EA017916B1 - Мутагенизированное растение табака и его применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к разведению растений табака, модифицированных методами мутагенеза, межвидовой гибридизации с последующей полиплоидизацией и методами рекомбинантной ДНК, характеризующихся тем, что они способны давать высокий урожай семян, которые могут применяться для получения масла для энергетических и промышленных целей, такого как масла для горения, биодизельное и смазочное масло, а также для применения в пищу человеку и в корм животным.

Description

(57) Изобретение относится к разведению растений табака, модифицированных методами мутагенеза, межвидовой гибридизации с последующей полиплоидизацией и методами рекомбинантной ДНК, характеризующихся тем, что они способны давать высокий урожай семян, которые могут применяться для получения масла для энергетических и промышленных целей, такого как масла для горения, биодизельное и смазочное масло, а также для применения в пищу человеку и в корм животным.

Предпосылки создания изобретения

Поначалу табак выращивался как декоративное и как лекарственное растение, затем он показал себя как предмет роскоши, став частью человеческой культуры и изменив обычаи и привычки человека.

Среди сельскохозяйственных растений табак занимает положение, не сравнимое с другими культурными растениями, и имеет некоторые отличительные особенности:

1) это одно из немногих растений, которое ценится на рынке из-за своих листьев;

2) это основное непищевое растение в мире, которое выращивается на площади более четырёх миллионов гектаров во всём мире;

3) во многих странах он является очень важным инструментом экономической и финансовой политики;

4) его потребление основано на превращении листьев в курительный табак, порошки нюхательного табака и жевательный табак;

5) учитывая его характеристики как наркотического вещества и опасность, которую он представляет для здоровья человека, всегда делались попытки, имеющие целью запретить его применение и, следовательно, его производство.

Эволюция рода ΝίοοΙίαηα в различные ареалы, сначала за счёт природной селекции и полиплоидизации и, позже, с помощью селекции, проводимой человеком, привела к появлению широкого ряда сортов, каждый из которых отобран с учётом свойств листьев, так как лист полагали единственной ценной частью растения.

В последнее время к вышеперечисленным вариантам применения табака добавлены альтернативные варианты:

1) получение пищевых белков очисткой их от листьев (Ьопд КС. 1979. ТоЬассо ргобисйоп Гог ргоГет. Рго)ес1 η. 03245. №г111 Сагойпа 8ГаГе ишуегайу, Ра1ещ11 ΝΠ);

2) экстракция активных ингредиентов фармакологического применения, обычно присутствующих в листьях (Вага1б1 М. еГ а1. 2004. Ргехепха άί 5о51апхе Веп/об1а/ерто-5нш1| ίη екГгаГД άί Годйе άί ГаЬассо (МсоОапа ГаЬасиш). Αΐίί 151. 8рег. ТаЬ., 23 Лрп1е, Нота, рр.45- 52);

3) получение рекомбинантных белков, экспрессируемых в листьях или в семенах генетически модифицированных растений (Т\\утап еГ а1. 2003. Мо1еси1аг Гагтнщ ίη р1ап(5: 1ю51 5У51ет5 аЫ ехрге55юп Гесйпо1о§у. Тгс1П5 Вю1ссЬпо1. 21: 570- 578).

У растения табака очень большая площадь листьев, очень маленькое соцветие и соотношение надземная часть:корни является наивысшим среди сельскохозяйственных растений (ХУегИ, 1957. ТНе ехрептеηГа1 сопГго1 оГ р1агИ дгоМй, рр. 343. СНгошса Во!ашса, Уа1Г1ат, Ма55.).

Несмотря на угрожающее увеличение хронического отравления никотином (никотинизма) среди молодёжи, принимая во внимание экономическую значимость разведения табака, в Европе выделяют средства на его разведение, что вызывает возражения как экономического, так и этического плана.

Европейская комиссия на своём интернет-сайте (\\л\л\\ес.еигора.еи/риЫ1/Гас1/1оЬассо) утверждает: не существует экономически убедительной альтернативы этой культуре, для которой не использовалась бы плодородная земля. Меры поощрения разведения табака способствуют спасению сельского хозяйства и вызывают промышленную активность, что содействует выживанию регионов, которым угрожает запустение.

Негативные последствия применения горючих ископаемых с точки зрения экологии и ограниченные запасы нефти требуют поиска новых источников энергии. Среди них с точки зрения будущих перспектив биотопливо является наилучшим выбором вследствие его возобновляемости.

В настоящее время при рассмотрении биотоплив из сельскохозяйственных растений основное внимание уделяется получению биоэтанола из растений, вырабатывающих простые (т.е. сахароза) или сложные (т.е. целлюлоза) сахара. Модельными растениями для такого продуцирования являются сахарный тростник, кукуруза, пшеница, маниок, сахарная свёкла, ячмень, сорго и т.д. Для разведения культур с целью получения максимального количества биомассы, превращающейся в результате процесса брожения в этанол, или для получения биотоплив или газа в результате газификации, могут применяться те же самые растения. Или же, уровень техники направлен на получение жидкого топлива и биодизельного топлива из масличных культур и немасличных, но богатых маслом культур, таких как соя, подсолнечник, рапс, арахис, лён, кукуруза (маис), пальма, ядро пальмы масляной, кокосовый орех, рицин (клещевина) и т.д.

Выбор идеального вида для получения биотоплив определяется соответствием следующим требованиям:

1) определяющий выигрыш в энергии по разнице между потребляемой и вырабатываемой энергией, причём в данный расчёт включаются энергетические затраты на изготовление сельскохозяйственной техники и на процессы экстракции и превращения/очистки масла;

2) определяющие экологические преимущества в результате поддержки сельскохозяйственного производства, снижения содержания СО₂ и уменьшения выделения конкретного вещества (например, РМ-10) после сжигания и ограниченного применения агрохимикатов, гербицидов и минеральных удобрений;

- 1 017916

3) экономическая конкурентоспособность и, возможно, определяющая общественная польза, которая может увеличить системную экономию, например, за счёт снижения непрямых затрат на санитарную систему, а также с учётом того, что энергия полезных ископаемых, используемая в настоящее время, приводит к затратам на сохранение окружающей среды, которые обычно не учитываются; биотопливо даёт преимущества как с точки зрения конкурентной стоимости, так и с точки зрения экологии;

4) наличие в больших количествах, при этом не снижается пищевая доступность; при применении сельскохозяйственных растений, традиционно используемых в пищевой промышленности, обоснованно не позволяется использовать их для получения биотоплив без определения уменьшения источников пищи из указанных растений, тем самым удорожается стоимость сырья;

5) растительная культура, из которых его (биотопливо) получают, по возможности, относится к землям, которые едва ли будут использованы для других культур.

В уровне техники растениями, рассматриваемыми как подходящие для получения масла, являются: соя (61уе1ие тах), подсолнечник (НейапШие аппиие), рапс (Вгаееюа парие), арахис (АгасЫе йуродаеа), рицин (Ктстие соттише), лён (Пиит иейайеетит), кукуруза (маис) (2еа тебе), кунжут (8ееатит ίηάίсит), пальма (плод, Агасасеае), пальмиста (пальмовые ядра, семена, Агасасеае), копра (кокосовый орех, Сосое писйега), сафлор (Саййатие ОпсЮгше). олива (О1еа еигореа), хлопок (Соееуршт ер.), кайя иворская (Апасагбшт осс1беп!а1е), конопля (СаииаЫе еайуа), мак (Рарауеге ер.), горчица (Вгаееюа ер.), виноград (УШе ер.), абрикос (Рйтие агтешаса), сосна (Ршие ер.), железное дерево (АгаЫа ертоеа), авокадо (Регееа атепсапа), миндаль (Ргииие атудба1ие), фундук (Согу1ие ауейапа), орех (1ид1аие гед1а), мелия индийская (Ахабйас11)а шбюа), масличный нуг (СшхоОа аЬуеетса), хохоба (жожоба) (81ттопбе1а сЫпепе1е), рис (Огуха еайуа), тыква (СисигЬйа ер), крамбе (СгатЬе аЬуеетса).

В отличие от этих растений в предыдущем уровне техники табак всегда считали сельскохозяйственным растением, дающим листовую массу.

В литературе имеются только три публикации, перечисленные ниже, в которых говорится о других применениях табака, имеются в виду современные сорта табака, селекцию которых проводили с целью получения листовой массы, в качестве источника семян, побочного продукта, для экстракции масла.

В частности, 61аппе1ое е! а1. (ТоЬассо еееб ой ае ап аНегпайуе б1еее1 Гие1: р11уеюа1 апб сйетюа1 ргорегйее. 1пбие1па1 Сгоре апб Ргобис1е, 2002, 16:1-9), заявляющие, что семена являются побочным продуктом при получении листовой массы в Греции, говорят о возможности использования указанных семян для получения топлива, описывая методы экстракции масла из семян табака, в которых используются растворители, однако, указывают, что масло, экстрагированное из табака, нельзя в таком виде использовать в качестве биодизельного топлива из-за высокого йодного числа.

Ие1а N. (Иее оГ 1оЬассо еееб ой те(Ну1 ее!ег т а ШгЬосйагдеб шбиес! щесИоп б1еее1 епщпе. Вютаее апб Вю-епегду, 2005, 28: 77-86) заявляет, что масло из семян табака является побочным продуктом мирового производства табачных листьев, оценивает мировое производство семян, образующихся при выращивании табака для получения листьев (листовой массы) и описывает экстракцию масла из семян растворителями.

Наконец, Ра1е1 е! а1. (Ргобисйоп ро!епйа1 апб с.|иа1йу аерес!е оГ 1оЬассо еееб ой. ТоЬассо Кеееагсй, 1998, 24: 44-49) оценивает количество табачных семян, получаемых в качестве побочного продукта при производстве табачных листьев в Индии, в 1171 кг/га с содержанием масла 38 вес.% и описывает экстракцию масла растворителями.

Технологические процессы экстракции масла включают механический (давление) и химический (растворители) методы. На практике две системы часто комбинируют. Механическую экстракцию обычно проводят, если семена содержат более 20% жира (например, рапс и подсолнечник), при условии, что размер семян подходит для прессования. Например, из-за очень маленького размера семян табака масло из них экстрагируют химическими методами.

Как правило, возможность экстрагировать масло механическими методами позволяет осуществлять прямую экстракцию в местах получения семян, следовательно, также на уровне ферм, на небольших фабриках.

При более низком содержании жира используют химическую экстракцию, её можно применять и для жмыха, остающегося после механической экстракции, чтобы регенерировать 6-12% масла, оставшегося после механической обработки. Для масла, экстрагированного с применением растворителей (например, гексаном), перед продажей его в качестве пищевого продукта, требуется стадия очистки. Основным продуктом процесса экстрации является неочищенное масло; при механической экстракции помимо этого получают белковый корм - жмых, тогда как при химической экстракции получают муку. Последняя, идущая на корм животным, значительно повышает экономический эффект процессов производства и переработки содержащих масло семян.

В некоторых случаях производство связано с необходимостью получать белковую муку (например, соевую). Затем неочищенное масло можно ректифицировать с помощью ряда физико-химических стадий (например, корректировка рН, фильтрация, рафинирование гидратацией, обесцвечивание и т.д.) в зависимости от предполагаемого применения.

Материальный баланс всего процесса меняется от вида к виду, например, считается, что при содер

- 2 017916 жании масла 42% в случае семян подсолнечника на тонну семян (которые являются основным продуктом) приходится 2.6 тонн побочного продукта (биомассы), при этом получают 420 кг неочищенного (нерафинированного) масла, 580 кг жмыха и в качестве конечного продукта получают 390 кг рафинированного масла и 30 кг отходов. С учётом того, что средний урожай семян подсолнечника составляет около 2.6 тонн/га (+/-15%), можно рассчитать, что выход масла на гектар составляет около одной тонны. Это соотношение сохраняется и для других видов, в частности рапса, завися от процентного содержания масла. Растительные масла можно применять непосредственно в качестве жидкого топлива с целью получения тепловой (печи и бойлеры (котлы)) или механической (двигатели, машины) энергии, используя их высокую энергию сгорания, которая составляет около 8500 ккал/кг, или, после переэтерификации, в переработанном виде, как биодизельное топливо.

Применение растительных масел в бойлерах (котлах, парогенераторах) можно осуществлять с помощью обычных горелок (форсунок), заменяя промышленное топливо или топочный мазут на растительное масло. Такое решение кажется весьма интересным ввиду того, что: (1) цена заменяемого ископаемого топлива часто практически равна цене автомобильного дизельного масла и облагается высокими акцизными налогами; (и) использование масла в бойлерах (котлах) требует организации очень простой агроэнергетической линии, которая может заканчиваться непосредственно в сельских районах, где производители и потребители топлива могут находиться очень близко друг к другу или могут даже быть одними и теми же. Более лёгкий или менее лёгкий процесс экстракции - это другой важный аспект, который следует принимать во внимание при рассмотрении возможности местного применения биотоплива. Экономичность производства и более или менее предпочтительный энергетический баланс зависят, главным образом, от выхода жидкого топлива на гектар.

С другой стороны, для применения растительных масел в дизельных двигателях требуется химический процесс переэтерификации с помощью композиции метанола и некоторых жирных кислот, которую можно охарактеризовать йодным числом, оно должно быть <120. Растительные масла часто также используют в качестве пищевого продукта. В зависимости от растения, продукты могут использоваться главным образом для пищевых продуктов или главным образом для энергетики, или и для того, и для другого.

В свете вышеуказанных проблем было бы весьма желательным использовать табачное производство для целей экологии и сделать его безвредным для человека.

Следовательно, выяснение возможности альтернативного и экономически эффективного применения табака является очевидной глобальной экономически интересной задачей.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение раскрывает создание растений табака, пригодных для получения с высоким выходом конкретного компонента растения: семян. Указанные растения создают методами соматического ίη νίίτο химического или физического мутагенеза и/или межвидовым скрещиванием с последующей хромосомной дупликацией. Указанные растения, необязательно, далее модифицируют методами рекомбинантной ДНК (генетической инженерии). Селекция растений табака в уровне техники всегда была направлена на листья в качестве конечного продукта, внимание и, следовательно, селекция растений никогда ранее не сосредотачивались на максимальной урожайности семян, она позволяет использовать табак для того, чтобы максимально повысить урожайность семян в ущерб выходу листовой массы.

Неожиданно было найдено, что селекция растений табака, проводимая с применением небиологических методов химического, физического и соматического ίη νίίτο мутагенеза, скрещивания также различных видов с последующей индукцией амфидиплоидов и, необязательно, методами рекомбинантной ДНК, позволяет получать растения табака, проявляющие следующие характерные особенности:

они проявляют идеальные свойства для превращения сельскохозяйственного растения табака из растения для получения листовой массы в растение для получения семян;

они способны давать семена с выходом (урожайностью) от 20 центнеров/гектар до 50 центнеров/гектар, или до 70 центнеров/гектар, или даже до 90 центнеров/гектар с возможностью дальнейшего повышения урожайности;

они дают семена с содержанием масла (масличностью) вплоть до 38% от веса семян, или вплоть до 40%, или вплоть до 48%, или вплоть до 52%, или вплоть до 58%, или даже вплоть до 60%;

они не требуют больших затрат на агротехнические мероприятия по защите от паразитов и сорняков;

Помимо этого, совершенно неожиданно, настоящее изобретение показывает, что благодаря малым размерам семян табака, а именно одним из наименьших размеров семян среди культурных растений, можно экстрагировать масло из семян прессованием, с выходом, достигающим, примерно, 80% общего количества масла в семенах, примерно, 90% общего количества масла в семенах, или даже, примерно, 95% общего количества масла в семенах, тем самым подтверждая правильность проведения экстракции также в случае малых растений для применения в сельском хозяйстве.

Следовательно, целью изобретения являются растения табака, которые мутагенизированы и/или получены межвидовым скрещиванием с последующей диплоидизацией и селекцией и характеризуются тем, что они дают семена в количестве, равном по меньшей мере 20 центнеров/гектар, причём указанные

- 3 017916 растения, необязательно, дополнительно модифицируются генетической инженерией, применение указанных растений для получения семян, для производства масла и его производных, применение указанных растений для получения биомассы для биохимической или термохимической конверсии, способ получения и селекции указанных растений, семена указанных растений и их применение для производства масла и его производных, масло из этих семян, биодизельное топливо, получаемое из указанных семян, пищевая добавка, получаемая из табака, жидкие топлива, содержащие жмых, получаемые из семян табака после прессования, способ экстракции масла из семян табака прессованием.

Подробное описание фигур

Фиг. 1. Общие характеристики растения табака, получаемого химическим мутагенезом, внутри- и межвидовым скрещиванием, полиплоидизацией, селекцией, индукцией, с помощью сомаклональной изменчивости, генетической трансформацией, которые нацелены на получение максимальной урожайности (выхода) семян на единицу площади, с высоким содержанием масла (масличностью) и с характеристиками, подходящими для использования в качестве источника энергии, для промышленного использования и использования в качестве продукта питания для человека и в качестве корма для животных. Основные индуцированные и селекционные свойства (характеристики): глубокая и широкая корневая система; тонкие и линейно-ланцетные листья; крепкий в основании стебель с длинными междоузлиями; початковидное соцветие компактное, широкое или колоннообразное; короткие нелопающиеся коробочки на ножках, двух- или многостворчатые, прямая верхушка по меньшей мере 5000 семян/коробочка; семена овальной или эллиптической формы длиной >1 мм; высота растения 50-120 см, устойчивость к насекомым, устойчивость к гербицидам, устойчивость к грибкам, устойчивость к засухе, переменное соотношение жирных кислот.

Фиг. 2. Пример продуктов - масла и жмыха - полученных из семян табака прессованием на шнековом (червячном) прессе модели Коше! (ΙΒΟ). После прессования масло фильтруют через бумажный фильтр и получают масло высокой степени прозрачности.

Подробное описание изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к созданию (выведению) растений рода ЧсоОапа как идеальных растений для продукции семян, из которых получают жидкое топливо, биодизельное топливо, белки, масло для применения в зоотехнике, для промышленного использования, для использования в качестве пищевого продукта для человека.

Сорта рода №сойапа. которые можно использовать в качестве исходных растений для выведения растений по изобретению, могут находиться среди следующих видов: N. !аЬасит, N. гикбса, N. д1аиса, N. рашси1а1а, N. кшдЫтапа, N. 8о1аийо11а, N. Ьепазэбейг N. согбгГойа, N. га1тоиби, N. ФугыДога, N. 1ошеи1о8а, N. ЮтегИоыГогтЧ N. оЮркога, N. 8е1сйе11и, N. д1цДио8а, N. оиби1а!а, N. агепЫг N. \\щапб|о1бе8, N. 1Ддоиорйу11а, N. ра1тегг N. ууке^гЧ N. 1аид8богДи, N. а1а!а, N. Гогдейапа, N. Ьопайепык, N. 1оидй1ога, N. р1цтЬад1пгГойа, N. гераиба, N. 81оск1опй, N. ие§орЫ1а, N. тосййога, N. 1отеи1ойГогтщ, N. оФрйога, N. 8е1сйе11й, N. д1ийио§а, N. ре1ишо1бе8, N. асаЫЧ N. атедЫиоц N. асит1па1а, N. раиаДога, N. айеииа!а, N. ннегйг N. согутЬоза, N. 1шеаЙ8, N. кредахлпП, N. Ыде1оуй, N. с1еуе1аиби, N. иибюаиНк, N. талйта, N. уе1ийиа, N. доккец N. ехсекюг, N. теда1ойрйои, N. ех1диа, N. дообзреебй, N. тдц1Ьа, N. йеиосагра, N. осс1беи1аЙ8, N. гоФибгГойа, N. беЬпеук N. Ьеи!йат1аиа, N. Ггадгаиз, N. 8иауео1еи8, N. оЫийГойа.

Согласно настоящему изобретению растение получают методами мутагенеза, который позволяет создать растения, способные давать семена в количествах, превышающих среднюю урожайность семян исходных растений. Мутагенез можно индуцировать стандартными для растений табака химическими и/или физическими методами, или также выращиванием ш уйго с целью индукции сомаклональных мутантов. Более высокий выход (урожайность) семян можно получать также, создавая гибридные растения, получаемые межвидовым скрещиванием с последующей диплоидизацией набора хромосом (чтобы избежать событий стерильности (бесплодия), наблюдаемых у межвидовых гибридов) химической обработкой колхицином. Растения, получаемые межвидовым скрещиванием, можно затем мутагенизировать стандартными химическими и/или физическими методами.

Когда мутанты получены, их подвергают отбору на особенности урожайности (выхода) семян, таким образом, чтобы выделить и отобрать растения, дающие по меньшей мере 20 центнеров семян на гектар культуры.

Следовательно, согласно настоящему изобретению растение создают (реализуют) исходя из семян, получаемых:

1) скрещиванием между собой отдельных представителей одного вида;

2) собственно скрещиванием между собой отдельных представителей разных видов, имеющих одинаковое число хромосом (например, N. 1аЬаснт и N. с1еуе1аиби), или указанным скрещиванием с последующими методами культивирования эмбрионов и индукцией полиплоидов обработкой мутагенным фактором - колхицином, используя приёмы, хорошо известные специалистам в данной области техники, для получения амфидиплоидов, или

3) скрещиванием между собой отдельных представителей различных видов с различным числом хромосом (например, N. 1аЬаснт и N. йгдоиорйу11а), с последующими методами культивирования эм

- 4 017916 брионов и индукцией полиплоидов обработкой мутагенным фактором - колхицином, используя приёмы, хорошо известные специалистам в данной области техники, для получения амфидиплоидов.

Как указано выше, когда нет индукции диплоидизации. как в случаях 1 и 2, семена мутагенизируют химическими и/или физическими методами, когда мутация числа хромосом индуцируется диплоидизацией, как в случаях 2 и 3, селекцию можно осуществлять на указанные мутантные семена, полученные таким образом, или на указанные мутантные семена, дополнительно мутагенизированные химическими и/или физическими методами. Можно использовать стандартные методы мутации, известные специалисту в данной области, например, такие как обработка семян этилметансульфонатом (ЭМС, ЕМ8) (например, в водном растворе с концентрацией 0.5%) и выдерживание ЭМС в контакте с семенами различное время, например, как указано в примере 1, или, как уже говорилось, при использовании колхицина, так, чтобы индуцировать полиплоидизацию, облучение рентгеновскими или гамма-лучами, осуществляемое на соответствующих участках, или любой способ в соответствии с любым протоколом, описанным в литературе, используемым для мутагенеза растений и для осуществления скрининга в больших масштабах. Обработанные таким образом семена оставляют прорастать и селекцию растений М₂ поколения проводят с учётом следующих характеристик: форма соцветия, число коробочек, число семян в коробочке, размер семян, форма листьев, размеры корневой системы, относительное направление листа и т.д.

Согласно настоящему изобретению отбирают растения, имеющие следующие характеристики: высота растения 80-120 см, лист с тонкой листовой пластинкой и прямо (вертикально) направленный, компактное соцветие, число цветков выше 100, число коробочек выше 100, число семян в коробочке выше 5000, одревесневший и сильный стебель, глубокие корни.

Количество семян, даваемых отобранными растениями, затем проверяют в открытом поле и отбирают только растения, дающие по меньшей мере 20 центнеров семян/гектар при густоте семян, примерно 125000-250000 растений/гектар.

Химическим и физическим мутагенезом и соматическим мутагенезом получают мутанты различных классов, тем самым повышается вероятность обнаружения заданных вариантов. Например, мутант с ланцетным листом, вертикально направленным, позволяет повысить густоту (плотность, сомкнутость) семян, не мешая улавливать свет, что важно для фотосинтетической активности и, следовательно, для повышения урожайности семян на га. Например, более глубокая корневая система мутанта позволяет растению лучше закрепляться, заякориваться в почве и способствует лучшему поступлению питательных веществ. Например, компактное соцветие и более высокое число коробочек у мутанта способствуют увеличению количества семян, даваемых каждым отдельным растением.

Настоящее изобретение охватывает полученные и отобранные таким образом растения, урожайность семян у которых выше или равна 20 центнерам/гектар. Растения по настоящему изобретению модифицируют с целью получить выход семян до 90 центнеров на возделанный гектар, следовательно, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 центнеров на возделанный гектар по сравнению с урожаем 10-12 центнеров/гектар, обычно даваемым растениями табака, отобранными для получения листовой массы.

Растения по изобретению можно получать также индукцией соматоклональных вариантов, при этом вышеуказанные семена можно обрабатывать гипохлоритом натрия, а затем 70% этанолом, у растений, проросших из этих семян, берут части листа и образование каллусов индуцируют и репродуцируют различное число раз ίη νίΐτο, т.е. растения являются, следовательно, индуцированными при использовании указанных частей. Из указанных каллусов регенерируют растения с переменными характеристиками, такими как: форма соцветия, число коробочек, число семян в коробочке, размеры семян, форма листа, размеры корневой системы, направление листа, урожайность (выход) семян, содержание масла в семенах, состав жирных кислот в масле, содержание белка в семенах и т.д, причём проводят селекцию указанного растения с учётом вышеперечисленных показателей.

Можно далее проводить селекцию растений по изобретению на наличие следующих характеристик: процентное содержание масла в семенах, состав жирных кислот в масле, состав белков в семенах и т.д.

Описанные выше растения можно далее модифицировать методами рекомбинантной ДНК с целью получения других предпочтительных характеристик, в том случае, если указанные характеристики отсутствуют у отобранных мутантов, эти характеристики суть: повышение процентного содержания масла в семенах, переменный состав жирных кислот, зависящий от того, для каких целей применяется масло, устойчивость к инсектицидам, устойчивость к гербицидам, устойчивость к грибкам и т.д.

Для генетической трансформации растений по изобретению можно использовать векторы, подходящие для трансформации растительных клеток, а также кассеты экспрессии, способствующие экспрессии генов, представляющих интерес. В зависимости от того, должны представляющие интерес гены экспрессироваться в зелёной части листа (например, гены устойчивости к паразитам или гербицидам) или в семенах (например, гены, участвующие в метаболизме жирных кислот), можно отбирать известные в уровне техники векторы, гарантирующие экспрессию указанных генов в представляющих интерес органах. Следовательно, можно использовать векторы с конститутивными промоторами, известными в уровне техники, или с индуцибельными промоторами, например, при атаке паразитов или в образующейся коробочке. В частности, так как растения по изобретению отбирают по высокой урожайности семян и при условии, что продукт из указанных семян представляет особый интерес, то особенно пригодны век

- 5 017916 торы, содержащие семяспецифичные кассеты экспрессии, которые гарантируют экспрессию гетерологичных встроенных генов в семенах растения по изобретению.

Для генетической трансформации можно использовать ЛдгоЬае1егшт ШтеГааеик или системы физического переноса ДНК.

В одном варианте изобретения особенно предпочтительно создавать растения, показывающие не только высокую урожайность семян, но также устойчивость к насекомым, устойчивость к гербицидам, устойчивость к грибкам, устойчивость к засухе, это позволяет значительно уменьшить затраты на выращивание растений, тем самым повышается продуктивность культуры и уменьшается отрицательное воздействие на окружающую среду.

В данном случае можно использовать векторы, содержащие в качестве маркера ген устойчивости к канамицину, регулирующий области, способствующие конститутивной экспрессии (например, промотор 358 или убиквитин) генов, представляющих интерес, такой как сгу-ген ВасШик ОшппщепыА ген агоА 8а1тоие11а [урЫтипит. Вр11 ген N. оЫиыГойа. Указанные гены позволяют, в том же порядке, получать растения, устойчивые, соответственно, к: насекомым, гербицидам, грибковым заболеваниям, и их можно вводить стандартными методами переноса генов, известными специалистам в данной области техники.

Устойчивости можно вводить, следуя одному или более событий трансформации с помощью нескольких векторов, или же, благодаря тому, что растения могут очень легко скрещиваться, устойчивости можно вводить по одной в различных отдельных представителей одного и того же отобранного сорта, а затем объединять вместе в одном отдельном представителе с помощью скрещивания.

В этом случае легко добиться гомозиготности по любому признаку дупликацией гаплоидов, полученных с помощью 1И νίΐΙΌ культуры пыльников.

Генетическую трансформацию можно осуществлять аналогично для целей метаболической инженерии, направленной на повышение количества масла, аккумулирующегося в семенах, и на модификацию метаболического пути жирных кислот. В этом случае можно использовать регулирующие области с семяспецифичной активностью, такие как промотор гена глобулинов, и направляющие ферментные белки на эндоплазматический ретикулум, где они могут стабилизироваться вставкой специфического сигнала, такого как КОЕБ, или откуда могут транспонироваться (мигрировать) в пластиды, вводя специфические в отношении аминокислот сигналы, например лидерную последовательность малой субъединицы ВцВйСО.

Например, количество масла и состав жирных кислот в нём можно модифицировать модификацией экспрессии генов, кодирующих ферменты, но только в качестве примера, такие как ацетил-СоАкарбоксилаза (АССаза), диацилглицерин-ацилтрансфераза (Э6АТ), лизофосфатидат-ацилтрансфераза (БРАТ), фосфатидатфосфогидролаза (РАРаза) ацилпереносящего белка (АСР), малонил СоА: АСР трансацилаза, кетоацил-АСР-синтаза (КА8), кетоацил-АСР-редуктаза, 3-гидроксиацил АСР-дегидраза, еноил-АСР-редуктаза, стеароил-АСР-десатураза, ацил-АСР-тиоэстераза, глицерин-3-фосфатацилтрансфераза, 1-ацил-8И-глицерин-3-фосфатацилтрансфераза, цитидин-5-дифосфатдиацилглицеринсинтаза, фосфатидилглицерофосфатсинтаза, фосфатидилглицерин-3-фосфатфосфатаза, ΓΑΌ1-8 десатураза, фосфатаза фосфатидной кислоты, моногалактозилдиацилглицеринсинтаза, дигалактозилдиацилглицеринсинтаза, белок биосинтеза сульфолипидов, длинноцепная ацил-соА-синтаза, глицерин-3-фосфатацилтрансфераза (6РАТ), диацилглицеринхолинфосфотрансфераза, фосфатидилинозитсинтаза, ацил-СоАдиацилглицеринацилтрансфераза, ацил-АСР-десатураза, линеоилдесатураза, сфинголипиддесатураза, олеат 12-десатураза, ацетиленаза для жирных кислот, эпоксигеназа для жирных кислот, диацетилглицеринкиназа, холинфосфатцитидилтрансфераза, холинкиназа, фосфолипаза, фосфатидилсериндекарбоксилаза, фосфатидилинозиткиназа, кетоацил-СоА-синтаза, фактор транскрипции СЕВ, олеозин, 3-кетоацилСоА-тиолаза, ацил-СоА-дегидрогеназа, еноил-СоА-гидратаза, ацил-СоА-оксидаза.

Согласно изобретению можно добиться повышения общего содержания масла в семенах, определяя сверхэкспрессию ацетил-СоА-карбоксилазы табака или этого же фермента другого вида (например, рапса). Например, изменение профиля жирных кислот и, следовательно, йодного числа можно получить сайленсингом или экспрессией антисмысловых конструкций, гена, кодирующего олеат десатуразу пластиды и эндоплазматического ретикулума. Экспрессия или сайленсинг одного или более указанных генов в семенах растений по изобретению приводят к тому, что масло, даваемое указанными семенами, можно непосредственно использовать для получения биодизельного топлива, так как оно имеет йодное число ниже или равное 120.

Экспрессия указанных генов может также влиять на процентное содержание масла в семенах, и растения по изобретению можно далее отбирать по содержанию масла в семенах (масличности), которое может составлять примерно до 38% от веса семян, 40, 48, 52, 58 и даже 60%.

Вышеуказанные гены можно вводить в векторы для специфической экспрессии в семенах так, как это описано в патентной заявке \¥О 03073839, следуя указаниям, данным в этой заявке. Так вектор экспрессии, используемый в указанном варианте изобретения, представляет собой вектор, содержащий: а) промотор гена растения, специфический к экспрессии в запасающих органах семян; б) последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность растительного белка, способную направлять продукт представляющего интерес гена в запасающие органы семян через эндоплазматический ретику

- 6 017916 лум; в) кодирующую последовательность ДНК для указанного гена, представляющего интерес, лишённого нативной сигнальной последовательности; г) стоп-сигнал. Промоторная и лидерная последовательности могут принадлежать, например, гену 78 глобулина сои или бета-конглицинина сои, или генам, кодирующим запасные белки семян табака.

Вышеуказанные гены можно вводить в соответствии с одним или более событий трансформации, или трансформацией с помощью нескольких векторов, или же так как растения могут легко скрещиваться, указанные гены можно вводить по одному в различных отдельных представителей одного и того же отобранного сорта, а затем объединять вместе в одном отдельном представителе с помощью скрещивания.

В этом случае легко добиться гомозиготности по всем признакам дупликацией гаплоидов, полученных с помощью ίη νίΐτο культур пыльников.

Таблица 1. Состав жирных кислот некоторых сортов табака, отобранных только после мутагенеза, или сконструированных и отобранных с целью изменить метаболический путь жирных кислот и отобранных по стабильности признака. В табл. показан результат, полученный в результате мутагенеза и генетической интервенцией, проводимой путём введения некоторых из перечисленных генов с целью изменить кислотный состав; масло в трёх последних столбцах имеет йодное число, пригодное для трансформации указанного масла в биодизельное топливо.

Компонент	РЬТ 103	РЬТ 256	РЬТ 318	РЬТ 335
Пальмитиновая кислота	6,31%	8,26%	7,15%	17,20%
Пальмитолеиновая кислота	0,11%	0,18%	0,18%	1,25%
Стеариновая кислота	2,58%	5,20%	8,50%	12,50%
Олеиновая кислота	12,62%	22,58%	25,56%	53,27%
Линолевая кислота	77,48	58,78%	52,00%	6,45%
Линоленовая кислота	0,65%	4,15%	5,25%	7,80%
Арахидоновая кислота	0,13%	0,85%	0,80%	0,85%
Эйкозановая кислота	0,13%	0,58%	0,56%	0,68%

Объектом изобретения являются также семена растений, описанных выше, которые, будучи семенами мутантных растений, также будут мутантными и, таким образом, будут содержать модификации ДНК, что сделает их отличными от семян дикого типа. Кроме того, как говорится выше, указанные семена могут иметь число хромосом, отличное от исходных растений (например, полиплоиды), и в большинстве случаев также будут трансформированы вышеуказанными векторами.

Когда трансформацию осуществляют при использовании векторов, экспрессирующих гены, связанных с метаболизмом жирных кислот, приведённых выше, указанные семена будут также характеризоваться тем, что они содержат масло с йодным числом более низким, чем или равным 120, и процентное содержание масла составляет 38-60% от общего веса семян.

Объектом настоящего изобретения является также способ получения растения по изобретению, включающий следующие стадии:

а) осуществление мутагенеза семян, полученных начальным скрещиванием отдельных растений одного и того же вида, принадлежащих к дикому типу или к выбранным сортам;

б) проращивание указанных семян и отбор растений поколений М2-М4 в соответствии со следующими показателями:

ί) наличие отличительных признаков, которые проявляют себя на фенотипическом уровне, выбранных из группы следующих признаков: высота растения 80-120 см, листья с тонкими листовыми пластинками и направленные вертикально, компактное соцветие, число цветков более 100, число коробочек более 100, число семян в коробочке более 5000, сильный и одревесневший стебель, глубокие корни;

и) устойчивость выбранного отличительного признака в поколениях после М2;

ш) проверка наследования выбранного отличительного признака;

в) проращивание семян, отобранных на стадии б), и полное обновление растений, начиная с каллюса (наплыва) на мякоти листа (мезофилле), индуцированное ίη νίΐτο в присутствии фитогормонов, и селекция растений, сохраняющих основные признаки, отобранные на стадии б) в поколениях (генерациях) К0-К2;

г) засевание в открытом поле растений, отобранных на стадии в), и селекция растений, дающих по меньшей мере 20 центнеров семян на гектар.

В описанном методе растения, полученные на стадии а), можно также получать а') получая мутагенизированные семена межвидовым скрещиванием в роде ΝίοοΙίαηα с последующим обратным скрещива

- 7 017916 нием Р1 или индукцией амфидиплоидов обработкой колхицином вегетативного апекса.

Растения, полученные вышеописанными методами, могут проходить через дополнительные стадии

д) и/или е) и ж), указанные ниже:

д) генетическая трансформация растений, полученных в точке (на стадиях) а-г или а'-г, с помощью векторов, содержащих кассеты экспрессии, экспрессирующие в растении гены устойчивости к насекомым, гербицидам и/или грибковым заболеваниям, выбранные из группы, содержащей сгу-ген ВасШик 11шппщсп515. ген агоА 8а1тоие11а 1ур1нтипит. Ер11 ген N. оЫикйоНа, и селекция трансформированных таким образом растений в поколениях Т0-Т4 на устойчивость к насекомым, гербицидам и/или грибковым заболеваниям;

е) генетическая трансформация растений, полученных в пунктах а-г или а'-г, с помощью одного или более векторов, содержащих кассеты экспрессии, экспрессирующие в семенах гены метаболизма жирных кислот, выбранные из группы, включающей гены ацетил-СоА-карбоксилазы (АССазы), диацилглицеринацилтрансферазы (Ό6ΑΤ), лизофосфатидатацилтрансферазы (ЬРАТ), фосфатидатфосфогидролазы (РАРазы) ацилпереносящего белка (АСР), малонил СоА: АСР трансацилазы, кетоацил-АСР-синтазы (КА8), кетоацил-АСР-редуктазы, 3-гидроксиацил-АСР-дегидразы, еноил-АСР-редуктазы, стеароил-АСР-десатуразы, ацил-АСР-тиоэстеразы, глицерин-3-фосфатацилтрансферазы, 1-ацил-8и-глицерин-3-фосфатацилтрансферазы, цитидин-5-дифосфатдиацилглицеринсинтазы, фосфатидилглицерофосфатсинтазы, фосфатидилглицерин-3-фосфатфосфатазы, РАО 1-8 десатуразы, фосфатазы фосфатидной кислоты, моногалактозиддиацилглицеринсинтазы, дигалактозилдиацилглицеринсинтазы, белка биосинтеза сульфолипидов, длинноцепной ацил-соА-синтазы, глицерин-3-фосфатацилтрансферазы (СРАТ), диацилглицеринхолинфосфотрансферазы, фосфатидилинозитсинтазы, ацил-СоА-диацилглицеринацилтрансферазы, ацил-АСРдесатуразы, линеоилдесатуразы, сфинголипиддесатуразы, олеат 12-десатуразы, ацетиленазы для жирных кислот, эпоксигеназы для жирных кислот, диацетилглицеринкиназы, холинфосфатцитидилтрансферазы, холинкиназы, фосфолипазы, фосфатидилсериндекарбоксилазы, фосфатидилинозиткиназы, кетоацилСоА-синтазы, фактора транскрипции СЕВ, олеозина, 3-кетоацил-СоА-тиолазы, ацил-СоА-дегидрогеназы, еноил-СоА-гидратазы, ацил-СоА-оксидазы, с последующей селекцией растений в поколениях Т0-Т4 на такие признаки, как общее содержание масла в семенах и состав жирных кислот в этом масле;

ж) скрещивание растений, полученных в пунктах а-е или а'-е), и селекция полученного в результате потомства на такие признаки, как: высокая семенная продуктивность, высокое содержание масла в семенах, переменный состав жирных кислот масла в зависимости от предполагаемого использования, устойчивость к насекомым, устойчивость к гербицидам, устойчивость к грибкам.

Селекцию растений по пунктам между пп.б и е можно проводить, например, на наличие характеристик (отличительных признаков), которые могут определяться химическим анализом, таких как общее содержание масла в семенах и/или содержание отдельных кислотных компонентов семян и/или содержание белков в семенах.

Другим объектом изобретения является способ экстракции масла из семян табака, отличающийся тем, что выход масла составляет 70-95% от масла, содержащегося в указанных семенах, включающий следующие стадии:

а) механическая экстракция указанного масла прессованием (холодный отжим) и получение масла и остаточного продукта - жмыха;

б) фильтрование указанного масла, экстрагированного на стадии а) через бумажный или матерчатый фильтр.

Вышеуказанный способ даёт выход более 70%, который является совершенно неожиданным при использовании указанных методов прессования таких маленьких семян, как семена табака. В настоящем изобретении, в котором с целью повысить выход масла с растения выбирают растения с высокой семенной продуктивностью, обнаружение того факта, что метод прессования в применении к семенам табака даёт выход, сравнимый с выходом в случае семян больших размеров, делает возможным чрезвычайно эффективное применение изобретения.

Помимо более низких производственных затрат и совершенно неожиданных выходов с точки зрения уровня техники указанный способ позволяет экстрагировать масло табака непосредственно в тех местах, где его можно использовать для энергетических нужд.

В одном варианте изобретения семена по изобретению можно подвергать холодному прессованию (холодному отжиму) с помощью винтового (червячного) пресса или пресса другого вида, в который загружают семена. Температура пресса может достигать, примерно, 60°С, когда пресс работает постоянно, а отжатое из семян масло собирают и фильтруют через бумажный или матерчатый фильтр, помещённый в фильтр-пресс. Для прессования семян табака можно применять другие системы прессования, пригодные для семян.

Для дополнительного повышения выхода в методе по изобретению, в котором выход масла из семян должен быть максимальным, можно осуществлять дополнительную стадию

в) химическая экстракция растворителями остаточного масла в жмыхе, полученном в п.а).

- 8 017916

Таблица 2. Характеристики масла табака, полученного прессованием семян и фильтрованием

Определение	Результат	Ед. изм.	Методы
Температура вспышки	236.0	°С	υΝΙΕΝΚΟ 27 19 2005
Сера	<0.01	% м/м	Ι5Ο 8754 1992
Зольность	0.005	% м/м	ΕΝ КО 6245 2002
Вязкость при 50°С	21.630	мм2/сек	ΌΝΙ ΕΝ КО 3104 200
Температура плавления	-18	°С	КО 3016 1994
Теплотворность	9670	ккал/кг	А8ТМ 0240-97
Объёмная масса при 15°С	925.0	кг/м3	υΝΙ ΕΝ КО 3675 2002
Число омыления	193.6	мг КОН/г	А5ТМ Э94-02

В табл. показаны более высокая теплотворность, низкое содержание серы, низкая вязкость по сравнению с другими растительными маслами.

Объектом изобретения также является применение растений по изобретении и/или их семян для получения жидких или твёрдых топлив, биодизельного топлива, промышленных смазочных масел, пластических материалов, таких как линолеум, пищевых добавок для животных, пищевых добавок для людей.

Таким образом, растения по изобретению проявляют отличительные признаки, которые чрезвычайно благоприятны для получения результатов:

они дают масло, получаемое прессованием, идеальное, также без рафинирования, так как достаточно простого фильтрования, для использования в качестве горючего масла, так оно прозрачно на вид, кинематическая вязкость при 40°С 29,11 мм²/с, а при 50° С 21,63 мм²/с, и содержание серы ниже 0,01%, что позволяет относить его к классу с очень хорошими физическими и термодинамическими характеристиками;

они дают масло, получаемое прессованием семян, которое, даже в самом простом варианте изобретения, и, следовательно, без трансформации с целью экспрессии генов метаболизма жирных кислот, указанных выше, может использоваться для получения биодизельного топлива в смеси с 25% пальмового масла или с содержанием другого растительного масла с более низким йодным числом, чтобы понизить йодное число ниже 120, и которое, в варианте изобретения, включающем экспрессию одного или более указанных генов с целью изменить метаболизм жирных кислот, может непосредственно использоваться для превращения его в биодизельное топливо, имеющее йодное число, равное 120, или лучше равное 100, или даже лучше равное 80;

они дают жмых, остающийся после отжима семян, с переменным (примерно, от 6 до 12%) содержанием масла и с содержанием белка около 35%, который идеален в качестве пищевой добавки, идущей на корм животным, благодаря высокому содержанию в нём Омега-6 жирных кислот (линолевой кислоты);

они дают жмых, остающийся после отжима семян, который, в качестве альтернативы его применения для корма животным, можно использовать как твёрдое горючее на заводах, работающих на угле или на гранулах (пеллетах) из биомассы, благодаря его теплотворной способности, превышающей 4950 ккал/кг;

они дают масло с температурой вспышки 236°С и температурой плавления -18°С, таким образом, масло пригодно для применения в качестве не загрязняющего окружающую среду смазочного масла, например, для приводов цепной пилы, или в качестве смазочных масел вообще;

они дают масло, которое, с учётом его композиции, богатой полиненасыщенными жирными кислотами (С18:2, ΡϋΕΑ), существенно важными для человека и, следовательно, необходимыми для здоровья (Омега-6), может использоваться в качестве продукта питания или в качестве пищевой добавки для людей;

они дают биомассу (листья, стебли, соцветия, внешняя оболочка коробочек), остающуюся после сбора семян, её количество может достигать 100 центнеров с гектара или, лучше, 200 центнеров с гектара, или, ещё лучше, 300 центнеров с гектара с возможностью дальнейшего увеличения выхода с гектара;

они дают остаточную биомассу, которую можно использовать для обычных целей, таких как газификация, сжигание, пиролиз, анаэробное расщепление, ферментация или паровая газификация (взрывной автогидролиз, паровой взрыв), тем самым повышая экономическую эффективность культуры.

Следовательно, целью изобретения является использование растений по изобретению в целом для получения семян табака в больших масштабах.

Целью изобретения является использование указанных растений и/или семян для получения масла табака.

Также целью изобретения является использование растений и/или семян для получения топлива на основе масла табака или, в особенности, состоящего из масла табака, для бойлеров (котлов) или дизельных двигателей.

- 9 017916

В особенно предпочтительном варианте изобретения указанное масло табака получают методом прессования (отжима) по изобретению, а не экстракцией растворителями.

Действительно, метод экстракции по изобретению позволяет получать масло, которое можно прямо использовать в качестве топлива, благодаря тому, что кинематическая вязкость указанного масла при 40°С равна 29.11 мм²/с, а при 50°С равна 21.63 мм²/с, что позволяет впрыскивать его в форсунки без ожижения предварительным нагревом.

Другой целью изобретения является использование растений и/или семян по изобретению для получения биодизельного топлива смешением масла семян табака, например с 25% пальмового масла или с растительными маслами в другом процентном отношении, снижая йодное число конечной смеси. Получение биодизельного топлива по изобретению можно осуществлять, смешивая масло табака, экстрагированное вышеописанным методом (прессование, отжим), с растительными маслами, способными понижать йодное число до величины 120 или ниже.

Также целью изобретения является использование растений и/или семян по изобретению для получения масла семян табака, имеющего йодное число, равное 120 или ниже 120, без проведения каких-либо операций, направленных на снижение йодного числа масла, экстрагированного по методу по изобретению. В данном варианте изобретения могут использоваться трансгенные растения и/или трансгенные семена, экспрессирующие один или более перечисленных выше генов метаболизма жирных кислот по изобретению, дающие масло табака с йодным числом, равным 120 или меньшим, чем 120.

Следовательно, в этом случае после прессования (отжима) по изобретению не проводят процесс рафинирования или обработки масла с целью понизить йодное число полученного при этом масла. Таким образом, биодизельное топливо может содержать 100% масла табака. Биодизельное топливо получают из масла табака обычными методами переэтерификации метанолом, известными специалисту в данной области техники.

В одном варианте изобретения биодизельное топливо состоит исключительно из масла табака, имеющего йодное число меньше 120, или даже равное или меньшее 100, или даже равное или меньшее 80, причём указанное масло переэтерифицировано метанолом методами, известными специалисту в данной области техники.

Целью изобретения является также использование растений и/или семян по изобретению для получения твёрдого топлива для заводов, работающих на угле или гранулах (пеллетах) из биомассы. В этом случае можно использовать биомассу, образующуюся в результате возделывания растений, причём указанная биомасса имеет теплотворную способность (теплотворность) выше 4200 ккал/кг.

Целью изобретения является также топливо (топлива), получаемое, как указано выше, т.е. топливо, содержащее жмых, остающийся после прессования (отжима) семян табака.

Или же растения и/или семена по изобретению можно использовать для приготовления пищевых добавок в корм животным. Жмых, остающийся после отжима (прессования) семян табака по изобретению, содержит примерно от 6%, примерно до 12% масла и примерно 35% белков от веса жмыха и имеет высокое содержание Омега-6 жирных кислот (линолевой кислоты), что делает его идеальным для указанного применения. В испытаниях, проводимых при выращивании поросят, замена соевой белковой муки на табачный жмых в количестве, варьирующемся от 3 до 7% в изопротеиновых диетах, не наблюдается заметных различий в развитии животных.

В другом варианте изобретения растения и/или семена по изобретению можно использовать для приготовления экологически чистых (не загрязняющих окружающую среду) смазочных масел. Например, масло, полученное методом по изобретению из растений, дающих семена по изобретению, не имеющее иных модификаций, помимо мутаций с целью выявления основного признака (т.е. высокой урожайности семян), уже имеет температуру вспышки 236°С и температуру плавления -18°С, характеристики, которые делают его пригодным для применения даже как такового в качестве не загрязняющего окружающую среду смазочного масла, например, для привода цепной пилы, или в качестве смазочных масел вообще.

Ещё в одном варианте изобретения растения и/или семена по настоящему изобретению можно использовать для приготовления пищевых продуктов или пищевых добавок для людей.

В этом случае масло, полученное в процессе по изобретению, дополнительно очищают, чтобы удалить парафины, смолы, сложные углеводы, фосфолипиды, и снижают кислотность. После очистки (рафинирования) его можно использовать само по себе или в качестве пищевой добавки людям. Преимущество указанного применения обеспечивается тем, что указанное масло обогащено полиненасыщенными жирными кислотами (С18:2, РИЕЛ), существенно важными для человека и, следовательно, необходимыми для здоровья (Омега-6).

Очевидно, что все варианты изобретения, предусматривающие применение масла семян табака, предпочтительно получаемого прессованием (отжимом), или жмыха, остающегося после прессования семян, можно осуществлять также на немутагенизированных растениях табака. Неоспоримое преимущество растений по изобретению, безусловно, обеспечивается высоким урожаем (выходом) семян и повышенным выходом продукта, получаемого при использовании растений по изобретению и их семян, по

- 10 017916 сравнению с выходом в случае растений дикого типа и семян табака, засеваемых на сравнимой культивированной площади и сравнимыми методами культивации.

Применение масла табака для получения смазочных масел, пищевых добавок для человека или животных, никогда не раскрывалось в уровне техники. Очевидно, что все варианты изобретения, в которых масло, имеющее йодное число, меньшее или равное 120, экстрагируют отжимом (прессованием) и дополнительно не обрабатывают, также никогда не описывались.

Растения по изобретению также дают остаточную биомассу (листья, стебли, коробочки (капсулы) и соцветия и оболочки), количество которой, после сбора семян, может достигать 100-300 центнеров или более с гектара, применение растений по изобретению в качестве источника биомассы для процессов газификации, сжигания, пиролиза, анаэробного расщепления, аэробного расщепления, ферментации или паровой газификации (взрывного автогидролиза, парового взрыва), описанные в уровне техники, с целью дальнейшего повышения выхода культуры, является, следовательно, целью изобретения.

Целями изобретения являются также: масло семян табака, получаемое из растений по изобретению методом экстракции по изобретению, биодизельное топливо, получаемое переэтерификацией указанного масла, виды топлива, содержащие указанное масло, пищевые добавки для людей, полученные из дополнительно очищенного указанного масла, смазочные масла, содержащие указанное масло, масло семян табака, получаемое из семян растений по изобретению методом экстракции по изобретению, характеризующееся тем, что оно имеет йодное число, меньшее или равное 120, не требующее смешения с другими маслами для снижения указанного числа, биодизельное топливо, содержащее указанное масло, имеющее йодное число, равное или меньшее 120.

Примеры

Пример 1. Химический мутагенез.

Проводят отбор семян определённого сорта для получения мутантов химическим мутагенезом, помещают в колбу на 100 мл в количестве 20 г на эксперимент, что соответствует 200000 семенам. В колбу добавляют 50 мл деионизированной воды и проводят регидратацию семян в течение 14 ч при 25°С. Затем воду заменяют 0,5% водным раствором ЭМС (ЕМ8). Семена перемешивают магнитной мешалкой различное время, от 0,5 до 5 ч, в зависимости от сорта, который в предварительных испытаниях показал более высокую частоту мутаций, вызывающих изменение морфологических признаков, таких как высота растения, размеры семян, форма листьев, число коробочек, семенная продуктивность растения и т.д.

По окончании периода обработки мутагенный раствор отбрасывают, выгружая семена на редкое сито и промывая их в течение нескольких минут водопроводной водой. Затем семена промывают 6 раз в колбе, добавляя 50 мл воды, и встряхивают их 10 мин при каждой промывке.

Семена сушат на фильтровальной бумаге и отсылают на специальную фирму для дражирования (пеллетирования).

Дражированные семена имеют конечный диаметр 1,2 мм и используются для непосредственного засевания в поле (М1) при плотности 100000 растений. Поколение Μι оставляют цвести и изучают на возможное наличие доминантных мутаций и, когда семена созревают, коробочку (капсулу) с растения собирают вручную, чтобы получить семенную массу, которую используют для засевания в открытом поле на следующий год и для фенотипического скрининга М₂ поколения. Каждый представляющий интерес мутант индивидуально собирают и контролируют в последующих поколениях.

Пример 2. Индукция сомаклональных вариантов.

Семена сорта, отобранного для индукции сомаклональных вариантов, стерилизуют, погружая на 5 мин в 20% раствор гипохлорита натрия с последующим погружением на 1 мин в 70% этанол, и затем промывают 5 раз в стерильной воде. Семена оставляют прорастать в прямоугольных пластиковых контейнерах со стороной 10 см и высотой 12 см, содержащих агаризованную М8 среду. От полностью развившихся растений отрезают части листа со стороной 0.5 см и помещают в чашки Петри с М81 (М8 + 1 мг/л 2,4-0) средой, чтобы индуцировать образование каллуса. Также используют отдельные экземпляры Ει, полученные межвидовым скрещиванием. Каллусы, собранные с чашек Петри с фрагментами листьев, помещают в жидкую среду М81 в колбе на 250 мл, содержащей 50 мл среды, и перемешивают при 80 об/мин на вращающейся платформе при 28°С в течение 16 ч светового дня.

Каллус сохраняют в жидкой культуре в течение нескольких поколений, обновляя культуру каждые 20 дней и инокулируя в новую колбу с 50 мл жидкой среды 2,5 мл предыдущей культуры. В каждом поколении часть каллуса распределяют в чашках Петри, содержащих агаризованную среду М82 (М8 + 1 мг/л ΝΑΑ +1,5 мг/л кинетина), чтобы индуцировать образование отростков, которые по достижении длины 2 см переносят на среду М83 (М8 + 1 мг/л ΙΒΑ) для образования корня, а затем переносят в горшок в теплице. Полученные варианты подвергают скринингу в поколениях В! и В₂ и описывают размеры листьев, форму листьев, размеры коробочек (капсул), число семян в коробочке, содержание масла в семенах и т.д.

Пример 3. Скрещивание и хромосомная дупликация.

Многие виды Мсойаиа совместимы при половом скрещивании с ΝίοοΙίαηα 1аЬасиш, и даже если продукт скрещивания стерилен, возможно обратное скрещивание при использовании исходных (роди

- 11 017916 тельских) растений в качестве опылителя или можно индуцировать образование амфидиплоидов. В этих видах работа упрощается ввиду того, что можно получать популяции межродовых гибридов Р₄ из многих тысяч отдельных экземпляров, что позволяет проводить программу усовершенствования на основе амфидиплоидов. Скрещивания проводят, используя родительские (исходные) виды ΝίοοΙίαηα. имеющие как одинаковое число хромосом (например, Ν. рашси1а!а х Ν. 5о1ашГо11а: Ν. 1аЬасит х Ν. гикйса), так и различное число хромосом (например, Ν. 1аЬасиш х Ν. рашси1а1а; Ν. 1аЬасит х Ν. 1опщГ1ога). Ρι гибриды (индивидуумы), получаемые определённым подбором для скрещивания, выращивают в теплице, чтобы проверить их фенотипические характеристики и скрестить их с обоими родительскими растениями, и кроме того, оставляют для созревания ίη νίΐτο и микроразмножения. Микроразмноженный материал используют для проведения экспериментов по хромосомной дупликации обработкой колхицином в фазе размножения ростками или позже после пересадки в горшок и перед цветением. Ростки проросших семян срезают у основания и переносят на М8 среду, содержащую 2 мг/л бензиламинопиридина (ВАР). Примерно, через 4-5 недель образовавшиеся боковые побеги срезают и выдерживают в той же среде. Для получения целых растений осуществляют перенос на среду М8 без гормонов, чтобы индуцировать образование корней. Через несколько дней после того, как срезанные побеги переносят на среду для образования корня, в неё вносят каплю 0,5% раствора колхицина. Когда растения пустят корни, их переносят в горшочки в теплице и оставляют цвести, чтобы проверить их фертильность и их способность образовывать жизнеспособные семена. В некоторых случаях для того, чтобы содействовать гибридизации между различными видами, необходимо удвоить гаплоиды и проводить гибридизацию на аутотетраплоидах.

Материалы, полученные при использовании поколений обратного скрещивания или размножением ίη νίΐτο с последующей хромосомной дупликацией, подвергают скринингу на их фенотипические признаки и необязательно используют в программах генетического улучшения.

Контроль числа хромосом в стабилизированных линиях амфидиплоидов осуществляют, используя кончик корня.

Пример 4. Генетическая трансформация, опосредуемая АдгоЬас1егшт ШтеГааещ.

День 1. Небольшое количество АдгоЬас1егшт ШтсГасющ штамма ЕНА 105, содержащего представляющую интерес плазмиду, собирают с культуры на чашке Петри вручную в стерильных условиях, инокулируют в 2 мл стерильной ЬВ среды. Затем собирают лист здорового растения, не имеющий какихлибо изменений и, с другой стороны, обладающий идеальной упругостью. Лист быстро промывают в бидистиллированной воде для удаления поверхностных загрязнений и погружают в 0,1% раствор 8Ό8 в 20% растворе гипохлорита натрия на 8 мин и оставляют сушиться в стерильном вытяжном шкафу и все последующие операции проводят в стерильных условиях. В частности, лист погружают в 95% этанол и встряхивают примерно 30-40 с, чтобы полностью увлажнить обе стороны. Затем лист оставляют до полного высыхания.

Получают стерилизованные этанолом диски, образованные перфорацией всей поверхности листа, и помещают на плашки с не содержащей антибиотики средой М8 10; конкретно, в плашку помещают не более 30 дисков. Затем на плашку выливают 2 мл ЬВ плюс адгоЬас!егшт (свежеинокулированные) и бактериальную суспензию равномерно распределяют осторожными вращательными движениями, чтобы достичь гомогенного распределения бактерий на дисках. Избыток ЬЭ осторожно отбирают пипеткой. В качестве негативного контроля либо ничего не добавляют, либо добавляют только ЬВ.

Затем плашки инкубируют в течение 24-48 ч при 28°С при постоянном освещении, и на рост бактерий указывает появление тонкого непрозрачного пятна, распространяющегося по всей плашке.

День 2. Листовые диски осторожно переносят на плашку, содержащую М810+цефотаксим 500 мг/мл, и инкубируют в течение 6 дней при 28°С при постоянном освещении. Эта стадия определяет инактивацию адгоЬас1егшт.

День 8. Затем листовые диски осторожно переносят на среду М810+цефотаксим 500 мг/мл и канамицин 200 мг/л и инкубируют в течение 14 дней при 28°С при постоянном освещении. Эта стадия определяет селекцию трансформированных растений, так как ген устойчивости к канамицину переносится плазмидой, встроенной в АдгоЬас1егшт.

День 22. Листовые диски, которые вырастают за это время, образуя при этом каллус, осторожно переносят на среду М810+цефотаксим 500 мг/мл, канамицин 200 мг/л и карбенициллин 500 мг/л и инкубируют в течение 6 дней. Эта стадия определяет удаление агробактерий, если они выжили в предыдущей стадии обработки антибиотиками.

День 28. Листовые диски ещё раз переносят на среду М810+цефотаксим 500 мг/мл и канамицин 200 мг/л и инкубируют до появления ростков. Как только на ростках появятся по меньшей мере два листа, их отделяют от массы каллуса и переносят на среду для образования корней М8О+цефотаксим 500 мг/л и канамицин 200 мг/л.

Как только появляются корни, маленькие растения извлекают из плашки, освобождают от остатков агара, осторожно промывают водопроводной водой и сажают в небольшие пластиковые горшочки в смесь грунта и песка (2:1). Грунт предварительно пропитывают водой, затем покрывают прозрачными пластиковыми крышками, чтобы сохранять высокую влажность, и помещают в камеру для выращивания

- 12 017916 при 25°С и продолжительности светового периода 16 ч. Присутствие трансгенов проверяют на всех растениях, собирая листовую часть (250 мг), выделяя ДНК и проводя сначала ПЦР анализ, а затем, на позитивных растениях, Саузерн-блоттинг, чтобы проверить число копий трансгена.

Прмер 5. Экстракция масла из семян.

Для получения масла используют семена табака, даваемые определёнными отобранными сортами. В одном случае содержание влаги в анализируемых семенах составляет 7,01%, а содержание жировых веществ (экстракция гексаном) составляет 39,4%. Экстракцию масла проводят как холодную экстракцию, используя винтовой пресс модели Коте! (1ВС. Ссгтапу). вручную загружаемый семенами табака. В установившемся режиме температура пресса достигает 60°С и пресс держится при этой температуре. После отжима масло фильтруют через бумажный фильтр, после этого оно является высокопрозрачным. Показано, что выход масла составляет 81,1% от общего содержания масла в семенах. В оставшемся жмыхе содержание масла составляет 0,74%, а содержание белка равно 34,5%.

Пример 6. Опыты по горению (сжиганию).

Масло, экстрагированное холодной экстракцией и отфильтрованное через бумажные фильтры, как в примере 5, переэтерифицируют метиловым спиртом в присутствии ΝαΟΗ. Масло нагревают до 55°С, прибавляют раствор метанол-ΝαΟΗ и перемешивают 90 мин. В конце этой стадии после охлаждения смесь оставляют расслаиваться, при этом внизу находится слой глицерина, а наверху слой сложного эфира. Сложный эфир дважды промывают водой и при первой промывке к воде добавляют фосфорную кислоту (2,5 мл/л). Под конец масло нагревают в вакууме при 90°С для удаления всех остатков воды, и полученный эфир имеет сокращённое название ΤΟΕ (ТоЬассо Οίΐ ЕЦег, эфирное масло табака). Испытания проводят на дизельном двигателе непрямой инжекции (подробное описание: 4 цилиндра, роторный инжекционный насос, коэффициент сжатия 21.5:1, максимальная мощность 55 кВт при 4500 об/мин). Перед испытаниями горения проверяют аналитические показатели, такие как вязкость при 50°С (21,63 мм²/с), температура плавления (-18°С), наивысшая теплотворная способность (9670 ккал/кг), объёмная масса при 15°С (925,0 кг/м³), содержание серы (<0,01% м/м), зола (0,005% м/м). Для испытания используют газоанализатор гидравлический динамометр. Используемое эфирное масло в смеси с 20% с дизельного топлива имеет следующие характеристики по сравнению с ТЕО (показаны в скобках): плотность 840,8 (886,6), вязкость при 40°С 2,9 (3.3), содержание серы (мг/кг) 6750 (6). Результаты испытания не показывают заметных изменений характеристик двигателя при использовании двух продуктов, но говорят о более полном сгорании, которое даёт более высокий КПД, когда к дизельному топливу добавляют ТЕО. Максимальная мощность достигается при 2200 об/мин, на 3,5% более высокая, чем в случае чистого дизельного топлива (29,86 кВт по сравнению с 28,85 кВт). Содержание образующегося СО в смеси ниже, по сравнению с одним дизельным топливом, содержание серы также ниже, что определяет уменьшение эмиссии 8Ο₂ (до 40%).

Пример 7. Опыты по откорму животных.

Жмых, полученный прессованием семян табака, анализируют, чтобы оценить его пригодность в качестве пищевой добавки в корм животным. Данные анализа жмыха, получающегося при отжиме (прессовании), показывают содержание жиров (жировых веществ) 10,74%, содержание белка 34,5% и содержание влаги и летучих веществ 5.97%. Общее содержание аминокислот после гидролиза образца: аспарагиновая кислота 2,40%, треонин 1,06%, серин 1,17%, глутаминовая кислота 5,53%, пролин 0,83%, глицин 1,29%, аланин 1.18%, валин 1,27%, метионин 0,45%, изолейцин 1,13%, лейцин 1,84%, тирозин 0,97%, фенилаланин 1,43%, гистидин 0,72%, лизин 0,72%, аргинин 3,36%. Из общего содержания жировых веществ 76.59% составляет линолевая кислота, которая относится к классу Омега-6, особенно необходимому для питания животных.

Опыты по откорму проводят на поросятах с начальным весом около 8 кг, разделённых на две группы, по 20 поросят в каждой группе, контрольной группе дают корм с добавкой соевого белка (С), второй группе дают такое же количество белка, что и первой, но соя частично заменена на 3% жмыха растения табака (Т). У животных, которым давали жмых, не наблюдается никаких проблем ни в начале, ни в продолжение всего опыта при потреблении этого корма. В течение опыта постоянно проводят контроль и не наблюдают никакого нарушения в деятельности ЖКТ поросят. Наблюдается различный суточный привес у животных (237 г/голова/день при кормлении жмыхом табака, 170 г/голова/день при кормлении жмыхом сои) и наконец через 27 дней вес 15.2 кг для Т и 12.8 кг для С.

Claims (24)

1. Мутагенизированное растение табака, которое продуцирует количество семян, составляющее по меньшей мере 4000 кг на гектар при плотности посева около 125000 растений на гектар, полученное способом, включающим следующие стадии:

а) осуществление мутагенеза семян, полученных начальным скрещиванием между отдельными растениями одного и того же вида, принадлежащих к дикому типу или к выбранным сортам;

б) проращивание указанных семян и селекция растений М2-М4 поколений в соответствии со следующими показателями:

- 13 017916

ί) наличие одного или более внешних фенотипических проявлений признаков, выбранных из следующей группы: высота растения 80-120 см, листья с тонкими пластинками и направленные вертикально, компактное соцветие, число цветков более 100, число коробочек более 100, число семян в коробочке более 5000, одревесневший и сильный стебель, глубокие корни;

ίί) устойчивость выбранного отличительного признака в поколениях после М2;

ϊϊΐ) подтверждение наследования выбранного отличительного признака;

в) отрезание листьев с растений, отобранных на стадии б), индуцирование образования каллуса на мезофилле листа ίη νίίτο в присутствии фитогормонов, регенерация растений, начиная с каллюса на мезофилле листа, и селекция растений, сохраняющих основные признаки, выбранные на стадии б), в поколениях К0-К2;

г) засевание в открытом поле растений, отобранных на стадии в), и дальнейшая селекция растений, дающих по меньшей мере 4000 кг семян на гектар при плотности посева около 125000 растений на гектар.

2. Растение по п.1, полученное способом, охарактеризованным в п.1, в котором стадия а) заменена следующей стадией:

а') получение мутагенизированных семян с помощью межвидового скрещивания растений рода ΝίοοΙίαηα с последующими обратным скрещиванием отдельных растений Е1 и индукцией амфидиплоидов обработкой колхицином вегетативного апекса растений, полученных в результате указанных скрещиваний.

3. Растение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанное растение продуцирует количество семян, составляющее около 5000 кг на гектар, или около 7000 кг на гектар, или около 9000 кг на гектар.

4. Растение по п.1 или 2, где способ получения растения дополнительно включает следующие стадии:

д) трансформация растений, полученных на стадии г), с помощью векторов, содержащих кассеты экспрессии, экспрессирующие в растении гены устойчивости к насекомым, гербицидам и/или грибковым заболеваниям, и селекция трансформированных таким образом растений в поколениях Т0-Т4 на устойчивость к насекомым, гербицидам и/или грибковым заболеваниям; и/или

е) трансформация растений, полученных на стадии г), с помощью одного или более векторов, содержащих кассеты экспрессии, экспрессирующие в семенах гены метаболизма жирных кислот, с последующей селекцией трансформированных растений в поколениях Т0-Т4 на такие признаки, как общее содержание масла в семенах и состав жирных кислот в этом масле;

ж) скрещивание растений, полученных на стадиях д) и/или е), и селекция полученного в результате потомства на один или более признаков, выбранных из группы: высокая урожайность семян в количестве более 4000 кг на гектар, содержание масла в семенах, составляющее 38-60%, йодное число масла, полученного из семян указанного потомства, меньшее или равное 120, состав жирных кислот масла, содержащегося в семенах указанного потомства, меняется по отношению к растению дикого типа, устойчивость к насекомым, устойчивость к гербицидам, устойчивость к грибкам.

5. Растение по п.4, которое модифицировано по метаболизму жирных кислот генетической трансформацией и производит семена, содержащие масло, имеющее йодное число, меньшее или равное 120.

6. Растение по п.4 или 5, которое модифицировано по метаболизму жирных кислот генетической трансформацией и производит семена с процентным содержанием масла, составляющим около 40-60% от веса семян.

7. Растение по любому из пп.4-6, модифицированное трансформацией с помощью одного или более экспрессирующих векторов, включающих семяспецифичную кассету экспрессии, содержащую в порядке расположения от 5' конца к 3' концу кодирующую ДНК-последовательность промотора гена растения, специфическую в отношении экспрессии в запасающих органах семян; последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность растительного белка, способную направлять указанный белок в эндоплазматический ретикулум (ЕК), или последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, способную направлять белок в пластиду, или последовательность ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, способную заякорить белок в ЕК; последовательность ДНК, кодирующую белок, выбранный из группы, содержащей гены ацетил-СоА-карбоксилазы (АССазы), диацилглицеринацилтрансферазы (ΌΟΑΤ), лизофосфатидатацилтрансферазы (ЬРАТ), фосфатидатфосфогидролазы (РАРазы) ацилпереносящего белка (АСР), малонил СоА: АСР-трансацилазы, кетоацил-АСР-синтазы (КА8), кетоацил-АСР-редуктазы, 3-гидроксиацил-АСР-дегидразы, еноил-АСР-редуктазы, стеароил-АСРдесатуразы, ацил-АСР-тиоэстеразы, глицерин-3-фосфатацилтрансферазы, 1-ацил-§п-глицерин-3фосфатацилтрансферазы, цитидин-5-дифосфатдиацилглицеринсинтазы, фосфатидилглицерофосфатсинтазы, фосфатидилглицерин-3-фосфатфосфатазы, ΕΑΌ1-8 десатуразы, фосфатазы фосфатидной кислоты, моногалактозилдиацилглицеринсинтазы, дигалактозилдиацилглицеринсинтазы, белка биосинтеза сульфолипидов, длинноцепной ацил-соА-синтазы, глицерин-3-фосфатацилтрансферазы (СРАТ), диацилглицеринхолинфосфотрансферазы, фосфатидилинозитсинтазы, ацил-СоА-диацилглицеринацилтрансферазы, ацил-АСР-десатуразы, линеоилдесатуразы, сфинголипиддесатуразы, олеат-12-десатуразы, ацетиленазы для жирных кислот, эпоксигеназы для жирных кислот, диацетилглицеринкиназы, холинфосфатцитидил

- 14 017916 трансферазы, холинкиназы, фосфолипазы, фосфатидилсериндекарбоксилазы, фосфатидилинозиткиназы, кетоацил-СоА-синтазы, фактора транскрипции СЕК, олеозина, 3-кетоацил-СоА-тиолазы, ацил-СоАдегидрогеназы, еноил-СоА-гидратазы, ацил-СоА-оксидазы и сигнал полиаденилирования.

8. Растение по любому из пп.4-7, которое модифицировано генетической трансформацией для устойчивости к насекомым, гербицидам и грибкам.

9. Применение растения по любому из пп.1-8 для получения семян с целью производства табачного масла, жидкого топлива, биодизельного топлива, пищевых добавок для животных, твёрдого топлива, пищевых добавок для людей, смазочных масел.

10. Применение растения по любому из пп.1-6 для получения биомассы для биохимической конверсии или для термохимической конверсии методами прямого сжигания, карбонизации (сухой перегонки), пиролиза, газификации, анаэробного расщепления, аэробного расщепления, спиртовой ферментации или взрывного автогидролиза.

11. Способ получения мутагенизированного растения табака, которое продуцирует количество семян, составляющее по меньшей мере 4000 кг на гектар при плотности посева около 125000 растений на гектар, включающий следующие стадии:

а) осуществление мутагенеза семян, полученных начальным скрещиванием между отдельными растениями одного и того же вида, принадлежащих к дикому типу или к выбранным сортам;

б) проращивание указанных семян и селекция растений М2-М4 поколений в соответствии со следующими показателями:

ί) наличие одного или более внешних фенотипических проявлений признаков, выбранных из следующей группы: высота растения 80-120 см, листья с тонкими пластинками и направленные вертикально, компактное соцветие, число цветков более 100, число коробочек более 100, число семян в коробочке более 5000, одревесневший и сильный стебель, глубокие корни;

ίί) устойчивость выбранного отличительного признака в поколениях после М2;

ш) подтверждение наследования выбранного отличительного признака;

в) отрезание листьев с растений, отобранных на стадии б), индуцирование образования каллуса на мезофилле листа ίη νίΐτο в присутствии фитогормонов, регенерация растений, начиная с каллюса на мезофилле листа, и селекция растений, сохраняющих основные признаки, выбранные на стадии б), в поколениях К0-К2;

г) засевание в открытом поле растений, отобранных на стадии в), и дальнейшая селекция растений, дающих по меньшей мере 4000 кг семян на гектар при плотности посева около 125000 растений на гектар.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что стадия а) заменена следующей стадией:

а') получение мутагенизированных семян с помощью межвидового скрещивания растений рода ΝίοοΙίαηα с последующими обратным скрещиванием отдельных растений Е1 и индукцией амфидиплоидов обработкой колхицином вегетативного апекса растений, полученных в результате указанных скрещиваний.

13. Способ по пп.11 или 12, дополнительно включающий следующие стадии:

д) трансформация растений, полученных на стадии г), с помощью векторов, содержащих кассеты экспрессии, экспрессирующие в растении гены устойчивости к насекомым, гербицидам и/или грибковым заболеваниям, и селекция трансформированных таким образом растений в поколениях Т0-Т4 на устойчивость к насекомым, гербицидам и/или грибковым заболеваниям; и/или

е) трансформация растений, полученных на стадии г), с помощью одного или более векторов, содержащих кассеты экспрессии, экспрессирующие в семенах гены метаболизма жирных кислот, с последующей селекцией трансформированных растений в поколениях Т0-Т4 на такие признаки, как общее содержание масла в семенах и состав жирных кислот в этом масле;

ж) скрещивание растений, полученных на стадиях д) и/или е), и селекция полученного в результате потомства на один или более признаков, выбранных из группы: высокая урожайность семян в количестве более 4000 кг на гектар, содержание масла в семенах выше 42%, йодное число масла, полученного из семян указанного потомства, ниже 120, состав жирных кислот масла, содержащегося в семенах указанного потомства, меняется в зависимости от растения дикого типа, устойчивость к насекомым, устойчивость к гербицидам, устойчивость к грибкам.

14. Семена растений по любому из пп.1-8.

15. Применение семян по п.14 для производства табачного масла, жидкого топлива, биодизельного топлива, пищевых добавок для животных, твёрдого топлива, пищевых добавок для людей.

16. Способ экстракции масла из семян табака по п.14 с выходом масла от 70 до 95% от веса масла, содержащегося в указанных семенах, включающий следующие стадии:

а) механическая экстракция указанного масла прессованием (холодный отжим) в винтовом прессе и получение масла и остатка - жмыха;

б) фильтрование указанного масла, экстрагированного на стадии а) через бумажный или матерчатый фильтр.

17. Способ по п.16, дополнительно включающий следующую стадию:

- 15 017916

в) химическая экстракция остаточного масла, содержащегося в жмыхе, полученном на стадии а), с помощью растворителей.

18. Способ по п.16, дополнительно включающий следующую стадию:

г) рафинация масла, полученного на стадиях а), или б), или в).

19. Масло семян табака, полученное способом экстракции по п.16 или 17, характеризующееся тем, что оно имеет температуру плавления около -18°С.

20. Биодизельное топливо, содержащее масло семян табака по п.14, переэтерифицированное метанолом.

21. Пищевая добавка для людей, содержащая масло семян табака, полученное способом по п.18.

22. Пищевая добавка для животных, содержащая жмых, полученный способом по п.16 на стадии а).

23. Твёрдое топливо, содержащее жмых, полученный способом по п.16 на стадии а).

24. Промышленное смазочное масло, содержащее масло семян табака, полученное способом по любому из пп.16-18.