ITRM20070129A1 - Piante di tabacco mutagenizzate come coltura da seme per la produzioe di olio da usare ai fini energetici industriali e alimentari - Google Patents

Description

"Piante di tabacco mutagenizzate come coltura da seme per la produzione di olio da usare ai fini energetici, industriali e alimentari"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda lo sviluppo di piante di tabacco, modificate mediante tecniche di mutagenesi, ibridazione interspecifica seguita da poliploidizzazione e tecniche del DNA ricombinante, in grado di produrre una quantità di seme molto elevata e loro uso per la produzione di olio da utilizzare per scopi energetici e industriali quali, ad esempio, olio da combustione, biodiesel e lubrificanti e per l'alimentazione animale e umana.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

Il tabacco è stato introdotto in coltivazione come pianta ornamentale e medicamentosa, affermandosi poi come bene essenzialmente voluttuario entrando nella cultura dell'uomo modificandone costumi e abitudini.

Il tabacco, tra le piante agrarie, ha una posizione non confrontabile con altre colture e presenta singolari particolarità quali:

1. è una delle poche piante commercializzate solo per le foglie;

2. è la maggiore pianta non alimentare al mondo con una produzione estesa ad una superficie che supera i quattro milioni di ettari a livello mondiale;

3. in molti paesi è uno strumento importante della politica economica e finanziaria;

4. il consumo è basato sulla trasformazione delle foglie in prodotti da fumo, inalazione della polvere e masticazione;

5. considerando la sua caratteristica di sostanza narcotica e la sua pericolosità per la salute umana, si è regolarmente tentato di bandirne l'uso e quindi la produzione.

L'evoluzione del genere Nicotiana nei diversi ambienti, inizialmente per selezione e poliploidizzazione naturale e successivamente per selezione guidata dall'uomo, ha portato alla.

comparsa di un'ampia gamma di tipi tutti, comunque, selezionati per la foglia considerata come l'unica parte di valore della pianta.

Recentemente, quali usi alternativi del tabacco, sono stati indicati oltre a quelli sopra riportati:

1. la produzione di proteine alimentari mediante purificazione delle stesse dalle foglie (Long R.C. 1979. Tobacco production for protein. Project n. 03245. North Carolina State university, Raleigh NC);

2. l'estrazione di principi attivi farmacologicamente utili presenti normalmente nelle foglie (Baraldi M. et al. 2004. Presenza di sostanze Benzodiazepino-simili in estratti di foglie di tabacco ( Nicotiana tabacum) . Atti Ist. Sper. Tab., 23 Aprile, Roma, pp.45-52);

3 . la produzione di proteine ricombinanti espresse nelle foglie o nel seme di piante geneticamente modificate {Twyman et al. 2003. Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends Biotechnol.

21:570-578).

In tabacco l'area fogliare per pianta è molto alta con una infiorescenza piccola e il rapporto parte aerea:radici è il più alto che si ritrova tra le piante coltivate (Went, 1957. The experimental control of plant growth. pp. 343. Chronica Botanica, Waltham, Mass.).

Considerando l'importanza economica che la coltivazione del tabacco riveste, nonostante il preoccupante aumento del tabagismo tra i giovani, l'Europa ha in essere sussidi alla sua coltivazione suscitando perplessità di natura economica ed etica.

La Commissione Europea sul suo sito {www.ec.europa.eu/agriculture/publi/fact/tobacco) afferma: "non esistono alternative agricole economicamente valide a questa coltura, che non utilizza buone terre. L'aiuto alla tabacchicoltura consente di far vivere il tessuto rurale e produce una attività industriale che contribuisce alla sopravvivenza di regioni minacciate dalla desertificazione".

Le conseguenze negative, in termini ambientali, dell'uso del combustibile fossile e la disponibilità limitata di petrolio richiedono la ricerca di nuove fonti energetiche e tra questi i biocombustibili, per la loro rinnovabilità, sono la scelta migliore in prospettiva futura.

Per quanto riguarda i biocombustibili di origine agricola ad oggi si è lavorato sulla produzione di bioetanolo a partire da piante produttrici di zuccheri semplici (es. saccarosio) o complessi (es. cellulosa) le cui piante , modello sono state individuate nella canna da zucchero, mais, frumento, patata, tapioca, bietola da zucchero, orzo, sorgo ecc. Ló stesso scopo può avere lo sviluppo di colture finalizzate alla massimizzazione della produzione di biomassa da trasformare poi in bioetanolo mediante processi di fermentazione oppure per la produzione di gas o biocombustibili mediante gassificazione.

Alternativamente, nello stato dell'arte, ci si è indirizzati alla produzione di olio da combustione e biodiesel a partire da specie oleaginose o non oleaginose Comunque ricche in olio, quali soia, girasole, colza, arachide, lino, mais, sesamo, palma, paimisti, cocco, ricino, ecc.

La scelta della specie ideale per la produzione di biocombustibili deve basarsi sulla rispondenza a requisiti quali:

1. determinare un guadagno energetico netto nella differenza tra input e output della coltura, comprendendo in questo calcolo anche i costi energetici richiesti dalla produzione delle macchine agricole e della lavorazione per l'estrazione e la trasformazione/ purificazione dell'olio;

2. determinare benefici ambientali derivanti dalla sostenibilità della produzione agricola, abbassamento dell'emissione di C02 e particellato (PM-10) dopo combustione e uso limitato di agrochimici quali pesticidi, diserbanti e fertilizzanti;

3. essere economicamente competitivo e, possibilmente, determinare benefici sociali che possano valorizzare l'economicità del sistema, per esempio abbattendo costi indiretti sul sistema sanitario, considerando anche che l'energia fossile oggi utilizzata impone dei costi ambientali che non vengono calcolati nella determinazione del costo, un biocombustibile deve prevedere dei benefici sia in termini di competitività dei costi che in termini ambientali;

4. essere disponibile in grande quantità senza ridurre la disponibilità alimentare; l'uso di piante agrarie tradizionalmente utilizzate per la produzione alimentare verosimilmente non consente il loro utilizzo per la produzione di biocombustibili senza determinare una riduzione delle fonti alimentari da queste derivate e un conseguente aumento dei costi delle materie prime;

5. la coltura delle piante da cui deriva deve possibilmente interessare terre marginali difficilmente utilizzabili per colture alternative.

Nello stato dell'arte quali piante per la produzione di olio vengono considerate: Soia ( Glycine max) , Girasole ( Helianthus annuus) , Colza ( Brassica napus) , Arachide ( Arachis hypogaea) , Ricino ( Ricinùs communis) , Lino (Linum usitatissimum) , Mais ( Zea mais) , Sesamo ( Sesamum indicum) , Palma (frutto, Aracacéae) , Paimisti (seme, Aracaceae), Copra (noce di cocco, Cocos nucifera) , Cartamo ( Carthamus tinctorius) , Olivo (Olea europea), Cotone ( Gossypìum sp. ) , Anacardio ( Anacardium occidentale) , Canapa ( Cannabis sativa) , Papavero (Papavers sp. ) , Senape (Brassica sp. ) , Uva ( Vitis sp. ) , Albicocca ( Prunus armeniaca) , Pino ( Pinus sp. ) , Argan [Argania spinosa) , Avocado (Persea americana) , Mandorla ( Prunus amygdalus) , Nocciola ( Corylus avellana) , Noce ( Juglans regia) , Neem { Azadirachfa indica) , Niger ( Guizotia abyssinica) , Jojoba (Simmondsia chinensis) , Riso ( Oryza sativa) , Zucca ( Cucurbita sp.), Crambe (Crambe abyssinica).

Al contrario, nell'arte anteriore il tabacco è sempre considerato esclusivamente come pianta agraria adatta alla produzione di foglie.

Gli unici tre lavori presenti in letteratura, sopra riportati, che suggeriscono ulteriori usi del tabacco, prendono comunque in considerazione le varietà di tabacco attuali, selezionate per la produzione di foglie, come fonte del sottoprodotto seme per l'estrazione di olio.

In particolare Giannelos et.al. (Tobacco seed oil as an alternative diesel fuel: physical and Chemical properties. Industriai Crops and Products, 2002, 16:1-9) affermando che il seme "è un sottoprodotto della produzione di foglie in Grecia" suggeriscono la possibilità di utilizzare tali semi per la produzione di combustibili descrivendo metodi di estrazione di olio dai semi di tabacco mediante solventi, indicando però, che l'olio estratto da tabacco non può essere utilizzato tal quale come biodiesel a causa dell'elevato valore in iodio. Usta N. (Use of tobacco seed oil methyl ester in a turbocharged indirect injection diesel engine. Biomass and Bioenergy, 2005, 28:77-86) afferma che l'olio del seme di tabacco è un sottoprodotto della produzione delle foglie e stima la produzione mondiale di seme derivante dalla coltivazione del tabacco per il prodotto foglia e descrive l'estrazione dell'olio da seme mediante solventi. Per ultimo Patel et al. (Production potential and quality aspects of tabacco seed oil. Tobacco Research, 1998, 24:44-49) stimano la produzione di séme di tabacco, come sottoprodottò della produzione di foglie in India, pari a 1.171 kg/ha con un contenuto di olio pari al 38% in peso e ne descrivono l'estrazione mediante solventi.

I processi tecnologici di estrazione comprendono tecniche meccaniche (pressione) e chimiche (solventi). Nella pratica i due sistemi sono spesso combinati. In generale l'estrazione meccanica viene operata su semi contenenti materia grassa in quantità superiore al 20% (es. colza e girasole) e con dimensioni del seme tali da favorire, la pressatura. Ad esempio, il seme di tabacco, date le sue dimensioni estremamente ridotte viene sottoposto ad estrazione mediante trattamento chimico. In generale la possibilità di estrazione meccanica facilita l'estrazione diretta nei luoghi di produzione del seme, quindi anche a livello aziendale con piccoli impianti.

Per quantitativi inferiori di materia grassa si utilizza l'estrazione chimica che può essere applicata anche al panello, residuo dell'estrazione meccanica, per recuperare il rimanente 6-12% di olio rimasto dopo il trattamento meccanico. Gli oli estratti con solventi (es. esano), prima di essere commercializzati per usi alimentari, richiedono una raffinazione. Il principale prodotto del processo di estrazione è l'olio grezzo; con l'estrazione meccanica si ottiene inoltre il panello proteico, mentre con l'estrazione chimica la farina. Quest'ultima, utilizzata nell'alimentazione animale, incide in modo critico sull'economia della produzione e della lavorazione dei semi oleosi. In alcuni casi la produzione di olio è legata alla domanda di farina proteica (es. soia). L'olio grezzo può essere successivamente rettificato con una serie di trattamenti fisico-chimici (es. correzione pH, filtrazione, degommaggio, decolorazione, ecc.) in funzione dell'uso.

Il bilancio di massa dell'intero processo varia da specie a specie e, per es., nel girasole (considerando un contenuto in olio del 42%) per una tonnellata di semi (prodotto principale) si considerano 2,6 tonnellate di sottoprodotto (biomassa), con produzione di 420 kg di olio grezzo, 580 kg di panello, arrivando poi a 390 kg di olio raffinato e 30 kg di residui di processo. Considerando che la resa media in semi di girasole si aggira attorno alle 2,6 t/ha (+/-15%) si può calcolare che la resa per ettaro di olio è pari a circa una tonnellata. Questa relazione è valida anche per le altre specie, in funzione della percentuale in olio, e in particolare per il colza.

Gli oli vegetali possono essere utilizzati direttamente come oli combustibili per la produzione di calore (forni e caldaie) o per la produzione di energia meccanica (motori), sfruttando il loro potere calorifico che è di circa 10.000 kcal/kg oppure, dopo transesterificazione, trasformati in biodiesel.

L'utilizzazione degli oli vegetali in caldaia può essere fatta con bruciatori convenzionali in sostituzione del gasolio industriale o per riscaldamento. Questo tipo di soluzione appare interessante per il fatto che (i) il prezzo del combustibile fossile sostituito è frequentemente molto simile a quello del gasolio da autotrazione e soggetto all'applicazione di accise elevate; (ii) l'utilizzazione dell'olio in caldaia richiede l'organizzazione di una filiera agro-energetica molto semplice e che può chiudersi direttamente in ambito rurale, dove produttori di combustibile e utilizzatori possono essere molto vicini tra loro o coincidere. La maggiore o minore semplicità del processo di estrazione dell'olio è un altro aspetto importante da considerare nel caso di una utilizzazione locale del biocombustibile. L'economia di produzione e il bilancio energetico più o meno favorevole dipenderà principalmente dalla produzione ettaro di olio combustibile.

L'utilizzo degli oli vegetali nei motori diesel richiede invece un processo chimico di transesterificazione con alcol metilico e una certa composizione in acidi grassi, riassumibile nel valore di iodio che,deve essere minore o uguale a 120...

Gli oli vegetali, in molti casi, vengono inoltre utilizzati' a scopi alimentari. A seconda della pianta, si hanno produzioni prevalentemente per scopi alimentari, oppure per scopi energetici, o entrambi.

Dati i problemi sopra esposti sarebbe estremamente auspicabile poter riciclare l'industria del tabacco a fini ecologici e non dannosi per l'uomo.

L'identificazione di un uso alternativo economicamente valido del tabacco costituisce quindi un chiaro fattore di interesse economico mondiale.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Nella presente invenzione, sono state realizzate, mediante tecniche di mutagenesi chimica o fisica o somatica in vitro e/o incrocio interspecifico e successiva duplicazione dei cromosomi piante di tabacco adatte alla produzione molto elevata di una componente della pianta particolare: il seme. Tali piante sono state opzionalmente ulteriormente modificate, mediante tecniche di ingegneria genetica. La selezione delle piante di tabacco nello stato dell'arte, è sempre stata rivolta alla foglia come prodotto finale, la focalizzazione dell'attenzione e quindi la selezione delle piante al fine di massimizzare la produzione di seme non è mai proposta prima e permette di utilizzare il tabacco in modo da massimizzare la produzione di seme a scapito della produzione di foglie.

Sorprendentemente si è verificato che la costituzione di piante di tabacco, eseguita utilizzando tecniche non biologiche di mutagenesi chimica, fisica e somatica in vitro, di incrocio anche tra specie diverse seguito dalla induzione di anfidiploidi e, opzionalmente la tecnologia del DNA ricombinante ha consentito di ottenere e selezionare piante di tabacco che:

-presentano le caratteristiche ideali per trasformare la pianta agraria tabacco da pianta per la produzione di foglie a pianta per la produzione di seme;

-presentano la capacità di produrre seme fino a raggiungere valori da 20 quintali per ettaro, a 50 quintali per ettaro, o a 70 quintali per ettaro o addirittura a 90 quintali per ettaro con la possibilità di ulteriori miglioramenti della resa di seme per ettaro;

-presentano un contenuto del seme in olio pari al 38% del suo peso o al 40%, o al 48% o al 52%, o al 58% o addirittura al 60%;

-presentano una bassa necessità di input agronomici per la difesa contro i parassiti e le infestanti. Inoltre, fattore del tutto inatteso date le piccole dimensioni del seme di tabacco, che è tra i più piccoli dei semi delle piante coltivate, nella presente invenzione, si è evidenziata la possibilità di estrarre l'olio dal seme mediante spremitura .con presse raggiungendo valori di estrazione pari,all'80% dell'olio totale presente nel seme, al 90% dell'olio totale o addirittura pari al 95% dell'olio totale presente nel seme, garantendo la possibilità di realizzare l'estrazione anche in piccoli impianti di tipo aziendale.

Sono quindi oggetto dell'invenzione piante di tabacco mutagenizzate e/o ottenute per incrocio interspecifico seguito da diploidizzazione e selezione, caratterizzate dal fatto di produrre una quantità di seme pari ad almeno 20 quintali per ettaro, dette piante opzionalmente ulteriormente modificate mediante ingegneria genetica, l'uso di dette piante per la produzione di seme per la fabbricazione di olio e loro derivati, l'uso di dette piante per la produzione di biomassa per la conversione biochimica o per la conversione termochimica, il metodo per la produzione e la selezione di dette piante, i semi di dette piante e il loro uso per la fabbricazione di olio e loro derivati, l'olio di detti semi, il biodiesel ottenibile da detti semi, integratori alimentari derivati da tabacco, combustibili solidi comprendenti il panello risultante dalla spremitura di semi di tabacco, il metodo per l'estrazione di olio da semi di tabacco mediante spremitura.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE

Figura 1. Caratteristiche generali della pianta di tabacco, realizzata mediante interventi di mutagenesi chimica, incrocio intra e interspecifico, poliploidizzazione, selezione, induzione di variabilità somaclonale, trasformazione genetica, finalizzata a massimizzare la produzione di seme per unità di superficie con un contenuto in olio elevato e con caratteristiche adatte all'uso come fonte energetica, per usi industriali e per l'alimentazione animale ed umana. Caratteristiche principali indotte e selezionate: apparato radicale profondo ed esteso; foglie lanceolate strette ed erette; stelo robusto alla base con internodi lunghi; infiorescenza a pannocchia compatta ampia o colonnata; capsule pedicellate brevi non deiscenti, bi- o multivalvate, apice diritto, con almeno 5000 semi per capsula; semi ovali o ellittici di lunghezza > 1 miti; altezza della pianta tra 60 e 150 cm, resistenza agli insetti, resistenza ai diserbanti, resistenza ai funghi, resistenza alla siccità, rapporto tra le componenti acidi grassi variabile.

Figura 2. Esempio del prodotto olio e panello ottenuti dalla spremitura con pressa a coclea mod. Komet (IBG), del seme di tabacco. Dopo la spremitura l'olio è stato filtrato su carta e presenta caratteristiche di limpidità elevate.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda quindi la realizzazione di piante del genere Nicotiana come piante ideali per la produzione di seme da cui ricavare olio combustibile, biodiesel, proteine, olio per uso zootecnico, olio per uso industriale, òlio per uso alimentare umano.

Le varietà del genere Nicotiana che possono essere utilizzate come piante parentali per la realizzazione delle piante dell'invenzione possono essere, a titolo di esempio, comprese tra le specie: N. tabacum, N. rustica, N. gauca, N, paniculata, N, knightiana, N. solanifolia, N. benavidesii, N. cordifolia, N. raimondii, N. thyrsiflora , N. tomentosa, N. tomentosiformis , N. otophora, N. setchellii , N. glutinosa, N. ondulata , N: arentsii, N. wigandioides , N. trigonophylla , N. paimeri . N. sylvestris, N. langsdorffii, N. alata, N. forgetiana, N..bonariensis, N. longiflora , N. plumbagini folla, N. repanda, N. stocktonii, N. nesophila, N. moctiflora, N. tomentosi formis, N. otophora, W. setchellii, N..glutinosa, N. petunioides, N. acaulis, N. ameghinoi, N. acuminata, N. pauciflora, N. attenuata, N. miersii, N. corymbosa, N. linear is , N. spegazinii , N. bigelovii , N. clevelandii , N. nudicaulis, N. maritima , N. velutina, N. gossei, N. excelsior, N. megalosiphon, N. exigua, N. goodspeedii, N. ingulba, W. stenocarpa , N. occidentalis, N.

roturidifolia, N. debneyi , N. benthamiana, N. fragrane , N. suaveolens, N. obtusifolia .

Secondo la presente invenzione, la pianta verrà realizzata mediante tecniche di mutagenesi che permetteranno di sviluppare piante in grado di produrre un quantitativo di seme superiore alla media degli individui di partenza. La mutagenesi potrà essere indotta mediante tecniche standard di trattamento chimico e/o fisico di semi di tabacco, o anche mediante la coltura in vitro per indurre mutanti somaclonali. La maggiore produzione di seme potrà essere ottenuta anche mediante la generazione di piante ibride prodotte da incrocio interspecifico seguito da diploidizzazione del corredo cromosomico (in modo da ovviare ai fenomeni di sterilità manifestata dagli ibridi interspecifici) mediante trattamento chimico con colchicina. Le piante prodotte da incrocio interspecifico potranno anche essere ulteriormente mutagenizzate mediante tecniche standard chimiche e/o fisiche.

Una volta ottenuti i mutanti, essi saranno selezionati per il carattere produzione di seme, in modo da isolare e selezionare piante che producano almeno 20 quintali di seme per ettaro di coltura.

Secondo la presente invenzione, la pianta verrà quindi realizzata partendo da semi prodotti da:

1. incrocio tra individui della stessa specie, oppure

2. incrocio tra individui di specie diverse con lo stesso numero di cromosomi (es. N. tabacum x N. clevelandii) tal quali o in cui detto incrocio è seguito da tecniche di embriocoltura e induzione di poliploidi mediante trattamento con il mutageno colchicina, seguendo le tecniche conosciute alle persone esperte nell'arte per ottenere anfidiploidi oppure,

3 . incrocio tra individui di specie con numero cromosomico diverso (es. W. tabacum x N. trigonophylla) seguito da tecniche di embriocoltura e induzione di poliploidi mediante trattamento con il mutageno colchicina, seguendo le tecniche conosciute alle persone esperte nell'arte per ottenere anfidiploidi.

Come detto sopra, nei casi 1 e 2 quando non vi è induzione di diploidizzazione, i semi saranno mutagenizzati mediante tecniche chimiche e/o fisiche, nel caso in cui vengano indotte mutazioni del corredo cromosomico mediante diploidizzazione come descritto in 2. e 3. la selezione potrà essere effettuata sui semi mutanti così prodotti o su detti semi ulteriormente mutagenizzati mediate tecniche chimiche e/o fisiche.

Potranno essere utilizzate tecniche di mutagenesi standard note al tecnico del settore, quali ad esempio, il trattamento del seme con etilmetansulfonato (EMS) {ad esempio, in soluzione acquosa alla concentrazione dello 0,5%) e lasciandolo a contatto con il seme per tempi variabili e.g. come indicato nell'esempio 1, oppure come già detto con colchicina, in modo da indurre poliploidizzazione, mediante radiazioni X o gamma eseguite in campi appositi o comunque seguendo qualsiasi protocollo noto in letteratura che viene utilizzato per mutagenizzare le piante ed effettuare screenings in larga scala. I semi così trattati saranno fatti germinare e le piante della generazione M2saranno scelte in base alle seguenti caratteristiche: forma dell'infiorescenza, numero di capsule, numero di semi per capsula, dimensioni del seme, forma della foglia, dimensioni dell'apparato radicale, portamento della foglia, ecc.

Secondo la presente invenzione, saranno selezionate piante aventi le seguenti caratteristiche: altezza della pianta di 80-120 cm, foglie a lamina stretta e portamento eretto, infiorescenza compatta, numero di fiori superiore a 100, numero di capsule superiore a 100, numero di semi per capsula superiore a 5.000, fusto robusto e lignificato, radici profonde.

La quantità di produzione del seme delle piante selezionate verrà poi verificata in campo e saranno selezionate solo quelle piante che producono almeno 20 quintali di seme per ettaro di seminato, ad una densità di semina variabile da circa 125.000 a circa 150.000 piante per ettaro.

Dalla mutagenesi chimica e fisica e dalla mutagenesi somatica si ottengono mutanti di classe diversa che quindi aumentano la probabilità di trovare le varianti cercate. Per esempio un mutante con una foglia a forma lanceolata e a portamento eretto consente di aumentare la densità di semina, Senza compromettere la ricezione della luce importante per l'attività fotosintetica, e quindi aumentare la produzione di seme per ha. Per esempio un mutante con apparato radicale più profondo consente un migliore ancoraggio e nutrimento della pianta. Per esempio un mutante con infiorescenza compatta e un numero maggiore di capsule consente di aumentare la quantità di seme prodotto da ogni singola pianta.

Fanno parte della presente invenzione le piante così ottenute e selezionate che producono una quantità di semi maggiore o uguale ai 20 quintali/ettaro. Le piante della presente invenzione sono modificate al fine di produrre una quantità di seme uguale o superiore ai 20 quintali per ettaro coltivato, fino ad anche 90 quintali per ettaro coltivato, quindi 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 quintali per ettaro coltivato contro i 10-12 normalmente prodotti dalle piante di tabacco selezionate per la produzione di foglie.

Le piante dell'invenzione possono essere ottenute anche mediante induzione di varianti somatoclonali, in cui i semi come sopra possono essere trattati con ipoclorito di sodio e poi con etanolo al 70%, dalle piante germinate da detti semi si prelevano porzioni di foglia dalle quali si induce la formazione dì calli riprodotti per tempi variabili in vitro e da cui si rigenerano piante che presentano caratteristiche varianti quali: forma dell'infiorescenza, numero di capsule, numero di semi per capsula, dimensioni del seme, forma della foglia, dimensioni dell'apparato radicale, portamento della foglia, produzione di seme, contenuto in olio del seme, composizione in acidi grassi dell'olio, contenuto in proteine del seme ecc. e che possono essere selezionate in base ai parametri sopra riportati.

Le piante dell'invenzione potranno essere ulteriormente selezionate per la presenza di caratteristiche quali: percentuale di contenuto in olio del seme, composizione in acidi grassi dell'olio, contenuto in proteine del seme, ecc.

Le piante sopra descritte potranno essere ulteriormente modificate mediante tecniche di DNA ricombinante al fine di ottenere ulteriori caratteristiche vantaggiose, qualora non fossero già presenti nei mutanti selezionati, quali: aumento del contenuto percentuale di olio nel seme, composizione in acidi grassi variabile in funzione dell'uso previsto per l'olio, resistenza agli insetti, resistenza ai diserbanti, resistenza ai funghi, ecc.

Per la trasformazione delle piante dell'invenzione potranno essere utilizzati vettori idonei alla trasformazione di cellule vegetali e cassette di espressione che permettano l'espressione dei geni di interesse nelle piante. A seconda che i geni di interesse debbano essere espressi dalla parte verde della pianta (es. geni di resistenza a parassiti o diserbanti) o dai semi {es. geni coinvolti nel metabolismo dei grassi), potranno essere selezionati vettori noti nello stato dell'arte che assicurino l'espressione di tali geni negli organi di interesse. Potranno quindi essere utilizzati vettori con promotori costitutivi, noti nello stato della tecnica, o con promotori inducibili, per es., dall'attacco di parassiti o nella capsula in formazione. In particolar modo, essendo le piante dell'invenzione selezionate per l'elevata produzione di seme ed essendo il prodotto di detto seme particolarmente interessante, saranno particolarmente indicati vettori contenenti cassette di espressione seme specifiche che garantiscano l'espressione dei geni eterologhi immessi, nel seme delle piante dell'invenzione.

Potrà essere utilizzato come sistema di trasformazione genetica l' Agrobacterium tumefaciens o sistemi fisici di trasferimento del DNA.

In una forma di realizzazione, potrà essere particolarmente vantaggioso realizzare piante che oltre a presentare una capacità produttiva di seme elevata, presentino anche resistenza agli insetti, resistenza ai diserbanti, resistenza ai funghi e resistenza alla siccità, consentendo di ridurre in modo significativo gli input della coltivazione migliorando la redditività della coltura e ridùcendo l'impatto ambientale.

In questo caso possono essere utilizzati vettori contenenti come marcatore il gene di resistenza alla kanamicina e regioni di regolazione che consentano l'espressione costitutiva (per es. 35S o il promotore dell'ubiquitina) dei geni di interesse, come per esempio il gene cry di Bacillus thuringiensis, il gene aroA di Salmonella typhimuriim, il gene Rptl di N. obtusifolia , che permettono di ottenere piante resistenti, rispettivamente, agli insetti, ai diserbanti e a malattie fungine, secondo le tecniche di trasferimento genico e di espressione standard conosciute agli esperti dell'arte.

Le resistenze potranno essere introdotte a seguito di più eventi di trasformazione o di trasformazione singola con più vettori, alternativamente, dato che le piante sono facilmente incrociabili, le resistenze potranno essere introdotte singolarmente in diversi individui della stessa varietà selezionata e successivamente riunite nello stesso individuo mediante incrocio.

In questo caso si potrà facilitare l'ottenimento dell'omozigosi per tutti i caratteri mediante duplicazione di aploidi ottenuti da coltura di antere in vitro.

La trasformazione genetica potrà essere eseguita in modo analogo per scopi di ingegneria metabolica finalizzati ad aumentare la quantità di olio accumulata nel seme e a modificare il pathway metabolico della via degli acidi grassi, in questo caso utilizzando regioni di regolazione attive in modo specifico nel seme, come per es. il promotore per le globuline ed indirizzando le proteine enzimatiche al reticolo endoplasmatico, dove si possono stabilizzare per l'inserimento di uno specifico segnale, per es. KDEL, oppure da qui essere poi traslocate ai plastidi, sempre per l'inserimento di specifici segnali aminoacìdici, per es. il leader della subunità piccola della rubisco. Per esempio, la quantità di olio e la composizione in acidi grassi dello stesso può essere modificata introducendo o modificando l'espressione di geni che codificano per enzimi quali, a solo titolo di esempio, acetil-CoA carboxilasi (ACCase), diac l glicerolo acil trasferasi (DGAT), liso fosfatidico acil trasferasi (LPAT), fosfatidato fosfo idrolasi {PAPase) proteina acil carrier (ACP), malonil-CoA:ACP transacilasi, ketoacil-ACP sintasi (KAS), ketoacil-ACP reduttasi, 3-idrossiacil-ACP deidrasi, enoil-AGP reduttasi, stearoil-ACP desaturasi, acil-ACP tioesterasi, glicerol-3-fosfatoaciltrasferasi, 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltrasferasi, citidina-5-difosfato-diacilglicerol sintasi, fosfatidii glicerofosfato sintasì, fosfatidii glicerol-3-fosfato fosfatasi, FAD1-8 desaturasi, .fosfatidico acido fosfatasi, monogalattosil diacil glicerolo sintasi, digalattosil diacil glicerolo sintasi, proteina solfolipide biosintesi, catena lunga acil-coA sintasi, glicerol-3-fosfato aciltrasferasi (GPAT), diacil glicerolo colinofosfo trasferasi, fosfatidii inositolo sintasi, acil-CoA diacilglicerolo aciltrasferasi, acil-ACP desaturasi/ lineoil desaturasi, sfingolipidi desaturasi, oleato 12-desaturasi, acidi grassi acetilenasi, acidi grassi epoxigenasi, diacilglicerolo kinasi, colinofosfato citidil trasferasi, colina chinasi, fosfolipasì, fosfatidilserina decarbossilasi, fosfatidil inositolo kinasi, ketoacil-CoA sintasi, fattore di trascrizione CER, oleosina, 3-ketoacil-CoA tiolasi, acil-CoA deidrogenasi, enoil-CoA idratasi, acil-CoA ossidasi.

Secondo l'invenzione, un aumento del contenuto totale di lio nel seme si potrà avere determinando una sovra espressione del gene acetil-CoA carboxilasi di tabacco o di un'altra specie (es. colza). Per esempio una variazione del profilo degli acidi grassi e quindi del numero di iodio, si potrà avere silenziando, mediante l'espressione di costrutti antisenso, il gène oleato desaturasi plastidico e del reticolo endoplasmatico. L'espressione o il silenziamento di uno o più di questi geni nei semi delle piante dell'invenzione, fa si che l'olio prodotto da questi semi possa essere utilizzato direttamente per la produzione di biodiesel avendo un numero di iodio inferiore o uguale a 120.

L'espressione di tali geni potrà anche influenzare la percentuale di olio presente nel seme e le piante dell'invenzione potranno essere ulteriormente selezionate per il contenuto del seme in olio che potrà essere pari al 38% del suo peso circa, al 40%, al 48%, al 52%, al 58% finanche al 60%.

I geni sopra indicati potranno essere introdotti in vettori per l'espressione seme specifica quali quelli descritti nella domanda di brevetto WO03073839 seguendo gli insegnamenti di tale domanda di brevetto. Il vettore di espressione utilizzato nella presente forma di realizzazione, sarà quindi un vettore comprendente: a. un promotore di un gene vegetale specifico per l'espressione negli organi di riserva del seme ; b. una sequenza di DNA codificante la sequenza segnale di una proteina vegetale in grado di indirizzare il prodotto del gene di interesse agli organi di riserva del seme via reticolo endoplasmatico; c. una sequenza di DNA codificante detto gene privo della sequenza segnale nativa; d. un segnale di stop. I promotori e le sequenze leader potranno appartenere,,per és., al gene della globulina 7S di soia o al gene della beta conglicinina sempre di soia, o a geni di proteine di riserva del tabacco. I geni sopra indicati potranno essere introdotti a seguito di più eventi di trasformazione o di trasformazione con più vettori, alternativamente, dato che le piante sono facilmente incrociabili, detti geni potranno essere introdotti singolarmente in diversi individui della stessa varietà selezionata e successivamente riunite nello stesso individuo mediante incrocio.

In questo caso si potrà facilitare l'ottenimento dell'omozigosi per tutti i caratteri mediante duplicazione di aploidi ottenuti da coltura di antere in vitro.

Tabella 1. Contenuto in acidi grassi di alcune varietà di tabacco solo selezionate dopo mutagenesi, o ingegnerizzate e selezionate, al fine di cambiare il pathway metabolico degli acidi grassi, e selezionate per la stabilità del carattere. La tabella evidenzia il risultato della mutagenesi e dell'intervento genetico realizzato introducendo alcuni dei geni elencati per cambiare la composizione addica; l'olio delle ultime colonne ha un titolo in iodio adatto alla trasformazione in biodiesel.

Sono oggetto dell'invenzione anche i semi delle piante come sopra descritte che, essendo semi di piante mutanti, saranno anch'essi mutanti e conterranno quindi alterazioni del DNA che li distingueranno dai semi wild type. Inoltre, come sopra descritto, detti semi potranno avere un corredo cromosomico diverso da quello delle piante parentali (es. poliploide), e nella maggior parte dei casi saranno anche trasformati con i vettori sopra indicati.

Nel caso della trasformazione con vettori esprimenti in seme geni correlati al metabolismo degli acidi grassi sopra indicati, detto seme sarà anche caratterizzato dal fatto di contenere un olio avente un titolo di iodio inferiore o uguale a 120 ed una percentuale di olio compresa tra il 38% ed il 60% del peso totale del seme.

Oggetto della presente domanda è anche il metodo per la produzione della pianta dell'invenzione comprendente i seguenti passaggi:

a) semi prodotti da incroci iniziali tra individui della stessa specie appartenenti a varietà selvatiche o selezionate vengono sottoposti a mutagenesi;

b) vengono fatti germinare detti semi è vengono selezionate le piante nelle generazioni M2-M4; secondo i seguenti parametri :

i) presenza di caratteristiche evidenziabili a livello fenotipico scelte nel gruppo comprendente altezza della pianta di 80-120 cm, foglie a lamina stretta e portamento eretto, infiorescenza compatta, numero di fiori superiore a 100, numero di capsule superiore a 100, numero di semi per capsula superiore a 5.000, fusto robusto e lignificato, radici profonde;

ii) stabilità del carattere selezionato nelle generazioni successive alla M2;

iii) verifica della ereditabilità del carattere selezionato;

c) i semi selezionati al punto b) vengono fatti germinare e vengono rigenerate piante a partire da callo ottenuto da mesofillo fogliare indotto in vitro in presenza di fitoormoni, e vengono selezionate le piante che mantengono i caratteri selezionati al punto b nelle generazioni R0-R2; d) le piante selezionate al punto c) vengono seminate in campo e vengono ulteriormente selezionate le piante che producono almeno 20 quintali di seme per ettaro.

Nel metodo così descritto, le piante ottenute al punto a) possono essere ottenute anche mediante a') esecuzione di incroci interspecifici all'interno del genere Nicotiana, seguito dal reincrocio delle Fi o dalla induzione di anfidiploidi mediante trattamento con colchicina degli apici vegetativi.

Le piante ottenute con i metodi sopra descritti possono essere sottoposte ulteriormente ai passaggi e) e/o f) ed al passaggio g) come sotto riportato:

e) trasformazione genetica delle piante ottenute ai punti a-d o a'-d con vettori contenenti cassette di espressione che esprimono in pianta geni per la resistenza a insetti, erbicidi e/o malattie fungine scelti nel gruppo comprendente il gene cry di Bacillus thuringiensis, il gene aroA di Salmonella typhimurium, il gene Rptl di N. obtusifolia e selezione delle piante così trasformate nelle generazioni T0-T4 per la resistenza a insetti, erbicidi e/o malattie fungine;

f) trasformazione genetica delle piante ottenute ai punti a-d o a'-d con uno o più vettori contenenti cassette di espressione che esprimono in seme geni del metabolismo degli acidi grassi scelti nel gruppo comprendente acetil-CoA carboxilasi (ACCase), diacil glicerolo acil trasferasi (DGAT), liso fosfatidico acil trasferasi (LPAT), fosfatidato fosfo idrolasi (PAPase) proteina acil carrier (ACP), malonil-CoA:ACP transacilasi, ketoacil-ACP sintasi (KAS), ketoacil-ACP reduttasi, 3-idrossiacil-ACP deidrasi, enoil-ACP reduttasi, stearoil-ACP desaturasi, acil-ACP tioesterasi, glicerol-3-fosfatoaciltrasferasi, 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltrasferasi, citidina-5-difosfatodiacilglicerol sintasi, fosfatidii glicerofosfato sintasi, fosfatidii glicerol-3-fosfato fosfatasi, FADl-8 desaturasi, fosfatidico acido fosfatasi, monogalattosil diacil glicerolo sintasi, digalattosil diacil glicerolo sintasi, proteina solfolipide biosintesi, catena lunga acil-coA sintasi, glicerol-3-fosfato aciltrasferasi {GPAT), diacil glicerolo colinofosfo trasferasi, fosfatidii inositolo sintasi, acil-CoA diacilglicerolo aciltrasferasi, acil-ACP desaturasi, lineoil desaturasi, sfingolipidi desaturasi, oleato 12-desaturasi, acidi grassi acetilenasi, acidi grassi epoxigenasi, diacilglicerolo kinasi, colinofosfato citidil; trasferasi, colina chinasi, fosfolipasi, fosfatidilserina decarbossilasi, fosfatidii inositolo kinasi, ketoacil-CoA sintasi, fattore di trascrizione CER, oleosina, 3-ketoacil-CoA tiolasi, acil-CoA deidrogenasi, enoil-CoA idratasi, acil-CoA ossidasi seguita da selezione delle piante trasformate nelle generazioni T0-T4 per caratteristiche quali contenuto totale di olio nel seme e composizione in acidi grassi dello stesso;

g) incrocio dei materiali ottenuti ai punti a-f o a'-f e selezione delle progenie risultanti per caratteristiche quali: capacità elevata di produrre seme, contenuto elevato di olio nel seme, composizione in acidi grassi dell'olio variabile in funzione dell'uso, resistenza agli insetti, resistenza agli erbicidi, resistenza ai funghi.

Le piante ai punti tra b ed f possono, ad esempio, essere selezionate per la presenza di caratteristiche evidenziabili mediante analisi chimica quali contenuto totale in olio del seme e/o contenuto delle singole componenti acidiche del seme e/o contenuto in proteine del seme.

E' anche oggetto dell'invenzione un metodo di estrazione di olio da semi di tabacco in cui la resa di olio è pari a valori tra il 70 e il 95% dell'olio presente in detti semi comprendente i seguenti passaggi:

a) estrazione meccanica di detto olio mediante spremitura con pressa con ottenimento di olio di tabacco e di un panello residuo;

b) filtrazione di detto olio ottenuto al punto a) con filtri di carta o tessuto.

Il metodo sopra indicato ha, sorprendentemente una resa superiore al 70%, resa del tutto inattesa utilizzando metodi di spremitura su semi piccoli come quelli del tabacco. Nella presente invenzione, in cui vengono selezionate piante aventi un'elevata produzione di seme al fine di aumentare la produzione di olio di tabacco/pianta, la scoperta che il metodo di spremitura applicato al tabacco ha una resa paragonabile a quella che si ottiene con semi di grosse dimensioni, ha applicazioni estremamente vantaggiose. A parte i costi di produzione inferiori e le rese del tutto inattese dato quanto noto nello stato dell'arte, tale metodo permette anche l'estrazione di olio di tabacco direttamente dove può essere utilizzato a scopo energetico.

In una forma di realizzazione, il seme dell'invenzione può essere sottoposto a spremitura a freddo utilizzando presse a coclea o di altro tipo, caricate con il seme. La pressa può raggiungere temperature anche dintorno ai 60°C a regime e l'olio spremuto dal seme viene raccolto e filtrato su carta o con filtropresse a tessuto. Altri sistemi di spremitura idonei per i semi possono essere utilizzati per la spremitura di seme di tabacco.

Per migliorare ulteriormente la resa del metodo dell'invenzione, laddove si voglia sfruttare al massimo la produzione di olio da parte del seme, è possibile effettuare un ulteriore passaggio di c) estrazione chimica con solventi dell'olio residuo presente nel panello ottenuto al punto a).

Tabella 2. Caratteristiche dell'olio di. tabacco ottenuto da seme mediante spremitura e filtrazione. La tabella evidenzia l'elevato potere calorifico superiore/il basso contenuto in zolfo e la bassa viscosità a confronto con altri oli vegetali.

E' anche oggetto dell'invenzione l'uso delle piante dell'invenzione e/o del loro seme per la produzione di combustibili liquidi o solidi, biodiesel, lubrificanti industriali, materiale plastico quale linoleum, integratori alimentari per mangimi animali, integratori alimentari ad uso umano.

Le piante dell'invenzione, infatti, presentano caratteristiche particolarmente vantaggiose per la produzione di detti prodotti in quanto:

-presentano un olio ottenuto dalla spremitura del seme che è ideale, anche senza raffinazione bastando una semplice filtrazione, per l'uso come olio combustibile avendo un aspetto limpido, una viscosità cinematica a 40°C di 29,11 mm2.s e a 50°C di 21,0 mm2.s e un tenore in zolfo minore dello 0,01%, rientrando quindi nella classe con caratteristiche fisiche e termodinamiche molto buone;

- presentano un olio, ottenuto dalla spremitura del seme che anche nella forma di realizzazione più semplice dell'invenzione, quindi senza la trasformazione per l'espressione dei geni del metabolismo degli acidi grassi sopra indicati, può essere utilizzato per la produzione di biodiesel in miscela, ad esempio, con il 25% di olio di palma o con altre percentuali di oli vegetali a minor titolo di iodio, portando il titolo di iodio sotto al valore di 120; e che, nella forma di realizzazione che comprende l'espressione di uno o più dei suddetti geni al fine di cambiare il metabolismo degli acidi grassi, può essere utilizzato direttamente per la trasformazione in biodiesel avendo un numero di iodio pari a 120 o meglio pari a 100 o ancora meglio pari a 80;

presentano un panello, risultante dalla spremitura del seme, avente un contenuto in olio variabile dal 6 al 12% e un contenuto in proteine di circa il 35%, che è ideale per l'integrazione di mangimi animali grazie al suo elevato contenuto in acidi grassi omega 6 (acido linoleico);

- presentano un panello risultante dalla spremitura del seme che, alternativamente all'uso come mangime animale, può essere utilizzato come combustibile solido, in impianti che funzionano a carbone o a pellet da biomasse, avendo un potere calorifico superiore pari a 4.200 KCal/kg;

presentano un olio che ha un punto di infiammabilità di 236°C e un punto di scorrimento di -18°C superando l'esame di idoneità all'impiego come lubrificante non inquinante, ad esempio per catene di motoseghe o come lubrificante in genere; - presentano un olio che, considerando la sua composizione ricca in acidi grassi poliinsaturi (C18:2, PUFA) essenziali per l'uomo e richiesti ai fini salutistici (omega 6), può essere utilizzato, dopo raffinazione, come alimento o come additivo per l'uomo;

- presentano una biomassa residua (foglie, steli, infiorescenze e rivestimento delle capsule), dopo la raccolta del seme, che può raggiungere valori di 100 quintali per ettaro, o meglio di 200 quintali per ettaro o ancora meglio di 300 quintali per ettaro con la possibilità di ulteriori miglioramenti della resa per ettaro;

- presentano una biomassa residua che può essere utilizzata per gli usi abituali a questa riservati come, per es. , gassificazione, combustione, pirolisi, digestione anaerobica, digestione aerobica, fermentazione o steam explosion, contribuendo a migliorare la resa economica della coltura.

Di conseguenza, è oggetto dell'invenzione l'uso delle piante dell’invenzione in generale per la produzione di seme di tabacco in larga scala.

E' oggetto dell'invenzione l'uso di dette piante e/o seme per la produzione di olio di tabacco.

E' anche oggetto dell'invenzione l'uso delle piante e/o del seme dell'invenzione per la preparazione di combustibili per caldaie o motori diesel a base di olio di tabacco o composti essenzialmente da olio di tabacco.

In una forma di realizzazione particolarmente vantaggiosa, detto olio di tabacco sarà ottenuto mediante il metodo di spremitura dell’invenzione o comunque mediante metodi di spremitura e non di estrazione mediante solventi.

Il metodo di estrazione dell'invenzione, infatti, permette di ottenere un olio utilizzabile anche direttamente come combustibile avendo esso una viscosità cinematica a 40°C di 29,11 mm2.s e a 50°C di 21,0 mm2.s che consente la sua nebulizzazione nei bruciatori senza necessità di preriscaldamento per la sua fluidificazione.

E' ulteriore oggetto dell'invenzione l'uso delle piante e/o del seme dell'invenzione per la preparazione di biodiesel mediante miscelazione di olio di semi di tabacco con, ad esempio, il 25% di olio di palma, o con altre percentuali di oli vegetali che ne riducano il titolo di iodio finale. La produzione di biodiesel secondo l'invenzione può essere effettuata miscelando l'olio di tabaccò estratto secondo il metodo sopra descritto (spremitura) con oli vegetali che ne abbassino il titolo di iodio ad un valore uguale o inferiore a 120

E' anche oggetto dell'invenzione, l'uso delle piante e/o del seme dell'invenzione per la preparazione di olio di semi di tabacco avente un titolo di iodio uguale o inferiore a 120 senza effettuare alcun procedimento sull'olio estratto secondo l'invenzione che ne diminuisca il titolo di iodio. In questa forma di realizzazione, verranno utilizzate piante e/o seme transgenico secondo l'invenzione che esprimono uno più geni del metabolismo degli acidi grassi tra quelli sopra elencati e che producono un olio di tabacco avente un titolo di iodio uguale o inferiore a 120.

In questo caso quindi, non verrà effettuato alcun procedimento di raffinazione o di trattamento dell'olio dopo la spremitura secondo l'invenzione, al fine di abbassare il numero di iodio dell'olio così ottenuto, il biodiesel secondo l'invenzione potrà quindi avere una composizione in olio di tabacco del 100%. Il biodiesel verrà ottenuto dall'olio di tabacco secondo le normali procedure di transesterificazione con metanolo conosciute alla persona esperta del settore.

In una forma di realizzazione dell'invenzione il biodiesel sarà composto interamente da olio di tabacco avente un titolo di iodio inferiore a 120 o inferiore a 100 o addirittura inferiore o uguale a 80, detto olio essendo transesterificato con metanolo secondo i metodi noti al tecnico del settore .

E' oggetto dell'invenzione anche l'uso delle piante e/o del seme dell'invenzione per la preparazione di combustibile solido per impianti che funzionano a carbone, o a pellet da biomasse. In questo caso, si potrà utilizzare la biomassa risultante dalla coltivazione avendo tale biomassa un potere calorifico superiore di 4.200 KCal/kg Sono oggetto dell'invenzione anche i combustibili ottenibili come sopra descritto, ovvero combustibili composti da panello risultante dalla spremitura di semi di tabacco.

Alternativamente, le piante e/o il seme dell'invenzione potrà essere utilizzato per la preparazione di integratori per mangimi animali. Il panello residuo della spremitura del seme di tabacco secondo l'invenzione, presenta infatti un contenuto d'olio compreso tra il 6 ed il 12% circa, (i calcoli sono esatti e i dati reali ottenuti partendo da un seme con il 39,4% di olio, che è stato estratto all'81% e nel panello ne è rimasto il 10%) un contenuto in proteina pari a circa il 35% in peso del panello ed un elevato contenuto in acidi grassi omega 6 (acido linoleico) che lo rendono ideale a tale scopo. In prove eseguite su suinetti all'ingrasso sostituendo, in diete isoproteiche, la farina proteica di soia con panello di tabacco in percentuali variabili dal 3 al 7% non si sono evidenziate differenze significative nello sviluppo degli animali.

In un'altra forma di realizzazione, le piante e/o il seme della presente invenzione, possono essere utilizzati per la preparazione di lubrificanti non inquinanti. Ad esempio, l'olio ottenuto con il metodo dell'invenzione, da piante che producono il seme dell'invenzione, senza ulteriori trasformazioni oltre alle mutazioni per la comparsa del carattere di base, ovvero l'elevata produzione in seme, presenta già un punto di infiammabilità di 236°C ed un punto di scorrimento di -18°C, caratteristiche che lo rendono idoneo ad essere utilizzato anche tal quale come lubrificante non inquinante, ad esempio per catene di motoseghe o come lubrificante per motori in genere.

In un'ulteriore forma di realizzazione, le piante e/o il seme della presente invenzione, possono essere utilizzati per la preparazione di alimenti o di integratori alimentari ad uso umano.

In questo caso, l'olio ottenuto mediante il procedimento dell'invenzione verrà ulteriormente raffinato allo scopo di eliminare cere, gomme, carboidrati complessi, fosfolipidi e deacidificato. Una volta raffinato potrà essere utilizzato tal quale, o come integratore alimentare ad uso umano. Il vantaggio di questo utilizzo è dato dalla ricchezza di detto olio in acidi grassi poliinsaturi (C18:2, PUFA) essenziali per l'uomo e richiesti a fini salutistici (omega 6).

E' ovvio che in tutte le forme di realizzazione dell'invenzione che prevedono l'utilizzo di olio di semi di tabacco, preferibilmente ottenuto mediante spremitura, o di panello risultante dalla spremitura del seme, potranno essere utilizzate piante di tabacco anche non mutagenizzate. L'indubbio vantaggio nell 'utilizzo delle piante dell'invenzione è ovviamente dato dall'elevata produzione di seme e dalla maggior resa di prodotto ottenibile dalle piante dell'invenzione e dal loro seme rispetto a quella ottenibile da piante e seme di tabacco wild type a parità di area di coltivazione e di metodo di coltivazione.

L'uso dell'olio di tabacco per la preparazione di lubrificanti, di integratori alimentari animali o umani non sono comunque mai stati descritti in letteratura. Ovviamente non sono mai state descritte neppure tutte quelle forme di realizzazione in cui viene utilizzato un olio estratto per spremitura e non ulteriormente trattato avente un titolo di iodio inferiore o pari a 120.

Le piante dell'invenzione, inoltre, presentano anche una biomassa residua (foglie, steli, rivestimento delle capsule e infiorescenze) che, dopo la raccolta del seme, possono raggiungere valori tra i circa 100 e i circa 300 quintali per ettaro o anche di più, è quindi oggetto dell'invenzione anche l'uso delle piante dell'invenzione come fonte di biomassa per procedimenti di . gassificazione, combustione, pirolisi, digestione anaerobica, digestione aerobica, fermentazione o steam explosion, come descritto in letteratura in modo da migliorare ulteriormente la resa economica della coltura.

Oggetto dell'invenzione è anche l'olio di semi di tabacco ottenibile dal seme delle piante dell'invenzione con il metodo di estrazione dell'invenzione, biodiesel ottenuto da detto olio per transesterificazione, combustibili comprendenti tale olio, integratori alimentari umani derivati da tale olio ulteriormente raffinato, lubrificanti comprendenti tale olio, l'olio di semi di tabacco ottenibile dal seme delle piante dell'invenzione con il metodo di estrazione dell'invenzione caratterizzato dal fatto di avere un titolo di iodio inferiore o uguale a 120 senza che debbano essere effettuate miscelazioni con altri oli atte ad abbassare il titolo di iodio, biodiesel comprendente detto olio avente un titolo di iodio uguale o inferiore a 120.

ESEMPI:

ESEMPIO 1

Mutagenesi chimica

Il seme della varietà scelta per l'induzione di mutanti mediante mutagenesi chimica, nella quantità di 20 gr per esperimento corrispondenti a circa 200.000 semi, è stato posto in una beuta da 100 ml e a questa sono stati aggiunti 50 ml di acqua deionizzata e il seme reidratato per 14 ore a 25°C. L'acqua è stata poi sostituita con una soluzione acquosa di EMS allo D,5%. Il seme è stato mantenuto in agitazione utilizzando un'ancorétta magnetica per un tempo variabile da 0,5 a 5 ore, a seconda della varietà, che in prove preliminari portava ad una maggiore frequenza delle mutazioni per caratteri morfologici quali altezza della pianta, dimensioni del seme, forma delle foglie, numero di capsule, produzione di seme per pianta ecc.

Terminato il periodo di trattamento la soluzione mutagena è stata eliminata versando il seme in un setaccio fine e risciacquandolo per alcuni minuti sotto acqua corrente. Successivamente il seme è stato risciacquato per 6 volte in beuta aggiungendo 50 mi di acqua e mantenendolo in agitazione per 10 minuti ad ogni risciacquo.

Il seme è stato poi asciugato su carta da filtro e inviato per la confettatura ad una ditta specializzata. Il seme confettato ad un diametro finale di 1,2 mm è stato utilizzato per la semina diretta in campo (Mi) ad una densità di 100.000 piante per ettaro. La generazione M1 è stata portata a fioritura, controllando l'eventuale presenza di mutazioni dominanti e a maturazione del seme si è raccolto a mano una capsula per pianta ottenendo il seme massaie utilizzato per la semina in campo nell'anno successivo e controllo fenotipico della generazione M2. I singoli mutanti di interesse sono stati raccolti e controllati nelle generazioni successive.

ESEMPIO 2

Induzione di varianti somaclonali

Il seme della varietà scelta per l'induzione di varianti somaclonali è stato sterilizzato immergendolo per 5 minuti in una soluzione di sodio ipoclorito al 20% e poi in alcool etilico al 70% per 1 minuto, seguito da 5 risciacqui on acgua sterile. Il seme è stato posto a germinare in contenitori di plastica rettangolari di lato di 10 cm e alti 12 cm contenenti il terreno MS agarizzato. Dalle piante completamente sviluppate sono state ritagliate porzioni di foglia di 0,5 cm di lato e queste poste in capsule Petri con il terreno MSI (MS 1 mg/lt 2,4-D) per indurre la formazione di callo. Oltre alle piante cosi ottenute da seme si sono utilizzati anche individui F1 di incroci interspecifici. Il callo prelevato dai dischi fogliari è stato posto in terreno MSI liquido disposto in beute da 250 ml contenti 50 mi di terreno e mantenuto agitato a 80 rpm su piastra rotante mantenuta a 28°C con fotoperiodo di 16 ore. Il callo è stato mantenuto in coltura liquida per diverse generazioni rinnovando la coltura ogni 20 giorni inoculando una nuova beuta da 50 mi di terreno liquido con 2,5 mi della coltura precedente. Ad ogni generazione una parte del callo veniva distribuita su piastre Petri contenenti il terreno MS2 (MS 1 mg/1 NAA 1,5 mg/1 Kinetina) agarizzato per indurre la formazione di germogli che, raggiunta la lunghezza di circa 2 cm, venivano trasferiti su terreno MS3 (MS 1 mg/1 IBA) per la radicazione e successivo trasferimento in vaso in serra. Le varianti ottenute venivano controllate nelle generazioni Ri e R2e riguardavano le dimensioni delle foglie, forma delle foglie, dimensioni delle capsule, numero di semi per capsula, contenuto in olio del seme, ecc.

ESEMPIO 3

Incrocio e duplicazione cromosomica

Molte specie di Nicotiana sono sessualmente compatibili con Nicotiana tabacum e anche se il prodotto dell'incrocio si presenta sterile è possibile reincrociare questi individui usando i parentali come impollinatori o inducendo la formazione di anfidiploidi. In questa specie il lavoro è facilitato dal fatto che è possibile ottenere popolazioni F1 degli ibridi intergenerici di diverse migliaia di individui, rendendo possibile il programma di miglioramento basato sugli anfidiploidi. Gli incroci sono stati eseguiti sia utilizzando parentali di Nicotiana spp. aventi lo stesso numero di cromosomi (es. N. paniculata x N. solanifolia; N. tabacum x N. rustica ) che numero diverso (es. N. tabacum x N. paniculata; N. tabacum x N. longìflora) . Gli individui F1 ottenuti da alcune delle combinazioni di incrocio sono stati sia coltivati in serra, per verificare le loro caratteristiche fenotipiche e incrociarli con entrambi i parentali, sia fatti germinare in vitro e micropropagati. Il materiale micropropagato è stato utilizzato per eseguire esperimenti di duplicazione cromosomica mediante trattamento con colchicina in fase di moltiplicazione dei germogli o successivamente dopo il trapianto in vaso e prima della fioritura. I germogli dei semi germinati sono stati tagliati alla base e trasferiti su terreno MS contenete 2 mg/litro di Benzìlaminopurina (BAP). Dopo circa 4-5 settimane i germogli laterali formatisi sono stati excisi e mantenuti sullo stesso terreno. Per la formazione di piante complete il trasferimento veniva eseguito su terreno MS privo di ormoni, in modo da indurre la formazione di radici. Dopo pochi giorni dal trasferimento dei germogli excisi sul terreno di radicazione, sugli stessi veniva depositata una goccia di una soluzione allo 0,5% di colchicina. Le piante una volta radicate venivano trasferite in vaso in serra e portate a fioritura per verificare se erano fertili e in grado di formare seme vitale. In alcuni casi per rendere possibile l'ibridazione tra specie diverse è stato necessario duplicare gli aploidi ed eseguire l'ibridazione degli autotetraploidi .

I materiali ottenuti dalle generazioni di reincrocio o dalla propagazione in vitro seguita dalla duplicazione dei cromosomi venivano valutati per le loro caratteristiche fenotipiche ed eventualmente utilizzati nei programmi di miglioramento genetico.

Il controllo del numero di cromosomi nelle linee di anfidiploidi stabilizzati è stato eseguito utilizzando gli apici radicali.

ESEMPIO 4

Trasformazione_ genetica mediata da Agrobacterium Tumefaciens

1° giorno: in 2 mi di LB sterile, è stata inoculata una piccola quantità di Agrobatterio tumefaciens del ceppo EHA 105 contenente il plasmide di interesse, prelevata da una coltura su piastra petri con un'ansa sterile. Successivamente è stata prelevata da una pianta sana di tabacco una foglia che non presentava alterazioni di sorta e che manifestava per converso condizioni ottimali di turgore. La foglia è stata sciacquata brevemente in acqua bidistillata per eliminare le impurità superficiali, immersa in una soluzione di sodio ipoclorito 20 % e SDS 0,1 % per 8 min, e lasciata asciugare sotto cappa a flusso verticale. Da questo momento, tutte le operazioni sono state eseguite sotto cappa. In particolare la foglia è stata immersa in etanolo 95 % e agitata in modo da bagnarne completamente le due pagine, per 30 - 40 sec. La foglia è stata poi lasciata asciugare perfettamente.

Con una punzonatrice sterilizzata in etanolo, sono stati ricavati dischetti da tutta la superficie fogliare, facendoli cadere su piastre con MS10 privo di antibiotici; in particolare non sono stati posti più di 30 dischetti per piastra. Successivamente 2 mi di LB agrobatterio (appena innoculato) sono stati versati sulla piastra, e la sospensione batterica sparsa uniformemente su tutta la piastra con dolce movimento rotatorio, in modo da ottenere una omogenea distribuzione dei batteri tra i dischetti. L'eccesso di LB è stato aspirato con cura con una pipetta. Nello svolgimento di queste operazioni si è sempre avuto cura di eseguire un controllo negativo in parallelo con una piastra a cui non si aggiunge nulla, o solo LB.

Le piastre sono quindi state incubate per 24-48 ore a 28°C, ad illuminazione costante e la crescita dei batteri è stata indicata dalla comparsa di un sottile alone opaco diffuso su tutta la piastra.

2° Giorno

I dischi fogliari sono stati trasferiti con cura su una piastra con MS10 cephotaxime 500 mg/1, e incubati per 6 giorni a 28°C, in illuminazione costante. Questo passaggio determina la inattivazione dell'agrobatterio.

8° giorno

I dischi fogliari sono stati quindi trasferiti con cura su MS10 cephotaxime 500 mg/1 e Kanamicina 200 mg/1, ed incubati per 14 giorni a 28°C, in illuminazione costante. Questo passaggio ha determinato la selezione delle piante trasformate: il gene della resistenza alla Kanamicina è infatti portato dal plasmide inserito in Agrobacterium.

22<0>Giorno

I dischi fogliari che nel frattempo si sono accresciuti, formando callo, sono stati trasferiti con cura su MS1Q cephotaxime 500 mg/1, Kanamicina 200 mg/1 e carbenicillina 500 mg/1, e incubati per 6 giorni. Questo passaggio determina la eliminazione degli agrobatteri eventualmente sopravvissuti ai precedenti trattamenti con antibiotico.

28<0>Giorno

I dischi fogliari sono stati nuovamente trasferiti su MS10 cephotaxime 500 mg/1 e kanamicina 200 mg/1, ed incubati fino alla comparsa dei germogli. Quando i germògli presentavano almeno due foglie, sono stati separati dalla massa callosa e trasferiti sul terreno per la radicazione: MSO cephotaxime 500 mg/1 e kanamicina 200 mg/1.

Al momento della comparsa delle radici, le piantine sono state estratte dalla piastra, liberate dai residui di agar, sciacquate delicatamente in acqua corrente e poste a dimora in piccoli vasi di plastica, in terriccio e sabbia (2:1). Il terreno è stato preventivamente saturato d'acqua, in seguito i vasetti sono stati coperti con coperchi di plastica trasparente per mantenere condizioni di elevata umidità, e sono stati posti in camera di crescita a temperatura ambiente, con un periodo giornaliero di illuminazione di 16 ore. La presenza del transgene è stata controllata su ogni pianta prelevando una piccola porzione di foglia {250 mg), estraendo il DNA ed eseguendo prima un'analisi PCR e poi sulle piante positive, l'analisi Southern per controllare il numero di copie del transgene.

ESEMPIO 4

Estrazione dell'olio dal seme

Il seme di tabacco prodotto da alcune delle varietà selezionate è stato utilizzato per la produzione di olio. In un caso il seme analizzato ha un contenuto in umidità del 7,01% e un contenuto in sostanze grasse (estrazione con esano) pari al 39,4%. L'estrazione dell'olio è stata eseguita a freddo utilizzando una pressa a coclea mod. Komet (IBG, Germania), caricata manualmente con il seme di tabacco. A regime la pressa ha raggiunto e mantenuto una temperatura di 60°C. Dopo la spremitura l'olio è stato filtrato su carta e presenta caratteristiche di limpidità elevate. La resa in olio estratto è risultata pari all'81,1% dell'olio totale presente nel seme. Il panello residuo aveva un contenuto in olio del 10,74% e 34,5% di proteine.

ESEMPIO 5

Prove di combustione

L'olio estratto a freddo e filtrato con filtri di carta, ottenuto come nell'esempio 4, è stato transesterificato con alcool metilico in presenza di NaOH. L'olio è stato scaldato a 55°C e si è aggiunta la miscela di metanolo-NaOH miscelando per 90 minuti. Alla fine, dopo essere stata raffreddata, la miscela si è lasciata stratificare separando lo strato inferiore di glicerolo dall'estere. L'estere è stato lavato due volte con acqua e nel primo lavaggio l'acqua è stata addizionata di acido fosforico (2,5 ml/litro). Alla fine del processo l'olio è stato scaldato a 90°C sotto vuoto per rimuovere ogni residuo di acqua e l'estere ottenuto viene indicato con la sigla EOT (estere olio di tabacco). Le prove sono state eseguite con un motore diesel ad iniezione indiretta (specifiche: 4 cilindri, pompa ad iniezione rotatoria, rapporto di compressione 21,5:1, potenza massima 55kW a 4500 rpm). Prima delle prove di combustione sono stati verificati parametri analitici quali: viscosità a 50°C (21,63 mm2/s), punto di scorrimento (-18°C), potere calorifico superiore (9670 KCal/kg), massa volumica a 15°C (925,0 kg/m3), zolfo (<0,01 % m/m), ceneri (0,005 % m/m). Durante la prova si sono utilizzati un analizzatore di gas e un dinamometro idraulico. L'estere dell'olio è stato utilizzato al 20% in miscela con diesel avente le seguenti caratteristiche principali, a confronto con EOT (in parentesi): densità 840,8 (886,6), viscosità a 40°C 2,9 (3,3), contenuto in zólfo (mg/kg) 6.750 (6)._I risultati del test non hanno evidenziato apprezzabili variazioni nella performance del motore utilizzando i due prodotti e una più completa combustione che si è tradotta in una maggiore efficienza termica, nel caso del diesel addizionato con EOT. L'aumento massimo della forza si è avuto a 2.200 rpm con un aumento del 3,5% in riferimento al diesel puro (29,86 kW contro 28,85 kW). La CO prodotta è minore nella miscela a confronto con il diesel da solo e anche il contenuto in zolfo è minore determinando una diminuzione dell'emissione di SO2(fino al 40%)

ESEMPIO 6

Prove di alimentazione animale

Il panello ottenuto dalla spremitura a freddo del seme di tabacco è stato analizzato per valutarne il suo utilizzo come integratore proteico nei mangimi animali. I dati analitici del panello risultante dalla spremitura evidenziano un contenuto in sostanza grassa del 10,74%, proteine 34,5% e una umidità e sostanze volatili del 5,97%. Gli . aminoacidi totali dopo idrolisi sul campione tal quale risultano: ac. aspartico 2,40%, treonina 1,06%, serina 1,17%, ac. glutammico 5,53%, prolina 0,83%, glicina 1,29%, alanina 1,18%, vaiina 1,27%, metionina 0,45%, isoleucina 1,13%, leucina 1,84%, tirosina 0,97%, fenilalanina 1,43%, istidina 0,72%, lisina 0,72%, arginina 3,36%. Del contenuto totale di sostanza grassa il 76,59% è determinato da acido linoleico e quindi rientra nella classe degli omega 6, particolarmente importanti per la dieta animale. La prova di alimentazione è stata eseguita su suinetti con peso iniziale di circa 8 kg, suddivisi in due gruppi di 20 individui ciascuno, uno di controllo alimentato con un mangime con integrazione proteica a base soia, e il secondo isoproteico nei confronti del primo sostituendo parzialmente la soia con il 3% di panello di tabacco. Gli animali trattati con panello non hanno avuto alcun problema nell'iniziare ad assumere il mangime e per tutta la durata della prova, monitorata costantemente, non hanno dato alcuna manifestazione gastroenterica. Gli animali dei due gruppi hanno presentato lo stesso incremento ponderale (320 gr/giorno panello soia, 328 gr/giorno panello tabacco), lo stesso consumo di mangime (367,4 capo/g panello soia, 365,6 capo/g panello tabacco).

Claims (23)

1. RIVENDICAZIONI 1. Pianta di tabacco mutagenizzata caratterizzata dal fatto di produrre una quantità di seme pari ad almeno 20 quintali per ettaro.
2. 2. Pianta, secondo la rivendicazione 1 in cui detta quantità di seme è pari a circa 50 quintali per ettaro, oppure pari a 70 quintali per ettaro, oppure pari a 90 quintali per ettaro.
3. 3. Pianta, secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzata dal fatto di essere ulteriormente modificata mediante trasformazione genetica nel metabolismo degli acidi grassi e di produrre seme contenente olio avente un titolo di iodio minore o uguale a 120.
4. 4. Pianta, secondo le rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzata dal fatto di essere ulteriormente modificata mediante trasformazione genetica nel metabolismo degli acidi grassi e di produrre seme contenente una percentuale di olio compresa tra circa il 40% e circa il 60% del seme.
5. 5. Pianta, secondo le rivendicazioni 3 o 4, modificata mediante trasformazione con uno o più vettori di espressione comprendenti una cassetta di espressione seme specifica contenente, ordinati dal 5' al 3' una sequenza di DNA codificante il promotore di un gene vegetale specifico per l'espressione negli organi di riserva del seme; una sequenza di DNA codificante la sequenza segnale di una proteina vegetale in grado di indirizzare detta proteina al reticolo endoplasmatico (ER); una sequenza di DNA codificante la sequenza segnale per il trasferimento della proteina ai plastidi o una sequenza di DNA codificante la sequenza segnale per l'ancoraggio della proteina all'ER; una sequenza di DNA codificante una proteina scelta nel gruppo comprendente i geni acetil-CoA carboxilasi (ACCase), diacil glicerolo acil trasferasi (DGAT), liso fosfatidico acil trasferasi (LPAT), fosfatidato fosfo idrolasi (PAPase) proteina acil carrier (ACP), malonil-CoA:ACP transacilasi, ketoacil-ACP sintasi (KAS), ketoacil-ACP reduttasi, 3-idrossiacil-ACP deidrasi, enoil-ACP reduttasi, stearoil-ACP desaturasi, acil-ACP tioesterasi, glicerol-3-fosfatoaciltrasferasi, 1-acil-snglicerol-3-fosfato aciltrasferasi, citidina-5 difosfato-diacilglicerol sintasi, fosfatidii glicerofosfato sintasi, fosfatidii glicerol-3-fosfato fosfatasi, FAD1--8 desaturasi, fosfatidico acido fosfatasi, monogalattosil diacil glicerolo sintasi, digalattosil diacil glicerolo sintasi, proteina solfolipide biosintesi, catena lunga acilcoA sintasi, glicerol-3-fosfato aciltrasferasi (GPAT), diacil glicerolo colinófosfo trasferasi, fosfatidii inositolo sintasi, acil-CoA diacilglicerolo aciltrasferasi, acil-ACP desaturasi, lineoil desaturasi, sfingolipidi desaturasi, oleato 12-desaturasi, acidi grassi acetilenasi, acidi grassi epoxigenasi, diacilglicerolo kinasi, colinofosfato citidil trasferasi, colina chinasi, fosfolipasi, fosfatidilserina decarbossilasi, fosfatidii inositolo kinasi, ketoacil-CoA sintasi, fattore di trascrizione CER, oleosina, 3-ketoacil-CoA tiolasi, acil-CoA deidrogenasi, enoil-CoA idratasi, acil-CoA ossidasi ed un segnale di poliadenilazione.
6. 6. Pianta, secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni caratterizzata dal fatto di essere ulteriormente modificata mediante trasformazione genetica per la resistenzza ad insetti, erbicidi e funghi.
7. 7. Uso della pianta secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per la produzione di seme per la fabbricazione di olio di tabacco, oli combustibili, biodiesel, integratori di mangimi animali, combustibili solidi, integratori alimentari per l'uomo, lubrificanti.
8. 8. Uso della pianta secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per la produzione di biomassa per la conversione biochimica o per la conversione termochimica secondo le procedure di combustione diretta, carbonizzazione, pirolisi, gassificazione, digestione anaerobica, digestione aerobica, fermentazione alcoolica o steam explosion.
9. 9. Metodo per la produzione delle piante secondo le rivendicazioni da 1 a 4, comprendente i seguenti passaggi: a) semi prodotti da incroci iniziali tra individui della stessa specie appartenenti a varietà selvatiche o selezionate vengono sottoposti a mutagenesi; b) vengono fatti germinare detti semi e vengono selezionate le piante nelle generazioni M2-M4; secondo i seguenti parametri : i) presenza delle caratteristiche evidenziabili a livello fenotipico: altezza della pianta di 80-120 cm, foglie a lamina stretta e portamento eretto, infiorescenza compatta, numero di fiori superiore a 100, numero di capsule superiore a 100, numero di semi per capsula superiore a 5.000, fusto robusto e lignificato, radici profonde, ecc.; ii) stabilità del carattere selezionato nelle generazioni successive alla M2; iii) verifica della ereditabilità del carattere selezionato; c) i semi selezionati al punti b) vengono fatti germinare e vengono rigenerate piante a partire da callo ottenuto da mesofillo fogliare indotto in vitro in presenza di fitoormoni, e vengono selezionate le piante che mantengono i caratteri selezionati al punto b nelle generazioni R0-R2; d) le piante selezionate al punto c) vengono seminate in campo e vengono ulteriormente selezionate le piante che producono almeno 20 quintali di seme per ettaro.
10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 9 in cui il punto a) è sostituito dal punto a') vengono prodotti semi mutagenizzati mediante esecuzione di incroci interspecifici all'interno del genere Nicotiana, seguito dal reincrocio delle FI o dalla induzione di anfidiploidi mediante trattamento con colchicina degli apici vegetativi delle piante prodotte da detti incroci.
11. 11. Metodo, secondo le rivendicazioni 9 o 10 ulteriormente comprendente i seguenti passaggi: e) si trasformano le piante ottenute al punto d con vettori contenenti cassette di espressione che esprimono in pianta geni per la resistenza a insetti, erbicidi e/o malattie fungine e si selezionano le piante così trasformate nelle generazioni T0-T4 per la resistenza a insetti, erbicidi e/o malattie fungine e/o; f) si trasformano le piante ottenute al punto d con .uno o più vettori contenenti cassette di espressione che esprimono in seme geni del metabolismo degli acidi grassi seguita da selezione delle piante trasformate nelle generazioni T0-T4 per caratteristiche quali contenuto totale di olio nel seme e composizione in acidi grassi dello stesso; g) si incrociano le piante ottenute ai punti g e/o f e si selezionano le progenie risultanti per una o più caratteristiche scelte nel gruppo: capacità elevata di produrre seme in quantità superiore ai 40 quintali per ettaro, contenuto di olio nel seme superiore al 42%, titolo di iodio nell'olio ottenuto dai semi di detti progenie inferiore a 120, composizione in acidi grassi dell'olio ottenuto dai semi di detti progenie variabile rispetto alla pianta wild type, resistenza agli insetti, resistenza agli erbicidi, resistenza ai funghi.
12. 12. Seme delle piante secondo le rivendicazioni da 1 a 6.
13. 13. Uso del seme secondo la rivendicazione 12, per là fabbricazione di olio di tabacco oli combustibili, biodiesel, integratori di mangimi animali, combustibili solidi, integratori alimentari per l'uomo.
14. 14. Metodo per l'estrazione di olio da semi di tabacco in cui la resa di olio è pari a valori tra il 70 e il 95% dell'olio presente in detti semi comprendente i seguenti passaggi: a) estrazione meccanica di detto olio mediante spremitura con pressa elicoidale; b) filtrazione di detto olio estratto al punto a) con filtri di carta o tessuto.
15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 14 ulteriormente comprendente un passaggio di c) estrazione chimica con solventi dell'olio residuo presente nel panello ottenuto al punto a).
16. 16. Metodo secondo le rivendicazioni 14 o 15, in cui detto olio è estratto da semi secondo la rivendicazione 12.
17. 17. Metodo secondo le rivendicazioni 15 o 16 ulteriormente comprendente un passaggio di d) raffinazione
18. 18. Olio di semi di tabacco ottenibile con il metodo di estrazione secondo le rivendicazioni 15 o 16 caratterizzato dall'avere un titolo di iodio minore o uguale a 120.
19. 19. Biodiesel comprendente olio di semi di tabacco secondo la rivendicazione 12, transesterificato con metanolo.
20. 20 Integratore alimentare per uso umano caratterizzato dal fatto di comprendere olio di semi di tabacco ottenibile mediante il procedimento secondo la rivendicazione 17.
21. 21. Integratore per mangimi animali comprendente il panello derivante dalla spremitura di semi di tabacco secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 o 16 quando dipendente dalla 14,
22. 22. Combustibile solido comprendente il panello risultante dalla spremitura di semi di tabacco secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 o 16 quando dipendente dalla 14.
23. 23. Lubrificante industriale comprendente l'olio di semi di tabacco ottenibile con il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 16.