CN101679994B - 诱变的烟草植物作为种子培养来产生能源、工业和营养用途的油 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及培育一种烟草植物，其通过诱变技术，种间杂交，然后进行多倍体化和重组DNA技术来修饰，其特征为，能够产生非常大量的种子，以及其用作生产能源和工业范畴的油例如燃烧油、生物柴油和润滑油的用途，以及用作动物和人类营养的用途。

Description

诱变的烟草植物作为种子培养来产生能源、工业和营养用途的油
背景技术
烟草最初是作为观赏植物和药用植物被种植的，后来其作为奢侈品被征税而进入人类文化并改变了人类风俗和习惯。
烟草在农业植物中的地位与其他植物农作物不具有可比性，其具有一些特性，例如：
1.它是极少数只以叶子在市场上买卖的植物；
2.它是世界上的主要的非食物性植物，其在全世界的种植范围高于四百万公顷；
3.它在很多国家是非常重要的经济和金融政治工具；
4.它的消费是基于将其叶子转化为烟制品、吸入性粉末和可咀嚼制品；
5.考虑到其麻醉物质特性和其对人类健康的危害，人们一直致力于禁止其使用和生产；
最初通过自然选择和多倍化，后来通过人工选择，烟草属进化为不同的生境，出现了非常多的物种，这全部是基于叶子特性的选择；叶子被认为是该植物的唯一有价值的部分。
最近人们指出烟草除了上述应用以外的用途：
1.从其叶子纯化而生产食物性蛋白质(LongR.C.1979.Tobaccoproductionforprotein.Projectn.03245.NorthCarolinaStateuniversity，RaleighNC)；
2.分离通常存在于叶子中的药理学上有用的活性成分(BaraldiM.etal.2004.PresenzadisostanzeBenzodiazepino-similiinestrattidifoglieditabacco(Nicotianatabacum).AttiIst.Sper.Tab.，23Aprile，Roma，pp.45-52)；
3.生产在经遗传修饰的植物的叶子中或种子中表达的重组蛋白(Twymanetal.2003.Molecularfarminginplants：hostsystemsandexpressiontechnology.TrendsBiotechnol.21：570-578)。
烟草植物具有非常大的叶子面积，其花小，其空气中部分：根的比率在农业植物中是最高的(Went，1957.Theexperimentalcontrolofplantgrowth.pp.343.ChronicaBotanica，Waltham，Mass.)。
考虑到烟草种植所发挥的经济实用性，虽然在年轻人中有令人担忧的增加的烟草成瘾性，欧洲同意了其种植，这产生了经济和伦理上的困惑。
欧洲委员会在其互联网站点上(www.ec.europa.eu/agriculture/publi/fact/tobacco)确认：这种种植物不使用良好土壤，没有经济上有效的替代物可以取代它。种植烟草的动机允许农村组织的生存，并产生工业上的效益，其对于沙漠化威胁的区域的生存作出贡献。
从环境角度来说，使用化石燃料的消极性结果以及石油的有限性需要寻找新的能源资源。在这些之中，生物燃料因其可再生性而成为将来的最佳选择。
考虑到农业来源的生物燃料，至今为止人们的注意力集中在从产生简单的(即蔗糖)或复杂的(即纤维素)糖类的植物中生产生物酒精。用于此种生产的模式植物已经在糖用甘蔗、玉米、小麦、马铃薯、木薯、糖用甜菜、大麦、高粱等中鉴定出来。旨在使发酵过程中乙醇中待转化的生物质(biomass)最大化而培育种植物和旨在使气化过程中所生产的生物燃料或燃气最大化而培育种植物，二者可具有相同的范畴。或者，现今技术旨在从油质或富含油的非油质物种(例如大豆、向日葵、油菜、花生、亚麻、玉米、芝麻、棕榈、棕榈仁、椰子、蓖麻等)中生产燃料油和生物柴油。
用于生产生物燃料的理想物种的选择应该基于满足这样的要求，例如：
1.确定种植物投入和产出之间的净能量获得值，所述计算中包含用于生产农业机械和用于提取和转化/纯化油的能量消耗；
2.确定从支持农业生产中所获得的环境的受益，燃烧后CO2和特别物质(例如PM-10)释放的减少，以及农用化学品例如杀虫剂、除草剂和肥料的使用的限制；
3.具有经济上的竞争性，以及可能地，确定增加系统的经济的社会效益，例如通过间接降低卫生系统的成本，同时考虑到现在所用的燃料能源具有环境成本，而此环境成本在确定成本的时候通常不包括在内；生物燃料应该同时对于成本竞争性方面和环境方面具有优点。
4.可大量获得而不降低食物性可用性；使用传统用于食物生产的农业性植物并不必然使其可用于生产生物燃料，如果不确定从所述植物中来源的食物的减少从而增加原材料的成本。
5.其来源的植物种植物应该涉及不可能用于替代种植物的边缘地带。
在现今技术下，考虑用于生产油的植物为大豆(Glycinemax)，向日葵(Helianthusannuus)，油菜(Brassicanapus)，花生(Arachishypogaea)，蓖麻(Ricinuscommunis)，亚麻(Linumusitatissimum)，玉米(Zeamais)，芝麻(Sesamumindicum)，棕榈(果实，Aracaceae)，棕榈仁(种子，Aracaceae)，干椰子肉(椰子，Cocosnucifera)，红花(Carthamustinctorius)，橄榄(Oleaeuropea)，棉花(Gossypiumsp.)，腰果(Anacardiumoccidentale)，大麻(Cannabissativa)，罂粟(Papaverssp.)，芥菜(Brassicasp.)，葡萄(Vitissp.)，杏(Prunusarmeniaca)，松树(Pinussp.)，坚果(Arganiaspinosa)，鳄梨(Perseaamericana)，杏仁(Prunusamygdalus)，榛实(Corylusavellana)，核桃(Juglansregia)，苦楝树(Azadirachfaindica)，小葵子(Guizotiaabyssinica)，希蒙得木(Simmondsiachinensis)，水稻(Oryzasativa)，南瓜(Cucurbitasp.)，海甘蓝(Crambeabyssinica)。
与此相反，在现有技术中，烟草一直被认为是一种易于产生叶子的农业植物。
文献中仅有三篇论文指出烟草的进一步应用，如下所列，考虑将如今的那些被选择用于生产叶子的烟草的种类作为用于提取油的种子副产品的来源。
特别地，Giannelos等人(Tobaccoseedoilasanalternativedieselfuel：physicalandchemicalproperties.IndustrialCropsandProducts，2002，16：1-9)的宣称“在希腊种子是叶子生产的副产品”提示了使用所述种子用于生产燃料的可能性，描述了使用溶剂从烟草种子中提取油的方法，但是，表明：因为其高碘值的原因，从烟草中提取的油可能不可用作例如生物燃料。
UstaN.(Useoftobaccoseedoilmethylesterinaturbochargedindirectinjectiondieselengine.BiomassandBio-energy，2005，28：77-86)宣称烟草种子油是世界上叶子生产的副产品，评估了世界上由种植烟草生产叶子而来的种子的生产，描述了使用溶剂从种子中提取油。
最后，Patel等人(Productionpotentialandqualityaspectsoftobaccoseedoil.TobaccoResearch，1998，24：44-49)评估了在印度作为叶子的副产品生产烟草种子达到1171kg/ha，油的含量为38重量％，描述了使用溶剂的提取。
油提取的技术过程包括机械(压力)和化学(溶剂)技术。在实践中，经常将这两个系统混合。通常，对于含有20％以上脂肪材料(例如油菜和向日葵)的种子使用机械提取，其中种子的尺寸对于压榨技术来说是合适的。烟草种子，举例来说，由于其非常细小的尺寸，可通过化学处理来提取。
通常，通过机械来提取油的可能性促进了在种子产地的直接提取，因此延及在农场水平的小植物。
对于较低数量的脂肪材料，使用化学提取，其也可用于油渣饼(机械提取后的残余物)以回收机械处理后剩余的6-12％的油。通过使用溶剂(例如己烷)提取的油在用于食物用途的商业化之前需要一个精炼步骤。提取过程的主要产物为粗制油；机械提取进一步产生蛋白质油渣饼，而化学方法产生粉末。后者，用于动物饲养，在油种子经济的生产和加工中占有重要位置。
在一些情况下，生产与蛋白质粉需求相关(例如大豆)。粗制油可通过接下来的一系列物理化学处理进行精馏(例如pH调整、过滤、脱胶、褪色等)，这取决于需要的用途。
整个过程的质量平衡根据物种而变化，举例来说，对于向日葵种子的42％的含油量，可考虑一吨种子(这是主要产品)2.6吨副产品(生物质)，产生420kg的粗制油，580kg的油渣饼，最终获得390kg的精炼油和30kg的加工残留物。考虑到向日葵种子的平均产率为大约2.6t/ha(+/-15％)，可以计算出油的每公顷的产率为大约1吨。这个相关性对于其他物种特别是油菜来说也是正确的，取决于油的百分率。植物油可直接用作燃料来产生热量(烤箱或锅炉)或机械能量产生(发动机)，利用其大约为8500kcal/kg的总发热量；或者经过酯基转移作用被转化为生物柴油。
可通过常规燃烧器(将工业柴油或加热柴油替换为植物油)在锅炉中使用植物油。这种方案似乎非常有意思，因为：(i)取代的化石燃料的价格通常与自动发动机柴油的价格非常近似，且被征收高额消费税；(ii)在燃烧器中使用油需要生物具有非常简单的农业能量线程，其可在乡村环境中直接终止，其中燃料生产者和燃料使用者彼此位置非常近甚至可以通信。当在本地使用生物燃料时，油提取过程的较高或较低的容易性是另一个重要的考虑方面。生产经济和或多或少的能量平衡主要取决于每公顷燃料油的产量。
另一个方面，在柴油发动机中使用植物油需要以甲醇和一些脂肪酸组合物进行一个酯基转化的化学过程，这可总结为碘值必须等于或小于120。植物油经常被用于食物范畴。取决于该植物，产物可以主要被用于食物或能源范畴，或二者均有。
考虑到上述的问题，十分需要为了经济范畴和人类无害而使烟草工业进行再循环利用。
因此鉴定出烟草的其他的和经济上的有效用途确实成为一个清楚的世界范围内感兴趣的经济话题。
发明内容
本发明公开了一种烟草植物，其适合于非常大量的生产该植物的特别部分：种子。所述植物已经通过体外体细胞、化学或物理诱变技术和/或种间杂交和后续染色体复制实现。可选地，所述植物通过遗传工程技术进一步修饰。在现今技术中对烟草植物的选择总是朝着叶子作为最终产物的方向进行的；以前从来没有人建议人们的注意力集中于为了种子生产最大化来选择植物，从而允许叶子生产被破坏但是可使种子生产最大化。
令人惊奇的发现，对于烟草植物的选择，通过使用非生物技术(化学的、物理的和体外体细胞诱变技术)以及不同种间杂交的技术，然后进行双二倍体诱导，并且可选地，通过重组DNA技术，可以获得具有以下特性的烟草植物：
-它们具有将烟草农业植物从生产叶子的植物转化为生产种子的植物的理想特性；
-它们具有生产多达20公担/公顷(quintals/hectare)至50公担/公顷，或多至70公担/公顷，甚至是90公担/公顷的种子的能力，并在种子/公顷产率方面具有进一步改进的可能性；
-它们具有多达38％或多达40％，或多达48％，或多达52％，或多达58％，甚至是多达60％的种子重量的种子油含量；
-它们对于抵抗寄生虫和杂草的农业经济学投入必需性较低。
此外，完全没有预料到的是，由于烟草植物的种子尺寸较小(其在种植的植物中是最小的种子之一)，本发明表明有可能通过压榨而从种子中提取油，产率达到种子中总油量的大约80％，种子中总油量的大约90％，甚至是种子中总油量的大约95％，因此使得进行为农场使用而在小的工厂进行提取成为可能。
因此，本发明的目的是：通过诱变和/或种间杂交然后进行二倍体化和选择而产生的烟草植物，其特征为，它们产生至少20公担/公顷的种子数量，所述植物可选地通过遗传工程进行进一步修饰；所述植物用于生产种子的用途，用于生产油及其衍生物的用途；所述植物用于产生用于生物化学或热化学转化的生物质(biomass)的用途；产生和选择所述植物的方法；所述植物的种子及其用于生产油及其衍生物的用途；源自所述种子的油；从所述种子获得的生物柴油；源自烟草的食物添加剂；包含来自压榨烟草种子而产生的油渣饼的固体燃料；通过压榨从烟草中提取油的方法。
附图说明
图1.通过化学诱变、种内和种间杂交、多倍化、选择、体细胞克隆变异的诱导、遗传转化而获得的烟草植物的一般特征；旨在使每单位面积的种子生产最大化，且具有高含油量并具有适合于用作能量来源的特性，用于工业和人类和动物营养的用途。主要的诱导的和选择的特性：深且宽的根器官；细和直立的矛尖形叶子；健壮的茎，在底部具有长的节间；密集肉穗花序，宽阔或柱状；蒴果具短梗，不开裂，二或多室，顶端直，每个蒴果至少有5,000枚种子；种子卵圆形或椭圆形，长度大于1mm；植物高度介于50至120cm，昆虫抗性、杀虫剂抗性、真菌抗性、干旱抗性，脂肪酸含量比率可变。
图2.使用螺旋压榨机mod.Komet(IBG)进行压榨而获得的油和油渣饼产物的例子。压榨以后，在纸上过滤油，其具有高脂特性。
具体实施方式
因此，本发明涉及实现烟草属的植物作为生产种子的理想植物，从中可获得燃料油、生物柴油、蛋白质、用于动物技术、用于工业用途或人类食物用途的油。
可用作实现本发明植物的亲代植物可以是烟草属的品种，例如，包含下列物种：普通烟草(N.tabacum)、黄花烟草(N.rustica)、粉蓝烟草(N.glauca)、圆锥烟草(N.paniculata)、奈特氏烟草(N.knightiana)、茄叶烟草(N.solanifolia)、贝纳米特氏烟草(N.benavidesii)、心叶烟草(N.cordifolia)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、蓝烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、耳状烟草(N.otophora)、赛特氏烟草(N.setchellii)、粘烟草(N.glutinosa)、波叶烟草(N.ondulata)、阿伦特氏烟草(N.arentsii)、芹叶烟草(N.wigandioides)、三叶草烟草(N.trigonophylla)、帕尔梅里烟草(N.palmeri)、林烟草(N.sylvestris)、蓝格斯多夫烟草(N.langsdorffii)、花烟草(N.alata)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、博内里烟草(N.bonariensis)、长花烟草(N.longiflora)、蓝茉莉烟草(N.plumbaginifolia)、残波烟草(N.repanda)、斯托克通氏烟草(N.stocktonii)、内索菲拉烟草(N.nesophila)、夜花烟草(N.moctiflora)、茸毛烟草(N.tomentosiformis)、耳状烟草(N.otophora)、赛特氏烟草(N.setchellii)、心叶烟草(N.glutinosa)、碧冬烟草(N.petunioides)、丛生烟草(N.acaulis)、阿米基诺氏烟草(N.ameghinoi)、渐尖叶烟草(N.acuminata)、少花烟草(N.pauciflora)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、摩西氏烟草(N.miersii)、伞状烟草(N.corymbosa)、狭叶烟草(N.linearis)、斯佩格茨烟草(N.spegazinii)、毕基劳氏烟草(N.bigelovii)、克里夫兰氏烟草(N.clevelandii)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、海滨烟草(N.maritima)、颤毛烟草(N.velutina)、革西氏烟草(N.gossei)、高烟草(N.excelsior)、麦格隆息丰烟草(N.megalosiphon)、稀少烟草(N.exigua)、古特斯皮德氏烟草(N.goodspeedii)、因古儿巴烟草(N.ingulba)、斯迪诺卡帕烟草(N.stenocarpa)、西方烟草(N.occidentalis)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、迪勃纳氏烟草(N.debneyi)、本塞姆氏烟草(N.benthamiana)、香烟草(N.fragrans)、香甜烟草(N.suaveolens)、奥图系佛里烟草(N.obtusifolia)。
根据本发明，植物将通过诱变技术来获得，所述诱变技术允许培育能够产生比起始个体的平均数高的种子数量。诱变可通过以标准的化学和/或物理技术来处理烟草种子来诱导，也可以通过体外培植来诱导体细胞克隆变体。还可以通过中间杂交然后用秋水仙碱化学处理而进行染色体系的二倍化(为了避免种间杂交所显示的不育事件)产生杂交的植物，从而获得较高的种子产量。可以通过化学和/或物理标准技术对种间杂交所产生的植物进行进一步诱变。
一旦获得了突变体，将为生产种子对它们进行选择，从而分离并选择出每种植公顷能够产生至少20公担种子的植物。
因此根据本发明，植物将由以下方式产生的种子而获得：
1.在同种个体间进行杂交；或
2.在具有相同染色体数目的不同种个体(例如普通烟草x克里夫兰氏烟草)间进行杂交；或者，其中在所述杂交之后进行胚胎培植方法和使用本领域普通技术人员熟知的技术通过诱导剂秋水仙碱处理进行多倍体诱变，以获得双二倍体；或
3.在具有不同染色体数目的不同种间(例如普通烟草x三叶草烟草)进行杂交，然后进行胚胎培植方法和使用本领域普通技术人员熟知的技术通过诱导剂秋水仙碱处理进行多倍体诱变，以获得双二倍体。
如上所述，当没有二倍体化诱导时，如在1和2中，种子将通过化学和/或物理技术诱变；当染色体数目的突变被二倍体话诱导时，如在2和3中，选择将基于所述突变的种子进行或基于对所述种子进行进一步化学和/或物理技术诱变而进行。技术人员可以使用的标准的诱变技术，举例来说，例如以乙基甲烷磺酸盐(EMS)处理种子(例如在浓度为0.5％的水溶液中)并将EMS与种子保持接触不定的时间，例如在实施例1中所指明的，或者例如已经对于秋水仙碱所讲过的，来诱导多倍体化，通过在合适的场地进行X或伽玛射线，或，总之，根据文献中已有的用于植物诱变或进行大规模筛选的任何程序。经此处理的种子将能够萌发，将根据如下特性选择M2代植物：花序形状、蒴果数目、每个蒴果的种子数目、种子尺寸、叶子形状、根器官的尺寸、叶子的形态等。
根据本发明，将选择具有如下特性的植物：植物高度为80-120cm，叶子具有薄而直的形态，紧密花序，花的数目为100以上，蒴果数目为100以上，每个蒴果的种子数目为5000以上，木质化和强壮的茎，根深。
所选植物产生的种子数量将在开阔的场地进行验证，只有每公顷产生至少20公担种子，且种子密度为大约125,000至250,000植物/公顷的植物被选择。
通过化学和物理诱变和通过体细胞诱变，获得了不同种类的突变体，因此增加了发现所需要变体的可能性。作为一个例子，一种具有直立叶子形态的毛尖叶子的突变体可以增加种子密度而不危害光的摄取(光的摄取对于光合作用活性是重要的)因此增加了每公顷的种子产量。举例来说，一种具有较深的根器官的突变体能够更好的附着植物并给植物更好的营养。举例来说，具有紧密花序和较多数目蒴果的突变体能够增加每个单独植物的种子数量。
因此本发明包含所获得和选择的每公顷产生20公担或20公担以上数量种子的植物。本发明所述植物经过修饰以产生每种植公顷多达90公担的种子数量，因此每种植公顷有20、30、40、50、60、70、80、90公担，与此对比，那些为了生产叶子而选择的烟草植物通常为10-12。
本发明所述植物还可以通过体细胞克隆变体诱导而获得，其中可以用次氯酸钠处理上述种子，然后用70％乙醇处理，从所述种子萌发而来的植物中取下叶子，诱导愈伤组织，在体外繁殖不定的时间，因此从所述部分诱导出来。来自所述愈伤组织的植物具有不定的特性如：花序形状，蒴果数目，每个蒴果的种子数目，种子尺寸，叶子形状，根的尺寸，叶子形态，种子产量，种子含油量，油的脂肪酸组成，种子的蛋白质含量等。基于上述的参数可以选择所述植物。
可根据以下特性的存在可以进一步选择本发明所述植物：种子含油量百分比，油的脂肪酸组成，种子的蛋白含量等。
如果所述特性不存在于所选择的突变体中的话，可通过重组DNA技术来改变上述植物以获得更优秀的特性，这些特性例如：种子含油量百分比的增加，基于油用途的脂肪酸的不定的组成，除草剂抗性，真菌抗性等。
为了对本发明所述植物进行遗传转化，可以使用合适的用于植物细胞转化的载体以及允许在植物中表达目的基因的表达框。取决于目的基因是否是在植物的绿色部分被表达(即寄生虫或杀虫剂抗性基因)或在种子中被表达(即参与脂肪酸代谢的基因)，可以选择本领域已知的载体来确保所述基因组目的器官被表达。因此，可以使用本领域已知的具有组成型启动子，或具有诱导型启动子的载体，例如使用通过寄生虫攻击或在形成的蒴果中的载体。特别地，由于本发明所述的植物是为了生产高产量的种子而被选择的，作为具有特别意义的所述种子的产物，那些含有种子特异性表达框的载体将是特别合适的，所述种子特异性表达框将保证异源插入的基因组本发明所述植物的种子中表达。
对于遗传转化，可以使用根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或物理DNA转移系统。
在本发明的一个具体实施方式中，优选的是实现不仅种子产量高的植物，而且具有昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性、干旱抗性的植物，这将显著性降低培育投入，因此增加培育的生产力并减少环境的影响。
在这种情况下，可以使用这样的载体：其含有卡那霉素抗性基因作为标记，含有允许目的基因的组成型表达的调剂区域(例如35S或泛素启动子)，所述目的基因为例如苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)的cry基因，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的aroA基因，奥图系佛里烟草(N.obtusifolia)的Rpt1基因。以相同的顺序，所述基因允许植物分别对下列产生抗性：昆虫、除草剂、真菌病，所述基因可通过技术人员已知的标准基因转移技术导入。
可以在一个或多个转化事件之后通过各载体导入抗性，或者，由于植物可以容易地进行杂交的事实，可以单独地在所选同一品种的不同个体间导入抗性，然后通过杂交将其在同一个体中组装。
在这种情况下，通过来自体外花粉囊培养的单倍体的复制来获得纯合子是容易的。
可以通过与代谢工程目的类似的方法来进行遗传转化，所述代谢工程目的为增加种子中积累的油数量和修饰脂肪酸代谢途径。在这种情况下，可以使用具有种子特异活性的调节区域，例如球蛋白启动子，将酶蛋白导向内质网，在内质网它们可稳定插入特异信号例如KDEL，或者从内质网它们可被转位至质体，插入氨基酸特异性信号，例如小RuBisCO亚单元的引导序列。
举例来说，油的数量和脂肪酸的组成可通过改变编码以下酶的表达来改变：例如，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二乙酰甘油乙酰转移酶(DGAT)、卵磷脂乙酰转移酶(LPAT)、磷脂磷水解酶(PAPase)、乙酰蛋白转运体(ACP)、丙二酰辅酶A:ACP转酰酶、酮乙酰-ACP合成酶(KAS)、酮乙酰-ACP还原酶、3-羟基乙酰-ACP脱氢酶、烯酰ACP还原酶、硬脂酰-ACP去饱和酶、乙酰-ACP硫酯酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、1-乙酰-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶、胞苷-5-二磷酸-二酰基甘油合成酶、磷脂酰甘油磷酸合成酶、磷脂酰甘油-3-磷酸磷酸酶、FAD1-8去饱和酶、磷脂酸磷酸酶、单半乳糖基二酰基甘油合成酶、双半乳糖二酰基甘油合成酶、硫脂生物合成蛋白、长链乙酰辅酶A合成酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、二乙酰甘油胆碱磷酸转移酶、磷脂酰肌醇合成酶、乙酰辅酶A二酰基甘油酰基转移酶、乙酰-ACP去饱和酶、亚麻酰去饱和酶(lineoyldesaturase)、鞘脂去饱和酶、油酸酯12-去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂肪酸环氧化酶、二乙酰甘油激酶、胆碱磷酸盐胞嘧啶核苷酸转移酶、胆碱激酶、磷脂酶、磷脂酰丝氨酸脱羧酶、磷脂酰肌醇激酶、酮脂酰辅酶A合成酶、CER转录因子、油质蛋白(Oleosin)、3-酮脂酰-辅酶A硫解酶、乙酰辅酶A脱氢酶、烯脂酰辅酶A水合酶、乙酰辅酶A氧化酶。
根据本发明，可通过确定烟草的乙酰CoA羧化酶或另一个品种(例如油菜)的同种酶的过表达来获得总的种子含油量的增加。作为例子，可以通过反义构建体的表达来使编码质体和内质网的油酸盐去饱和酶的基因沉默，从而获得脂肪酸的改变并因此获得碘值的改变。本发明所述植物的种子中的一个或多个所述基因的表达或沉默产生这样的结果：所述种子产生的油可以直接用于生产生物柴油，因为其碘值低于或等于120。
所述基因的表达还可以影响种子中油的百分比，为了种子的含油量达到大约种子重量的38％、40％、48％、52％、58％甚至是60％，可进一步选择本发明所述植物。
上述基因可导入载体而进行种子特异性表达，例如在专利申请WO03073839中所描述的，按照所述申请中教导的方法。因此用于所述具体实施方式的表达载体包含：a.为了在种子贮藏器官中表达的植物基因特异性启动子；b.编码植物蛋白的信号序列的DNA序列，所述信号序列能够指导目的基因通过内质网进入种子贮藏器官；c.编码所述目的基因的DNA序列，其中除去天然信号序列；d.终止信号。启动子和引导序列可以属于例如7S大豆球蛋白或β伴球蛋白(conglycinin)大豆基因，或属于编码烟草种子贮藏蛋白的基因。
上述基因可以在一个或多个转化事件之后被导入，或以几个载体通过转化导入，或者，由于植物可以容易地进行杂交，可以单独地在所选同一品种的不同个体间导入所述基因，然后通过杂交将其在同一个体中组装。
在这种情况下，通过体外培养另一个中植物而获得单倍体的复制来获得具有所有特性的纯合子是容易的。
表1.仅通过诱变选择/通过工程化然后选择从而改变脂肪酸代谢途径，以及为了特性的稳定性而选择，如此获得的一些烟草变体的脂肪酸含量。表中指出通过诱变和通过引入所列举的一些用于改变酸性组成的基因进行基因干涉而获得的结果；最后三栏的油的碘值适合于将所述油转化为生物柴油。
成分 PLT 103 PLT 256 PLT 318 PLT 335
棕榈酸 6,31％ 8,26％ 7,15％ 17,20％
棕榈油酸 0,11％ 0,18％ 0,18％ 1,25％
硬脂酸 2,58％ 5,20％ 8,50％ 12,50％
油酸 12,62％ 22,58％ 25,56％ 53,27％
亚油酸 77,48 58,78％ 52,00％ 6,45％
亚麻酸 0,65％ 4,15％ 5,25％ 7,80％
花生四烯酸 0,13％ 0,85％ 0,80％ 0,85％
二十碳酸 0,13％ 0,58％ 0,56％ 0,68％
本发明的目的还在于如上所述的植物的种子，即，变异植物的种子，也将变异并因此含有将其与野生型种子区分开的DNA的修饰。此外，如上所述，与其亲代植物相比，所述种子可以具有不同的染色体数目(例如多倍体)，在大多数情况下，也可以通过上述载体进行转化。
当使用上面列举的那些表达与脂肪酸代谢相关基因的载体进行转化时，所述种子将具有如下特征：其含有低于或等于120的碘值的油，且油的百分比介于种子总重量的38％至60％。
本发明的目标还在于产生本发明所述植物的方法，所述方法包含以下步骤：
a)将由属于野生型的相同种的个体进行起始杂交而产生的种子或所选择的变体进行诱变；
b)使所述种子萌发，根据以下参数选择M2-M4代的植物：
i)具有可在表型水平证明的特性，该特性选自：植物高度为80-120cm，叶子具有薄而直的形态，紧密花序，花的数目为100以上，蒴果数目为100以上，每个蒴果的种子数目为5000以上，强壮和木质化的茎，根深；
ii)M2代之后的子代中所选特性的稳定性；
iii)测试所选特性的遗传性；
c)使步骤b)中所选的种子萌发，在植物激素存在的情况下，从体外诱导叶子叶肉获得的愈伤组织出发再生出植物，在R0至R2代中选择那些保持了在步骤b)中所选的特性的植物；
d)在开阔场地中种植步骤c)中所选的植物，选择那些每公顷产生至少20公担的植物。
在所描述的方法中，步骤a)中所获得的植物还可通过如下步骤获得：
a’)在烟草属中进行种间杂交，然后进行F1回交，或通过秋水仙碱处理植物营养性顶端从而诱导双二倍体。
对于上述方法中获得的植物可进行进一步的步骤e)和/或f)，并进行g)，如下所述：
e)使用载体对步骤a至d或a’至d获得的植物进行遗传转化，所述载体包含在植物中表达昆虫、除草剂和/或真菌病抗性的基因的表达框，所述基因选自：苏云金杆菌的cry基因，鼠伤寒沙门氏菌的aroA基因，奥图系佛里烟草(N.obtusifolia)的Rpt1基因；并在T0至T4代中选择具有昆虫、除草剂和/或真菌病抗性的转化的植物；
f)使用一个或多个载体对步骤a至d或a’至d获得的植物进行遗传转化，所述载体包含在种子中表达脂肪酸代谢的基因的表达框，所述基因选自：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二乙酰甘油乙酰转移酶(DGAT)、卵磷脂乙酰转移酶(LPAT)、磷脂磷水解酶(PAPase)、乙酰蛋白转运体(ACP)、丙二酰辅酶A:ACP转酰酶、酮乙酰-ACP合成酶(KAS)、酮乙酰-ACP还原酶、3-羟基乙酰-ACP脱氢酶、烯酰ACP还原酶、硬脂酰-ACP去饱和酶、乙酰-ACP硫酯酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、1-乙酰-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶、胞苷-5-二磷酸-二酰基甘油合成酶、磷脂酰甘油磷酸合成酶、磷脂酰甘油-3-磷酸磷酸酶、FAD1-8去饱和酶、磷脂酸磷酸酶、单半乳糖基二酰基甘油合成酶、双半乳糖二酰基甘油合成酶、硫脂生物合成蛋白、长链乙酰辅酶A合成酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、二乙酰甘油胆碱磷酸转移酶、磷脂酰肌醇合成酶、乙酰辅酶A二酰基甘油酰基转移酶、乙酰-ACP去饱和酶、亚麻酰去饱和酶、鞘脂去饱和酶、油酸酯12-去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂肪酸环氧化酶、二乙酰甘油激酶、胆碱磷酸盐胞嘧啶核苷酸转移酶、胆碱激酶、磷脂酶、磷脂酰丝氨酸脱羧酶、磷脂酰肌醇激酶、酮脂酰辅酶A合成酶、CER转录因子、油质蛋白(Oleosin)、3-酮脂酰-辅酶A硫解酶、乙酰辅酶A脱氢酶、烯脂酰辅酶A水合酶、乙酰辅酶A氧化酶；然后在T0至T4代中选择具有特性的植物，例如种子的总的含油量和脂肪酸组成的转化的植物；
g)将步骤a至f或a’至f获得的材料进行杂交，并选择具有特性的子代，例如：种子生产力高、种子含油量高、取决于想要的用途的不同的脂肪酸组成、昆虫抗性、除草剂抗性、真菌抗性。
在步骤b和f之间获得的植物可以根据一些特性的存在进行选择，例如，所述特性可以通过化学分析进行，如种子的总含油量和/或种子的单个酸性成分含量和/或种子的蛋白含量。
本发明的另一个目的是一种从烟草种子中提取油的方法，其中油的产量等于所述种子中含油量的70-95％，该方法包括以下步骤：
a)通过压榨机械提取所述的种子，从而产生油和残余油渣饼；
b)用纸或布过滤器过滤步骤a)中所产生的油；
令人惊奇的是，上述方法的产率在70％以上，这是对像烟草这么小的种子使用压榨方法完全不能预料到的产率。在本发明中，其旨在为了增加每株植物的烟草油产量而选择具有高种子产量的植物，这样的发现，即压榨烟草种子的产率与压榨大尺寸种子的产量相当，这是非常有利的应用。
考虑现有技术的状况，除了生产成本低以及完全没有预料到的产率外，所述方法允许直接在可以用于能源范畴的地方直接提取烟草油。
在一个具体实施方式中，本发明所述种子可以使用进行装载了种子的螺旋压榨机或另一种压榨机进行冷压榨。当稳定运行时，压榨机可以达到高达60℃的温度，收集从种子中压榨出来的油，并在纸或布过滤器上进行过滤。可以使用其他的适合种子压榨的系统来压榨烟草种子。
为了进一步改善本发明所述方法(其中最大可能的开发种子的油产量)的产率，可能进行另一个步骤：
c)将步骤a)中获得的油渣饼中存在的残余油与溶剂进行化学提取。
表2.通过压榨种子和过滤而获得的烟草油的特性。本表格指出了其与其他的植物油相比较高的总发热量，较低的硫含量，较低的粘度。
测定 结果 单位. 方法
燃烧点 236.0 ℃ UNI EN ISO 27 192005
硫 ＜0.01 ％m/m ISO 8754 1992
灰 0.005 ％m/m EN ISO 6245 2002
50℃时的粘性系数 21.630 mm2/s UNI EN ISO 3104 200
熔点 -18 ℃ ISO 3016 199410 -->
燃烧值 9,670 Kcal/Kg ASTM D240-97
15℃时单位体积质量 925.0 Kg/m3 UNI EN ISO 3675 2002
皂化值 193.6 mg KOH/g ASTM D94-02
本发明的目的还在于本发明所述植物和/或其种子在制备液体或固体燃料、生物柴油、工业润滑剂、塑料材料例如油布、饲养动物的食品添加剂、人类使用的食品添加剂的用途。
事实上，本发明所述植物确实显示出非常利于生产所述产品的特性，例如：
-它们产生通过压榨而获得的理想的可用于燃烧的油，也不需要精炼，因为简单的过滤就足够了，因为其具有清澈的外貌，40℃时为29.11mm2/s的运动粘性系数和50℃时为21.63mm2/s的运动粘性系数，0.01％以下的含硫量，属于非常好的物理和热动力性特性的类别；
-即使在本发明最简单的具体实施方式中，即不需要为了表达如上所述的脂肪酸代谢的基因的转化，它们可产生通过压榨种子而获得的可用于生产生物柴油的油，一旦与25％的棕榈油或者是其他百分比的具有低碘值的植物油混合来将碘值降低至120以下；在包含表达一个或多个所述基因(其旨在改变脂肪酸代谢)的具体实施方式中，可直接用于转化成碘值等于120，或更好是等于100，或更好是等于80的生物柴油；
-它们从压榨种子中产生油渣饼，具有大约6-12％不等的含油量和大约35％的蛋白含量，由于其较高的ω6脂肪酸(亚油酸)含量，可用于饲养动物的理想的添加剂；
-它们从压榨种子中产生油渣饼，由于其4950KCal/kg以上的发热量，除了作为饲养动物的用途外，还可用作煤炭或生物质颗粒工厂的固体燃烧物；
-它们产生的油具有236℃的燃烧点和-18℃的熔点因此适合于用作非污染性润滑剂，例如用于链锯或作为一般的润滑剂；
-它们产生对人类重要的油，考虑到其富含人类必需的聚合不饱和脂肪酸(C18:2，PUFA)，因此为健康范畴所需(ω6)，可用于食物或作为人类的食品添加剂；
-它们在收获种子后产生残余的生物质(叶子、茎、花、蒴果的包被)，这些可达到每公顷100公担的量，或更高为每公顷200公担，或再更高为每公顷300公担，还有可能再改善每公顷的产量；
-它们产生的残余生物质可用于其通常的用途，例如，气化、燃烧、高温分解、无氧消化、发酵或蒸汽爆炸，因此对改善了培养物的经济产率；
因此，本发明的目的是本发明所述植物通常用于大规模生产烟草种子的用途。
本发明的目的是所述植物和/或种子用于生产烟草油的用途。
本发明的目的还在于植物和/或种子在制备用于锅炉或柴油机发动机的基于烟草油或实质上烟草油组成的燃料中的用途。
在本发明的特别优选的具体实施方式中，所述烟草油通过本发明所述压榨方法获得而不是通过溶剂提取获得。
本发明所述提取方法实际上允许产生可直接用作燃料的油，因为所述油具有40℃时为29.11mm2/s的运动粘性系数和50℃时为21.63mm2/s的运动粘性系数，这使其在燃烧器中呈雾状而不需要液体化预先加热处理。
本发明的目的还在于本发明所述植物和/或种子在制备生物柴油中的用途，通过将烟草种子油与例如25％的棕榈油或者是其他百分比的植物油混合而降低最终碘值。可通过将上述方法(压榨)所提取的烟草油与能够降低其碘值至等于或低于120的植物油混合来生产本发明所述生物柴油。
本发明的目的还在于本发明所述植物和/或种子在制备具有等于或低于120的碘值的烟草种子油中的用途，其中不进行任何旨在降低本发明所述方法所提取的油的碘值的程序。在本发明的这个具体实施方式中将使用那些表达一个或多个上面所列脂肪代谢基因的转基因植物和/或转基因种子，其产生的烟草油具有等于或低于120的碘值。
在这种情况下，因此，不要在本发明所述压榨之后进行任何旨在降低所获得的油的碘值的精炼或处理过程。根据本发明所述的生物柴油因此可以具有100％的烟草油组成。将通过本领域技术人员已知的程序使用甲醇通过正常酯基转移来获得生物柴油。
在本发明一个具体实施方式中，生物柴油完全由烟草油组成，所述烟草油的碘值在120以下，或甚至等于或低于100，或甚至等于或低于80，所述油通过本领域技术人员已知的方法使用甲醇进行酯基转移。
本发明的目的还在于本发明所述植物和/或种子在制备用于煤炭或生物质颗粒加工工厂的固体燃料中的用途。在这种情况下，可以使用从培育所得到的生物质，所述生物质的发热量在4200Kcal/kg以上。
本发明的目的还在于上述可获得的燃料，即包含从烟草种子压榨所获得的油渣饼的燃料。
或者，本发明所述植物和/或种子可用于制备动物饲养的食品添加剂。从压榨本发明所述烟草种子所获得的油渣饼具有油渣饼重量的大约6％至大约12％含油量和油渣饼重量的大约35％的蛋白含量，以及较高的ω6脂肪酸(亚油酸)含量，这使其对于这个使用范畴是理想的。在培养小猪的试验中，在等蛋白食物中用3％至7％不等的烟草油渣饼替换大豆蛋白没有显示出动物发育的显著区别。
在本发明的另一个具体实施方式中，本发明所述植物和/或种子可用于制备非污染性润滑油。举例来说，使用本发明所述方法从产生本发明所述种子的植物(无其它修饰，除了对于出现基本特性及种子产量高而作的突变)中获得的油已经显示出236℃的燃烧点和-18℃的熔点，这些特点使其适合于用作例如非污染性润滑剂例如用于链锯或一般的发动机。
在另一个具体实施方式中，本发明所述植物和/或种子可用于制备人类用途的食物或食品添加剂。
在这种情况下，由本发明所述方法获得的油将进行进一步精炼以出去蜡、树脂、复杂碳水化合物、磷脂并进行脱酸。一旦精炼即可这样使用或用作人类的食品添加剂。所述用途的优点由所述油富含聚合不饱和脂肪酸(C18:2，PUFA)的特点所提供，聚合不饱和脂肪酸对于人类是必不可少的，对于健康也是需要的(ω6)。
显而易见的是所有的设想烟草种子油(优选通过压榨获得)或从压榨种子所获得的油渣饼的具体实施方式也可以通过非诱变烟草植物来进行。显而易见，本发明所述植物的不容置疑的优点明显由以下提供：在相当的种植区域内使用相当的种植方法种植，与可以从野生型植物和烟草种子获得的产率相比，本发明所述植物及其种子产生较高的种子产量以及较高的可获得的产物产率。
本领域中从来没有揭示烟草油用于制备润滑剂和人类及动物食品添加剂的用途。显而易见，也从来没有描述那些通过压榨而没有进一步处理的油具有等于或低于120的碘值的具体实施方式。
本发明所述植物，还具有收获以后能够达到每公顷100至300公担的残余的生物质(叶子、茎、蒴果和花包被物)；因此本发明的目的在于，本发明所述植物用作生物质来源以进行现有技术中描述的气化、燃烧、高温分解、无氧消化、有氧消化、发酵或蒸汽爆炸过程从而进一步增加培育的经济产率。
本发明的目的还在于：使用本发明所述提取方法从本发明所述植物中获得的烟草种子油；通过酯基转移从所述油获得的生物柴油；包含所述油的燃料；从所述油精炼得到的人类食品添加剂；含有所述油的润滑剂；可以通过本发明所述方法从本发明所述植物中获得的烟草植物油，其特征在于不加入其它用于降低碘值的油即具有等于或低于120的碘值；包含所述油的具有等于或低于120的碘值生物燃料。
实施例
实施例1
化学诱变
将选作进行化学诱变的品种的种子置于100ml的烧瓶中，每个实验中20gr，对应于大约200,000个种子。向烧瓶中加入50ml的去离子水，种子在25℃进行再水化14小时。然后用0.5％的EMS水溶液替代水。使用磁铁振荡种子持续0.5至5小时的不等时间，取决于在预先试验中该品种显示出较强的形态学特征的突变频率，如植物高度、种子尺寸、叶子形状、蒴果数目、每个植物的种子产量等。
一旦处理结束，将种子倒进细筛子从而丢弃诱变溶液，在流水中润洗几分钟。然后，在烧瓶中润洗种子6次，每次润洗在烧瓶中加入50ml水并振荡10分钟。
然后再过滤纸上干燥种子，送去专业的公司粒化。
粒化的种子的最终尺寸为1.2mm，直接用于在场地中播种(M1)，密度为每公顷100,000植物。使M1代开花，然后检查可能存在的显性突变体，一旦种子成熟，手工收获每个植物的蒴果以获得完整的种子，以用于下一年开阔场地播种的以及M2代的表型筛选。每个感兴趣的突变进行单独的筛选并在接下来的子代中控制。
实施例2
体细胞克隆变异诱导
将选作诱导体细胞克隆的种子品种浸没于20％的次氯酸盐溶液中5分钟进行杀毒，然后浸没在70％乙醇中1分钟，然后以无菌水洗涤5次。使种子在含有琼脂化MS培养基，每边长10cm、高度为12cm的矩形塑料容器中发育。从完全发育的植物中切取每片叶子0.5cm的部分并置于含有MS1(MS+1mg/lt2，4-D)的皮氏培养皿中，以诱导愈伤组织的形成。也使用种间杂交获得的F1个体。将从叶子培养皿中收集的愈伤组织置于250ml的含有50ml的液态MS1培养基的烧瓶中，在16小时光周期的28℃中转动板上以80rpm振荡。
将愈伤组织保持在液体培养中进行几代，每20天更新培养物，将2.5ml的前次培养物接种到新的50ml液态培养基烧瓶中。在每一代，将愈伤组织的一部分分布于含有琼脂化MS2培养基(MS+1mg/lNAA+1，5mg/l激动素)的皮氏培养皿以诱导萌芽的形成，一旦达到2cm的长度即转移到MS3培养基(MS+1mg/lIBA)以生根及为了后续转移到温室中罐子内。基于叶子尺寸、叶子形状、蒴果尺寸、每个蒴果的种子数目、种子含油量等在R1和R2代中筛选所获得的变异。
实施例3
杂交及染色体复制
很多烟草属与普通烟草是有性相容的，即使杂交产物是不育的，也可能使亲代作为授粉者进行回交或诱导双二倍体的形成。由于可以获得成千上万个体的属间杂交F1群体，从而允许进行基于双二倍体的改善，这促进了这种物种下的工作。杂交既使用具有相同染色体数目的亲代烟草属(例如圆锥烟草x茄叶烟草；普通烟草x黄花烟草)也使用具有不同染色体数目的烟草属(例如普通烟草x圆锥烟草；普通烟草x长花烟草)进行。将一些由杂交组合获得的F1个体在温室中培养，以确定其表型特征并将其与两个亲代植物杂交，并允许其在体外发育和微繁殖。在萌芽繁殖期或，移植到罐子中开花之前，使用秋水仙碱处理微繁殖的材料来进行染色体复制试验。将发育的种子的萌芽在基部切割并转移到含有2mg/升的苯甲基氨基嘌呤(BAP)的MS培养基中。在大约4-5周后，将所形成的侧部萌芽切除并保持在同样的培养基中。为了获得整株植物，在不含激素的培养基上进行转移以诱导根的形成。从切下的萌芽被转移到生根培养基中几天后，加入1滴0.5％的秋水仙碱溶液。一旦植物生根及将其转移到温室中的罐子并使其开花以确定其可育性和形成重要种子的能力。在一些情况中，为了允许不同种之间的杂交，需要进行异倍体的复制以在同源四倍体上进行杂交。
筛选通过回交子代获得的材料或通过体外繁殖然后进行染色体复制获得的材料的表型特性，可选地将其用于遗传改造程序。
在稳定的双二倍体株系中使用根尖进行染色体数目的控制。
实施例4
根瘤农杆菌介导的遗传转化
第一天：将小数量的EHA105菌株的根瘤农杆菌(其含有目的质粒，以无菌操作从皮氏培养皿中培养物收集)接种到2ml的无菌LB培养基中。然后，收集不显示变异而另一方面显示出理想的紧涨度(turgidity)条件的健康植物的叶子。将叶子在双蒸水中简单润洗以出去表面杂质，浸在20％次氯酸钠0.1％SDS溶液中8分钟，然后再无菌通风厨中干燥。所有后续操作都在无菌条件下进行。特别地，将叶子浸在95％乙醇中并振荡以使两个面都完全湿润，持续30～40秒。然后使叶子完全干燥。
使用乙醇灭菌的打孔机从所有叶子的表面取得小圆盘，置于含有MS10(MS10不含抗生素)的培养板中；具体地，放入不超过30片小圆盘。然后，向培养板中倒入2ml的LB加农杆菌(新鲜接种的)，轻轻的转动使细菌悬浮液均匀分布以获得在小圆盘上匀质的细菌分布。以移液器小心地洗掉多余的LB。没有加入任何东西或只加入LB作为阴性对照。
然后在28℃孵育培养板24-48小时，恒定光照，通过所有的培养板上细小不透明光环的出现来指示细菌的生长。
第二天：将叶子小圆盘小心地转移到含有MS10+500mg/l头孢噻肟(cephotaxime)的培养板中，在28℃恒定光照下孵育6天。此步骤确定将农杆菌灭活。
第8天：将叶子小圆盘小心地转移到含有MS10+500mg/l头孢噻肟+200mg/l卡那霉素的培养板中，在28℃恒定光照下孵育14天。这个步骤确定转化植物的选择，因为插入农杆菌质粒中携带卡那霉素抗性基因。
第22天：将同时生长而形成愈伤组织叶子小圆盘小心地转移到含有MS10+500mg/l头孢噻肟+200mg/l卡那霉素+500mg/l羧苄青霉素的培养板中，孵育6天。这个步骤确保出去可能在抗生素处理之前存活的农杆菌。
第28天：将叶子小圆盘再次转移到含有MS10+500mg/l头孢噻肟+200mg/l卡那霉素的培养板中，孵育直至出现萌芽。一旦在至少两片叶子上出现萌芽，即将其从愈伤组织块中分离并转移到生根培养基MSO+500mg/l头孢噻肟+200mg/l卡那霉素中。
一旦出现根，即将小植物从培养板中提取出来，从琼脂残余中释放出来，轻轻地在流水中润洗，种植于小的塑料罐子的土壤和沙子(2∶1)中。沙子预先经过水饱和，然后，以塑料透明盖子将罐子盖上以保持高的湿度条件，将其置于25℃生长房间，每日日照期为16小时。在所有的植物上收集叶子部分(250mg)来筛选转基因的出现，提取DNA进行第一次PCR分析，然后在阳性植物上进行Souhtern分析来确定转基因的拷贝数。
实施例5
从种子中提取油
将一些选择的品种所产生的烟草种子用于生产油。在一种情况下，所分析的种子具有7.01％的水分和39.4％的脂肪质含量(以己烷提取)。使用人工装载烟草种子的螺旋压榨机mod.Komet(IBG，Germany)以冷提取来进行油的提取。在平稳状态下，压榨机达到并维持60℃的温度。压榨之后将油在纸上过滤，表现出高度清澈的特性。经证明提取油的产率为种子中总含油量的81.1％。残余的油渣饼具有0.74％的含油量和34.5％的蛋白含量。
实施例6
燃烧测试
在氢氧化钠存在下使用甲醇将实施例5中冷提取并经纸过滤器过滤的油进行酯基转移反应。将油加热至55℃，加入甲醇-氢氧化钠溶液并混合90分钟。在此步骤结尾，冷却之后，使混合物分层因此将酯和低甘油层分开。用水将酯洗涤两次，在第一次洗涤中向水中加入磷酸(2.5ml/升)。在过程结尾，在90℃真空加热油以除去所有的残余水，所获得的酯被命名为TOE(TobaccoOilEster的缩写，烟草油酯)。使用间接注射柴油发动机进行试验(细节：4个汽缸，旋转注射泵，压缩率21.5∶1，最大功率：4500rpm时55kW)。在燃烧试验之前，确定分析参数，例如50℃时粘性系数(21.63mm2/s)、熔点(-18℃)、总发热量(9,760Kcal/kg)、15℃的单位质量(925.0kg/m3)、硫(＜0.01％m/m)、灰(0.005％m/m)。在试验中使用气体分析器和水压功率计。油脂与20％的柴油混合使用，其与TEO(括号中所示)的主要特性对比如下：密度840.8(886.6)，40℃时粘性系数2.9(3.3)，含硫量(mg/kg)6,750(6)。使用两个产品的发动机表现的测试结果没有显示出可检测到的区别，当柴油中加入TEO时显示出更完全的燃烧从而有更高的发热效率。2,200rpm时最大功率与纯柴油相比，增加了3.5％(29.86kW相对于28.85kW)。与单独柴油相比，混合物所产生的CO更低，含硫量也更低，这决定了SO2排放也降低(至40％)。
实施例7
动物饲养试验
分析从压榨烟草种子获得的油渣饼以评价其用作动物饲养中的蛋白食品添加剂的合适性。从压榨得到的油渣饼的分析数据表明：脂肪质含量为10.74％，蛋白含量为34.5％，湿度和挥发性物质含量为5.97％。样品水解后总的氨基酸为：天门冬氨酸2.40％、苏氨酸1.06％、丝氨酸1.17％、谷氨酸5.53％、脯氨酸0.83％、甘氨酸1.29％、丙氨酸1.18％、缬氨酸1.27％、蛋氨酸0.45％、异亮氨酸1.13％、亮氨酸1.84％、酪氨酸0.97％、苯丙氨酸1.43％、组氨酸0.72％、赖氨酸0.72％、精氨酸3.36％。在总的脂肪质含量中，76.59％为亚油酸，属于ω6类，其对于动物食物是非常相关的。
以起始体重为大约8kg的小猪进行饲养试验，其被分成两组，每组20只，对照组(C)以含有大豆蛋白添加物的食物饲养，第二组(T)以与第一组具有相同蛋白量的食物喂养，其中大豆部分被3％的烟草油渣饼替换。以油渣饼处理的动物在最初以及在摄取所述食物的测试全过程中没有显示出任何问题。持续监视测试过程，小猪没有传播胃肠疾病。动物显示出不同的每日体重增加(烟草油渣饼组为237gr/头/天，大豆油渣饼组为170gr/头/天)，最终，27天后，T组重量为15.2kg，C组为12.8kg。

Claims (14)

1.一种产生烟草植物的方法，其中在种植密度为每公顷125000株植物时所述烟草植物每公顷产生的种子数量至少为2000千克，该方法包括以下步骤：
a)在烟草属中进行种间杂交，然后进行F1个体回交，并通过秋水仙碱处理通过该杂交产生的植物的营养性顶端诱导双二倍体，从而产生种子；
b)使所述种子萌发，根据以下参数选择M2-M4代的植物：
i)具有可在表型水平证明的下列特性：植物高度为80-120cm，叶子具有薄而直的形态，紧密花序，花的数目为100以上，蒴果数目为100以上，每个蒴果的种子数目为5000以上，强壮和木质化的茎，根深；
ii)M2代之后的子代中所选特性的稳定性；
iii)测试所选特性的遗传性；
c)使步骤b)中所选的种子萌发，在植物激素存在的情况下，从体外诱导叶子叶肉获得的愈伤组织出发再生出植物，在R0至R2代中选择那些保持了在步骤b)中所选的特性的植物；
d)在开阔场地中种植步骤c)中所选的植物，进一步选择那些在种植密度为每公顷125000株植物时每公顷产生至少2000千克的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在种植密度为每公顷125000株植物时所述烟草植物每公顷产生的种子数量至少为5000千克或7000千克或9000千克。
3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
e)使用载体对步骤d)中获得的植物进行遗传转化，所述载体包含在植物中表达昆虫、除草剂和/或真菌病抗性的基因的表达框；并在T0至T4代中选择具有昆虫、除草剂和/或真菌病抗性的如此转化的植物，和/或；
f)使用一个或多个载体对步骤d)中获得的植物进行转化，所述载体包含在种子中表达脂肪酸代谢的基因的表达框；然后在T0至T4代中选择具有特性的转化的植物，所述的特性如种子的总的含油量及其脂肪酸组成；
g)将步骤e)和/或f)中获得的植物进行杂交，并在所产生的子代中选择具有种子生产力高，每公顷在2000千克以上以及一个或多个选自下列特性的子代：种子含油量在42％以上；从所述子代中获得的种子中获得的油的碘值在120以下；相对于野生型植物来说，所述子代中含有的油的脂肪酸组成是改变的；具有昆虫抗性；具有除草剂抗性；具有真菌抗性。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤e)中的转化利用一个或多个包含种子特异性表达框的载体而进行，所述表达框从5’到3’方向包含：
编码启动子的DNA序列，所述启动子为了特异在种子贮藏器官中表达植物基因；编码植物蛋白的信号序列的DNA序列，所述信号能够将所述蛋白指引至内质网(ER)；编码信号序列的DNA序列，所述信号序列能够将蛋白指引至质体或能够将蛋白锚定至ER；编码选自下列的蛋白的DNA序列：乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二乙酰甘油乙酰转移酶(DGAT)、卵磷脂乙酰转移酶(LPAT)、磷脂磷水解酶(PAPase)、乙酰蛋白转运体(ACP)、丙二酰辅酶A:ACP转酰酶、酮乙酰-ACP合成酶(KAS)、酮乙酰-ACP还原酶、3-羟基乙酰-ACP脱氢酶、烯酰ACP还原酶、硬脂酰-ACP去饱和酶、乙酰-ACP硫酯酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、1-乙酰-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶、胞苷-5-二磷酸-二酰基甘油合成酶、磷脂酰甘油磷酸合成酶、磷脂酰甘油-3-磷酸磷酸酶、FAD1-8去饱和酶、磷脂酸磷酸酶、单半乳糖基二酰基甘油合成酶、双半乳糖二酰基甘油合成酶、硫脂生物合成蛋白、长链乙酰辅酶A合成酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、二乙酰甘油胆碱磷酸转移酶、磷脂酰肌醇合成酶、乙酰辅酶A二酰基甘油酰基转移酶、乙酰-ACP去饱和酶、亚麻酰去饱和酶、鞘脂去饱和酶、油酸酯12-去饱和酶、脂肪酸乙炔酶、脂肪酸环氧化酶、二乙酰甘油激酶、胆碱磷酸盐胞嘧啶核苷酸转移酶、胆碱激酶、磷脂酶、磷脂酰丝氨酸脱羧酶、磷脂酰肌醇激酶、酮脂酰辅酶A合成酶、CER转录因子、油质蛋白、3-酮脂酰-辅酶A硫解酶、乙酰辅酶A脱氢酶、烯脂酰辅酶A水合酶或乙酰辅酶A氧化酶；以及多聚腺嘌呤化信号。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中获得的植物用于生产用于生产烟草油、燃料油、生物柴油、动物食品添加剂、固体燃料、人类食品添加剂、润滑油的种子。
6.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中获得的植物用于生产用于生物化学转化或通过直接燃烧、碳化、高温分解、气化、无氧消化、有氧消化、酒精发酵或蒸汽爆炸程序用于热化学转化的生物质。
7.一种从根据权利要求1至4任一项所述的方法获得的植物的烟草种子中提取油的方法，其中所述烟草种子具有多达38％或多达40％，或多达48％，或多达52％，或多达58％，甚至是多达60％的种子重量的种子油含量，油的产率为所述种子中含油量的70％至95％，该方法包括以下步骤：
a)通过螺旋压榨机械提取所述种子油，获得油和残余油渣饼；
b)用纸或布过滤器过滤步骤a)中所提取的油。
8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括以下步骤：
c)使用溶剂来化学提取步骤a)中获得的油渣饼中存在的残余油。
9.根据权利要求7或8所述的方法，进一步包括以下步骤：
d)将步骤a)或b)，以及c)中获得油精炼。
10.根据权利要求7至9任一项所述的方法获得的烟草种子的油在制备生物柴油中的用途，其中所述烟草种子的油经过甲醇的酯基转移反应。
11.通过权利要求9所述的方法获得的烟草种子油在制备人类食品添加剂中的用途。
12.一种动物用途的食品添加剂，其特征在于，其包含通过权利要求7至9任一项的步骤a)中获得的油渣饼，其中所述油渣饼中脂肪质含量为10.74％，蛋白含量为34.5％，湿度和挥发性物质含量为5.97％。
13.一种固体燃料，其包含通过权利要求7至9任一项的步骤a)中获得的油渣饼，其中所述油渣饼中脂肪质含量为10.74％，蛋白含量为34.5％，湿度和挥发性物质含量为5.97％。
14.权利要求7至9任一项中获得的烟草种子油在制备工业润滑剂中的用途。
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