CN105861543A - 一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法 - Google Patents

一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行侵染，瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养得到愈伤组织；筛选阶段：将愈伤组织转接到筛选培养基中筛选得到幼芽；生根阶段：将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；阳性检测阶段：取抗性苗的叶片，进行阳性检测，建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系。本发明提供的农杆菌介导豆瓣绿的转化体系，愈伤组织形成频率、分化频率以及转化率都较高，可以满足观音莲育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。

Description

一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法
技术领域
本发明属于农杆菌介导植物转染体系技术领域，尤其涉及一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法。
背景技术
豆瓣绿(Peperomia tetraphylla)是胡椒科草胡椒属多年生常绿草本植物。小型盆栽，体态玲珑、斑斓雅洁、端庄大方。常用白色塑料盆、白瓷盆栽培，置于茶几、装饰柜、博古架、办公桌上，十分美丽。或任枝条蔓延垂下，悬吊于室内窗前或浴室处，也极清新悦目。功效应用：对甲醛，二甲苯，二手烟有一定的净化作用。原产于台湾、福建、广东、广西、贵州、云南、四川及甘肃南部和西藏南部。生于潮湿的石上或枯树上，是世界应用最普遍的观叶植物之一。
农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中。目前，还没有文献和专利报道过农杆菌成功介导豆瓣绿转基因。使用农杆菌介导豆瓣绿转化，可以使豆瓣绿快速获得目的性状，而且可以突破豆瓣绿自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法。本发明使用农杆菌介导豆瓣绿转化，打通豆瓣绿农杆菌介导高效转染体系。这是通过农杆菌转染体系培育新型豆瓣绿最为重要的一步，建立豆瓣绿农杆菌介导高效转染体系意味着能够突破豆瓣绿自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
本发明的技术方案如下：一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
侵染和共培养阶段：将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行侵染，瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养，共培养目的是让菌液和无菌苗叶片充分接触，充分完成转基因过程；
所述共培养培养基：SH基础配方+TDZ0.01～2.5mg·L-1+NAA0.01～2.0mg·L-1+IBA 0.01～2.0mg·L-1+蔗糖30～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS 100～300μmol·L-1，pH 5.2～5.8，120～125℃灭菌20-30min；
其中SH基础配方：硝酸钾2～5.0g·L-1，硫酸镁0.1～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙150～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳10～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1；以下步骤中的SH基础配方也采用该配方。
所述侵染条件如下：真空度为0.2～1.0Kpa，侵染时间为12～48h；侵染时间过短，农杆菌与豆瓣绿组织接触时间短，侵染效果不好；侵染时间过长，造成被侵染细胞死亡以及农杆菌抑制不住等问题；
所述共培养条件如下：暗培养温度20～28℃，培养时间为3～7天。
筛选阶段：将共培养后的叶片转接到筛选培养基中筛选得到幼芽；
筛选阶段：所述筛选培养基成分如下：SH基础配方+TDZ0.01～2.5mg·L-1+NAA0.01～2.0mg·L-1+IBA 0.1～2.0mg·L-1+蔗糖30～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+羧苄青霉素250～750mg·L-1+潮霉素20～200mg·L-1，pH5.2～5.8。
筛选阶段：共培养后的叶片转接到筛选培养基中进行第一次筛选，培养20～30天后，更换筛选培养基，进行第二次筛选，培养25～30天得到幼芽；
第一次筛选和第二次筛选培养条件如下：20～28℃光照培养，每天光照10～16h，光照强度1000～3000lx。
生根阶段：将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；
所述生根培养基成分如下：SH基础配方+IBA 0.1～1.6mg·L-1+蔗糖30～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8。
生根培养条件如下：22～28℃光照培养7～8周，光照强度为1000～3000lx，光照时间为12～14h/天。
阳性检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染豆瓣绿的阳性苗，建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系。
本发明所述豆瓣绿无菌苗可以采用以下制备方法得到，当然也可以采用其他方法制备：
豆瓣绿幼芽培养阶段：将豆瓣绿幼芽消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成无菌苗；豆瓣绿幼芽消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗5～12次，在75％乙醇中浸泡60～360s，再使用无菌水清洗5～12次，在0.1～0.5％升汞中浸泡5～15min，再使用无菌水清洗种子5～15次，放在滤纸上晾干。
豆瓣绿幼芽培养条件为：20～28℃光照培养，每天光照10～16h，光照强度1000～3000lx，培养时间30～90天；
所述基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖30～60g·L-1，pH5.2～5.8，120～125℃高压灭菌20-30min。
为了得到数量较多的豆瓣绿无菌苗，需要进行无菌苗扩繁。
无菌苗扩繁阶段：将萌发长到5～12cm的无菌苗切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中进行扩繁培养；
无菌苗扩繁培养条件为：20～28℃光照培养30～90天，每天光照10～16h，光照强度1000～3000lx。
本发明所述农杆菌菌液制备：将农杆菌加入到添加有40～65mg/L卡那霉素和40～70mg/L利福平的YM培养基中，2000～4000r/min，4～8℃离心10～20min，弃上清，下层加入重悬液使OD值达到0.4～0.8，最后向菌液中加入AS，终浓度为100～300μmol·L-1，混匀备用。
所述YM培养基成分如下：蛋白胨5-20g/L，酵母提取物5-10g/L，氯化钠5-20g/L，农杆菌在YM培养基中培养条件如下：26～32℃培养12～24h，有无光照不影响效果。
所述重悬液为SH基础配方+蔗糖30～60g·L-1，pH5.2～5.8，120～125℃灭菌20～30min。
农杆菌植物转化虽然比较常见，但一般都针对水稻等谷物植物；由于豆瓣绿的基因屏障作用较强，农杆菌很难侵染到豆瓣绿基因中，因此其他植物的农杆菌转化方法对豆瓣绿的借鉴意义很小。
以豆瓣绿为模型的研究平台，建立豆瓣绿的组织培养体系以及转基因体系的重点在于共培养、筛选和生根培养等过程。而共培养基、筛选培养基、以及生根培养基中加入的激素种类及组合、激素添加量以及培养时间，都有不可预知、不可控的结果。根据研究，发现在本发明提供的侵染条件下容易打破其基因屏障，农杆菌能够成功介导豆瓣绿，且本发明采用的激素配方以及培养时间比较适合侵染后的豆瓣绿共培养、筛选等，愈伤组织形成频率较高。
本发明通过对共培养、筛选和抗性苗培养(生根培养)步骤的不断探索，摸索出最佳培养条件，成功打通宽叶不死鸟农杆菌介导高效转染体系，愈伤组织形成频率达到90％以上，愈伤组织分化频率达85％以上，转化效率达50％以上，可以满足豆瓣绿育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的农杆菌介导豆瓣绿的转化体系，愈伤组织形成频率、分化频率以及转化率都较高，可以满足观音莲育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。
附图说明
图1为实施例1中豆瓣绿转化阳性苗PCR扩增后的凝胶电泳图；
图2为实施例2中豆瓣绿转化阳性苗PCR扩增后的凝胶电泳图；
中英文对照
SH：Protocol for Schenk and Hildebrandt，SH培养基；
NAA：a-萘乙酸
AS：乙酰丁香酮；
Hyg：潮霉素；
Carb：羧苄青霉素；
IBA：吲哚丁酸；
TDZ：噻苯隆；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1：豆瓣绿的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1获得豆瓣绿无菌苗阶段：将豆瓣绿幼芽置于无菌水中冲洗6次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃60s，倒出乙醇，无菌水清洗6次，倒出无菌水，加入0.1％升汞，浸泡6min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子6次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于基础培养基(SH基础配方+琼脂8g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH5.2，120℃高压灭菌20min)，20～22℃光照培养，每天光照10h，光照强度1000～1500lx；
SH基础配方：硝酸钾2g·L-1，硫酸镁0.1·L-1，磷酸二氢铵0.3g·L-1，氯化钙150mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，肌醇100mg·L-1，盐酸硫胺素0.4mg·L-1，盐酸吡哆素0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳10mg·L-1，六水氯化钴0.1mg·L-1，五水硫酸铜0.2mg·L-1，硼酸5mg·L-1，碘化钾1mg·L-1，一水硫酸锰10mg·L-1，二水钼酸钠0.1mg·L-1，七水硫酸锌1mg·L-1；以下步骤也采用该配方。
步骤2无菌苗扩繁阶段：30天后，将步骤1中萌发长到5cm左右的无菌苗叶片切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中，20～22℃光照培养。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物双元载体PCAMBIA1300的农杆菌加入到添加有40mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的抗生素的YM培养基中，摇床培养的转速100r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，2000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使OD值达到0.4；重悬液为SH基础配方+蔗糖30g·L-1，pH5.2，120℃高温灭菌20min。最后向菌液中加入100μmol·L-1AS，混匀备用；
YM培养基成分：蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
步骤4侵染和共培养阶段：在基础培养基中培养30天后，将步骤2中获得的无菌苗切成1mm2左右的叶片块，放入100mL三角瓶中约200块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.2kPa，保持12h，倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基(SH基础配方+TDZ 0.04mg·L-1+NAA0.06mg·L-1+IBA0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1+葡萄糖10g·L-1+琼脂8g·L-1+AS 100μmol·L-1，pH 5.2，120℃灭菌20min)，20～22℃暗培养。
步骤5筛选阶段：在共培养基中暗培养7天后，将步骤4中获得的叶片转接到筛选培养基(SH基础配方+TDZ 0.04mg·L-1+NAA0.06mg·L-1+IBA 0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1+羧苄青霉素250mg·L-1+潮霉素30mg·L-1，pH5.2)，20～22℃光照培养，每天光照10h，光照强度1000～1500lx，筛选20天后，更换筛选培养基，进行二次筛选；
步骤6生根阶段：二次筛选培养20天后，将步骤5中获得的幼芽转接到生根培养基(SH基础配方+IBA 0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，pH5.2)，
培养条件如下：20～22℃光照培养7周，光照强度为1000～1500lx，光照时间为10h/天。
步骤7阳性检测阶段：在生根培养基培养约7周后，将步骤6获得的抗性苗取叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
PCR扩增条件：
其中2c-3c-4c循环30次。
电泳条件：电压100v，电流100mA
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因已经表达。
参考图1，9号，26号，43号泳道为DL2000marker；50号泳道为阳性对照；51号泳道为阴性对照；1号，2号，4号，5号，6号，8号，11号，15号，17号，22号，23号，24号，27号，28号，31号，33号，37号，38号，39号，41号，42号，45号，48号，49号泳道为阳性，共计24个泳道获得与阳性对照相同的电泳条带，证明为阳性植株。
实施例1中，愈伤组织形成率91.3％，长绿苗的频率为85.6％，生根率99.1％，转化率52.2％，如表1、表2和表3所示。
表1
表2
表3
实施例2：豆瓣绿的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1获得豆瓣绿无菌苗阶段：将豆瓣绿幼芽置于无菌水中冲洗10次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃300s，倒出乙醇，无菌水清洗10次，倒出无菌水，加入0.5％升汞，浸泡15min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子10次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于基础培养基(SH基础配方+琼脂15g·L-1+蔗糖50g·L-1，pH5.6，125℃高压灭菌30min)，26～28℃光照培养，每天光照15h，光照强度2000～2500lx；
SH基础配方：硝酸钾4.0g·L-1，硫酸镁0.3g·L-1，磷酸二氢铵0.5g·L-1，氯化钙250mg·L-1，甘氨酸4mg·L-1，肌醇180mg·L-1，盐酸硫胺素0.75mg·L-1，盐酸吡哆素1.0mg·L-1，烟酸1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳35mg·L-1，六水氯化钴0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.4mg·L-1，硼酸10mg·L-1，碘化钾2mg·L-1，一水硫酸锰18mg·L-1，二水钼酸钠0.2mg·L-1，七水硫酸锌2mg·L-1；以下步骤也采用该配方。
步骤2无菌苗扩繁阶段：30天后，将步骤1中萌发长到10cm左右的无菌苗叶片切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中，26～28℃光照培养。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物双元载体PCAMBIA1300的农杆菌加入到添加有60mg/L卡那霉素和65mg/L利福平的抗生素的YM培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心15min，倒掉上清液，加入重悬液使OD值达到0.75；重悬液为SH基础配方+蔗糖50g·L-1，pH5.6，125℃高温灭菌30min。最后向菌液中加入250μmol·L-1AS，混匀备用；
YM培养基成分：蛋白胨15g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠20g/L；
步骤4侵染和共培养阶段：在基础培养基中培养70天后，将步骤2中获得的无菌苗切成5mm2左右的叶片块，放入100mL三角瓶中约400块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.8kPa，保持45h，倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基(SH基础配方+TDZ 2.2mg·L-1+NAA 1.75mg·L-1+IBA 1.8mg·L-1+蔗糖50g·L-1+葡萄糖55g·L-1+琼脂15g·L-1+AS 250μmol·L-1，pH 5.68，125℃灭菌30min)，26～28℃暗培养。
步骤5筛选阶段：在共培养基中暗培养7天后，将步骤4中获得的愈伤组织转接到筛选培养基(SH基础配方+TDZ 2.2mg·L-1+NAA 1.75mg·L-1+IBA 1.8mg·L-1+蔗糖50g·L-1+琼脂15g·L-1+羧苄青霉素700mg·L-1+潮霉素175mg·L-1，pH5.6)，26～28℃光照培养，每天光照15h，光照强度2000～2500lx。筛选30天后，更换筛选培养基，进行二次筛选；
步骤6生根阶段：二次筛选培养30天后，将步骤5中获得的幼芽转接到生根培养基(SH基础配方+IBA 1.4mg·L-1+蔗糖50g·L-1+琼脂15g·L-1，pH5.6)，
培养条件如下：26～28℃光照培养8周，光照强度为2000～2500lx，光照时间为15h/天。
步骤7阳性检测阶段：在生根培养基培养约8周后，将步骤6获得的抗性苗取叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
PCR扩增条件：
其中2c-3c-4c循环30次。
电泳条件：电压100v，电流100mA
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因已经表达。
参考图2，9号，26号，43号泳道为DL2000marker；50号泳道为阳性对照；51号泳道为阴性对照；1号，2号，3号，6号，8号，10号，11号，16号，17号，18号，20号，21号，23号，27号，28号，30号，31号，36号，37号，40号，42号，46号，47号，49号泳道为阳性，共计24个泳道获得与阳性对照相同的电泳条带，证明为阳性植株。
实施例2中，愈伤组织形成率90.7％，长绿苗的频率为83.9％，生根率98.4％，转化率50.8％，如表4、表5和表6所示。
表4
表5
表6
筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导的方法能将外源基因引入豆瓣绿基因组。因此，采用此方法进行豆瓣绿的诱导愈伤及农杆菌介导的高效转染，可以使豆瓣绿快速获得目的性状，而且可以突破豆瓣绿自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
实施例3
分别改变侵染条件、共培养条件，具体结果如表7、8、9和10所示。
表7
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
由表7可知：本发明提供的侵染条件和共培养条件容易打破豆瓣绿基因屏障，农杆菌成功介导豆瓣绿转化体系，且转化率较高。
其中，虽然共培养8～10天转化率稍高一些，但是后期农杆菌抑制不住，在筛选的时候全部死亡。共培养3～7天后，上筛选农杆菌能抑制住，在筛选的时候农杆菌污染比较少。
表8
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
表8可以看出在合适的真空度下(0.2～1.0Kpa)，转化率比较好。
表9
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
表9可以看出在合适的侵染时间范围内(12h～48h)，转化率比较好。
时间过长，则会造成侵染过度，使得植物细胞死亡。
表10
说明：表中的转化率是指共培养后，叶片就进行GUS染色，得到的转化率。(采用组织化学法检测，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。)
表10可以看出，缺少某一种激素培养时，转化率都偏低。

Claims (10)

1.一种建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
侵染和共培养阶段：将豆瓣绿无菌苗叶片块放入三角瓶中，倒入农杆菌菌液进行侵染，瓶口密封抽真空，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中暗培养；
筛选阶段：将共培养后的叶片转接到筛选培养基中筛选得到幼芽；
生根阶段：将获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；
阳性检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染豆瓣绿的阳性苗，建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系。
2.如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述共培养培养基：SH基础配方+TDZ0.01～2.5mg·L-1+NAA0.01～2.0mg·L-1+IBA 0.01～2.0mg·L-1+蔗糖30～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS 100～300μmol·L-1，pH 5.2～5.8，120～125℃灭菌20-30min；
其中SH基础配方：硝酸钾2～5.0g·L-1，硫酸镁0.1～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙150～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳10～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1。
3.如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述侵染条件如下：真空度为0.2～1.0Kpa，侵染时间为12～48h；所述共培养条件如下：暗培养温度20～28℃，培养时间为3～7天。
4.如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，筛选阶段：所述筛选培养基成分如下：SH基础配方+TDZ 0.01～2.5mg·L-1+NAA0.01～2.0mg·L-1+IBA0.1～2.0mg·L-1+蔗糖30～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+羧苄青霉素250～750mg·L-1+潮霉素20～200mg·L-1，pH5.2～5.8。
5.如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，筛选阶段：共培养后的叶片转接到筛选培养基中进行第一次筛选，培养20～30天后，更换筛选培养基，进行第二次筛选，培养25～30天得到幼芽；
第一次筛选和第二次筛选培养条件如下：20～28℃光照培养，每天光照10～16h，光照强度1000～3000lx。
6.如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，生根阶段中所述生根培养基成分如下：SH基础配方+IBA0.1～1.6mg·L-1+蔗糖30～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8；
生根培养条件如下：22～28℃光照培养7～8周，光照强度为1000～3000lx，光照时间为12～14h/天。
7.如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述豆瓣绿无菌苗制备方法如下：
豆瓣绿幼芽培养阶段：将豆瓣绿幼芽消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成无菌苗；
所述豆瓣绿幼芽消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗5～12次，在75％乙醇中浸泡60～360s，再使用无菌水清洗5～12次，在0.1～0.5％升汞中浸泡5～15min，再使用无菌水清洗种子5～15次，放在滤纸上晾干。
8.如权利要求7所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖30～60g·L-1，pH5.2～5.8，120～125℃灭菌20-30min。
豆瓣绿幼芽培养条件为：20～28℃光照培养，每天光照10～16h，光照强度1000～3000lx，培养时间30～90天。
9.如权利要求1所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，农杆菌菌液制备：将农杆菌加入到添加有40～65mg/L卡那霉素和40～70mg/L利福平的YM培养基中，2000～4000r/min，4～8℃离心10～20min，弃上清，下层加入重悬液使OD值达到0.4～0.8，最后向菌液中加入AS，终浓度为100～300μmol·L-1，混匀备用。
10.如权利要求9所述的建立农杆菌介导豆瓣绿高效转染体系的方法，其特征在于，所述YM培养基成分如下：蛋白胨5-20g/L，酵母提取物5-10g/L，氯化钠5-20g/L，农杆菌在YM培养基中培养条件如下：26～32℃培养12～24h；
所述重悬液为SH基础配方+蔗糖30～60g·L-1，pH5.2～5.8，120～125℃灭菌20～30min。
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