CN105039396A - 一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法及应用，以荻成熟种子为外植体，诱导愈伤组织，通过农杆菌介导的遗传转化方法，利用hptII基因作为筛选基因，以潮霉素作为选择剂，对转化后的愈伤组织在相应的筛选压力培养基上进行两次筛选，分化出的植株经PCR检测，证实外源基因已整合到荻基因组中，获得了转基因荻植株。本发明首次报道了采用农杆菌介导荻种子愈伤转化的方法。本发明为荻遗传转化创新种质资源提供了新的技术平台。
Description
技术领域
本发明涉及植物转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法。
背景技术
荻(Miscanthussacchariflorus(Maxim)Benth.)为禾本科多年生水陆两生的草本植物。荻高1～1.5m，直径约5mm，具有10多个节和发达被鳞片的长匍匐根状茎，原产于东亚，目前在我国东北、华北、西北和华东地区均有分布。因具有再生能力强、适应性强和干物质产量高等特点，被认为是一种重要的能源植物。而利用能源植物开展重金属污染土壤修复可以实现生物质原料生产与污染土壤治理的双赢。
例如，公开号为CN101786097A的中国发明专利申请文献公开了一种修复镉铅等重金属污染土壤的方法，技术方案是：在含污染物镉铅等金属的土壤上种植荻，当荻长到成熟期后，将荻整体从污染土壤上移走；在含污染物镉铅等重金属的土壤上种植荻，采用露天常规栽培，调节土壤水份和营养成分。
公开号为CN104472328A的中国发明专利申请文献公开了一种富硒荻笋的栽培方法，属于食品加工技术领域。按如下步骤制备：(1)将硒矿石通亚硫酸溶液浸泡溶解硒元素；(2)磷酸盐溶液沉降处理重金属，过滤，调节滤液pH＝6.5-7.5；(3)加入荻苇生长所必需的氮、磷、钾等微量元素得到富硒培养液；(4)荻苇幼苗置于培养槽中，放置光照充足通风处培养至笋高25cm左右。
然而，荻对于土壤修复还存在一定的局限性，例如，虽然荻对重金属具有较强的耐性，但由于其不能把较多的重金属转移到地上部，而不能有效的用于植物修复。建立荻转基因技术是一种很好的快速培育荻抗逆新品种的方法。例如，公开号为CN102239808A的中国发明专利申请文献公开了荻的组织培养基及组培方法，组培方法经过如下五个步骤：一是外植体的采集与消毒，二是初代培养，三是不定芽诱导，四是不定芽增殖培养，五是生根诱导。并公开了分别用于初代培养、不定芽诱导、不定芽增值培养基生根诱导的4中培养基。
由于转化方法成熟、转化效率高和操作简单等优点，农杆菌转化法已成为应用最广泛的植物转化方法。然而，截止到目前，还没有关于采用农杆菌介导荻愈伤组织转基因技术的报道。
发明内容
本发明提供了一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法及应用，为通过转基因技术培育荻抗逆新品种奠定了基础。
一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，包括如下步骤：
(1)选取荻成熟种子，消毒、清洗后依次进行愈伤组织诱导、继代培养；
(2)将继代培养后的胚性愈伤组织置于含有农杆菌菌液的侵染液中侵染，所述农杆菌菌液带有表达载体；侵染后的胚性愈伤组织在共培养基上进行共培养；
(3)取共培养后的愈伤组织依次经无菌水和含羧卞青霉素的无菌水清洗，然后移至含有羧卞青霉素和潮霉素的选择培养基上进行筛选；
(4)将筛选得到的抗性愈伤组织移至分化培养基上，进行分化培养，诱导出不定芽；
(5)将分化出的不定芽移至生根培养基上，培养成完整植株。
荻成熟种子的消毒、清洗过程为：选取籽粒饱满的荻种子，依次用75％的乙醇和30％的次氯酸钠消毒，消毒结束后用无菌水清洗种子。
愈伤组织诱导过程为：将消毒的种子在无菌滤纸上晾干，接种到诱导培养基上，每皿20颗左右，用封口膜封好培养皿，在28℃光照培养箱培养40天。
继代培养过程为：用镊子挑选生长良好的胚性愈伤组织接种于继代培养基上，在28℃光照培养箱继代培养15天。
愈伤组织诱导和继代培养基：MS培养基+6mg/L2,4-D+0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.5g/L水解酪蛋白+0.5g/L脯氨酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8。
优选地，所述农杆菌为EHA105；所述表达载体为pCAMBIA1300。pCAMBIA1300的物理图谱如图1所示，该表达载体为空载体，载体上含有35S启动子序列和hptII基因序列。
进一步地，步骤(2)中所述含农杆菌菌液的侵染液由如下方法制备：
挑取单个携带pCAMBIA1300载体的农杆菌菌落，接入到含有卡那霉素和链霉素的YEP液体培养基中，26～30℃过夜培养，得到OD600为0.8-1.0的菌液；取培养好的菌液离心收集菌体，用含乙酰丁香酮的侵染液重悬菌体，使重悬后的菌液OD600达到0.015～0.025，即得所述含农杆菌菌液的侵染液。
更进一步，挑取单个携带pCAMBIA1300载体的农杆菌菌落，接入到含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的YEP液体培养基中，28℃过夜培养，得到OD600为0.8-1.0的菌液；取培养好的菌液1ml离心收集菌液，用含200μM乙酰丁香酮的侵染液重悬菌液，使重悬后的菌液OD600达到0.02，即得步骤(2)中所述含农杆菌菌液的侵染液。
其中，含200μM乙酰丁香酮的侵染液的组成为：MS培养基+1mg/L烟酸+1mg/L盐酸吡哆醇+10mg/L盐酸硫脘素+0.1g/L肌醇+3.9g/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸+0.5g/L水解酪蛋白；蔗糖30g/L；pH5.5；高压灭菌冷却至55℃时加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM。
YEP液体培养基：10g/L酵母提取物+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠。
优选地，步骤(2)中在侵染液中侵染的时间为5-10min。
步骤(2)中共侵染时的振荡速度为80rpm。
优选地，共培养培养基为：MS培养基+1mg/L烟酸+1mg/L盐酸吡哆醇+10mg/L盐酸硫脘素+0.1g/L肌醇+3.9g/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸+0.5g/L水解酪蛋白；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8；高压灭菌冷却至55℃时加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM。
共培养时的培养条件为：将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；将愈伤组织置于有一张无菌滤纸的共培养基上，24～26℃(优选25℃)暗培养2～4(优选3)天。
优选地，步骤(3)中在利用选择培养基进行两轮筛选。
进一步优选地，选择培养基：MS培养基+6mg/L2,4-D+0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.5g/L水解酪蛋白+0.5g/L脯氨酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8；第一轮筛选的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二轮筛选的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素。
更进一步优选地，每轮筛选的周期为20天。
选择培养前先用无菌水清洗5-6次，再用含300mg/L的羧卞青霉素的无菌水清洗2遍；然后在无菌滤纸上晾干。
优选地，分化培养条件：将选择培养后的抗性愈伤移至分化培养基上，放入恒温(25±1℃)培养室中，光照时间16小时，光照强度为1200lx，相对湿度为60±2％，培养40天后可诱导出不定芽。
分化培养基：MS培养基+0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.05mg/L萘乙酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8。
优选地，生根培养条件：将分化出来的不定芽分成的单株接种到生根培养基上，放入恒温(25±1℃)培养室中，光照时间16小时，光照强度为1200lx，相对湿度为60±2％，10天后形成完整植株。
生根培养基：1/2MS培养基+0.4mg/L萘乙酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8。
对获得的完整植株进行阳性苗PCR检测：将获得的所得的转35S启动子和hpt基因的植株进行PCR检测。
阳性苗PCR检测方法是：用CTAB法提取T0代转基因荻株系的基因组DNA，以35S启动子序列为模板设计引物，扩增得到238bp(SEQIDNO：1)片段，引物序列如下：
正向引物35SU:5’-TCCATCTTTGGGACCACTGT-3’(SEQIDNO：3)
反向引物35SL:5’-CGACACTCTCGTCTACTCCA-3’(SEQIDNO：4)
以hptII基因序列为模板设计引物，扩增得到373bp(SEQIDNO：2)片段，引物序列如下：
正向引物hptU:5’-GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATC-3’(SEQIDNO：5)
反向引物hptL:5’-CATAACAGCGGTCATTGACTGGAGC-3’(SEQIDNO：6)。
本发明的方法用于培育荻转基因植株。为通过转基因技术培育荻抗逆新品种奠定了基础。
本发明的有益效果：
1、本发明在国内外首次利用农杆菌介导荻成熟种子愈伤组织转化获得转基因植株，为今后荻的遗传改良培育抗逆种质资源提供了新的技术平台。利用农杆菌介导荻成熟种子愈伤组织转化获得转基因植株相对于其他传统方法，具有费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点。
2、本发明的受体材料易于获得，实验不受季节限制。在种子成熟期，可收集大量的种子于4℃保存；由种子诱导出的胚性愈伤，增值率高。
3、本发明从种子诱导胚性愈伤到获得完整转基因植株需要5个月，操作方便，再生率高达30.2％。
4、荻为单子叶植物，本发明通过诱导愈伤进行侵染，优化得到诱导荻愈伤的培养基，采用农杆菌侵染愈伤组织，大大的提高了转化效率。
附图说明
图1是本发明应用的表达载体pCAMBIA1300的物理图谱。
图2：是本发明实施例中采用荻成熟种子诱导的胚性愈伤。
图3是本发明实施例中胚性愈伤的不同状态：图3A在第一轮选择培养基上的抗性愈伤；图3B在第二轮选择培养基上的抗性愈伤；图3C是抗性愈伤分化20天后的状态；图3D是抗性愈伤分化30天后的状态；图3E是分化出的植株不定芽增殖的状态；图3F是不定芽生根的状态。
图4是T0代植株35S启动子PCR鉴定示意图。
图5是T0代植株hptII基因PCR鉴定示意图。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，以下结合实例加以说明。
实施例1荻成熟种子胚性愈伤的诱导和继代
1)种子的收集：荻的成熟种子于2013年11月采于浙江临安大明山景区，采回后连带花序烘干置于4℃保存。
2)种子的消毒：将荻种子的外壳剥去，选取健壮成熟的种子装入1.5mL离心管中进行消毒处理。过程如下：向装有种子的离心管中加入1mL75％的乙醇，上下颠倒试管30s后倒掉酒精；再用30％的次氯酸钠消毒15min，期间不断摇动试管，以使种子与次氯酸钠充分接触；然后再用无菌水冲洗3-5次；最后将消毒好的种子置于无菌滤纸上晾干，备用。以上操作均在无菌超净台上进行。
3)胚性愈伤诱导和继代：将步骤2)的种子接种于诱导培养基上，培养基配方如下：MS培养基+6mg/L2,4-D+0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.5g/L水解酪蛋白+0.5g/L脯氨酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8；在121℃高压灭菌15min。培养条件：温度28±2℃，相对湿度60％，光照2000lux，光照时间16/8h。培养40d左右，挑去胚性愈伤于同样的培养基上进行继代培养。
实施例2利用农杆菌介导的方法将表达载体pCAMBIA1300转化荻胚性愈伤
1)转化根癌农杆菌：本发明所用的表达载体pCAMBIA1300(其物理图谱见图1)和农杆菌EHA105感受态为实验室保存。将pCAMBIA1300的质粒通过电击的方法转化农杆菌EHA105菌株[电击转化方法参照Sambrook等报道的方法，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)]。取2μgpCAMBIA1300质粒加到冰上溶解的EHA105感受态中，轻轻混匀，冰浴30min，准入灭菌并预冷的电极杯中，然后放入电转化仪(BIO-RAD)两电极间，点击按钮进行转化，将转化后的农杆菌细胞，涂布于含有链霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP的固体培养基平板上，28℃培养2-3天，挑单克隆菌落，在相同抗性的YEP液体培养基中，28℃，扩大培养，鉴定阳性转化菌，-80℃保存，用于荻的转化。
2)农杆菌培养：将保存的pCAMBIA1300农杆菌菌液在YEP(含50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素)固定培养基上划板，培养36h后，挑取单个携带pCAMBIA1300载体的农杆菌的菌落，接入到含有50mg/L卡那霉素和50mg/L链霉素的YEP液体培养基中，28℃过夜培养，得到OD600为0.8-1.0的菌液。取培养好的菌液1ml离心收集菌液，用含200μM乙酰丁香酮的侵染液重悬菌液，使重悬后的菌液OD600为0.02左右，备用。
3)农杆菌侵染：将获得的胚性愈伤组织置于步骤(1)终浓度为0.02的侵染液中进行侵染5-10min，震荡速度为80rpm。
4)共培养：将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；将愈伤组织置于有一张无菌滤纸的共培养基上。25℃暗培养3天。
5)选择培养：将愈伤组织取出，先用无菌水清洗5-6次，再用含300mg/L的羧卞青霉素的无菌水清洗2遍；将愈伤组织在无菌滤纸上晾干，然后移至相应压力的选择培养基上进行两轮选择，每轮筛选周期为20天。第一轮选择培养基上的抗性愈伤如图3A所示；第二轮选择培养基上的抗性愈伤如图3B所示。
6)分化培养：将选择培养后的抗性愈伤移至分化培养基上，放入恒温(25±1℃)培养室中，光照时间16小时，光照强度为1200lx，相对湿度为60±2％，培养40天后可诱导出不定芽。图3C是抗性愈伤分化20天后的状态；图3D是抗性愈伤分化30天后的状态；图3E是分化出的植株不定芽增殖的状态。
7)生根培养：将分化出来的不定芽分成的单株接种到生根培养基上，10天后形成完整植株，培养条件同步骤7)。图3F是不定芽生根的状态。
培养基配方如下：
YEP液体培养基：10g/L酵母提取物+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠；
含200μM乙酰丁香酮的侵染液组成为：MS培养基+1mg/L烟酸+1mg/L盐酸吡哆醇+10mg/L盐酸硫脘素+0.1g/L肌醇+3.9g/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸+0.5g/L水解酪蛋白；蔗糖30g/L；pH5.5；高压灭菌冷却至55℃时加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM。
共培养培养基：MS培养基+1mg/L烟酸+1mg/L盐酸吡哆醇+10mg/L盐酸硫脘素+0.1g/L肌醇+3.9g/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸+0.5g/L水解酪蛋白；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8；高压灭菌冷却至55℃时加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM。
选择培养基：MS培养基+6mg/L2,4-D+0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.5g/L水解酪蛋白+0.5g/L脯氨酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8；第一轮选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二轮选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素；
分化培养基：MS培养基+0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.05mg/L萘乙酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8；
生根培养基：1/2MS培养基+0.4mg/L萘乙酸；蔗糖30g/L；Phytagel植物凝胶4g/L；pH5.8。
实施例3对T0代转化植株的PCR检测
用CTAB法提取T0代转基因荻株系叶片的基因组DNA，以35S启动子序列为模板设计引物，扩增得到238bp片段(电泳图如图4，碱基序列如SEQIDNO：1)，引物序列如下：
正向引物35SU:5’-TCCATCTTTGGGACCACTGT-3’(SEQIDNO：3)
反向引物35SL:5’-CGACACTCTCGTCTACTCCA-3’(SEQIDNO：4)
以hptII基因序列为模板设计引物，扩增得到373bp片段(电泳图如图5，碱基序列如SEQIDNO：2))，引物序列如下：
正向引物hptU:5’-GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATC-3’(SEQIDNO：5)
反向引物hptL:5’-CATAACAGCGGTCATTGACTGGAGC-3’(SEQIDNO：6)
PCR反应体系为(20μl)：模板2μl，kodaq2×PCRMasterMix(Cat.No.G497,abm,Canada)10μl，引物10.5μl，引物20.5μl，ddH2O7μl。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统下拍照。实验结果如图4和5。
由以上结果可知，本发明通过农杆菌介导荻种子愈伤组织转化成功将表达载体中的35S启动子序列及hptII基因序列转入荻种子基因中，获得转基因荻植株。
Claims (9)
1.一种农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取荻成熟种子，消毒、清洗后依次进行愈伤组织诱导、继代培养；
(2)将继代培养后的胚性愈伤组织置于含有农杆菌菌液的侵染液中侵染，所述农杆菌菌液带有表达载体；侵染后的胚性愈伤组织在共培养基上进行共培养；
(3)取共培养后的愈伤组织依次经无菌水和含羧卞青霉素的无菌水清洗，然后移至含有羧卞青霉素和潮霉素的选择培养基上进行筛选；
(4)将筛选得到的抗性愈伤组织移至分化培养基上，进行分化培养，诱导出不定芽；
(5)将分化出的不定芽移至生根培养基上，培养成完整植株。
2.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，进行愈伤组织诱导的培养基组成为：以MS培养基为基础添加6mg/L2,4-D、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、0.5g/L脯氨酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8。
3.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA1300。
4.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，步骤(2)中在侵染液中侵染的时间为5-10min。
5.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，共培养基的组成为：以MS培养基为基础培养基，添加1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、10mg/L盐酸硫脘素、0.1g/L肌醇、3.9g/L2-(N-吗啡啉)乙磺酸、0.5g/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8；高压灭菌冷却至55℃时加入乙酰丁香酮至终浓度为200μM。
6.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，步骤(3)中利用选择培养基进行两轮筛选：
所述选择培养基的组成为：以MS培养基为基础培养基，添加6mg/L2,4-D、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.5g/L水解酪蛋白、0.5g/L脯氨酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8；第一轮筛选的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和80mg/L潮霉素；第二轮筛选的选择培养基在高压灭菌后加入300mg/L羧卞青霉素和100mg/L潮霉素。
7.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，所述分化培养基的组成为：以MS培养基为基础添加0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8。
8.根据权利要求1所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法，其特征在于，所述生根培养基的组成为：以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.4mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4g/LPhytagel植物凝胶；pH5.8。农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法。
9.一种如权利要求1～8任一权利要求所述农杆菌介导的荻种子愈伤组织转化方法在培育荻转基因植株上的应用。
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| 王子岚等: "荻植株再生体系建立", 《河北林果研究》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861543A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-08-17 | 云南纳博生物科技有限公司 | 一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法 |
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