hospedeiras adequadas incluem, mas não se limitam a, célulasvegetais, células bacterianas, células de levedura e outras fúngicas, célulasde insetos e células de mamíferos. Vetores para a transformação de umaampla variedade dessas células hospedeiras são bem conhecidos por aque-les versados na técnica. Eles incluem, mas não se limitam a, plasmídios,fagemídios, cosmídios, baculovírus, bacmídios, cromossomos artificiais bac-terianos (BACs), cromossomos artificiais de levedura (YACs), assim comooutros vetores bacterianos, de levedura e virais. Tipicamente, kits para aprodução de células hospedeiras transgênicas conterão um ou mais vetoresapropriados e instruções para a produção das células transgênicas usando ovetor. Os kits também podem incluir um ou mais componentes adicionais,como meios de cultura para o cultivo das células, reagentes para efetuar atransformação das células e reagentes para testar as células transgênicasquanto à expressão do gene, para nomear alguns.

A presente invenção inclui plantas transgênicas compreendendouma ou mais cópias de um gene codificador de oleosina ou esteroleosina, ouseqüências de ácidos nucléicos que inibam a produção ou função de oleosi-nas ou esteroleosinas endógenas da planta. Isso é realizado por transforma-ção de células vegetais com um transgene que compreenda parte de ou to-da uma seqüência codificadora de oleosina ou esteroleosina, ou seu mutan-te, antissenso ou variante, incluindo RNA, controlada por seqüências regula-doras nativas ou recombinantes, conforme descrito abaixo. Espécies de cafésão atualmente preferidas para a preparação das plantas transgênicas aquidescritas, incluindo, sem limitação, C. abeokutae, C. arabica, C. arnoldiana,C. aruwemiensis, C. bengalensis, C. canephora, C. congensis, C. dewevrei,C. excelsa, C. eugenioides e C. heterocalyx, C. kapakata, C. khasiana, C.liberica, C. moloundou, C. rasemosa, C. salvatrix, C. sessiflora, C. stenophyl-la, C. travencorensis, C. wightiana e C. zanguebariae. Plantas de qualquerespécie também estão incluídas na invenção; essas incluem, mas não selimitam a, tabaco, Arabidopsis e outras espécies "amigáveis para laborató-rio", colheitas de cereais, como milho, trigo, arroz, soja, cevada, centeio, a-veia, sorgo, alfafa, trevo e outras, plantas produtoras de óleo, como canola,tomate verde, girassol, amendoim, cacau e outras, colheitas de legumes,como tomate, fisális, batata, pimenta, berinjela, beterraba, cenoura, pepino,alface, ervilha e outras, plantas de horticultura, como áster, begônia, crisân-temo, delfínio, petúnia, zínia, gramas e turfas e outras.

Plantas transgênicas podem ser geradas usando-se métodospadronizados de transformação de plantas conhecidos por aqueles versadosna técnica. Esses incluem, mas não se limitam a, vetores de Agrobacterium,tratamento de protoplastos com polietileno glicol, distribuição biolística deDNA, microfeixe de laser UV, vetores de vírus gêmeos ou outros vetoresvirais de plantas, tratamento de protoplastos com fosfato de cálcio, eletropo-ração de protoplastos isolados, agitação de suspensões celulares em solu-ção com microglóbulos revestidos com DNA transformador, agitação de sus-pensões celulares em solução com fibras de silício revestidas com DNAtransformador, captação direta de DNA, captação de DNA mediada por Ii-possomo e outros. Esses métodos foram publicados na técnica. Veja, porexemplo, Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach e Weissbach,Eds., 1988); Methods in Plant Molecular Biology (Schuler e Zielinski, Eds.,1989); Plant Molecular Biology Manual (Gelvin, Schilperoort, Verma, eds.,1993); e Methods in Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual (Maliga,Klessig, Cashmore, Gruissem e Varner, eds., 1994).

O método de transformação depende da planta a ser transfor-mada. Vetores de Agrobacterium são freqüentemente usados para transfor-mar espécies dicotiledôneas. Vetores binários de Agrobacerium incluem,mas não se limitam a, BIN19 e seus derivados, a série de vetores pBI e osvetores binários pGA482, pGA492, pl_H7000 (Acesso GenBank AY234330)e qualquer um dos vetores pCAMBIA adequados (derivados dos vetorespPZP construídos por Hajdukiewicz, Svab e Maliga, (1994) Plant Mol. Biol.25: 989-994, disponível na CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601,Austrália ou pela rede mundial em CAMBIA.org). Para a transformação deespécies monocotiledôneas, bombardeamento biolístico com partículas re-vestidas com DNA transformador e fibras de silício revestidas com DNAtransformador freqüentemente é usado para transformação nuclear. Alterna-tivamente, vetores "superbinários" de Agrobacterium foram usados com su-cesso para a transformação de arroz, milho e várias outras espécies mono-cotiledôneas.

Construtos de DNA para transformar uma planta selecionadacompreendem uma seqüência codificadora de interesse operacionalmenteligada a seqüências reguladoras 5' (por exemplo, promotores e seqüênciasreguladoras da tradução) e seqüências reguladoras 3' (por exemplo, termi-nadores). Em uma modalidade preferida, utiliza-se uma seqüência codifica-dora de oleosina ou esteroleosina sob controle de seus elementos regulado-res 5' e 3' naturais. Em outras modalidades, seqüências codificadoras e re-guladoras de oleosina e esteroleosina são trocadas (por exemplo, a seqüên-cia codificadora CcOLE-1 operacionalmente ligada ao promotor CcOLE-2)para alterar o perfil de óleo da semente da planta transformada para um a-perfeiçoamento fenotípico, por exemplo, no sabor, aroma ou outras caracte-rísticas.

Em uma modalidade alternativa, a região codificadora do gene écolocada sob um promotor constitutivo poderoso, como o promotor 35S doVírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV) ou o promotor 35S do vírus do mo-saico da escrofulária. Outros promotores constitutivos considerados para usona presente invenção incluem, mas não se limitam a, promotores de T-DNAmanopina sintetase, nopalina sintetase e octopina sintetase. Em outras mo-dalidades, usa-se um promotor forte de monocotiledônea, por exemplo, opromotor de ubiquitina de milho, o promotor de actina de arroz ou o promotorde tubulina de arroz (Jeon etal., Plant Physiology, 123: 1005-14, 2000).

Plantas transgênicas que expressam seqüências codificadorasde oleosina ou esteroleosina sob um promotor induzível também são consi-deradas dentro do âmbito da presente invenção. Promotores induzíveis deplantas incluem o promotor controlador por repressor/operador de tetracicli-na, os promotores do gene de choque térmico, promotores induzidos porestresse (por exemplo, lesões), promotores do gene sensível à defesa (porexemplo, genes de fenilalanina amônia liase), promotores de genes induzi-dos por lesões (por exemplo, genes da proteína de parede celular rica emhidroxiprolina), promotores de genes quimicamente induzíveis (por exemplo,genes da nitrato redutase, genes da glucanase, genes da quitinase e outros)e promotores de genes induzíveis pelo escuro (por exemplo, o gene da as-parigina sintetase), para nomear alguns.

Promotores específicos para tecidos e específicos para desen-volvimento também são considerados para uso na presente invenção, alémdos promotores de oleosina específicos para semente da invenção. Exem-plos não-limitativos de outros promotores específicos para sementes incluemCim1 (mensagem induzida por citocinina), cZ19B1 (zeína de 19 kDa do mi-lho), milps (mio-inositol-1 -fosfato sintetase) e ce1A (celulose sintetase) (pe-dido norte-americano n° de série 09/377.648), beta-faseolina de feijão, napi-na beta-conglicinina, Iectina de soja, cruciferina, zeína de 15 kDa, zeína de22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, cerosa, contraída 1, contraída 2 e globuli-na 1 do milho, Iegumina 11S de soja (Bãumlein et ai, 1992) e proteína dearmazenamento em semente 11S de C. canephora (Marraccini et ai, 1999,Plant Physiol. Biochem. 37: 273-282). Veja também WO 00/12733, em quese apresentam promotores preferidos por sementes dos genes end1 e end2.Outros promotores específicos para sementes de Coffea também podem serutilizados, incluindo, mas não limitados a, o promotor do gene de deirdinadescrito no pedido de patente provisória norte-americana copendente e depropriedade em comum n° 60/696890. Exemplos de outros promotores es-pecíficos para tecidos incluem, mas não se limitam a, os promotores do geneda subunidade pequena de ribulose bisfosfato carboxilate (RuBisCo) (porexemplo, o promotor da subunidade pequena do café conforme descrito porMarracini et ai, 2003) ou promotores do gene da proteína de ligação a colo-rofila a/b (CAB) para expressão em tecido fotossintético; e os promotores dogene da glutamina sintetase específica para raiz, quando se deseja a ex-pressão em raízes.

A região codificadora também está operacionalmente ligada àseqüência reguladora 3' apropriada. Em modalidades em que não se usa aseqüência reguladora 3' nativa, pode-se usar a região de poliadenilação danopalina sintetase. Outras regiões reguladoras 3' utilizáveis incluem, masnão se limitam a, a região de poliadenilação da octopina sintetase.

A região codificadora selecionada, sob controle de elementosreguladores apropriados, está operacionalmente ligada a um marcador deresistência a fármaco nuclear, como resistência à canamicina. Outros siste-mas marcadores selecionáveis utilizáveis incluem genes que confiram resis-tências a antibióticos ou herbicidas (por exemplo, resistência a higromicina,sulfonilureia, fosfinotricina ou glifosato) ou genes que confiram crescimentoseletivo (por exemplo, fosfomanose isomerase, que permitem o crescimentode células vegetais em manose). Genes marcadores selecionáveis incluem,sem limitação, genes que codificam resistência a antibióticos, como aquelesque codificam neomicina fosfotransferase Il (ΝΕΟ), di-hidrofolato redutase(DHFR) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que confe-rem resistência a compostos herbicidas, como EPSPS resistente a glifosatoe/ou glifosato oxidorredutase (GOX), Bromoxinil nitrilase (BXN) para resis-tência a bromoxinila, genes AHAS para resistência à imidazolinonas, genesde resistência à sulfonilureia e genes de resistência à 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).

Em certas modalidades, promotores e outras seqüências regula-doras de expressão englobadas pela presente invenção estão operacional-mente ligadas a genes repórteres. Genes repórteres considerados para usona invenção incluem, mas não se limitam a, genes que codificam a proteínafluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (DsRed), proteínafluorescente ciano (CFP), proteína fluorescente amarela (YFP)1 proteína fluo-rescente laranja de Cerianthus (cOFP), fosfatase alcallina (AP), β-lactamase,cloranfenicol acetiltransferase (CAT)1 adenosina desaminase (ADA), amino-glicosídeo fosfotransferase (neor, C418r), di-hidrofolato redutase (DHFR)1higromicina-B-fosfotransferase (HPH)1 timidina quinase (TK)1 IacZ (que codi-fica α-galactosidade) e xantina guanina fosforribosil transferase (XGPRT)1beta-glucuronidase (gus), fosfatase alcalina placentária (PLAP)1 fosfatasealcalina embrionária secretada (SEAP) ou Iuciferase de vaga-lume ou bacte-riana (LUC). Como com muitos dos procedimentos padronizados associadosà prática da invenção, aqueles versados estão cientes de seqüências adicio-nais que podem atender à função de um marcador ou repórter.

Conhecem-se modificações de seqüências adicionais na técnicapara intensificar a expressão do gene em um hospedeiro celular. Essas mo-dificações incluem a eliminação de seqüências que codifiquem sinais de po-liadenilação supérfluos, sinais de sítio de junção exon-íntron, repetições dotipo transposon e outras seqüências bem caracterizadas que possam serprejudiciais para a expressão do gene. Alternativamente, caso necessário, oteor de G/C da seqüência codificadora pode ser ajustado a níveis médiospara um dado hospedeiro celular de planta de café, conforme calculado comreferência a genes conhecidos expressados em uma célula de planta de ca-fé. Da mesma forma, quando possível, a seqüência codificadora é modifica-da para evitar estruturas de mRNA secundárias em grampo previstas. Outraalternativa para intensificar a expressão do gene é usar seqüências líderes5'. Seqüências líderes de tradução são bem conhecidas na técnica e incluemo derivado de ação eis (omega') da seqüência líder 5' (omega) do vírus domosaico do tabaco, as seqüências líderes 5' do vírus do mosaico do bromo,vírus do mosaico da alfafa e vírus do mosaico amarelo do nabo.

As plantas são transformadas e, depois disso, tríadas quanto auma ou mais propriedades, incluindo a presença do produto transgênico, omRNA codificador de transgene ou um fenótipo alterado associado à ex-pressão do transgene. Deve-se reconhecer que a quantidade de expressão,assim como o padrão específico para tecido e temporal da expressão dostransgenes em plantas transformadas podem variar dependendo da posiçãode sua inserção no genoma nuclear. Esses efeitos posicionais são bem co-nhecidos na técnica. Por essa razão, vários transformantes nucleares devemser regenerados e testados para expressão do transgene.

Métodos:

Os ácidos nucléicos e polipeptídios da presente invenção podemser usados em qualquer um dos inúmeros métodos em que os produtos pro-téicos possam ser produzidos em plantas de café, de modo que as proteínaspossam desempenhar um papel na intensificação do sabor e/ou aroma dabebida de café ou produtos de café produzidos com o grão da planta de caféque expressa a proteína.

Em um aspecto, a presente invenção apresenta métodos paraalterar o perfil de oleosina ou esteroleosina em uma planta, de preferênciacafé, compreendendo o aumento ou diminuição de uma quantidade ou ativi-dade de uma ou mais oleosinas ou esteroleosinas na planta. Por exemplo,em uma modalidade da invenção, um gene codificador de oleosina sob con-trole de suas próprias seqüências de controle de expressão é usado paratransformar uma planta com a finalidade de aumentar a produção dessa ole-osina na planta. Alternativamente, uma região codificador de oleosina ouesteroleosina está operacionalmente ligada a regiões controladoras de ex-pressão heterólogas, como promotores constitutivos ou induzíveis.

O perfil de corpúsculo de óleo de uma planta também pode seralterado por diminuição da produção de uma ou mais oleosinas ou esterole-osinas na planta, ou por triagem de variantes de ocorrência natural para ex-pressão diminuída de oleosina ou esteroleosina. Por exemplo, plantas mu-tantes de perda de função (nula) podem ser criadas ou selecionadas a partirde populações de mutantes de plantas atualmente disponíveis. Aqueles ver-sados na técnica também perceberão que populações de plantas mutantestambém podem ser triadas quanto a mutantes que superexpressem umaoleosina particular, utilizando um ou mais dos métodos aqui descritos. Popu-lações mutantes podem ser preparadas por mutagênese química, mutagê-nese por radição e inserções de transposon ou T-DNA, ou direcionamento alesões locais induzidas em genomas (TILLING, veja, por exemplo, Henikoffet ai, 2004, Plant Physiol. 135(2): 630-636; Gilchrist e Haughn, 2005, Curr.Opin. Plant Biol. 8(2): 211-215). Os métodos para preparar populações mu-tantes são bem conhecidos na técnica.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser usados para identi-ficar mutantes de oleosina ou esteroleosina em várias espécies de plantas.Em espécies como milho ou Arabidopsis, em que linhagens de inserção detransposon estão disponíveis, inciadores oligonucleotídicos podem ser proje-tados para triar linhagens para inserções nos genes de oleosina ou esterole-osina. Mediante cruzamento, pode-se, então, desenvolver uma linhagem deplanta que seja heterozigótica ou homozigótica para o gene interrompido.

Uma planta também pode ser manipulada para apresentar umfenótipo similar ao visto em mutantes nulos criados por técnicas mutagêni-cas. Um mutante nulo transgênico pode ser criado por uma expressão deuma forma mutante de uma proteína oleosina ou esteroleosina selecionada,para criar um "efeito negativo dominante". Embora não limitando a invençãoa qualquer mecanismo, essa proteína mutante competirá com proteína dotipo selvagem pela interação com proteínas ou outros fatores celulares. Ex-meplos desse tipo de efeito "negativo dominante" são bem conhecidos tantopara sistemas de insetos, quanto de vertebrados (Radke et ai, 1997, Gene-tics 145: 163-171; Kolch et ai, 1991, Nature 349: 426-428).

Outro tipo de mutantes nulos transgênicos pode ser criado porinibição da tradução de mRNA codificador de oleosina ou esteroleosina por"silencionamento de gene pós-transcrição". O gene codificador de oleosinaou esteroleosina da espécie-alvo para regulação negativa, ou seu fragmento,pode ser utilizado para controlar a produção da proteína codificada. Molécu-las antissenso de comprimento total podem ser usadas com essa finalidade.Alternativamente, podem-se utilizar oligonucleotídeos antissenso direciona-dos a regiões específicas do mRNA que sejam críticas para a tradução. Ouso de moléculas antissenso para diminuir os níveis de expressão de umgene predeterminado é conhecido na técnica. Moléculas antissenso podemser fornecidas in situ por transformação de células vegetais com um constru-to de DNA que, com a transcrição, produza seqüências de RNA antissenso.Esses construtos podem ser projetados para produzir seqüências antissensode comprimento total ou parcial. Esse efeito de silencionamento de genepode ser itnensificado por superprodução transgênica tanto de RNA em sen-so, quanto antissenso da seqüência codificadora do gene, de modo que seproduza uma elevada quantidade de dsRNA (por exemplo, veja Waterhouseet ai, 1998, PNAS 95: 13959-13964). Com relação a isso, dsRNA contendoseqüências que correspondam a parte ou a todo de pelo menos um íntron semostraram particularmente eficazes. Em uma modalidade, parte da ou todaa fita antissenso de seqüência codificadora de oleosina ou esteroleosina éexpressada por um transgene. Em outra modalidade, a hibridização de fitasem senso e antissenso de parte da ou de toda a seqüência codificadora deoleosina ou esteroleosina é expressada transgenicamente.

Em outra modalidade, genes de oleosina ou esteroleosina po-dem ser silenciados mediante uso de uma variedade de técnicas de silen-cionamento de gene pós-transcrição (silenciamento de RNA) que são atual-mente disponíveis para sistemas vegetais. O silencionamento de RNA en-volve o processamento de RNA de fita dupla (dsRNA) em pequenos frag-mentos de 21 - 28 nucleotídeos por uma enzima RNase à base de H ("Dicer"ou "do tipo Dicer"). Os produtos de clivagem, que são siRNA (RNA de inter-ferência pequeno) ou miRNA (micro-RNA), são incorporados em complexosefetores de proteínas que regulam a expressão do gene de maneira especí-fica para a seqüência (para revisões do silencionamento de RNA em plantas,veja Horiguchi, 2004, Differentiation 72: 65-73; Baulcombe, 2004, Nature431: 356-363; Herr, 2004, Biochem. Soe. Trans. 32: 946-951).

RNAs de interferência pequenos podem ser quimicamente sinte-tizados ou transcritos e amplificados in vitro e, então, distribuídos às células.A distribuição pode ser mediante microinjeção (Tuschl T. et ai, 2002), trans-fecção química (Agrawal N. et ai, 2003), eletroporação ou transfecção me-diada por Iipossomo catiônico (Brummelkamp TR et ai, 2002; Elbashir SM etai, 2002), ou qualquer outro meio disponível na técnica, o que é percebidopor aqueles versados na técnica. Alternativamente, o siRNA pode ser ex-pressado intracelularmente por inserção de moldes de DNA para siRNA nascélulas de interesse, por exemplo, por meio de um plasmídio (Tuschl T. etai, 2002), e pode ser especificamente direcionado a células selecionadas.RNAs de interferência pequenos foram introduzidos com sucesso em plantas(Klahre U. etal., 2002).

Um método preferido de silenciamento de RNA na presente in-venção é o uso de RNAs em grampo curtos (shRNA). Um vetor contendouma seqüência de DNA que codifique uma seqüência de siRNA desejadaparticular é distribuído a uma célula-alvo por qualquer meio comum. Umavez na célula, a seqüência de DNA é continuamente transcrita em moléculasde RNA que se enrolam sobre si mesmas e forma estruturas em grampomediante pareamento de bases intramoleculares. Essas estruturas emgrampo, uma vez processadas pela célula, são equivalentes a moléculas desiRNA e são usadas pela células para mediar o silecionamento de RNA daproteína desejada. Vários construtos de utilidade particular para silenciamen-to de RNA em plantas são descritos por Horiguchi, 2004, supra. Tipicamen-te, esse construto compreende um promotor, uma seqüência do gene-alvo aser silenciado na orientação "em senso", um espaçador, o antissenso daseqüência de gene-alvo e um terminador.

Ainda outro tipo de mutante nulo sintético também pode ser cria-do pela técnica de "cossupressão" (Vaucheret et al., 1998, Plant J. 16(6):651-659). Células vegetais são transformadas com uma cópia em sensocompleta ou uma seqüência em senso parcial do gene endógeno que é alvoda repressão. Em muitos casos, isso resulta na repressão completa do genenativo, assim como do transgene. Em uma modalidade, um gene codificadorde oleosina ou esteroleosina da espécie de planta de interesse é isolado eusado para transformar células da mesma espécie.

Plantas mutantes ou transgênicas produzidas por qualquer umdos métodos precedentes também são apresentadas de acordo com a pre-sente invenção. Em algumas modalidades, essas plantas são de utilidadecomo ferramentas de pesquisa para a elucidação adicional da participaçãode oleosinas e esteroleosinas no sabor, aroma e outras características desementes de café associadas a perfis de óleos. De preferência, as plantassão férteis, sendo, dessa forma, úteis para fins de cruzamento. Assim, mu-tantes ou plantas que exibam um ou mais dos fenótipos desejáveis acimamencionados podem ser usadas para cruzamento de plantas, ou diretamen-te em aplicações agrícolas ou de horticultura. Plantas contendo um transge-ne ou uma mutação especificada também podem ser cruzadas com plantascontendo um transgene ou genótipo complementar, para produzir plantascom fenótipos intensificados ou combinados.

Plantas de café produzidas de acordo com os métodos acimadescritos são de utilidade prática para a produção de grãos de café com sa-bor, aroma ou outras características intensificadas, conforme acima discuti-do. Tipicamente, os grãos são torrados e moídos para preparar a bebida.Entretanto, outros usos para esses grãos ficarão claros para aqueles versa-dos na técnica. Por exemplo, corpúsculo de óleo podem ser colhidos dosfeijões (não cozidos ou levemente torrados), de acordo com métodos conhe-cidos. Por exemplo, corpúsculos de óleo de diferentes níveis de pureza po-dem ser purificados conforme descrito em Guilloteau et aí. 2003, Plant Sci-ence 164: 597-606, ou, por exemplo, conforme apresentado na patente nor-te-americana n° 6.146.645, de Deckers et al., e na patente européia0883997, de Wkabayashi et al. De maneira similar às proteínas oleosina iso-ladas acima descritas, esses corpúsculo de óleo podem ser usados na in-dústria alimentícia para acrescentar sabor e nutrição, por exemplo, a produ-zidos assados, iogurte ou sorvete (por exemplo, pedido norte-americano pu-blicado n° 2005/0037111 A1, de Berry et al.) e outros, ou na indústria cosmé-tica para a produção de sabões, cremes para a pele, maquiagens e outros.

A presente invenção também apresenta composições e métodospara a produção, de maneira preferida em semente ou específica para se-mente, de qualquer produto de gene heterólogo selecionado em uma planta.Uma seqüência codificadora de interesse é colocada sob controle de umpromotor de oleosina de café ou outro específico para semente e outras se-qüências reguladoras apropriadas, para produzir um gene quimérico especí-fico para semente. O gene quimérico é introduzido em uma célula vegetalpor qualquer um dos métodos de transformação aqui descritos ou conheci-dos na técnica. Esses genes quiméricos e métodos podem ser usados paraproduzir uma variedade de produtos de genes de interesse na planta, inclu-indo, mas não limitados a, (1) produtos de genes detectáveis, como GFP ouGUS1 conforme acima enumerado; (2) produtos de genes que confiram umbenefício agronômico ou de horticultura, como aqueles cujas atividades en-zimáticas resultem na produção de micronutrientes (por exemplo, pró-vitamina A, também conhecida como beta-caroteno) ou antioxidantes (porexemplo, ácido ascórbico, omega ácidos graxos, licopeno, isoprenos, terpe-nos); ou (3) produtos de genes para controle de patógenos ou pragas, con-forme descrito por Mourgues et al. (1998), TibTech 16: 203-210 ou outrosreconhecidamente protetores para sementes de plantas ou prejudiciais parapatógenos.

Além disso, como a expressão de genes de oleosina, como ogene CcOLE-1, também é induzida sob condições de seca, promotores dogene de oleosina também podem ser mostrar úteis para dirigir a expressãodo gene em outros tecidos, como folhas maduras, quando são estressadasosmoticamente de maneira grave. Por exemplo, esses promotores podemser usados para expressar proteínas reocmbinantes especificamente nasfolhas de plantas (por exemplo, tabaco) ao término da maturação, ao sofre-rem senescência e começarem a secar.

Os exemplos a seguir são apresentados para ilustar a invençãoem maiores detalhes. Os exemplos são para fins ilustrativos e não preten-dem limitar a invenção.

Exemplo 1

Material de Planta para Extração de RNA

Raízes recém-colhidas, folhas jovens, caules, flores e frutos emdiferentes estágios de desenvolvimento foram colhidos de Coffea arabica Lcv. Caturra T-2308 cultivada sob condições de estufa (25°C, 70% de UR) ede Coffea canephora (robusta) BP-409 cultivada no campo na Indonésia. Osestágios de desenvolvimento são definidos da seguinte maneira: fruto verdepequeno (SG), fruto verde grande (LG), fruto amarelo (Y) e fruto vermelho(R). Os tecidos frescos foram congelados imediatamente em nitrogênio líqui-do, então, armazenados a -80°C até serem usados para extração de RNA.

Exemplo 2

Extração de RNA Total e Geração de cDNA

Amostras armazenadas a -80°C foram trituradas em um pó, e oRNA total foi extraído desse pós usando-se o método descrito por Gllloteauet al., 2003. As amostras foram tratadas com DNase usando-se o kit "QiagenRNase-Free DNase" de acordo com as instruções do fabricante, para remo-ver a contaminação com DNA. Todas as amostras de RNA foram analisadaspor eletroforese em geral de formaldeído agarose e inspeção visual dasbandas de RNA ribossômico mediante coloração com brometo de etídio. U-sando-se oligo (dT2o) como um iniciador, cDNA foi preparado a partir de a-proximadamente 4 pg de RNA total, de acordo com o protocolo no kit Su-perscript Il Reverse Transciptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para testar apresença de DNA genômico contaminante nas preparações de cDNA, proje-tou-se um par de inciadores cobrindo um íntron conhecido de um cDNA ubi-quamente expressado específico, calcona isomerase (CHI). Realizou-se RT-PCR com diluição de 10 vezes de cDNA, correspondendo a 0,1 pg de RNAoriginal. As reações de PCR convencionais continham 1x tampão e MgCI2 a5 mM, cada dATP a 200 μΜ, dCTP, dGTP e dTTP, e 1 unidade de polimera-se, e cada iniciador específico para os genes 800 nM - FWD-CCCACCTGGAGCCTCTATTCTGTT (SEQ ID NO: 83) e REV-CCCCGTCGGCCTCAAGTTTC (SEQ ID NO: 84) por 35 ciclos. Como espe-rado, uma banda de cDNA de 272 pb foi observada após a PCR. Uma se-gunda banda correspondendo ao cDNA + íntron a 750 pb não foi observada,indicando a ausência de DNA genômico nas amostras (dados não-mostrados).

Reações de PCR convencionais para os genes de interesse fo-ram realizadas usando-se uma diluição de 100 vezes de cDNA, correspon-dendo a 0,01 pg de RNA original. A PCR foi realizada usando-se 800 nM decada iniciador específico para os genes CcOLE-1 (FWD-TTCGTTATCTTTAG CCCCATT; REV-CATAGGCAAGATTAACAAGGAT353)(SEQ ID NOS: 43 e 44, respectivamente), CcOLE-2 (FWD-GTGGCAGCGTTGAGCGT; R E V-G AC AATAATG C ATG AATAC C AC AA309)(SEQ ID NOS: 45 e 46, respectivamente), CcOLE-3 (FWD-GAGATCAAGGTGGAAGGGAA; REV-GAAAACCC TCAACAAACAAAGA228)(SEQ ID NOS: 47 e 48, respectivamente), CcOLE-4 (FWD-CTGACACTGGCTGGAACAATA; REV-GCACAACATTCCATCAAGT

ATCT337) (SEQ ID NOS: 49 e 50, respectivamente) e CcOLE-5 (FWD-TGGCATCCTACTTCTCCTCACT; REV-CTCTCTAGCATAATCCTTCACCTG295) (SEQ ID NOS: 51 e 52, respectivamente). A amplificação do gene R-PL39 (FWD-TGGCGAAGAAGCAGAGGCAGA; REV-TTGAGGGGGAGGGTAAAAAG187) (SEQ ID NOS: 53 4 54, respectivamente, foi usada como umcontrole positivo para a transcrição reversa. As amostras foram submetidasa eletroforese em um gel de agarose a 1,5%. Os números sobrescritos emcada conjunto de inciadores indicam o tamanho do amplicon.

Realizou-se Taq-Man-PCR quantitativa com o cDNA descritoacima e usando-se o protocolo recomendado pelo fabricante (Applied Bi-osystems, Perkin-Elmer). Todas as reações continham 1x tampão TaMan(Perkin-EImer) e MgCL2 a 5 mM, cada dATP a 200 pg, dCTP, dGTP e dTTP,e 0,625 unidades de AmpIiTaq Gold polimerase. A PCR foi realizada usan-do-se cada iniciador específico para os genes a 800 nM, direto e reverso,sonda TaqMan a 200 nM e uma diluição de 1.000 vezes de cDNA, corres-pondendo a 0,001 pg do RNA original. Os inciadores e sondas foram proje-tados usando-se o software INCIADOR EXPRESS (Applied Biosystems: vejaTabela 3 abaixo). A especificidade cruzada dos inciadores e sondas é resu-mida na Tabela 4 abaixo. A mistura de reação foi incubada durante 2 min a50°C, então, 10 min a 95°C, seguido por 40 ciclos de amplificação de 15 s a95°C/1 min a 60°C. As amostras foram quantificadas no Sistema de Detec-ção de Seqüência GeneAmp 7500 (Applied Biosystems). Os níveis de trans-crito foram normalizados nos níveis do gene de controle rpl39.

Exemplo 3

Isolamento de Promotor e Construção do Vetor

A região a montante 5' do OLE-1 de Coffea canephora foi recu-perada usando-se o kit Genewalker (BD Biosciences) e os inciadores OLE-1A (5'-AAGTTGATGGACCCTTCTGAGGAAGG-3') (SEQ ID NO: 55), segui-do por PCR aninhada usando-se iniciador 0LE-1B (5-AGCTGGTAGTGCTCAGC CATGAAGG-3') (SEQ ID NO: 56). As reações dePCR continham 1x tampão e MgCI2 A 5 mM, cada Datp a 200 μΜ, dCTP,dGTP e dTTP, e 1 unidade de LA Taq polimerase (Takara, Combrex Bio1Bélgica), com iniciador 0LE-1A a 200 nM e 200 nM iniciador AP1 a 200 nM(kit Genewalker). A mistura de reação foi incubada durante 10 min a 94°C,seguido por 7 ciclos de amplificação de 25 s a 94°C/4 min a 72°C e, então,32 ciclos de amplificação de 25 s a 94°C/4 min a 67°C. A reação de PCR foidiluída a 1/200 e usada para uma segunda reação de PCR com iniciadoraninhado OLE-1B a 200 nM e iniciador aninhado AP2 a 200 nM. A PCR ani-nhada foi incubada durante 10 min a 94°C, seguido por 5 ciclos de amplifi-cação de 25 s a 94°C/4 min a 72°C e, então, 22 ciclos de amplificação de 25s a 94°C/4 min a 67°C. Um fragmento genômico de 1.075 pb foi recuperadoe clonado no vetor pCR4-TOPO (Invitrogen), para formar o pCR4-pOLE1, eo enxerto desse plasmídio foi sequenciado.

Exemplo 4

Isolamento e Identificação de Genes de Oleosina do Grão de Café em De-senvolvimento

Mais de 47.000 seqüências de EST de várias bibliotecas de cafépreparadas com RNA isolado de folhas jovens e de tecidos de grãos e peri-carpo dos frutos colhidos em diferentes estágios de desenvolvimento. ESTssuperpostos foram subseqüentemente "agrupados" em "unigenes" (isto é,contigs), e as seqüências do unigene foram anotadas efetuando-se umabusca BLAST de cada seqüência individual contra a base de dados de prote-ínas não-reduntantes. Os ORFs de cinco dos unigenes expressados duranteo desenvolvimento do grão foram anotados como proteínas ricas em glici-na/oleosinas. ESTs representando cDNA de comprimento total para cadaunigene foram isoladas e sequenciadas. Esses cDNAs foram chamados deCcOLE-1 a CcOLE-5 (SEQ ID NOS: 2 - 6) (clones cccs46w9j5,cccs46w20j22, cccs46w31f3, cccs20w17h11 e cccs20w33, respectivamen-te), dependendo do número de ESTs obtidas. Essas ESTs eram todas debibliotecas obtidas de grãos 30 e 46 semanas após a fertilização. As se-qüências de aminoácidos deduzidas (Figura 1) de CcOLE-1 a CcOLE-5têm massas moleculares de 15,7, 14,1, 18,6, 15,3 e 17,9 kDa, respecti-vãmente. Cada uma dessas proteínas contém uma região hidrofóbica de81, 73, 80, 72 e 75 aminoácidos, respectivamente, com a assinatura moti-vo knot contendo 3 prolinas conservadas e 1 serina conservada em seucentro.

As Figuras 9A a 9E mostram cada oleosina de café alinhadacom as quatro seqüências mais homólogas na base de dados de proteínasnão-reduntantes do GenBank, e a Tabela 1 mostra a porcentagem de identi-dade para cada proteína de café com as proteínas da base de dados maisintimamente relacionadas.

Tabela 1: Identidade da seqüência de aminoácidos da oleosina de Coffeacanephora com as seqüências de GenBank mais homólogas (NP = não pu-blicado). Os números de acesso das oleosinas de Coffea foram depositadosno banco de genes do NCBI.

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As diferentes seqüências de oleosina de café foram examinadasem maiores detalhes. Os gráficos de hidrofobicidade para cada oleosina decafé indicam claramente a presença de uma grande região com um valornegativo, que é equivalente à região hidrofóbica central (Figura 10). Essesperfis hidrofóbicos são similares aos perfis anteriormente publicados de ole-osinas específicas para sementes (S) de T. cacao (Guilloteau et ai, 2003) eArabidopsis (Kim et ai, 2002) e oleosinas específicas para sementes e mi-crósporos (SM) de Arabidopsis (Kim et ai, 2002).

Foi anteriormente descoberto por Tai et ai. (2002) que oleosinasexpressadas durante o desenvolvimento da semente se encontram em duasclasses, que foram chamadas de formas H e L, e que se distinguem pelapresença ou ausência de uma inserção de 18 aminoácidos na região C-terminal. Efetuou-se, portanto, o alinhamento da região C-terminal em tornodo sítio de inserção das cinco oleosinas de café com as regiões equivalentesde inúmeras outras oleosinas encontradas na base de dados Genebank (Fi-gura 4). Esse alinhamento levou à classificação de OLE-1, OLE-3 e OLE-5como oleosinas H, e OLE-2 e OLE-4 como oleosinas L. Nota-se que a inser-ção de 18 resíduos C-terminal de OLE-5 era menos homóloga às inserçõesH das outras oleosinas, incluindo a ausência de uma glicina altamente con-servada na posição 6 da inserção. O trabalho anterior com corpúsculos deóleo montados in vitro demonstrou que oleosinas H ou L de arroz e gergelimpodem estabilizar corpúsculos de óleo, embora corpúsculos de óleo reconsti-tuídos apenas com oleosina L fossem mais estáveis do que aqueles recons-tituídos com oleosina H ou uma mistura de oleosinas HeL (Tzen et ai.,1998; Tai et al., 2002).

Exemplo 5

Especificidade Para Tecidos e Distribuição no Desenvolvimentoda Expressão do Gene CcOLE

A Tabela 2 mostra que há 52 ESTs no unigene que representa aoleosina mais abundante (CcOLE-1) e apenas 5 ESTs no unigene que re-presenta a oleosina menos abundante (CcOLE-5). Exceto pela EST CcOLE-5, EST encontrada na biblioteca de folha, todas as ESTs de oleosina foramdetectadas apenas nas bibliotecas de sementes, e não nas bibliotecas defolha ou pericarpo.

Tabela 2: Número e distribuição de ESTs no unigene contendo cDNA de o-leosina de Coffea canephora de comprimento total

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Para confirmar que as oleosinas do café eram específicas para ogrão, a expressão de cada gene foi estudada por RT-PCR utilizando os mé-todos descritos no Exemplo 2. Os níveis de transcrito de oleosina foram ana-lisados no grão e no fruto em quatro estágios de desenvolvimento diferentes,assim como nas folhas, caule, flores e raízes de C. canephora (robusta;BP409) e C. arabica (T-2308). Os resultados do experimento de RT-PCRconfirmam que todas as cinco oleosinas do café eram principalmente ex-pressadas nas sementes (Figuras 5A a 5E). A expressão de RPL39, um cD-NA de proteína ribossômica constitutivamente expressado, foi usada comoum controle positivo para mostrar a amplificação pro RT-PCR bem sucedidaem cada amostra de RNA (Figura 5F).

Para quantificar os níveis de transcrito de cada gene OLE emdiferentes estágios do desenvolvimento do grão de café, assim como emvários outros tecidos de café, ensaios específicos para transcrito baseadosem RT-PCR de tempo real fluorescente (TaqMan: Applied Biosystems) fo-ram desenvolvidos para cada gene, e os níveis relativos de transcritos emcada amostra de RNA foram quantificados versus a expressão de um geneconstitutivamente expressado (RPL39) na mesma amostra. A Taq-Man-PCRquantitativa foi realizada com o cDNA usando-se o protocolo recomendadopelo fabricante (Applied Biosystems, Perkin-Elmer). Todas as reações conti-nham 1x tampão TaqMan (Perkin-Elmer) e MgCL2 a 5 mM, cada dATP,dCTP a 200 pm, dGTP e dTTP, e 0,625 unidades de AmpIiTaq Gold polime-rase. A PCR foi realizada usando-se cada iniciador específico para os genesa 800 nM, direto e reverso, sonda TaqMan a 200 nM e uma diluição de 1.000vezes de cDNA, correspondendo a 0,001 pg do RNA original. Os inciadorese sondas foram projetados usando-se o software INCIADOR EXPRESS (Ap-plied Biosystems). Os inciadores e sondas específicos para genes são mos-trados na Tabela 3. A mistura de reação foi incubada durante 2 min a 50°C,então, 10 min a 95°C, seguido por 40 ciclos de amplificação de 15 s a95°C/1 min a 60°C. As amostras foram quantificadas no Sistema de Detec-ção de Seqüência GeneAmp 7500 (Applied Biosystems). Os níveis de trans-crito foram normalizados nos níveis do gene de controle RPL39.

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(1) As sondas MGB foram marcadas em 5' com o corante repór-ter fluorescente 6-carboxifluoresceína (FAM) e, em 3', com o corante finali-zador 6-carbóxi-N,N,N,,N,-tetrametilrodamina (TAMRA). Todas as seqüên-cias são dadas de 5' para 3'. (2) As sondas RPL39 e CsSTO-1 foram marca-das em 5' com o corante repórter fluorescente VIC1 e, em 3', com o finaliza-dor TAMRA.

Os resultados do teste de especificidade cruzada dos conjuntosde inciadores/sondas OLE determinados conforme descrito por Tan et al.(2003) e Simkin et al. (2004b) estão resumidos na Tabela 4. Uma curva pa-drão foi preparada a partir do cDNA correspondente. Os dados representama quantidade equivalente de sinal produzido por cada conjunto de inicia-dor/sonda com cada cDNA. Em testes pareados com outras oleosinas deCoffea, cada sonda proporcionou um mínimo de 104 vezes de discriminaçãona detecção de transcritos relacionados.Tabela 4: Especificidade de cada inciadores e sondas de PCR em temporeal CcOLE TaqMan na detecção da seqüência relacionada. ND = não de-tectado.

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Adicionou-se um plasmídio contendo cada cDNA por reação emum teste pareado contra cada conjunto de iniciador e sonda. Os dados re-presentam a quantidade equivalente de sinal produzido por 400 pg de cadagene específico.

Usando-se os ensaios TaqMan1 os níveis de transcritos de OLEforam quantificados nas mesmas amostras de cDNA anteriormente empre-gadas para RT-PCR convencional. Os resultados apresentados nas Figuras5A a 5E (histogramas) confirmam que cada gene OLE exibe expressão sig-nificativa apenas nos grãos. Entretanto, uma fraca expressão dos vários ge-nes de oleosina também foi detectada em certos outros tecidos. Isso é maisprovavelmente devido à existência de corpúsculos de óleo em outros teci-dos. Demonstrou-se que a biogênese de corpúsculos de óleo pode ocorrerfora do embrião em células de folha de tabaco (Wahlroos et ai, 2003), frutode Olea europea (Donaire et ai, 1984) e em juncos de arroz em maturação(Wu et al., 1998). Oleosinas também são encontradas associadas ao RE(Abell et al., 1997; Beaudoin e Napier, 2002). O nível mais significativo detranscritos de oleosina detectado foram do grão foi visto para OLE-5, em quea expressão era muito claramente detectada em flores maduras inteiras. Es-sa última observação é consistente com os alinhamentos anteriormente a-presentados, que indicam que OLE-5 pertence ao grupo SM das oleosinas(Kim et al., 2002). De fato, esta ultima observação é sustentada pelos resul-tados obtidos por uma comparação de seqüências entre as 16 seqüênciasconhecidas de Arabidopsis e as 5 seqüências de oleosina do café (Figura 2).

Notou-se que os transcritos de OLE parecem ser induzidos maiscedo em Coffea arabica, quando comparada a C. canephora (robusta). Re-sultados similares são mostrados na Tabela 2 acima, que mostra que ne-nhuma EST que codifique genes de oleosina foi detectada na amostra derobusta 18 semanas após a fertilização. Tomados juntos, esses dados indi-cam que os frutos de robusta no estágio verde pequeno estão menos de-senvolvidos que os frutos de arabica com uma aparência similar. Essa dife-rença no desenvolvimento poderia estar intimamente relacionada à matura-ção mais lenta dos frutos de robusta versus frutos de arabica; frutos de ro-busta se desenvolvem durante um período de 9 a 11 meses, ao passo queos frutos de arabica se desenvolvem durante um período de 6 a 8 meses(Costa, 1989).

Para confirmar a interpretação precedente, um ensaio de RT-PCR quantitativo Taqman específico foi projetado para examinar a expres-são de outro gene do café, o gene da proteína de armazenamento 11S, quetambém é fortemente induzido durante os estágios médio-tardios do desen-volvimento do grão (Marraccini et ai, 1999). Os resultados apresentados naFigura 6A mostram mais uma vez que a amostra de grãos verdes pequenosde robusta também não exibiram nenhuma expressão detectável de 11S, aopasso que a amostra comparável de arabica exibiu uma expressão significa-tiva desse gene. Além disso, um perfil de expressão adicional de genes es-pecíficos para o grão usando ensaios Taqman também demonstrou que operfil de expressão da amostra de grãos verdes pequenos de robusta é dife-rente do perfil associado a grãos verdes pequenos de arabica (dados não-mostrados). Pequenas diferenças observadas entre os resultados de Taq-Man e RT-PCR convencional (Figura 5) são provavelmente devidos à natu-reza não-quantitativa deste último em 40 ciclos.

Quando o padrão de expressão foi examinado para cada genede oleosina exclusivamente em grãos de robusta, pareceu que CcOLE-1, eem menor medida CcOLE-5, exibiram um padrão de expressão diferente dodos outros três genes; os níveis de transcrito de CcOLE-1 e 5 eram os maiselevados no estágio verde grande e, então, diminuíam progressivamentecom a maturidade, embora a diminuição fosse menos pronunciada em CcO-LE-5. Deve-se notar que CcOLE-1 e CcOLE-5 são ambas oleosinas H, e,portanto, o padrão de expressão observado era diferente com outras oleosi-nas H de café (CcOLE-3). Os padrões de expressão encontrados para CcO-LE-2, CcOLE-3 e CcOLE-4 em grãos de robusta indicam que os níveis detranscrito para esses genes tiveram um pico no estágio amarelo, e que osníveis antes e depois desse estágios eram ligeiramente menores. Quando osníveis de transcrito das cinco oleosinas em grãos de arabica e de robustaforam comparados, os padrões da expressão de transcritos eram relativa-mente similares, uma vez que a diferença de tempo de desenvolvimento foilevada em consideração (isto é, grãos verdes pequenos de arabica eramaproximadamente equivalentes a verdes grandes de robusta). Entretanto,com um exame mais detalhado, algumas diferenças nos níveis de transcritoentre grãos de arabica e de robusta podiam ser observadas. Considerando-se que o nível de transcritos de RPL39 é similar tanto em arabica, quanto emrobusta, os níveis de transcrito de pico de OLE-1, OLE-2 e OLE-4 pareceramser aproximadamente duas vezes maiores em arabica do que em robusta.Em contraste, o inverso para ser o caso para OLE-3, em que os níveis detranscrito eram aproximadamente duas vezes menores do que no estágioamarelo dos grãos de arabica, em comparação com o estágio amarelo dosgrãos de robusta. Deve-se notar que os níveis de transcrito de 11S eramrelativamente similares entre essas duas espécies. Esta última observaçãoimplica que as diferenças entre arabica e robusta no acúmulo de transcritosde oleosina provavelmente não são devidas a diferenças na expressão deRPL39.

Wu et al. (1998) mostraram que níveis de transcrito das duasoleosinas de arroz apareciam sete dias após a polinização e desapareciamem sementes maduras. Um resultado similar foi obtido por Guilloteau et al.,(2003), que mostraram que os transcritos de oleosina diminuíam em semen-tes maduras, atingindo um pico 146 dias após a fertilização (dpf) e diminuin-do a níveis mais baixos a 160 dpf. No presente exemplo, demonstrou-se quetodos os níveis de transcrito de OLE-1 e OLE-5 diminuíam nos estágios fi-nais da maturação, embora não na mesma medida. OLE-1 e OLE-5 mostra-ram a maior diminuição no decorrer do período de maturação.

Sem pretender ficar limitado a qualquer explicação de mecanis-mo, o alto nível de expressão de OLE-1 encontrado no estágio precoce dodesenvolvimento do endosperma poderia implicar que essa oleosina temalgum importante papel no início/formação de corpúsculo e óleo. Além disso,deve-se notar que as amostras com teor de óleo mais elevado (arabica)também têm níveis mais elevados de expressão de OLE-1. Embora tenhasido proposto por Ting et al. (1996) que o teor de oleosina não está relacio-nado ao teor de óleo, ainda pode ser o caso de que o teor de óleo possaestar relacionado ao nível da oleosina H do tipo OLE-1 expressada no está-gio de início da formação do corpúsculo de óleo.

Exemplo 6

Expressão de Oleosinas Durante a Germinação da Semente

Os níveis de transcrito para cada gene OLE foram quantificadosem diferentes estágios de germinação em C. arabica. Os resultados do ex-perimento de RT-PCR quantitativa mostraram que transcritos de OLE-1 aOLE-4 eram detectados nas sementes nos estágios precoces da germinação(Figura 7). Os níveis de transcrito de OLE-1, OLE-2 e OLE-3 foram observa-dos em um pico 3 dias após a embebição (3DAI). No caso de OLE-2, obser-vou-se que os níveis de transcrito aumentavam a níveis observados nos es-tágios finais da maturação da semente (veja Figura 7). A 5DAI, os níveis detranscrito de OLE-1 e OLE-3 de oleosinas de forma H diminuíam significati-vamente, juntamente com OLE-2, e permaneciam baixos durante todo o res-tante da germinação. Os níveis de transcritos de OLE-2 e OLE-3 não eramdetectáveis em 60DAI. OLE-5, anteriormente identificada como sendo umaoleosina SM, não foi detectada no grão em germinação. Além disso, a RT-PCR quantitativa também mostrou um aumento concomitante no transcritoSTO-1 durante a germinação, quando comparada à expressão de oleosinas(veja Figura 6C e Exemplo 9).Exemplo 7

Número de Cópias de CcOLE-1 no Genoma de C. canephora

Sabe-se que oleosinas individuais normalmente são codificadaspor genes únicos ou genes com baixo número de cópias (Tai et ai., 2002).

Neste exemplo, confirmou-se que a OLE-1 de Coffea canephora é codificadapor um único gene, ou de baixo número de cópias, no genoma do café. Ex-perimentos de Southern Blot foram realizados para estimar o número de có-pias de CcOLE-1. O enxerto completo de cDNA de CcOLE-1, incluindo aregião não-traduzida 3', foi marcado com P32 e, então, hibridizado sob condi-ções de elevado rigor a DNA genômico de robusta variedade BP-409, quehavia sido digerido com várias enzimas de restrição conforme acima descri-to. Os resultados obtidos após 10 dias de exposição (Figura 11) mostramque as digestões simples e duplas resultaram na detecção de principalmenteuma banda maior, exceto pelo produto de digestão com Hind Ill + Sspl, emque uma segunda banda também foi detectada. Acredita-se que essa bandaseja devida à presença de um sítio de corte de Hindlll em 123 pb a partir dosítio de início de transcrição (veja Figura 8). A presença de bandas mais fra-cas também foi detectada nos produtos de digestão simples com Dral e Ss-pl, que estavam faltando nos produtos de digestão dupla. Esses eram pro-vavelmente devidos à digestão parcial do DNA genômico, ou a hibridizaçãocruzada muito fraca com uma ou mais das outras oleosinas. Esses dadosindicam fortemente que apenas um, ou possivelmente dois genes no geno-ma do café codificam CcOLE-1.

Exemplo 8

Identificação de Elementos Reguladores Específicos Para Sementes na Re-gião 5' de OLE-1 de Coffea canephora

A região promotora de OLE-1 foi isolada do genoma de C. cane-phora (robusta BP-409). Uma seqüência de aproximadamente 1.075 pb amontante do sítio ATG de CcOLE-1 foi recuperada por um sequenciamento"Primer Walk" auxiliado por PCR e completamente sequenciada conformedescrito em exemplos anteriores. A seqüência promotora obtida foi, então,analisada quanto à presença de seqüências reguladoras conhecidas (Figura8). Essa análise indicou a presença de inúmeras seqüências reguladoras deDNA. Por exemplo, um motivo TTTAAAT está localizado a 39 pb a montanteda extremidade 5' do cDNa de CcOLE-1 (indicado por uma seta) e é um pro-vável candidato para a seqüência de caixa TATA. Outros elementos regula-dores anteriormente conhecidos como responsáveis pela especificidade es-pacial e temporal da expressão do gene de proteína de armazenamento emvárias plantas também foram encontrados. A seqüência TGTAAAGT(456/463) foi identificada como um chamado "motivo de endosperma" e estáimplicada no controle da expressão específica em endosperma de gluteninasna cevada (Thomas, 1993) e trigo (Hammond-Kosack et ai, 1993), Ieguminade ervilha (Shirsat et ai, 1989) e promotores da zeína do milho (Maier et ai,1987). Outras seqüências também foram identificadas, como a caixa ECANNTG (CAAATG 738/743; CATGTG 914/919), que se acredita que estejaenvolvida na expressão específica em sementes da faseolina de feijão fradi-nho (Kawagoe e Murai, 1992) e da proteína de armazenamento S2 da coní-fera norte-americana (Chatthai et ai, 2004). Um elemento CATGCAAA(886/894) é similar à chamada região repetida RY CATGCA(T/a)(A/g); a re-gião de núcleo da caixa de Iegumina (Dickinson et ai, 1988; Shirsat et ai,1989). Esse motivo é essencial para a expressão específica em semente degenes da Iegumina 11S da soja (Bãumlein et ai, 1992), β-conglicinina(Chamberlan et ai, 1992) e glicinina (Lelievre et ai, 1992). A região de se-qüência CCATGCA (885/891) é similar tanto ao elemento repetido RYGCATGC do promotor de albumina 2S essencialmente para a expressãoespecífica em semente em sementes de tabaco transgênicas (Chatthai et ai,2004), quanto às seqüências CATGCA e CATGCC detectadas no promotorde 11S específico de sementes de C. arabica (Marraccini et ai, 1999). Tam-bém se notou um motivo rico em AT ATATTTATT (504/512), similar ao in-tensificador específico para semente identificado na seqüência a montantedo gene de subunidade α da β-conglicinina da soja (Allen et ai, 1989).

Exemplo 9

Isolamento e Caracterização de um cDNA de Esteroleosina do Café

Um único membro da família das esteroleosinas, chamado deCcSTO-1 (cccs46w11o15, AY841276), CcSTO-1 aqui, foi detectado no grão30 semanas e 46 semanas após o florescimento (Tabela 5).

Tabela 5: Número e distribuição de ESTs no unigene contendo o cDNA deesteroleosina de comprimento total

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Esteroleosinas foram anteriormente identificadas em associaçãocom corpúsculo de óleo de sementes (Lin et ai, 2002; Lin e Tzen1 2002).Esteroleosinas são esterol desidrogenases de ligação a NADP+, que mani-festam atividade de desidrogenase tanto com estradiol e corticosterona invitro (Lin et ai, 2002). Sem pretender ficar limitado a qualquer explicação demecanismo, as esteroleosinas podem estar envolvidas na transdução desinais que regulam uma função biológica especializada relacionada a cor-púsculos de óleo de sementes, que possa estar afiliada à mobilização decorpúsculos de óleo durante a germinação das sementes (Lin et ai, 2002).Lin et ai (2002) e Lin e Tzen (2004) identificaram duas esteroleosinas distin-tas associadas a corpúsculos de óleo em Sesame indicum, designadas poresteroleosina-A e esteroleosin-B. Lin et ai (2002) também identificaram 8membros da família de esteroleosinas em Arabidopsis thaliana na base dedados de proteínas não-reduntantes do NCBI. Entretanto, Joliver et al.(2004) detectaram apenas uma esteroleosina (esteroleosina-1; BAB09145)associada a corpúsculos de óleo de Arabidopsis in vivo. Um alinhamentootimizado da seqüência da proteína CcSTO-1 com as duas seqüências deproteínas do GenBank mais homólogas é apresentada na Figura 2. A se-qüência de aminoácidos de comprimento total de CcSTO-1 tem 79% e 66%de homologia com a esteroleosina-B associada a corpúsculo de óleo de S.indicum (AF498264; Lin e Tzen, 2004) e a esteroleosina-7 de A. thaliana(CAB39626; veja Lin et ai, 2002), respectivamente. O sítio ativo S-(12X)-Y-(3X)-K conservado está indicado. Além disso, um motivo prolina knot dentrodo domínio N-terminal que tem duas prolinas conservadas também está in-dicado, e se acredita que funcione como uma âncora de maneira similar àanteriormente relatada para o motivo oleosina knot (Lin et aí., 2002).

Um ensaio de RT-PCR quantitativa Taqman específico para ge-ne dos níveis de transcrito de STO-1 tanto em arabica, quanto em robustamostrou que esse transcrito é expressado principalmente em baixos níveisno grão, embora níveis aproximadamente 16 vezes menores também fos-sem observados em outros tecidos (Figura 6). Quando os níveis de transcritode esteroleosina em grãos de arabica e robusta são comparados, os níveisdo transcrito de STO-1 se mostraram relativamente similares entre essasduas espécies, uma vez que a diferença de tempo de desenvolvimento sejalevada em consideração. O aparecimento de transcritos de STO-1 em umestágio posterior em robusta é similar aos resultados observados para todosos genes aqui testados. Tanto no grão de robusta, quanto no de arabica, osníveis de transcrito de STO-1 têm um pico no estágio verde grande e, então,diminuem nos estágios posteriores do desenvolvimento. Um resultado simi-lar foi obtido por Lin e Tzen (2004), que mostraram que o transcrito de este-roleosina-A associada a corpúsculo de óleo de sementes de gergelim se a-cumula durante o desenvolvimento da semente.

Exemplo 10

Análise Funcional do Promotor CcDH2 de Oleosina do Café em Arabidopsisthaliana Usando uma Fusão Promotor-GUS

Conduziu-se uma análise funcional do promotor CcDH2 de oleo-sina do café em Arabidopsis thaliana. O promotor foi ligado a um gene repór-ter, a saber, uma seqüência que codifica beta-glucuronidase (GUS).

Materiais e Métodos:

A seqüência do promotor CcOIeI de oleosina foi amplificada u-sando-se a polimerase Pfu 1 sob as condições descritas pelo fornecedor (S-tratagene) e os seguintes inciadores: TG - 702 ttgaagcttACGA-CAGGTTTCCCGACTG (SEQ ID NO: 81) e TG - 703 gcagatctac-catggGCGGTGGACGGTAGCTTAT (SEQ ID NO: 82). O fragmento de PCRassim obtido foi, então, cortado com Hindlll e Bglll e clonado nos sítios Hin-dlll/BglII do vetor de transformação de plantas pCAMBIA1301. Isso coloca ofragmento de aproximadamente 1 kb contendo a seqüência promotora deoleosina, que contém a região não-traduzida 5' quase completa (menos a-penas 3 pb) encontrada no cDNA de oleosina (aproximadamente 70 pb), noATG para GUS (primeiro exon de GUS). O posicionamento correto do pro-motor foi verificado por sequenciamento. O novo vetor contendo promotor deoleosina foi chamado de pCAMBIA1301 UCD3.1.

Transformação de plantas. O vetor de transformação pCAMBI-A1301UCD3.1 foi, então, transformado em cepa de Agrobacterium tumefaci-ens EHA105 usando-se procedimentos padronizados. O gene de resistênciaà higromicina, acionado por um promotor 2 χ 35S, foi o marcador selecioná-vel em plantas no pCambia1301. A transformação mediada por Agrobacteri-um tumefaciens de Arabidopsis (com o plasmídio pCAMBIA1301UCD3.1) foiefetuada pelo método de imersão floral (Clough e Bent, 1998).

As plantas transformadas foram identificadas por plaqueamentode sementes em ágar a 0,8% contendo nitrato de potássio a e 1 mM 50 pgpor mL de higromicina. Mudas transformadas foram identificadas 7 dias apóso plaqueamento como plantas com uma raiz primária estendida. As mudasforam transferidas para ágar a 0,8% contendo 0,5X sais M&S. As plantasforam transferidas para o solo, quando o segundo par de folhas se desen-volveu, e foram deixadas amadurecer e formar sementes (T1). Em algunscasos, as sementes T1 foram germinadas e, então, deixadas crescer atéformar sementes (T2).

Coloração com GUS. As mudas e síliquas examinadas por colo-ração com GUS eram de sementes T1 ou T2 e estavam em diferentes está-gios de desenvolvimento. A solução e coloração com GUS foi preparada pordissolução de 5 mg de X-Gluc em 50 pL de dimetil formamida e, então, adi-ção disso a 10 mL de NaPO4 a 50 mM, pH 7,0. Com um fórceps fino, as mu-das foram transferidas das placas de germinação para um tubo de microcen-trífuga de 1,5 mL contendo 1,0 mL de corante GUS. Os tubos foram transfe-ridos para um dessecador e colocados sob vácuo durante 10 minutos e in-cubados a 37°C (no escuro) durante 24 ou 48 horas. O corante foi removidoe substituído pela solução de descoloração (EtOH a 70%). O clareamento foiacelerado por colocação dos tubos a 37°C. Dependendo da quantidade depigmento no tecido, várias trocas de EtOH a 70% eram requeridas. As mu-das tingidas e outros tecidos foram visualizados sob um microscópio de dis-secação, e as imagens foram digitalmente gravadas. No caso de síliquas, assíliquas foram removidas das plantas e abertas com um bisturi para permitira penetração do corante. O corante GUS acima foi modificado para incluir0,5% de Triton X100. Após a coloração, as síliquas foram descoloradas porincubação em EtOH:ácido acético (2:1) e, então, incubação em meio Levede Hoyer (100 g de hidrato de cloral em 60 mL de água). Síliquas com se-mentes mais jovens foram pré-incubadas na solução de etanohácido acéticodurante 4 horas, e síliquas com sementes mais velhas durante 8 horas. Assíliquas foram clareadas em meio Leve Hoyer durante 24 horas a vários dias.

Resultados:

A expressão de GUS em Arabidopsis thaliana transformada compCam1301UCD3.1 foi observada em mudas em diferentes estágios de de-senvolvimento. A expressão foi observada em cotilédones, hipocótilos demudas muito jovens e nas primeiras folhas verdadeiras de mudas mais ve-lhas. Nenhuma expressão significativa foi detectada nas raízes. A atividadede GUS não foi detectada em folhas maduras. A expressão de GUS tambémfoi detectada na parede da síliqua, mas a coloração com GUS na parede dasíliqua não foi tão intensa quanto nos tecidos de semente em germinaçãojovens. Não era possível clarear completamente a síliqua em meio de Hoyle,de modo que a pigmentação verde residual permaneceu na parede da síli-qua, dado à síliqua tingida uma tonalidade azul esverdeada. A atividade deGUS estava restrita à síliquta e não se estendeu ao caule floral.

Esses dados confirmam que o promotor CcOLE-1 de oleosina decafé ativa a expressão da seqüência codificadora ligada em sementes, emsíliquas, assim como nos primeiros cotilédones e nas primeiras folhas ver-dadeiras de sementes em germinação. De maneira importante, esse resulta-do demonstra que a seqüência promotora CcOle-1 aqui descrita contém to-dos os elementos funcionais requeridos para ativar a expressão do geneespecífica para sementes em plantas. Os dados também indicam que opromotor CcOle-1 pode ser usado para ativar a expressão de genes em te-cidos imaturos, como os dois primeiros cotilédones derivados do embrião desemente em germinação. Além disso, os dados indicam que o promotor Cc-DH2 é ativado em outros tecidos, como as síliquas. Deve-se notar que o ní-vel de ativação nas síliquas e nos grãos parece ser relativamente menor quenos cotilédones da semente em germinação, embora pelo menos parte des-sa diferença possa ser devida a diferenças na capacidade de fazer a colora-ção com GUS nesses tipos de tecidos muito diferentes. Finalmente, dada agrande distância evolucionária entre Arabidopsis e Coffea, a presente de-monstração de que o promotor CcDH2 do café funciona em Arabidopsis im-plica que esse promotor deve estar ativo em uma variedade relativamenteampla de plantas.

Exemplo 11

Indução da Expressão do Gene CcOle-1 de Café por Estresse Osmótico

Para explorar o papel de CcOle-1 de oleosina do café na respos-ta ao estresse osmótico, a expressão de CcOle-1 foi examinada em plantassubmetidas a um déficit de água (seca).

Materiais e Métodos:

Os experimentos de desidratação foram realizados usando-sepequenas árvores de Coffea arabica catimor propagadas por clonagem culti-vadas em uma estufa. As árvores tinham aproximadamente três anos deidade e foram cultivadas no solo. Várias semanas antes dos experimentos,as árvores foram cultivadas juntas na estufa a uma temperatura de aproxi-madamente 25°C, com uma umidade relativa de aproximadamente 70% eforam aguadas diariamente com irrigação automática. No início do experi-mento, três árvores agiram como controles e foram aguadas diariamente. Asoutras três árvores não foram aguadas e, portanto, sofreram uma desidrata-ção progressiva. A amostragem de duas folhas jovens (5 - 8 cm de tamanho,tiradas do crescimento emergente no topo da planta) foi realizada a cadasemana para cada árvore. As amostras foram congeladas diretamente emnitrogênio líquido.Extração de RNA e síntese de cDNA. A extração de amostras detecidos submetidos a vários tratamento de estresse e dos controles foi feitausando-se um minikit RNEASY® Plant da Qiagen GmbH (Hilden, Alema-nha). As amostras de tecido congeladas foram inicialmente trituradas comum pilão e almofariz usando-se nitrogênio líquido para se obter um pó. ORNA nesse pó congelado foi, então, extraído de acordo como protocolo dominikit RNEASY® Plant. Em resumo, um máximo de 100 mg de pó congela-do foram misturados com o tampão de Iise celular e β-mercaptoetanol. Paratecidos que mostravam necrose significativa, PMSF a 2 μΜ também foramadicionados. Para eliminar baixos níveis de DNA genômico contaminante,usou-se um tratamento com RNase livre de DNase contido no minikit RNE-ASY® Plant (conforme descrito pelo fornecedor), isto é, um tratamento de 15min à temperatura ambiente na coluna. Ao término, o RNA foi eluído da co-luna em 50 μL de água livre de RNase. A quantidade de RNA foi determina-da por medição espectrofotométrica a 260 nm, e a qualidade do RNA foi es-timada por cálculo da razão de absorbância 260 nm/280 nm. A qualidadedos RNAs também foi verificada por eletroforese em géis de agarose a 1%.As reações de transcrição reversa para essas amostras de RNA foi realizadada seguinte maneira: aproximadamente 1 pg de RNA total e 12,4 μΜ de oli-go-dT [2,3 μL de oligo-dT a 70 μΜ (ProIigo)] com água livre de RNase a umvolume final de 13 μL. Essa mistura foi incubada a 65°C durante 5 min. En-tão, adicionaram-se 7 μL de uma mistura de 5X tampão (tampão de reaçãoTranscriptor RT), 20 U de inibidor de RNase, quatro dNTPs 1 mM (250 μΜcada) e 10 U de transcriptase reversa TRANSCRIPTOR® (Roche, Nutley,NJ). Essa mistura foi incubada a 55°C durante 40 min. Finalmente, 0,5 μL deRNaseH (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram, então, adicionados aos 20 μL demistura, e a reação foi adicionalmente incubada durante 30 min a 37°C. OscDNAs gerados foram purificados usando-se o Kit de Purificação em GelSNAP™ da Invitrogen (Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo apresen-tado pelo fornecedor.

Projeto de inciadores e sonda MGB. Os conjuntos de inciadorese sonda MGB foram projetados usando-se o software PIMER EXPRESS™(Applied Biosystems, Foster City, CA). As temperaturas de hibridização dosinciadores eram de cerca de 60°C, ao passo que a da sonda MGB era pró-xima de 70°C. O tamanho dos amplicons era de aproximadamente 80 pb. Osinciadores foram sintetizados por PROLIGO, e as sondas MGB foram sinteti-zadas de acordo com as instruções do fornecedor (Applied Biosystems, Fos-ter City, CA). As seqüências dos inciadores e sondas para CcOle-1 e Cc-Pr139 foram apresentadas acima na Tabela 3.

RT-PCR quantitativa em tempo real. O cDNA usado para essesexperimentos foi preparado conforme descrito acima. Efetuou-se TaqMan-PCR conforme descrito em várias seções acima. A ausência de qualquernível significativo de DNA genômico residual nas preparações de cDNA foiverificada medindo-se o nível do sinal de amplificação da PCR quantitativapara um conjunto de iniciador/sonda específico genômico para o gene GOSversus o sinal para a sonda de cDNA do gene GOS.

Resultados:

A Figura 12 mostra a indução da expressão do gene CcOle-1nas folhas de árvores pequenas cultivadas em estufa, quando a aguagem foiinterrompido (condições de seca). Depois de três semanas, verificou-se quea expressão de CcOle-1 era ligeiramente induzida pelo estresse de água emuma planta versus a expressão média de Ole-1 em três plantas de controlebem aguadas. Pouca indução foi observada nas outras duas plantas trata-das na semana 3. Mas, na semana 4, a expressão de Ole-1 foi induzida emduas das três plantas tratadas. Na semana 6, três plantas tratadas mostra-ram uma elevação da expressão de Ole-1. Os níveis aumentados de ex-pressão de Ole-1 encontrados para todas as três plantas com estresse deágua variou entre um RQ de > 0,18 e < 0,4. Embora esses valores fossemvárias vezes menores que aqueles observados para Ole-1 em grãos em de-senvolvimento, eram, todavia, várias vezes maiores do que aqueles obser-vados para as folhas de controle não estressadas. Esta última observaçãoindica que oleosinas como CcOle-1 podem contribuir para a proteção endó-gena dos tecidos de folhas sob estresse osmótico.

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<1X0> Hestec S.A.

Cornell Research FoundationSIMKIN, Andrew J.MCCARTHY, James G.PETIARD, VincentTANKSIiKY, Steven D.LIK, Chenwei

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO DE CAFÉ (COFFEA SPP) , MOLÉCULA DE IIlRNA e CDNA, OLIGONUCLE-<120> (OTÍDEO, VETOR, MÉTODO PARA MODULAR O SABOR OU AROMA DE GRAOS DE CAFÉ, PROMOTOR, GENEQUIMÉRICO

<130> NO 7880/W0

<150> U.S. 60/696445<151> 2005-07-01

<160> 84

<170> PatentInversion 3.3

<210> 1

<211> 447

<212> DNA

<213> Coffea arabica

<400> 1 atggctgagc actaccagct gcagcaacgc cccacagagg ccgtcaaaag cttccttcct 60cagaagggtc catcaacttc acatgtgtta gcagttgtca cgctcctccc agttgcggga 120gtcctgctag gcctttccgg gctgattctc gtcggaacgg tcatcggtct ggcggtgaca 180accccgcttt tcgttatctt tagccccatt ttggtcccag ctgtatttgc cctagggctg 240gccctggccg ggttcttgac ctccggtgct ttcgggatca ctgcacttgc ttcattgtcg 300tggatgctga actacatccg actcatgaag gcgtcttccc aggagcaaat ggacctcgca 360aagtggcgcg tgcaggacac tgccggccaa gttggtcaga aagcgagaga cgtgggccag 420agaactcaag atgtagccag agcatga 447

<210> 2<211> 629<212> DNA

<213> Coffea canephora (robusta)<400> 2

ggaccatctt tagcactcaa aaaggggaaataccgtccac cgcccttcat ggctgagcacgtcaaaagct tccttcctca gaagggtccactcctcccag ttgcgggagt cctgctaggc

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atcggtctgg cggtgacaac cccgcttttc gttatcttta gccccatttt ggtcocagctgtatttaccc tagggctgac cctggccggg ttcttgacct ccggtgcttt cgggatcactgcacttgctt cattgtcgtg gatgctgaac tacatccgac tcatgaaggc gtcttcccaggagcaaatgg acctcgcaaa gtggcgcgtg caggacactg ccggccaagt tggtcagaaagcgagagacg tgggccagag aactcaagat gtagccagag catgagctcc tgaagtgggctttgtgtcac gagctcggco caattttgta ttgggttttg atgttcgttt tgtttctgatccttgttaat cttgcctatg gcttttata

<210> 3<211> 558<212 > DNA

<213> Coffea canephora (robusta)

tgcagaattc ggtaccacaa caaaaacttc aattcccacc atccgcttgt cccttcgcct 60

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<210> 4<211> 707<212> DNA

<213> Coffea canephora (robusta)

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<210> 5<2Χ1> 720<212 > DKA

<213> Coffea canephora (robusta)

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<210> 6<211> 620<212> DNA

<213> Coffea canephora (robusta)

ctcttctcca aacaactcca gctttccaac catggccgac caccaagcca gcoctggcca 60

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<210> 7<211> 1224<212> DNA

<2Ι3> Coffea canephora (robusta)<400> 7

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<210> 8<211> 148<212 > PRT

<213> Coffea xarabica<400> 8

Met Ala Glu His Tyr Gln Leu Gln Gln Arg Pro Thr Glu Ala Val Lye

C 10 15

Ser Phe Leu Pro Gln Lys Gly Pro Ser Thr Ser His Val Leu Ala Val20 25 30

Val Thr Leu Leu Pro Val Ala Gly Val Leu Leu Gly Leu Ser Gly Leu35 40 45

Ile Leu Val Gly Thr Val Ile Gly Leu Ala Val Thr Thr Pro Leu Phe50 55 60

Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Val Phe Ala Leu Gly Leu65 70 75 80

Ala Leu Ala Gly Phe Leu Thx Ser Gly Ala Phe Gly Ue Thr Ala Leu85 9° 95

Ala Ser Leu Ser Trp Met Leu Asn Tyr Ile Arg Leu Met Lys Ala Ser100 105 HO

Ser Gln Glu Gln Met Asp Leu Ala Lys Trp Arg Val Gln Asp Thr Ala115 120 125

Gly Gln Val Gly Gln Lys Ala Arg Asp Vai Gly Gln Arg Thr Gln Asp130 "5 1^0

Val Ala Arg Ala145<210> 9<211> 148<212> PRT

<213> Coffea canephora (robusta)<400> 9

Met Ala GlU His Tyr Gln Leu Gln Gln Arg Pro Thr Glu Ala Val Lys1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Gln Lys Gly Pro Ser Thr Ser His Val Leu Ala Val20 25 30

Val Thr Leu Leu Pro Val Ala Gly Val Leu Leu Gly Leu Ser Gly Leu35 40 45

Ile Leu Val Gly Thr Val Ile Gly Leu Ala Val Thr Thr Pro Leu Phe5O 55 60

Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Val Phe Thr Leu Gly Leu65 70 75 80

Thr Leu Ala Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Ile Thr Ala Leu85 90 95

Ala Ser Leu Ser Trp Met Leu Asn Tyr Ile Arg Leu Met Lys Ala Ser100 105 no

Ser Gln Glu Gln Met Asp Leu Ala LyB Trp Arg Val Gln Asp Thr Ala115 120 125

Gly Gln Val Gly Gln Lys Ala Arg Asp Val Gly Gln Arg Thr Gln Asp130 135 140

Val Ala Arg Ala

145

<210> 10<211> 135<212> PRT

<213> Coffea canephora (robusta)<400> 10

Met Ala Asp Ile Arg Gln Gln Gln Pro Leu Ser His Gln Val Val Lys15 10 15

Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly20 25 30

Leu Ile Leu Ala Gly Thr Val Ile Ala Leu Ala Leu Ala Thr Pro Leu35 40 45

Leu Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Gly Ile Thr Val Phe50 55 60

Leu Leu Val Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly Val Ala Ala65 VO 75 80

Leu Ser Val Leu Ser Trp Ile Tyr Gly Tyr Val Thr Gly Lys Asn Pro85 90 95

Pro Gly Ala Asp Gln Leu Asp Arg Ala Arg Gln Lys Leu Ala Leu Lys100 105 HO

Ala Arg Glu Met Lys Asp Arg Ala Glu Gln Tyr Gly Gln Gln Asn Ile115 120 125

Pro Ala Gly Ser Gln Gln His130 135

<210> 11

<211> 175

<212> PRT

<213> Coffea canephora (robusta)

<400> 11

Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Pro Pro Gln Gln Leu Gln Val His Hisi 5 10 15

Gln His Leu Gly Tyr Gly Glu Gly Gly Val Lys Thr Leu Phe Pro Gln20 25 30

Thr Gly Pro Ser Ala Ile Gln Val Leu Ala Val Val Thr Leu Leu Pro35 40 45

Val Gly Gly Thr Leu Phe Gly Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gly Thr50 55 60Leu Ile Gly Leu Ala Leu Thr Thr Pro Leu Phe Val Ile Cys Ser Pro65 70 75 80

Val Leu Val Pro Ala Val Val Leu Phe Gly Leu Ala Val Thr Gly Phe85 90 95

Leu Ser Ser Gly Ala Phe Gly Leu Met Gly Leu Ser Ser Leu Ser Trp100 105 HO

Val Leu Asn Cys Phe Arg Gln Lys Ala Thr Glu Gln Met Asp Asp Ala115 120 125

Arg Arg Arg Met Gln Glu Ala Ala Gly Gln Leu Gly Gln Lys Thr Lys130 135 140

Glu Val Gly Glu Arg Ile Gln Thr Lys Ala Gln Glu Pro Thr Gly Arg145 150 155 160

Asp Gln Gly Val Arg Glu Ala Gly Lys Tyr Val Glu Lys Phe Gln165 170 175

<210> 12<211> 142<212> PRT<213> Coffea<400> 12

Met Ala Thr Leu Pro Asp Gln Pro Gln Thr Gln His Ser Thr Ser Gln15 10 15

Val Val Lys Thr Thr Thr Ala Val Ala Val Gly Gly Ser Leu Met Leu20 25 30

Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Gly Thr Ile Ile Gly Leu Val Leu Ala35 40 45

Thr Pro Leu Leu Val Ile Phe Ser Pro Val Ile Val Pro Ala Ala Val50 55 60

Thr Phe Phe Leu Ile Leu Ala Gly Phe Phe Ile Ser Gly Gly Leu Gly65 70 75 80

Val Thr Ala Thr Phe Ile Phe Tyr Trp Met Phe Arg Tyr Ala Thr Gly85

90 95

Lys His Pro Ile Gly Ala Asp Gln Leu Asp Arg Ala Arg Glu Lys Ile100 105 HO

Ala His Ala Ala Lys Glu Met Arg Asp Lys Rla Glu His Phe Gly Gln115 120 125

Gln Ala Gln Gln Gln Ile Lys Gly Ser Pro Asp Gln Asp Thr130 135 140

<210> 13<211> 167<212> PRT

<213> Coffea canephora (robusta)<400> 13

Met Ala Asp His Gln Ala Ser Pro Gly Gln Pro Gln Trp Pro Pro Arg1 5 10 15

Pro Thr Thr Thr Ser Thr Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Leu Arg Lys20 25 30

Met His Glu His Ala Pro Asn Ser Thr Gln Leu Ile Gly Phe Leu Thr35 40 45

Leu Val lie Ser Gly Gly He Leu Leu Leu Leu Thr Gly Leu Thr Leu50 55 60

Thr Ala Thr Val Leu Gly Leu Ile Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Ile65 70 75 80

Ser Ser Pro Ile Trp Val Pro Ala Gly Ser Ile Leu Phe Val Ile Ile85 90 95

Ala Gly Leu Leu Ser Phe Phe Gly Phe Gly Val Ala Ala Met Ala Ala100 105 HO

Phe Ser Trp Leu Tyr Arg Tyr Phe Arg Gly Phe His Pro Pro Gly Ser115 120 125

Asp Arg Val Asp Tyr Ala Arg Ser Arg Ile Ala Asn Thr Ala Ser Gln130 135 140Val Lys Asp Tyr Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Tyr Leu His Gly Lys vai145 150 155

Lys Asp Ala Ala Pro Gly Ala165

<210> 14<211> 356<212> PRT

<213> Coffea canephora (robusta)<400> 14

Met Asp Leu Ile Asn Ser Val Leu Asn Leu Val Val Pro Pro Ala Ser

EL 10

Leu Leu Met Leu Ala Phe Ala Trp Pro Thr Leu Ser Phe Ile Asn Ala20 25 30

CVS Glu Trp Leu Tyr Asn Thr Tyr Phe Ser Glu Glu Met Asp Asn Lys__ ΔΛ 45

35 «

Val Val Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Glu Gln Ile Ala50 55 60

Tyr Glu Tyr Ala Lys Arg Gly Ala Asn Leu Val Leu Val Ala Arg Arg65 70 75

Asp Aen Arg Leu Hie Gly He Ala Asp Aen Ala Gln Arg Leu Gly Ser85 90

Arg His Val Leu Ile Met Ala Ala Asp Val Val Lys Glu Glu Asp Cys100 105

(

Arg Arg Phe Ile Asn Glu Thr Ile Asn Tyr Phe Gly Cys Val Asp His115 120

Leu Val Asn Thr Ala Ser Leu Gly His Thr Phe Phe Phe Glu Glu Ala130 I35 140

Thr Asp Ala Ser Val Phe Pro lie Leu Leu Asp Ile Asn Phe Trp Gly

Asn

Val Tyr Pro Thr Tyr Val Ala Leu Pro IYr Leu Arg Gln Thr Asn1S5 170 175

Gly Arg Ile Val Val Asn Ala Ser Ile Glu Asn Trp Leu Pro Leu Pro180 185 190

Arg Met Ser Leu Tyr Ser Ala Ala Lys Ala Ala Leu Ile Asn Phe Tyr195 200 205

Glu Thr Leu Arg Phe Glu Val Lys Asp Glu Val Gly Ile Thr Ile Ala210 215 220

Thr Hls Gly Trp Ile Gly Thr Glu Met Thr Arg Gly Arg Phe Met Val225 230 235 240

Glu Glu Gly Ala Glu Met Gln Trp Lys Glu Glu Arg Glu Val Gln Val245 250 255

Thr Gly Gly Pro Ala Glu Asp Phe Ala Lys Leu Ile Val Ala Gly Ala260 265 270

Cys Arg Gln Ala Ala Tyr Val Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Asp Ile Phe275 280 285

/

Phe Val Phe Arg Val Phe Ser Pro Asn Val Leu Tyr Trp Thr Phe His290 295 300

Leu Leu Ser Thr Ser His Val Ser Arg Arg Thr Ser Phe Ile Gly Thr305 310 315 320

Gly Arg Pro Leu Leu Glu Gly Ser Pro Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gly325 330 335

Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Gln Ser Gln Ala Pro Val Tyr Gln Gln340 345 350

Gln Lys Val Glu355

<210> 15

<211> 1002

<212> DNA

<213> Coffea canephora (robusta)ZTzLcllc tttafcttfcta atttattgat gttttottae atcttttaat tttatttttg 60

tccattaaat taaaaaagtt aaaaaagaat tatttttctt taacccaaat tatttaatgc 120cacaaccact tacttttate tctttttttt tgtttcttat caagtttgca tttctattttcgattctctt gacttctttc gaaccccaaa ctttcttttt taaattgcaa tctctaaatcccaaaacgta aattaaaatt taagttcaca atgtctaaat tctcatagac gtgaattttgtataatttca aaatattgtg atatttttgg gttggattta agattttttg gtagatataatfcgaaattga aatgaaattt atttgtttta acttataatt caaaaaattt atttttaaaaatccaagtta ttcaaaaata gtaaactttt catcatgtaa agtattaaat tagtctattacatgtcttat tttgtgcata tatatattta tataaattat tttttaaaaa tttattgaaccgaagttgaa ctgatccgac cggttgaatc tcgacccttt cacttcaccg gttcaattaacagtccggtt tttaaaatat tcttatagac gggactgcca tggtgccaaa cttgtactagagaaaaatat gatttaagtc caacatgatt aatccaaatt caattagcca atggtttctttaaattaaga aaagtaacaa atgattgaaa aaaaaaaaac caatgggtta agttaaagaacataagtgcc cattaaatcc aataaatata taaactagaa aaagcatcat caatagatgctaacaaaatt gtgaagtcat catcattacc aaacaccaaa ttttccatgc aaaactactctccctttctc aaacatgtgt caccacctta actctacgtg tccattcccc cttcectttaaatccagcac ctcaccacga ccgccaccgc gccattttca cc

<210> 16

<211> 352

<212> PRT

<213> Sesamuro indicum

<400> 16

Met Asp Leu Ile Asn Ser Leu Leu Asn Phe Val Val Pro Pro Ala Ser

10

Leu Leu Met Leu Ala Phe Thr Trp Pro Thr Leu Phe Phe Ile Thr Thr20 25 30

Cvs Glu Trp Leu Tyr Asti Thr Tyr Leu Asn Ser Glu Asn Met Glu Asn35 40 45

Lys Val Val Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Glu Gln Ile

55 60

50

1802403003604204805406006607207808409009601002Ala Tvr Sln Tyr Ala Lys Arg Gly Ala Asn Leu Val Leu Val Ala Arg65 70 75 80

Arg Glu His Arg Leu Arg Gly Xle Ser Glu Asn Ala Arg Arg Leu Gly85 90 95

Ala Pro Asn Val Leu Ile Met Ala Ala Asp Val Val Lys Glu Glu Glu100 105 110

Cys Arg Arg Phe Ile Asn Glu Thr Ile Asn Tyr Tyr Gly Arg Val Asp

115 120 125

His Leu Val Asn Thr Val Ser Leu Gly His Thr Phe Tyr Phe Glu Glu130 "δ 140

Ala Ser Asp Ser Ser Val Phe Pro Ile Leu Met Asp Ile Asn Phe Trp

145

150 155 160

Gly Asn Val Tyr Pro Thr Tyr Val Ala Leu Pro Tyr Leu Arg Glu Ser165 170 175

Asn Gly Arg Ile Ile Val Asn Ala Ser Val Glu Asn Trp Leu Pro Leu180 185 190

Pro Arg Met Ser Leu Tyr Ser Ala Ala Lys Ser Ala Leu Ile Asn Phe19S 200 205

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Val Glu Glu Gly Ala Glu Met Gln Trp Lys Glu Glu Arg Glu Val His245 250 255

Val Thr Gly Gly Pro Val Glu Glu Phe Ala Lys Gln Ile Val Ser Gly260 265 270

Ala Cys Arg Gly Asp Pro Tyr Val Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Asp Ile275 280 285Phe Phe Leu Tyr Arg Val Phe Ala Pro Lys Val Leu Asp Trp Thr Phe290 295 300

Arg Phe Leu Leu Thr Asn Gly Gly Ala Arg Arg Thr Ser Phe lie Gly305 310 315 320

Thr Gly Arg Pro Leu Leu Glu Thr Ser Ser Pro Arg Arg Ser Ala Val325 330 335

Met Glu Gly Ser Ser Pro Arg Arg Leu Pro Pro Gly Pro Leu Thr Phe340 345 350

Ser Pro Ala Phe Gln Gln Gln Lys Ser Glu355 360

<210> 17<211> 389<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 17

Met Val Asp Leu Leu Asn Ser Val Met Asn Leu Val Ala Pro Pro Ala1 5 10 15

Thr Met Val Val Met Ala Phe Ala Trp Pro Leu Leu Ser Phe Ile Ser20 25 30

Phe Ser Glu Arg Ala Tyr Asn Ser Tyr Phe Ala Thr Glu Asn Met Glu35 40 45

Asp Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ala Ser Ser Ala Ile Gly Glu Gln50 55 60

Ile Ala Tyr Glu Tyr Ala Lys Arg Gly Ala Asn Leu Val Leu Val Ala65 70 75 80

Arq Arg Glu Gln Arg Leu Arg Val Val Ser Asn Lys Ala Lys Gln Ile85 90 95

Glv Ala Asn His Val Ile Ile Ile Ala Ala Asp Val Ile Lys Glu Asp100 105 HO

Asp Cys Arg Arg Phe Ile Thr Gln Ala Val Asn Tyr Tyr Gly Arg Val115 120 125

Asp His Leu Val Asn Thr Ala Ser Leu Gly His Thr Phe Tyr Phe Glu130 135 140

Glu Val Ser Asp Thr Thr Val Phe Pro His Leu Leu Asp Ile Asn Phe145 150 155 160

Trp Gly Asn Val Tyr Pro Thr Tyr Val Ala Leu Pro Tyr teu His Gln165 170 175

Thr Asn Gly Arg Ile Val Val Asn Ala Ser Val Glu Asn Trp Leu Pro180 185 190

Leu Pro Arg Met Ser Leu Tyr Ser Ala Ala Lys Ala Ala Leu Val Asn195 200 205

Phe Tyr Glu Thr Leu Arg Phe Glu Leu Asn Gly Asp Val Gly Ile Thr210 215 220

Ile Ala Thr His Gly Trp Ile Gly Ser Glu Met Ser Gly Gly Lys Phe225 230 235 240

Met Leu Glu Glu Gly Ala Glu Met Gln Trp Lys Glu Glu Arg Glu Val245 250 255

Pro Ala Asn Gly Gly Pro Leu Glu Glu Phe Ala Lys Met Ile Val Ala260 265 270

Gly Ala Cys Arg Gly Asp Ala Tyr Val Lys Phe Pro Asn Trp Tyr Asp275 280 285

Val Phe Leu Leu Tyr Arg Val Phe Thr Pro Asn Val Leu Arg Trp Thr290 295 300

Phe Lys Leu Leu Leu Ser Thr Glu Gly Thr Arg Arg Ser Ser Leu Val305 310 315 320

Gly Val Gly Ser Gly Met Pro Val Asp Glu Ser Ser Ser Gln Met Lys325 330 335

Leu Met Leu Glu Gly Gly Pro Pro Arg Val Pro Ala Ser Pro Pro Arg340 345 350Tyr Thr Ala Ser Pro Pro His Tyr Thr Ala Ser Pro Pro Arg Tyr Pro355 360 365

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Asn Ile Gln Glu Leu385

< 210 > 18<211> 183

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 18

Met Ala Asp Val Arg Thr His Ser His Gln Leu Gln Val His Pro Gln1 5 10 I5

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Thr Leu Leu Thr Ile Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Val Ile Glv50 55 60

Leu Met Leu Ala Phe Pro Leu Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Ile Val65 7O 75 80

Pro Ala Ala Phe Val Ile Gly Leu Ala Met Thr Gly Phe Leu Ala Ser85 90 95

Gly Ala Ile Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Met Ser Trp Val Leu Asn100 105 no

Tyr Ile Arg Arg Ala Gly Gln His Ile Pro Glu Glu Leu Glu Glu Ala115 120 I25

Lys His Arg Leu Ala Asp Met Ala Glu Tyr Val Gly Gln Arg Thr Lys130 135 i4oAsp145

Ala Glv Gln Thr Ile Glu Asp Lys Ala His Asp Val Arg Glu Ala160

150

155

Ly9 Thr Phe Asp Val Arg Asp Arg Asp Thr Thr Lys Gly Thr HiB Asn

165 no 175

Val Arg Asp Thr Lys Thr Thr180

<210> 19

<211> 191

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 19

Met Ala Asn Val Asp Arg Asp Arg Arg Val His Val Asp Arg Thr Asp5 10 15

Arq Val His Gln Pro Asn Tyr Glu Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly20 25 30

Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser35 40 45

Thr Asn Gln Ile Leu Ala Leu Ile Ala Gly Val Pro Ile Gly Gly Thr50 55 60

Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Val Ile Gly Leu65 70 75

Leu Val Ser Ile Pro Leu Phe Leu Leu Phe Ser Pro Val Ile Val Pro85 90 95

Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Val Thr Gly Ile Leu Ala 3er Gly100 105 110

Leu Phe Gly Leu Thr Gly Beu Ser Ser Val Ser Trp Val Leu Asn Tyr115 120 125

Leu Arg Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro Glu Gln Leu Asp Tyr Ala Lys130 135 140

Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu145 150 155Met Gly Gln Tyr Val Gln Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu165 170 175

Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser180 185 190

<210> 20<211> 173<212 > PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 20

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Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Gln Met Ser Gly20 25 30

Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Ala Thr35 40 45

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Val Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile65 70 75 80

Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile85 90 95

Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Val100 105 110

Phe Ser Trp Ile Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser115 120 125

Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp130 135 140

Leu Lys Asp Arg Ala Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly Glu145 150 155 160His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gln His Thr Thr165 170

<210> 21<211> 199<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 21

Met Ala Asp Thr His Arg Val Asp Arg Thr Asp Arg His Phe Gln Phe1 5 10 15

Gln Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Arg Gly Gln Gly Glxi Tyr Glu Gly Asp20 25 30

Arg Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Lys Ser Met Met Pro Glu Ser Gly35 40 45

Pro Ser Ser Thr Gln Val Leu Ser Leu Leu Ile Gly Val Pro Val Val50 55 60

Gly Ser Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ala Gly Ser Val Ile65 70 75 80

Gly Leu Met Val Ala Leu Pro Leu Phe Leu Leu Phe Ser Pro Val Ile85 90 95

Val Pro Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Met Thr Gly Phe Leu Ala100 105 110

Ser Gly Met Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Ile Ser Trp Val Met115 120 125

Asn Tyr Leu Arg Gly Thr Arg Arg Thr Val Pro Glu Gln Leu Glu Tyr130 135 140

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Tyr Asp Ile Ser Lys Pro His Asp Thr Thr Thr Lys Gly His Glu Thr180 1Β5 190Gln Gly Arg Thr Thr Ala Ala195

<210> 22

<211> 141

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 22

Met Ala Asp Gln Thr Arg Thr His His Glu Met Ile Ser Arg Asp Ser1 5 10 15

Thr Gln Glu Ala His Pro Lys Ala Arg Gln Met Val Lys Ala Ala Thr20 25 30

Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Thr Leu35 40 45

Ala Gly Thr Val Val Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val XleSO 55 60

Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Val Val Thr Val Ala Leu Ile lie65 70 75 80

Thr Gly Phe Leu Ala Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Ala85 90 95

Phe Ser Trp Leu Tyr Arg His Met Thr Gly Ser Gly Ser Asp Lys Ile100 105 110

Glu Asn Ala Arg Met Lys Val Gly Ser Arg Val Gln Asp Thr Lys Tyr115 120 125

Gly Gln His Asn Ile Gly Val Gln His Gln Gln Val Ser130 135 140

<210> 23<211> 187<212> PRT<213> Zea mays<400> 23

Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly Ile Tyr Gly Gly Ala His Ala ThrTyr Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gly Gly Gly Gly Arg Pro Met Gly Glu20 25 30

Gln Val Lys Lys Gly Met Leu His Asp Lys Gly Pro Thr Ala Ser Gln35 40 45

Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu Phe Pro Leu Gly Gly Leu Leu Leu Val50 55 60

Leu Ser Gly Leu Ala Leu Thr Ala Ser Val Val Gly Leu Ala Val Ala65 70 75 80

Thr Pro Val Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Leu85 90 95

Leu Ile Gly Thr Ala Val Met Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Leu Gly100 105 110

Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Asn Thr Ala Arg Gln115 120 125

Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp Tyr Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Met130 135 140

Ala Glu Ala Ala Ala Gln Ala Gly His Lys Thr Ala Gln Ala Gly Gln145 150 155 160

Ala Ile Gln Gly Arg Ala Gln Glu Ala Gly Thr Qly Gly Gly Ala Gly165 170 175

Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Ala Ser Ser180 185

<210> 24

<211> 175

<212 > PRT

<213> 2ea roays

<400> 24

(

Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly Ile Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Gly15 10 15Gln Gln Gln Gly Arg Pro Pro Met Gly Glu Gln Val Lys Gly Met Ile20 25 30

His Asp Lys Gly Pro Thr Ala Ser Gln Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu35 40 45

Phe Pro Leu Gly Gly Leu Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala50 55 60

Ala Ser Thr Val Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Val Phe Leu Leu Phe65 70 75 80

Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Leu Leu lie Gly Thr Ala Val Ala85 90 95

Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu100 105 110

Thr Cys Leu Ala Asn Thr Ala Arg Gln Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp115 120 125

Tyr Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Met Ala Glu Ala Ala Ma His Ala130 135 140

Gly His Lys Thr Ala Gln Ala Gly His Gly Ile Gln Ser Lys Ala Gln145 150 155 160

Glu Ala Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Gly Arg Thr Ser Ser165 170 175

<210> 25<211> 156<212? PRT<213> Zea mays<400> 25

Met Ala Asp His His Arg Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly1 5 10 15

Asp Leu Gln Arg Gly Gly Gly Met His Gly Glu Ala Gln Gln Gln Gln20 25 30Lys Gln Gly Ala Met Met Thr Ala Leu Lys Ala Ala Thr Ala Ala Thr35 40 45

Phe Gly Gly Ser Met Leu Val Leu Ser Gly Leu Ile Leu Ala Gly Thr50 55 60

Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Val Leu Val Ile Phe Ser Pro65 70 75 80

Val Leu Val Pro Ala Ala Ile Ala Leu Ala Leu Met Ala Ala Gly Phe85 90 95

Val Thr Ser Gly Gly Leu Gly Val Ala Ala Leu Ser Val Phe Ser Trp100 105 110

Met Tyr Lys Tyr Leu Thr Gly Lys His Pro Pro Ala Ala Asp Gln Leu115 120 125

Asp Eis Ala Lys Ala Arg Leu Ala Ser Lys Ala Arg Asp Val Lys Asp130 135 140

Ala Ala Gln His Arg Ile Asp Gln Ala Gln Gly Ser145 150 155

<210> 26

<211> 172

<212> PRT

<213> Orysa sativa

<400> 26

Met Ala Asp Arg Asp Arg Ala Gly Gln Tyr Tyr Gln Gln Gln Arg Gly1 5 10 15

Gln Val Gly Glu Thr Val Lys Gly Ile Leu Pro Glu Lys Ala Pro Ser20 25 30

Ala Ser Gln Ala Leu Thr Val Ala Thr Leu Phe Pro Leu Gly Gly Leu35 40 45

Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ser Val Val Gly Leu50 55 60

Ala Val Asp Thr Pro Val Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro65 70 75 80Ala Ala Leu Leu Ile Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu Thr Ser Gly85 90 95

Ala Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asn Thr100 105 110

Ala Arg Gln Ala Phe Gln Arg Thr Pro Asp Tyr Val Glu Gln Ala Arg115 120 125

Arg Arg Met Ala Glu Ala Ala Ala His Ala Gly Hie Lys Thr Ala Gln130 135 140

Ala Ala His Ala Ile Gln Gly Arg Ala Aep Gln Ala Gly Thr Gly Ala145 150 155 160

Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Thr Lys Thr Ser Ser165 170

<210> 27<211> 148<212> PRT<213> Oryza sativa<400> 27Met Ala Asp Gln His 1 5

10 15

Arg Gly Gly Gln Glu Gln Gln Glu Lys Gln Pro Phe Met Met Thr Ala20 25 30

Leu Lys Thr Val Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Ser Met Leu Val Leu35 40 45

Ser Gly Leu Ile Leu Ala Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr50 55 60

Pro Val Leu Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Ile Ala65 70 75 80

Leu Ala Leu Met Ala Ala Gly Phe Val Thr Ser Gly Gly Leu Gly Val85 90 95Ala Ala Leu Ser Val Phe Ser Trp Met Tyr Lys Tyr Leu Thr Gly Lys100 105 HO

His Pro Pro Gly Ala Asp Gln Leu Asp His Ala Lys Ala Arg Leu Ala115 120 125

Ser Lys Ala Arg Asp lie Lys Glu Ala Ala Gln His Arg Ile Asp Gln130 135 140

Ala Gln Ala Ser145

<210> 28

<211> 158

<212> PRT

<213 > Oryza sativa

<400> 28

Met Ala Gly Gly Gly Gly Ala Val Gly Glu His Tyr Met Arg Val Ile1 5 10 15

Arg Gly Asp Asp Gly Tyr Gly Aep Asp Gly Gly Gln His Gln Glu Lys20 25 30

Pro Gly Ala Ala Val Ser Val Ala Lys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala35 40 45

Ala Gly Ser Met Leu Ala Leu Ala Gly Leu Thr Ala Thr Gly Thr Ala50 55 60

Leu Ala Leu Ile Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Leu Phe Ser Pro Val65 70 75 80

Leu Val Pro Ala Ala Phe Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ala Gly Leu Ala85 90 95

Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ala Ala Ala Val Gly Val Leu Ala Trp Met100 105 110

Tyr Arg Tyr Leu Gln Ser Pro Ser Gly Glu His Ala Pro Ala Gly Ala115 120 125

Gly Lys Val Glu His Ala Arg Ala Leu Leu Asp Ala Lys Ala His Asp130 135 140Val Gly Asp Trp Val Gln His Arg Leu Asp Glri Ala Arg Thr

145

150

155

<210> 29

<211> 144

<212> PjRT

<213> Sesamum indlcum

<400> 29

Met Ala Asp Glu Pro His Asp Gln Arg Pro Thr Aep Val Ile Lys Ser1 5 10 15

Tyr Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Val20 25 30

Thr Leu Phe Pro Leu Gly Ala Val Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Ile35 40 45

Leu Thr Gly Thr lie Ile Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Leu Phe Val50 55 60

Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Ala Leu Thr Ile Ala Leu Ala65 70 75 80

Val Thr Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Ile Thr Ala Leu Ser85 90 95

Ser Ile Ser Trp Leu Leu Asn Tyr Val Arg Arg Met Arg Gly Ser Leu100 105 110

Pro Glu Gln Leu Asp His Ala Arg Arg Arg Val Gln Glu Thr Val Gly115 120 125

Gln Lya Thr Arg Glu Ala Gly Gln Arg ser Gln Asp Val Ile Arg Pro130 135 140

<210> 30

<211> 166

<212> PRT

<213> Sesamum indicum

<400> 30

Met Ala Asp Arg Asp Arg Pro His Pro His Gln He Gln Val His Pro1 5 10 15

Gln His Pro His Arg Tyr Glu Gly Gly Val Lys Eer Leu Leu Pro Gln20 25 30

Lys Gly Pro Ser Thr Thr Gln lie Leu Ala Ile Ile Thr Leu Leu Pro35 40 45

Ile Ser Gly Thr Leu Leu Cys Leu Ala Gly Ile Thr Leu Val Gly Thr50 55 60

Leu Ile Gly Leu Ala Val Ala Thr Pro Val Phe Val Ile Phe Ser Pro65 70 75 80

Val Leu Val Pro Ala Ala Ile Leu Ile Ala Gly Ala Val Thr Ala Phe85 90 95

Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Leu Ser Trp100 105 110

Val Leu Asn Ser Phe Arg Arg Ala Thr Gly Gln Gly Pro Leu Glu Tyr115 120 125

Ala Lys Arg Gly Val Gln Glu Gly Thr Leu Tyr Val Gly Glu Lys Thr130 135 140

Lys Gln Ala Gly Glu Ala Ile Lys Ser Thr Ala Lys Glu Gly Gly Arg145 150 155 160

Glu Gly Thr Ala Arg Thr165

<210> 31<211> 145<212> PRT

<213> Sesamum indicum<400> 31

Met Ala Glu His Tyr Gly Gln Gln Gln Gln Thr Arg Ala Pro His Leu1 5 10 15

Gln Leu Gln Pro Arg Ala Gln Arg Val Val Lys Ala Ala Thr Ala Val20 25 30Thr Ala Gly Qly Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Gly35 40 45

Thr Val Ile Ala Leu Thr Ile Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile Phe Ser50 55 60

Pro Val Leu Val Pro Ala Val Ile Thr Ile Phe Leu Leu Gly Ala Gly65 70 75 80

Phe Leu Ala Ser Gly Gly Phe Gly Val Ala Ala Leu Ser Val Leu Ser85 90 95

Trp Ile Tyr Arg Tyr Leu Thr Gly Lys His Pro Pro Gly Ala Asp Gln100 105 110

Leu Glu Ser Ala Lys Thr Lys Leu Ala Ser Lys Ala Arg Glu Met Lys115 120 125

Asp Arg Ala Glu Gln Phe Ser Gln Gln Pro Val Ala Gly Ser Gln Thr130 135 140

Ser145

<210> 32

<211> 160

<212> PRT

<213> Theobroma cacao

<400> 32

Met Ala Asp Arg Asp Arg Pro His Gln Ile Gln Val His Gln His His1 5 10 15

Arg Phe Asp Gln Gly Gly Lys Asn Tyr Gln Ser Ala Ser Gly Pro Ser20 25 30

Ala Thr Gln Val Leu Ala Val Leu Thr Leu Leu Pro Val Gly Gly Ile35 40 45

Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Thr Leu Thr Gly Thr Val Ile Gly Leu50 55 60

Cys Val Ala Thr Pro Leu Phe Ile Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro65 70 75 80

Ala Ala Xle Ala Val Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu Ser Ser Gly85 90 95

Ala Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Leu Ala Tyr Val Phe Asn Arg100 105 110

Leu Arg Arg Ala Thr Gly Thr Glu Gln Leu Asp Met Asp Gln Ala Lys115 120 125

Arg Arg Met Gln Asp Met Ala Gly Tyr Val Gly Gln Lys Thr Lys Glu130 135 140

Val Gly Gln Lys Ile Glú Gly Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Arg Thr145 150 155 160

<210> 33<211> 147<212> PRT

<213> Theobroma cacao<4 00> 33

Met Ser Asn Asp Gln Asn Lys Pro Met Thr Gln Lys Leu Tyr Glu Ser15 10 15

Ala Pro Ser Ser Arg Gln Ala Ala Lys Phe Leu Thr Ala Thr Thr Leu20 25 30

Gly Ala Thr Leu Leu Phe Leu Ser Gly Leu Thr Leu Thr Gly Thr Val35 40 45

Met Ala Leu Ile Met Ala Thr Pro Leu Met Val Ile Phe Ser Pro Ile50 55 60

Leu Val Pro Ala Gly Val Val Ile Phe Leu Val Ile Thr Gly Phe Leu65 70 75 Θ0

Phe Ser Gly Gly Cys Gly Val Ala Ala Ile Thr Ala Leu Ser Trp Ile85 90 95

Tyr Asn Tyr Val Arg Gly Lys His Pro Pro Gly Ala Asp Gln Leu Asp100 105 110Tyr Ala Arg Asn Thr Leu Ala Arg Tlir Ala Arg Asp Met Thr Glu Lys115 120 125

Ala Lys Glu Tyr Gly Gln Tyr Val Gln His Lys Ala Gln Glu Val Ala130 135 140

Gln Gly Ser145

<210> 34<211> 165<212> PRT<213> Olea<400> 34

Met Ala Glu Arg Asp Arg Pro Gln Pro His Gln Val Gln Val His Thr1 5 10 15

Gln Ser Arg Tyr Asp Gln. Gly Gly Gly Met Lys Ser Val Leu Pro Lys20 25 30

Lys Gly Pro Ser Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Val Thr Leu Leu Pro35 40 45

Val Gly Gly Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Glu Ser50 55 60

Leu Ile Gly Leu Ala Val Thr Thr Pro Leu Phe Ile Ile Phe Ser Pro65 70 75 80

Val Leu Val Pro Ala Thr Ile Leu Val Gly Leu Ala Val Thr Ala Phe85 90 95

Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Leu Ser Trp100 105 110

Val Val Asn Phe Leu Arg Gln Val Ser Gly Ser Met Leu Asp Leu Ala115 120 125

Lys Ser Arg Met Gly Asp Ala Ala Ile Gln Val Gly Gln Lys Thr Lys130 135 140

Glu Thr Gly Gln Thr Ile Gln Gln Lys Ala Pro Glu Gly Lys Glu SerThr Gly Gly Arg Thr165

155

160

<210> 35 <211> 140 <212 > PRT <213> Perilla frutescens <400> 35 Met Ala Glu Gln His Gln Gln His Arg Pro Thr His Asp Thr Ser1 5 10 15

Asp Leu His Asp Lys Gly Pro Ser Thr Ser Gln Val Leu Ala Val Ala20 25 30

Thr Leu Phe Pro Val Gly Gly Phe Leu Leu Gly Leu Ala Gly Leu Ile35 40 45

Leu Thr Gly Thr Leu Phe Gly Leu Ala Val Ser Thr Pro Leu Phe Leu50 55 60

Ile Phe Ser Pro Ile Ile Val Pro Ala Val Ile Ala Ile Ala Leu Ala65 70 75 80

Val Ala Gly Phe Leu Thr Ser Gly Val Phe Gly Ile Thr Ala Leu Ser85 90 95

Ser Val Ser Trp IXe Phe Asn Tyr Phe Arg Arg Met Arg Ala Ser Trp100 105 110

Pro Glu Gln Phe Asp Gln Ala Arg Arg Arg Val Gly Asp Thr Ala Ser115 120 125

His Met Gly Gln Lys Ala Gln Asp Ala Val Arg Thr130 135 140

<21Q> 36

<211?· 144

<212> PRT

<213> Citrus sinensis<400> 36

Met Ala Glu His Tyx Gln Pro Leu Gln Gln Thr Gln Leu Gln Ser Arg1 5 10 15

Gln Pro Arg Ser His Gln Val Val Lys Ala Ala Thr Ala Val Thr Ala20 25 30

Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Thr Met Ala Gly Thr Val35 40 45

Ile Ala Leu Thr Ile Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile Cys Ser Pro Val50 55 60

Leu Val Pro Ala Val Ile Thr Val Ser Leu Leu Ile Met Gly Phe Leu65 70 75 80

Ala Ser Gly Gly Phe Gly Val Ala Ala Ile Ser Val Leu Ser Trp Ile85 90 95

Tyr Arg Tyr Val Thr Gly Gly His Pro Pro Gly Ala Asp Gln Leu Glu100 105 110

Gln Ala Arg Met Lys Leu Ala Gly Lys Ala Arg Glu Met Arg Asp Arg115 120 125

Ala Glu Gln Phe Gly Gln Gln Gln Ile Thr Gly Ser Gln Gln Gly Ser130 135 140

<210> 37

<211> 148

<212> PRT

<213> Prunus dulcis

<400> 37

Met Ala Asp Gln His Phe Gln Gln Pro Leu His Phe Gln Gly Ser Tyr1 5 10 15

Gly Gln Gln Gln Pro Arg Ser Tyr Gln Val Ala Lys Ala Ala Thr Ala20 25 30

Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala35 40 45Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Ile Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile Phe50 55 60

Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Ile Thr Met65 70 75 80

Gly Phe Leu Thr Ser Gly Gly Phe Gly Val Ala Ala Val Thr Val Leu85 90 95

Ser Trp Ile Tyr Lys Tyr Val Thr Gly Lys Glxi Pro Pro Gly Ala Asp100 105 110

Gln Leu Asp Gln Ala Arg His Lys Leu Ala Gly Lys Ala Arg Asp Ile115 120 125

Lys Asp Arg Ala Glu Gln Phe Gly Gln Gln His Val Pro Ser Gly Gln130 135 140

Gln Gln Ser Ser145

<210> 38<211> 140<212> PRT

<213> Corylua avellana<400> 38

Met Ala Glu His Pro Arg Gln Leu Gln Asp Pro Ala His Gln Pro Arg15 10 15

Ser His Gln Val Val Lys Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Ser20 25 30

Leu Leu Val Pro Ser Gly Leu Ile Leu Ala Gly Thr Val Ile Ala Leu35 40 45

Thr Leu Ala Thr Pro Leu Phe Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro50 55 60

Ala Val Ile Thr Val Ser Leu Ile Ile Met Gly Phe Leu Ala Ser Gly65 70 75 80

Gly Phe Gly Val Ala Ala Val Thr Val Leu Ser Trp Ile Tyr Arg Tyr85 90 95Val Thr Gly Arg His Pro Pro Gly Ala Asp Gln Leu Asp His Ala Arg100 105 lio

Met Lys Leu Ala Ser Lys Ala Arg Glu Met Lys Asp Arg Ala Glu GlnIlS 120 125

Phe Gly Gln Gln His Val Thr Gly Ser Gln Gly Ser130 135 140

<210> 39<211> 177<212> PRT

<213> Perilla frutescens<400> 39

Met Ala Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Leu His Pro His Gln Ile15 10 15

Gln Val His Pro Gln His Pro Gly Gln His Arg Tyx Glu Gly Gly Ala20 25 30

Lys Ser Leu Leu Pro Gln Lys Gly Pro Ser Thr Gly Gln Ile Leu Ala35 40 45

Ile Ile Thr Leu Leu Pro Ile Gly Gly Thr Leu Leu Cys Leu Ala Gly50 55 60

Ile Thr Leu Ala Gly Ser Leu Ile Gly Leu Ala Phe Ala Thr Pro Leu65 70 75 80

Phe Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Phe Leu Leu Ala85 90 95

Leu Ala Val Thr Ala Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Gly100 105 110

Leu Ser Ser Leu Ser Trp Val Phe Asn Ser Phe Arg Gln Ala Thr Gly115 120 125

Gln Glu Pro Leu Asp Tyr Ala Lys Arg Arg Met Gln Glu Gly Thr Met130 135 140Tyr Val Gly Glu Lys Thr Lys Gln Val Gly Glu Thr Ile Lys Ser Lys145 150 155 160

Ala Gln Glu Gly Gly His Asp Asp Arg Thr Thr Val Leu Gly Gly Arg165 170 175

Thr

<210> 40<211> 175<212> PRT

<213> Perilla frutescens<400> 40

Met Ala Asp Arg Asp Arg Asp Arg Leu His Pro His Gln Ile Gln Val1 5 10 15

His Pro Gln His Pro Gly Gln Gln Arg Tyr Glu Gly Gly Ala Lys Ser20 25 30

Leu Leu Pro Gln Lys Gly Pro Ser Thr Gly Gln Ile Leu Ala Ile Ile35 40 45

Thr Leu Leu Pro Ile Gly Gly Thr Leu Leu Cys Leu Ala Gly Ile Thr50 55 60

Leu Ala Gly Ser Leu Ile Gly Leu Ala Phe Ala Thr Pro Leu Phe Val65 70 75 80

Ile Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Ala Phe Leu Leu Ala Leu Ala85 90 95

Val Thr Ala Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser100 105 110

Ser Leu Ser Trp Val Phe Asn Ser Phe Arg Gln Ala Thr Gly Gln Glu115 120 125

Pro Leu Asp Tyr Ala Lys Arg Arg Met Gln Glu Gly Thr Met Tyr Val130 135 140

Gly Glu Lys Thr Lys Gln Val Gly Glu Thr Ile Lys Ser Lys Ala GlnGlu Gly Gly HiB Asp Asp Arg Thr Thr Val Leu Gly Gly Arg Thr165 170 175

<210> 41<21!> 169<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 41

Met Ala Asp Arg Thr Asn Pro Ser Ser His Thr Gln Gln Arg Pro Ile1 5 10 15

Tyr Asn Ser Thr Thr Val Pro Arg Ser Asn Thr Thr Thr Asn His Pro20 25 30

Leu Ser Ser Leu Leu Arg Gln Leu Leu Gln Ser Gln Ser Pro Asn His

35 40 45

Ser Gly Gln Leu Phe Gly Phe Leu Ala Phe Phe Ile Ser Gly Gly Ile50 55 60

Leu Leu Leu Leu Thr Gly Ile Thr Val Thr Ala Phe Val Leu Gly Phe65 70 75 80

Ile Ala Phe Leu Pro Leu Ile Ile Ile Ser Ser Pro Ile Trp Ile Pro85 90 95

Leu Phe Leu Ile Val Thr Gly Phe Leu Ser Leu Ala Gly Leu Ile Leu100 105 110

Ala Thr Gly Ala Val Val Ser Trp Leu Tyr Arg Tyr Phe Lys Gly Met115 120 125

His Pro Leu Arg Ser Asp Gln Val Aep Tyr Ala Arg Ser Arg Ile His130 135 140

Asp Thr Ala Ala His Val Lys Asp Tyr Ala Gly Gly Tyr Phe His Gly145 150 155 160

Thr Leu Lys Asp Ala Ala Pro Gly Ala165<210> 42<211> Igg<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana<400> 42

Met Ala Glu Arg Phe Ser Ser Gly Glu Ala Gln Tyr Trp Pro Asn Tyr1 5 10 15

Gly Ser Thr Ala Thr Thr Thr Val Ser Asn Ser Pro Ile Ser Ser Phe20 25 30

Phe His Gln Leu Arg Ser His Ser Pro Thr Ser Ser Gln Leu Phe Gly35 40 45

Phe Leu Ala Leu Phe Ile Ser Thr Gly Ile Leu Leu Phe Leu Leu Gly50 55 60

Val Ser Val Thr Ala Ala Val Leu Gly Phe Ile Val Phe Leu Pro Leu65 70 75 80

Ile Ile Ile Ser Ser Pro Ile Trp Ile Pro Val Phe Val Val Val Gly85 90 95

Gly Phe Leu Thr Val Ser Gly Phe Leu Val Gly Thr Val Ala Leu Val100 105 110

Ser Trp Thr Tyr Arg Tyr Phe Arg Gly Met His Pro Val Gly Ser Asn115 120 125

Gln Met Asp Tyr Ala Arg Ser Arg Ile Tyr Asp Thr Ala Ser His Val130 135 140

Lys Asp Tyr Ala Arg Glu Tyr Gly Gly Tyr Phe His Gly Arg Ala Lys145 150 155 160

Asp Ala Ala Pro Gly Ala165

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> CcOLE-I iniciador ajusante

<400> 43

ttcgttatct ttagccccat tt

<210> 44

<211> 22

<212> DiJA

<213> Artificial

<220>

<223> CcOLE-I iniciador reverso

<400> 44

cataggcaag attaacaagg at

<210> 45

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CcOLB-2 iniciador ajusante

<400> 45

gtggcagcgt tgagcgt

<210> 46

<211> 24

<212> DWA

<213> Artificial

<220>

<223> CcOLS-2 iniciador reverso

<400> 46

gacaataatg catgaatacc acaa

<210> 47

<211> 20

<212> DHA

<213> Artificial

<220>

<223> CcOLE-3 iniciador ajusante

<400> 47

gagatcaagg tggaagggaa

<210> 48<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223 > CcOXjE-3 iniciador reverso

<400> 48

gaaaaccctc aacaaacaaa ga

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> CcOIiE-4 iniciador ajusante

<400> 49

ctgacactgg ctggaacaat a

<210> 50<211> 23

<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> CcOLE-4 iniciador reverso<400> 50

gcacaacatt ccatcaagta tct

<210> 51

<211> 22

<212> DWA

<213> Artificial

<220>

<223> CcOLS-5 iniciador ajusante

<400> 51

tggcatccta cttctcctca ct

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CcObE-5 iniciador reverso

<400> 52

ctctctagca taatccttca ccta<210><211><212>

5321DNA

<213> Artificial

<220>

<223? RPL39 iniciador ajusante<400> 53

tggcgaagaa gcagaggcag a

21

<210><211><212><213>

5420DNA

Artificial

<220><223>

RPL39 iniciador reverso

<400> 54

ttgaggggga gggtaaaaag

20

<210><211><212>

5526DNA

<213> Artificial<220>

<223> OLE-Ia iniciador

<400> 55

aagttgatgg acccttctga ggaagg

26

<210>< 211. ><212>

5625DNA

<213> Artificial<22 0>

<223> OLE-Ib iniciador

<400> 56

agctggtagt gctcagccat gaagg

25

<210> 57

<211><212>

20DNA

<213s· Artificial

<220>

<223> OLE-I iniciador ajusante<400> 57

ccgactcatg aaggcgtctt

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OLE-I iniciador reverso

<400> 53

gtcctgcagc gccacttt

<210> 59

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OLE-I sonda

<400> 59ccaggagcaa atgg

<210> 60<211> 17<212> DKA<213> Artificial

<220>

<223> OLE-2 iniciador ajusante

<400> 60

gaccgggcaa ggcaaaa

<210> 61<211> 20

<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> OLB-2 iniciador reverso

<400> 61

gctcagccct gtccttcatc

<210> 62

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> OLE-2 sonda<400> 62

ctgctcttaa ggctaggg

<210> 63

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OLE-3 Inioiador ajusante

<400> 63

ccgccacaac agcttcaag

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OLE-3 Iniciador reverso

<400> 64

acaccgcctt ccccatatc

<210> 65

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220?

<223> OLE-3 sonda

<400> 65acaceatcag cacctg

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OLE-4 Iniciador ajusante

<400> 66

attgctcatg cagctaagga gat

<210> 67<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 0LE-4 Iniciador reverso

<400> 67

tgagcctgct gcccaaa

<2ΐο> es

<211> 16

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> OLE-4 sonda

<400> 68agggacaaag ctgaac

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223 > OLE-5 Iniciador ajusante

<400> 69

ggttcggacc gggttgac

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OLE-5 Iniciador reverso

<400> 70

tcacctgact tgccgtattg c

<210> 71

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> OLE-5 sonda

<400>

71atgcaagaag ccgaatt

<210> 72

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IlS Iniciador ajusante<400> 72

cgtgctggcc gcattac

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IlS Iniciador reverso

<400> 73

ggaggctgct gaggatagga

<210? 74

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> IlS sonda

<400> 74

actgttaata gccaaaaga

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> STO-I Iniciador ajusante<400> 75

gcactggaag gcctcttttg

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213» Artificial

<220><223> SXO-I Iniciador reverso

<400> 76

ggacttgcac cagtgagaag ttt

<210> 77

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> STO-I sonda

<400> 77agggctcccc tccg

<210> 78

<211> 21<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> RPL Iniciador ajusante

<400> 78

gaacaggccc atcccttatt g

<210> 79

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> RPL39 Iniciador reverso

<400> 79

cggcgcttgg caattgta

<210> 80

<211> 16

<212> DKA

<213 > Artificial

<220>

<223> RPL39 sonda

<400> 80atgcgcactg acaaca

<210><211><212>

8128DNA<213> Artificial<220>

<223> TG-702 Iniciador<400> 81

ttgaagctta cgacaggttt cccgactg

<210> 82

<211> 34

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> TG-703Iniciador

<400> 82

gcagatctac catgggcggt ggacggtagc ttat

<210> 83

<211> 24

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> CHI intron Iniciador ajusante

<400> 83

cccacctgga gcctctattc tgtt

<210> 84

<2ll> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CHI intron Inioiador reverso

<400> 84

ccccgtcggc ctcaagtttc

Claims (75)

1. Molécula de ácido nucleico de café (Coffea spp.), caracteriza-da pelo fato de que apresenta uma seqüência codificadora que codifica umaoleosina.

2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora codifica uma oleosi-na com um peso molecular entre cerca de 14 kDa e cerca de 19 kDa.

3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a oleosina tem uma seqüência de aminoáci-dos compreendendo um ou mais fragmentos selecionados do grupo queconsiste em:a) resíduos 1 a cerca de 27, cerca de 28 a cerca de 109 ou cer-ca de 110 da terminação C da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9;b) resíduos 1 a cerca de 15, cerca de 16 a cerca de 89 ou cercade 90 da terminação C da SEQ ID NO: 10;c) resíduos 1 a cerca de 30, cerca de 31 a cerca de 114 ou cercade 115 da terminação C da SEQ ID NO: 11;d) resíduos 1 a cerca de 18, cerca de 19 a cerca de 89 ou cercade 90 da terminação C da SEQ ID NO: 12;e) resíduos 1 a cerca de 40, cerca de 41 a cerca de 115 ou cer-ca de 116 da terminação C da SEQ ID NO: 13.

4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a oleosina tem uma seqüência de aminoáci-dos mais de 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOS: 8-13

5. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a oleosina tem qualquer seqüência de amino-ácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8-13.

6. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora é mais de 70% idên-tica a qualquer uma das seqüências codificadoras apresentadas nas SEQ IDNOS: 1 -6.

7. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora compreende qual-quer uma das SEQ ID NOS: 1 - 6.

8. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que é um gene com um quadro aberto de leituraque compreende a seqüência codificadora.

9. Molécula de mRNA, caracterizada pelo fato de que é produzi-da por transcrição do gene como definida na reivindicação 8.

10. Molécula de cDNA, caracterizada pelo fato de que é produzi-da por transcrição reversa da molécula de mRNA como definida na reivindi-cação 9.

11. Oligonucleotídeo entre 8 e 100 bases de comprimento, ca-racterizado pelo fato de que é complementar a um segmento da molécula deácido nucleico como definida na reivindicação 1.

12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécu-Ia de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

13. Vetor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelofato de que é um vetor de expressão selecionado do grupo de vetores queconsiste em vetores plasmídicos, cosmídicos, de baculovírus, bacmídicos,bacterianos, de levedura e virais.

14. Vetor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelofato de que a seqüência codificadora da molécula de ácido nucleico está o-peracionalmente ligada a um promotor constitutivo.

15. Vetor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelofato de que a seqüência codificadora da molécula de ácido nucleico está o-peracionalmente ligada a um promotor induzível.

16. Vetor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelofato de que a seqüência codificadora da molécula de ácido nucleico está o-peracionalmente ligada a um promotor específico para tecido.

17. Vetor, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato de que o promotor específico para tecido é um promotor específico parasemente.

18. Vetor, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelofato de que o promotor específico para semente é um promotor específicopara semente de café.

19. Vetor, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de que o promotor específico para semente de café é um promotor dogene de oleosina.

20. Vetor, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelofato de que o promotor do gene de oleosina compreende a SEQ ID NO: 15.

21. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é trans-formada com o vetor como definida na reivindicação 12.

22. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 21, carac-terizada pelo fato de é selecionada do grupo que consiste em células vege-tais, células bacterianas, células fúngicas, células de insetos e células demamíferos.

23. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 21, carac-terizada pelo fato de que é uma célula vegetal selecionado do grupo de plan-tas que consiste em café, tabaco, Arabidopsis, milho, trigo, arroz, soja, cer-vada, centeio, aveia, sorgo, alfafa, trevo, canola, tomate verde, girassol, a-mendoim, cacau, fisális, batata, pimenta, berinjela, beterraba, cenoura, pepi-no, alface, ervilha, áster, begônia, crisântemo, delfínio, zínia e turfas.

24. Planta fértil, caracterizada pelo fato de que é produzida apartir da célula vegetal, como definida na reivindicação 23.

25. Método para modular o sabor ou aroma de grãos de café,caracterizado pelo fato de que compreende a modulação da produção deuma ou mais oleosinas em grãos de café.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que compreende o aumento da produção de uma ou mais oleo-sinas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que compreende o aumento da expressão de um ou mais genesde oleosina endógenos nos grãos de café.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que compreende a introdução de um transgene codificador deoleosina na planta.

29. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que compreende a diminuição da produção de uma ou mais o-leosinas.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que compreende a introdução de uma molécula de ácido nuclei-co no café que inibe a expressão de um ou mais genes codificadores de ole-osina.

31. Promotor isolado de um gene de planta de café, caracteriza-do pelo fato de que codifica uma oleosina.

32. Promotor, de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o gene codifica uma oleosina com um peso molecular entrecerca de 14 kDa e cerca de 19 kDa.

33. Promotor, de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o gene codifica uma oleosina com uma seqüência de ami-noácidos compreendendo um ou mais fragmentos selecionados do grupoque consiste em:a) resíduos 1 a cerca de 27, cerca de 28 a cerca de 109 ou cer-ca de 110 da terminação C da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 9;b) resíduos 1 a cerca de 15, cerca de 16 a cerca de 89 ou cercade 90 da terminação C da SEQ ID NO: 10;c) resíduos 1 a cerca de 30, cerca de 31 a cerca de 114 ou cercade 115 da terminação C da SEQ ID NO: 11;d) resíduos 1 a cerca de 18, cerca de 19 a cerca de 89 ou cercade 90 da terminação C da SEQ ID NO: 12;e) resíduos 1 a cerca de 40, cerca de 41 a cerca de 115 ou cer-ca de 116 da terminação C da SEQ ID NO: 13.

34. Promotor, de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que o gene codifica uma oleosina com uma seqüência de ami-noácidos mais de 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOS: 8-13.

35. Promotor, de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o gene codifica uma oleosina com qualquer seqüência deaminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8-13.

36. Promotor, de acordo com a reivindicação 34, caracterizadopelo fato de que o gene compreende um quadro aberto de leitura mais de-70% idêntico a qualquer uma das seqüências apresentadas nas SEQ IDNOS: 1-6.

37. Promotor, de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o gene compreende um quadro aberto de leitura com qual-quer uma das SEQ ID NOS: 1 - 6.

38. Promotor, de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que compreende uma ou mais seqüências reguladoras selecio-nadas do grupo que consiste em TTAAAT, TGTAAAGT, CAAATG, CATGTG,CATGCAAA, CCATGCA e ATATTTATT.

39. Promotor, de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 15.

40. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreendeo promotor como definida na reivindicação 30, operacionalmente ligado auma ou mais seqüências codificadoras.

41. Vetor para transformação de uma célula, caracterizado pelofato de que compreende um gene quimérico como definida na reivindicação 39.

42. Célula, caracterizada pelo fato de que transformada com ovetor como definida na reivindicação 40.

43. Célula transformada, de acordo com a reivindicação 41, ca-racterizada pelo fato de que é uma célula vegetal.

44. Célula vegetal transformada, de acordo com a reivindicação-42, caracterizada pelo fato de que é uma célula de Coffea spp.

45. Planta transgênica fértil, caracterizada pelo fato de que éproduzida por regeneração da célula vegetal transformada como definida nareivindicação 42.

46. Planta transgênica fértil, de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de que é Coffea spp.

47. Molécula de ácido nucleico isolada do café (Coffea spp.),caracterizada pelo fato de que apresenta uma seqüência codificadora quecodifica uma esteroleosina.

48. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação-46, caracterizada pelo fato de que a esteroleosina tem uma seqüência deaminoácidos compreendendo um ou mais fragmentos selecionados do grupoque consiste nos resíduos 1 a cerca de 50, cerca de 50 a cerca de 80, cercade 81 a cerca de 102, cerca de 103 a cerca de 307 e cerca de 308 até aterminação carbóxi da SEQ ID NO: 14.

49. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação-46, caracterizada pelo fato de que a esteroleosina tem uma seqüência deaminoácidos mais de 80% idêntica à SEQ ID NO: 14.

50. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação-48, caracterizada pelo fato de que a esteroleosina tem a SEQ ID NO: 14.

51. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação-49, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora é mais de 70%idêntica à seqüência codificadora apresentada na SEQ ID NO: 7.

52. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação-50, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora compreende aSEQ ID NO: 7.

53. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação-46, caracterizada pelo fato de que é um gene com um quadro aberto de lei-tura que compreende a seqüência codificadora.

54. Molécula de mRNA, caracterizada pelo fato de que é produ-zida por transcrição do gene como definida na reivindicação 52.

55. Molécula de cDNA, caracterizada pelo fato de que é produzi-da por transcrição reversa da molécula de mRNA como definida na reivindi-cação 53.

56. Oligonucleotídeo entre 8 e 100 bases de comprimento, ca-racterizado pelo fato de que é complementar a um segmento da molécula deácido nucleico como definida na reivindicação 46.

57. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécu-la de ácido nucleico como definida na reivindicação 46.

58. Vetor, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelofato de que é um vetor de expressão selecionado do grupo de vetores queconsiste em vetores plasmídicos, cosmídicos, de baculovírus, bacmídicos,bacterianos, de levedura e virais.

59. Vetor, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelofato de que a seqüência codificadora da molécula de ácido nucleico está o-peracionalmente ligada a um promotor constitutivo.

60. Vetor, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelofato de que a seqüência codificadora da molécula de ácido nucleico está o-peracionalmente ligada a um promotor induzível.

61. Vetor, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelofato de que a seqüência codificadora da molécula de ácido nucleico está o-peracionalmente ligada a um promotor específico para tecido.

62. Vetor, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelofato de que o promotor específico para tecido é um promotor específico parasemente.

63. Vetor, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelofato de que o promotor específico para semente é um promotor específicopara semente de café.

64. Vetor, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelofato de que o promotor específico para semente de café é um promotor dogene de oleosina.

65. Vetor, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelofato de que o promotor do gene de oleosina compreende a SEQ ID NO: 15.

66. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é trans-formada com o vetor como definida na reivindicação 56.

67. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 65, carac-terizada pelo fato de é selecionada do grupo que consiste em células vege-tais, células bacterianas, células fúngicas, células de insetos e células demamíferos.

68. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 66, carac-terizada pelo fato de que é uma célula vegetal selecionado do grupo de plan-tas que consiste em café, tabaco, Arabidopsis, milho, trigo, arroz, soja, cer-vada, centeio, aveia, sorgo, alfafa, trevo, canola, tomate verde, girassol, a-mendoim, cacau, fisális, batata, pimenta, berinjela, beterraba, cenoura, pepi-no, alface, ervilha, áster, begônia, crisântemo, delfínio, zínia e turfas.

69. Planta fértil, caracterizada pelo fato de que é produzida apartir da célula vegetal como definida na reivindicação 67.

70. Método para modular o sabor ou aroma de grãos de café,caracterizado pelo fato de que compreende a modulação da produção deuma ou mais esteroleosinas em grãos de café.

71. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizadopelo fato de que compreende o aumento da produção de uma ou mais este-roleosinas.

72. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que compreende o aumento da expressão de um ou mais genesde esteroleosina endógenos nos grãos de café.

73. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizadopelo fato de que compreende a introdução de um transgene codificador deesteroleosina na planta.

74. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizadopelo fato de que compreende a diminuição da produção de uma ou mais es-teroleosinas.

75. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizadopelo fato de que compreende a introdução de uma molécula de ácido nuclei-co no café que inibe a expressão de um ou mais dos genes codificadores deesteroleosina.