CN110484561A - 一种应用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法。本发明首先选取了gRNA靶点sgRNA1和sgRNA2，然后以pRGEB32‑GhU6.9‑NPTII载体为基础，将融合后的sgRNA1和sgRNA2插入pRGEB32‑GhU6.9‑NPTII载体的BsaI位点；将构建好的载体转化感受态大肠杆菌，涂布在含有卡那霉素的培养基平板上进行筛选，挑取单菌落培养，PCR鉴定，培养sgRNA1和sgRNA2序列正确的单克隆，提取质粒，然后采用农杆菌介导的方式转化至棉花中，筛选获得FAD2基因发生突变的转基因棉花植株，转基因棉花种子中的油酸含量显著提高，亚油酸含量显著降低。

Description

一种应用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法
技术领域
本发明涉及一种应用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
棉花是世界上最重要的天然纤维作物，同时也是重要的食用油和蛋白来源。棉仁中油份含量为15-40％，棉籽油为世界第五大食用植物油，仅次于大豆、棕榈、油菜和油葵，也是我国棉花主产区居民消费的主要食用植物油。棉籽脂肪酸成分主要包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。相对于其它植物油，其棕榈酸含量较高，使其具有较好的稳定性和起酥性，能够延长煎炸食品货架期；亚油酸含量高，具有能降低血液胆固醇、预防动脉粥样硬化的作用。但是，亚油酸的不饱和程度高，性质不稳定，热稳定性及抗氧化性能都比较差，不耐储存，高温烹调时易变质。油酸(C18:1)作为单不饱和脂肪酸，具有较高的稳定性且在烹调过程中不易产生反式脂肪酸，受到广大消费者青睐，被营养学界誉为“安全脂肪酸”。市场上常见的橄榄油和茶籽油，油酸含量均达到70％以上，但价格昂贵。因此，培育高油酸棉花可极大地提升棉籽的综合利用价值，是棉花育种的重要目标。
Δ12-脂肪酸脱饱和酶(FAD2)是催化油酸脱氢形成亚油酸的关键酶，也是多不饱和脂肪酸代谢途径的限速酶。研究表明抑制FAD2基因的表达，能够降低Δ12-脂肪酸脱饱和酶的活性，致使种子中油酸含量增加。美国杜邦(DuPont)公司利用RNAi技术干扰FAD2基因的表达，将大豆油酸含量由21％提高到77％。2014年美国Cellectis公司研究人员利用TALENs技术靶向敲除大豆FAD2-1A和FAD2-1B，纯合双突变体的油酸含量由20％提高到80％，亚油酸含量由50％降至4％，极大地改善了大豆油的品质。澳大利亚CSIRO的研究人员设计了带有硬脂酸酰基转运蛋白基因(ghSAD-1)和油酰卵磷脂基因(ghFAD2-1)2个基因反向重复片段及种子特异表达启动子(Soybean lectin promoter,Lec-P)的干涉载体，转化Coker315后，硬脂酸和油酸含量分别增加到40％和77％。另外利用棉花FAD2-1基因构建的ihpRNA载体进行转化，创造出油酸含量达58.5％～68.9％的棉花种质材料。进一步通过加代选择，已获得2个表现稳定的棉花高油酸品系High-Oleic和Mono-Cott，油酸含量分别达到77％和81％。中国农业大学同时构建了种子特异性启动子NAPIN调控的棉花FAD2-1基因的ihpRNA和amiRNA干扰载体并进行了棉花遗传转化，旨在提高油酸含量，改善棉籽油品质。截止目前，除澳大利亚CSIRO以外，国内外尚未获得高油酸含量的棉花新种质材料。
RNAi方法有时存在基因沉默不彻底，后代沉默效果易减弱，遗传不够稳定等问题。CRISPR-Cas系统是近年涌现出的一种简单高效的基因组编辑技术。通过对DNA序列进行特异性切割和修复，实现基因定点突变、敲除和插入等。目前已在水稻、小麦、玉米、高粱、大豆、拟南芥、烟草等多种植物中得到应用。在棉花上，华中农业大学和中国农业科学院棉花研究所等单位率先建立了棉花CRISPR-Cas基因编辑系统。但目前尚未见到利用CRISPR-Cas9技术提高棉花油酸含量的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种应用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法。本发明首先选取了gRNA靶点sgRNA1和sgRNA2进行融合，然后以pRGEB32-GhU6.9-NPTII为载体，构建CRISPR/Cas9系统对棉花FAD2基因进行定点编辑，从而得到转基因棉花植株。经试验证明：转基因棉花种子中的油酸含量显著提高，亚油酸含量显著降低。
本发明选择对目的基因FAD2进行定点突变，所述基因FAD2的序列信息来自于陆地棉标准系TM-1参考基因组数据库(http://www.cottonfgd.org/)。陆地棉是异源四倍体，FAD2基因在陆地棉基因组中含有2个拷贝，A亚基因组为Gh_A13G1850，D亚基因组中为Gh_D13G2238，其编码序列(cds)如SEQ No.1-2所示。
本发明的技术方案是：一种利用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，具体是利用CRISPR/Cas9系统对棉花FAD2基因进行定点编辑从而得到转基因棉花植株，主要包括以下步骤：
1)gRNA靶点选择
以棉花FAD2基因(Gh_A13G1850和Gh_D13G2238)为靶基因，利用在线软件CRISPR-Pv2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)筛选靶点，选取靶位点sgRNA1和sgRNA2(SEQNo.3-4)；
所述sgRNA1序列为：5’-CCATTCCGCCCCACTGTTTTCGC-3’；
所述sgRNA2序列为：5’-CCGTCACCACTCGAACACCGGTT-3’。
2)双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
以pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体为基础，将融合后的sgRNA1和sgRNA2插入pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体的BsaI位点；将构建好的载体转化感受态大肠杆菌，涂布在含有卡那霉素的培养基平板上进行筛选，挑取单菌落培养，PCR鉴定，培养sgRNA1和sgRNA2序列正确的单克隆，提取质粒，然后采用农杆菌介导的方式转化至棉花中，筛选获得FAD2基因发生突变的转基因棉花植株，转基因棉花种子中的油酸含量显著提高，亚油酸含量显著降低。
进一步的，采用重叠延伸PCR方法来融合sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1和sgRNA2融合采用的接头引物如SEQ No.5-8所示。
进一步的，所述农杆菌为农杆菌GV3101，所述的感受态大肠杆菌为感受态大肠杆菌DH5α。
进一步的，所述的转化至棉花中为转化至棉花下胚轴小段；进一步的，所述的棉花为陆地棉。
本发明的有益效果是：
1、棉花FAD2基因含有2个保守结构域，分别为DUF3474(PF11960)和FA_desaturase(PF00487)，靶点sgRNA1位于DUF3474结构域内，其PAM序列为CCA，而靶点sgRNA2位于FA_desaturase结构域内，其PAM序列为CCG。本发明的方法以pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体，上述载体利用tRNA-gRNA融合，可以把多个tRNA-gRNA串联为polycistron(多顺反子)，可以同时编辑多个靶位点；载体中的U6启动子为棉花GhU6-9的启动子。本发明采用sgRNA1、sgRNA2靶点及pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体构建的双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，可以稳定高效的对陆地棉FAD2基因进行编辑，在提高棉花的油酸含量方面具有良好的应用前景。
2、本发明首次利用CRISPR-Cas9技术对陆地棉FAD2基因进行定点突变，创制高油酸棉花新材料，通过实验证明，利用基因编辑技术对棉花FAD2基因进行定点突变后，确实能够显著提高棉花种子中的油酸含量(油酸含量67.36％-77.72％，提高了4.83-5.58倍)，显著降低亚油酸含量(亚油酸含量为5.78％-13.37％，下降了4.76-11.01倍)，因此，本发明的方法在提高棉花的油酸含量和降低亚油酸含量方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为棉花FAD2基因编辑载体构建示意图；
图2为华棉1号(HM1)的遗传转化图；图2中从左到右依次为下胚轴小段侵染、愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤分化、再生苗生根培养和移栽前炼苗。
图3为转基因棉花单株的PCR检测结果；B：空白对照；N：阴性对照；P：构建好的载体质粒；
图4为转基因棉花单株的PCR产物基因编辑结果解析；
图5棉花种子脂肪酸含量检测结果柱形图。
具体实施方式
实施例1：CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
1、gRNA靶点选择
以棉花FAD2基因(Gh_A13G1850和Gh_D13G2238)为靶基因，利用在线软件CRISPR-Pv2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)筛选的靶点，选取靶位点sgRNA1和sgRNA2。棉花FAD2基因含有2个保守结构域，分别为DUF3474(PF11960)和FA_desaturase(PF00487)，靶点sgRNA1位于DUF3474结构域内，其PAM序列为CCA，而靶点sgRNA2位于FA_desaturase结构域内，其PAM序列为CCG；
所述sgRNA1序列为：5’-CCATTCCGCCCCACTGTTTTCGC-3’；
所述sgRNA2序列为：5’-CCGTCACCACTCGAACACCGGTT-3’。
2、双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
sgRNA1和sgRNA2的接头引物：根据设计的靶位点合成构建载体相关引物，见表1：
表1 pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体靶点接头引物
sgRNA1和sgRNA2的组装：利用重叠延伸PCR融合sgRNA1和sgRNA2，PCR反应体系为20μl，包括10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture(2mmol/L each)0.3μl、F引物(10μmol/L)0.2μl、R引物(10μmol/L)0.2μl、rTaq DNA polymerase(1U/μL)0.2μl和ddH2O 17.1μl。
pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体酶切：酶切体系为100μl，包括pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体质粒10μg，10×cut smart buffer 10μl，内切酶BsaI 4μl，于37℃水浴中酶切5.5小时，回收酶切产物。
靶点与载体的连接：将100ng组装好的双靶点序列和BsaI酶切后的100ngpRGEB32-GhU6.9-NPTII载体混合，加入0.5μl T4 DNA连接酶，于37℃水浴中连接30min，从而得到棉花FAD2基因的CRISPR/Cas9编辑载体(图1)。
转化大肠杆菌感受态细胞：将上一步的连接产物与感受态大肠杆菌DH5α混合，冰上放置30min，42℃热激90s。转化后涂布在含有卡那霉素的培养基平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落培养，PCR鉴定，培养sgRNA1和sgRNA2序列正确的单克隆，提取质粒，转化农杆菌GV3101。
实施例2：基因编辑棉花植株的获得
1、无菌受体材料的准备
以陆地棉品种华棉1号(HM1)的种子为材料，硫酸脱绒后剥去种壳，先用70％的乙醇溶液灭菌1分钟，然后浸泡于0.1％的升汞(HgCl2)灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，接种于种子萌发培养基上，22-28℃下暗培养3-5天后待用。
种子萌发培养基为：1/2MS培养基大量元素+15g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝胶Phytagel，pH值为5.8-6.0。
2、供体农杆菌GV3101的培养
将携带双靶点sgRNA1和sgRNA2的根癌农杆菌GV3101接种在LB固体培养基平板上，28℃下暗培养36-48小时。利用无菌牙签挑取长势良好的单菌落，接种至LB液体培养基中，28℃振荡培养(200转/分钟)过夜，待菌株进入对数生长期(OD600值在0.5左右)备用。
LB固体培养基为：蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+15g/L琼脂+NaCl 10g/L+50mg/L卡那霉素+20mg/L利福平，pH值为7.2；
LB液体培养基为：蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+NaCl 10g/L+50mg/L卡那霉素+20mg/L利福平，pH值为7.2。
3、侵染与共培养
将无菌HM1棉苗的下胚轴切成0.6-0.8厘米的小段，浸泡在农杆菌GV3101菌液中8分钟，然后利用无菌滤纸吸干下胚轴小段上的菌液，置于铺有一层无菌滤纸的共培养培养基上，22-25℃培养2天。
共培养培养基为：MS无机盐(MS培养基的大量元素+微量元素+铁盐)+B5有机物(肌醇100mg/L+烟酸1.0mg/L+盐酸吡哆醇1.0mg/L+盐酸硫铵10mg/L)+0.1mg/L 2.4-D+0.1mg/LKT+30g/L葡萄糖+6.5g/L琼脂，pH值为6.0。
4、愈伤组织的诱导与继代
将共培养的下胚轴小段转移至愈伤诱导培养基上，于28℃和16小时光照条件下培养，待愈伤组织长至2-3厘米时，将其从胚轴小段上切下，转入相同培养基进行继代增殖(图2)。愈伤诱导培养基为：MS无机盐+B5有机物+0.1mg/L 2.4-D+0.1mg/L KT(激动素)+0.91g/L MgCl2+2.0g/L Gelrite(植物凝胶)+50mg/L Km(卡那霉素)+500mg/L Cef(头孢菌素)+30g/L葡萄糖，pH值为6.0。
5、胚性愈伤组织的诱导、分化和再生
待愈伤组织块直径达到7-8毫米时转入胚性愈伤组织诱导培养基上，于28℃和16小时光照条件下培养，一个月更换一次培养基，直至愈伤组织呈现米粒状，颜色为黄绿色或灰绿色。其后，将胚性愈伤转移至分化培养基中，进一步形成胚状体和幼苗，最后将发育正常的幼苗转移至生根培养基，直至根系发达健壮，炼苗后转入营养土中培养成株。
胚性愈伤组织诱导培养基为：MS无机盐+B5有机物+1.9g/L KNO3+0.91g/L MgCl2+2.0g/L Gelrite+30g/L葡萄糖，pH值为6.0。
分化培养基为：MS无机盐(去除NH4NO3)+B5有机物+1.9g/L KNO3+0.5g/L天氡酰胺+1.0g/L谷氨酰胺+0.91g/L MgCl2+2.5g/L Gelrite+30g/L葡萄糖，pH值为6.0。
生根培养基为：1/2MS无机盐+1/2B5有机物+15g/L葡萄糖+2.0g/L植物凝胶Phytagel，pH值为6.0。
实施例3：转基因棉花植株的PCR检测
1、转基因棉花植株的DNA提取
采用天根生化科技(北京)有限公司的“多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)”提取T0代转基因棉花叶片中的DNA。具体包括以下步骤：
(1)分别剪取各个转基因棉花单株和野生型棉花(HM1)的新鲜幼嫩叶片80-100mg，立即加入液氮充分研磨，将研磨好的粉末转移至编号后的1.5ml离心管中；
(2)迅速加入400μl缓冲液GPS和10μl RNase A(10mg/ml)，迅速涡旋混匀后，将离心管置于65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管5次以更好地混合样品；
(3)加入100μl缓冲液GPA，涡旋振荡1min，12000rpm离心5min，转移上清至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，然后12000rpm离心1min，转移滤液至新的1.5ml离心管中；
(4)加入等体积的无水乙醇，充分混匀，可见絮状沉淀；
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀转移至RNase-Free吸附柱CR2中(吸附柱CR2放在收集管中)，12000rpm离心1min，倒掉废液，吸附柱CR2放在收集管中；
(6)向RNase-Free吸附柱中加入550μl去蛋白液RD(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中；
(7)向RNase-Free吸附柱CR2中加入700μl漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉废液，将RNase-Free吸附柱CR2放入收集管中；
(8)重复步骤7；
(9)将RNase-Free吸附柱CR2放回收集管中，12000rpm离心2min，弃收集管，然后将RNase-Free吸附柱CR2转移至新的1.5ml离心管中，室温晾干5-10min；
(10)在RNase-Free吸附柱CR2中加入80μl洗脱缓冲液TB，室温放置3-5min，12000rpm离心2min，倒掉废液，将溶液收集到离心管中，置于-20℃冰箱中备用。
2、转基因棉花植株的PCR检测
以各个转基因棉花单株、野生型棉花HM1和载体质粒的DNA为模板，引物设计为重组载体上的选择标记基因NPTⅡ。
(1)引物序列见表2；
表2 转基因棉花PCR检测的引物序列
(2)PCR反应体系为20μl，包括DNA样品1μl、10×PCR buffer 2μl、dNTP mixture(2mmol/L each)0.4μl、NPTII-F(10μmol/L)0.2μl、NPTII-R(10μmol/L)0.2μl、rTaq DNApolymerase(1U/μL)0.2μl和ddH2O 16μl。
(3)PCR反应程序：94℃，3min；30cycles(94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s)；72℃，10min；25℃，1min。
(4)PCR检测结果：利用选择标记基因NPTII的特异性引物对获得的33株转基因棉花进行PCR检测，其中22株为阳性转化植株(图3)。
实施例4：转基因阳性棉花单株的FAD2基因编辑位点检测
1、靶位点区段的PCR扩增
利用高保真聚合酶Max DNA Polymerase(Takara，大连)扩增FAD2基因(Gh_A13G1850和Gh_D13G2238)，2个FAD2基因靶位点区段特异引物见表3。PCR反应体系为20μl，包括DNA样品1μl、PrimeSTAR Max Premix(2×)10μl、F引物(10μmol/L)0.2μl、R引物(10μmol/L)0.2μl和ddH2O 8.6μl。PCR反应程序：30cycles(98℃，10s；55℃，5s；72℃，10s)；25℃，1min。
表3 靶位点区段特异引物
PCR产物测序分析：对扩增得到的各个转基因棉花单株的PCR产物进行测序分析，利用在线软件DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)解码测序结果，结果发现存在多种编辑类型，包括单碱基插入、单碱基缺失和多碱基缺失等，其中单碱基插入和缺失为主要类型(图4)。
实施例5：转基因阳性棉花单株的脂肪酸含量检测
利用高分辨质谱测定了转基因棉花和野生型棉花种子的脂肪酸含量，主要包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。结果表明转基因棉花阳性单株T0代种子中的油酸和亚油酸含量发生显著变化。野生型棉花种子的油酸和亚油酸含量分别为13.94％和63.62％，而FAD2基因编辑棉花的油酸含量为67.36％-77.72％，提高了4.83-5.58倍；亚油酸含量为5.78％-13.37％，下降了4.76-11.01倍(图5)。这些结果证明：利用基因编辑技术对棉花FAD2基因进行定点突变后，确实能够显著提高棉花种子中的油酸含量，显著降低亚油酸含量。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东棉花研究中心
<120> 一种应用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法
<130> 0
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 陆地棉FAD2基因的编码序列Gh_A13G1850.1
<400> 1
aatcgagttc cgatcgagaa gcctccgttt acgctcggtc agatcaagca agccattccg 60
ccccactgtt ttcgccgctc cctccttcga tccttctcct acgtggtcca tgacctatgc 120
ttagcctctc tcttttacta cattgcaaca tcatattttc actttctccc acaacccttt 180
tcctacattg cttggcctgt ctattgggtt ctccaaggtt gcatcctcac cggtgtttgg 240
gtcatcgcac acgagtgcgg tcaccacgct ttcagtgact accaatgggt tgacgacacc 300
gtcgggttga tccttcattc cgccctttta gtcccgtact tctcgtggaa aatcagtcac 360
cgccgtcacc actcgaacac cggttccatg gagcgtgacg aagtattcgt gcccaaaccc 420
aagtctaaat tatcatgctt tgcgaaatac ttaaacaatc cacccggtcg agttctatct 480
cttgtagtca cattgactct tggttggcct atgtacttag ccttcaacgt ttcgggtcga 540
tactatgatc gattagcttc ccactataac ccttatggcc ccatttactc cgatcgcgag 600
aggctacaag tttacatctc cgatactggt atatttgcgg taatttatgt actttataag 660
attgctgcaa caaaagggct ggcttggctt ttatgcactt atggggtgcc tctacttatt 720
gtgaatgcct tccttgtgtt gatcacctac ttgcaacata ctcactcggc attgccgcat 780
tatgactcgt ccgaatggga ttggttgcga ggagcattgt cgacgatgga tcgagatttc 840
ggggtgttga acaaagtgtt ccataacatc accgatacgc atgttgctca tcacctcttc 900
tcaacgatgc cacattatca tgcaatggag gccactaaag caatcaaacc aatactcggc 960
aagtattatc ctttcgacgg gacaccgatt tacaaggcaa tgtggaggga ggcaaaagag 1020
tgcctttacg ttgagcctga cgttggtggt ggtggtggtg gtagcaaagg tgttttttgg 1080
tatcgtaaca agttctaa 1098
<210> 2
<211> 1152
<212> DNA
<213> 陆地棉FAD2基因的编码序列Gh_D13G2238.1
<400> 2
atgggtgccg gtggtaggat gccaattgac ggtataaagg aggaaaatcg aggctcggtc 60
aatcgagttc cgatcgagaa gcctccgttt acgctcggtc agatcaagca agccattccg 120
ccccactgtt ttcgccgctc cctccttcga tccttctcct acgtggtcca tgacctatgc 180
ttagcctctc tcttttacta cattgcaaca tcatattttc actttctccc acaacccttt 240
tcctacattg cttggcctgt ctattgggtt ctccaaggtt gcatcctcac cggtgtttgg 300
gtcatcgcac acgaatgcgg tcaccacgct ttcagtgact accaatgggt tgacgacacc 360
gtcgggttga tccttcactc cgccctttta gtcccgtact tctcgtggaa aatcagtcac 420
cgccgtcacc actcgaacac cggttccatg gagcgtgacg aagtattcgt gcccaaaccc 480
aagtctaaat tatcatgctt tgcgaaatac ttcaacaatc cacccggtcg agttctctct 540
cttgtagtca cattgactct tggttggcct atgtacttag ccttcaacgt ttcgggtcga 600
tactatgatc gattagcttc ccactataac ccttacggcc ccatttactc cgaacgcgag 660
aggctacaag tttacatctc cgatgctggt atagttgcgg taatttatgt actttataag 720
attgctgcaa caaaagggct ggcttggctt ttatgcactt atggggtacc tctacttatt 780
gtgaatgcct tccttgtgtt gatcacctac ttgcaacata ctcactcggc attgccgcat 840
tacgactcgt ctgaatggga ttggtttcga ggagcattgt cgacgattga tcgagattac 900
ggggtgttga acaaagtgtt ccataacatc accgatacgc atgtggctca tcacctcttc 960
tcaacgatgc cacattatca tgcaatggag gccactaaag caatcaaacc gatactcggc 1020
aagtattatc ctttcgacgg gacaccgatt tataaggcaa tgtggaggga ggcaaaagag 1080
tgcctttacg tcgaggctga cgttggtggt ggtggtagca aaggtgtttt ttggtatcgt 1140
aacaagttct aa 1152
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 靶点sgRNA1序列
<400> 3
ccattccgcc ccactgtttt cgc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 靶点sgRNA2序列
<400> 4
ccgtcaccac tcgaacaccg gtt 23
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体靶位点sgRNA1接头引物FAD2-1R
<400> 5
gcgaaaacag tggggcggaa tgcaccagcc gggaat 36
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体靶位点sgRNA1接头引物FAD2-1F
<400> 6
ttccgcccca ctgttttcgc gttttagagc tagaaata 38
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体靶位点接头sgRNA2引物FAD2-2R
<400> 7
aaccggtgtt cgagtggtga tgcaccagcc gggaat 36
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体靶位点sgRNA2接头引物FAD2-2F
<400> 8
tcaccactcg aacaccggtt gttttagagc tagaaata 38
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 基因NPTII引物NPTII-F
<400> 9
actgggcaca acagacaatc g 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 基因NPTII引物NPTII-R
<400> 10
gcatcagcca tgatggatac ttt 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶位点区段特异引物FAD2A-F
<400> 11
taggatgcta gttgacggta a 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶位点区段特异引物FAD2A-R
<400> 12
attaccgcaa atataccagt 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶位点区段特异引物FAD2D-F
<400> 13
taggatgcca attgacggta t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 靶位点区段特异引物DAD2D-R
<400> 14
attaccgcaa ctataccagc 20

Claims (6)

1.一种利用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，其特征是，利用CRISPR/Cas9系统对棉花FAD2基因进行定点编辑从而得到转基因棉花植株，主要包括以下步骤：
1)gRNA靶点选择
以棉花FAD2基因为靶基因，筛选到靶点为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1序列为：5’-CCATTCCGCCCCACTGTTTTCGC-3’；
所述sgRNA2序列为：5’-CCGTCACCACTCGAACACCGGTT-3’。
2)双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
以pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体为基础，将融合后的sgRNA1和sgRNA2插入pRGEB32-GhU6.9-NPTII载体的BsaI位点；将构建好的载体转化感受态大肠杆菌，涂布在含有卡那霉素的培养基平板上进行筛选，挑取单菌落培养，PCR鉴定，培养sgRNA1和sgRNA2序列正确的单克隆，提取质粒，然后采用农杆菌介导的方式转化至棉花中，筛选获得FAD2基因发生突变的转基因棉花植株。
2.如权利要求1所述的一种利用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，其特征是，采用重叠延伸PCR方法来融合sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1和sgRNA2融合采用的接头引物如SEQNo.5-8所示。
3.如权利要求1或2所述的一种利用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，其特征是，所述农杆菌为农杆菌GV3101。
4.如权利要求1或2所述的一种利用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，其特征是，所述的感受态大肠杆菌为感受态大肠杆菌DH5α。
5.如权利要求1或2所述的一种利用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，其特征是，所述的转化至棉花中为转化至棉花下胚轴小段。
6.如权利要求1或2所述的一种利用基因编辑技术获得高油酸棉花的方法，其特征是，所述的棉花为陆地棉。
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