CN102127566B - 黄花蒿的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
一种黄花蒿的遗传转化方法，该方法主要包括黄化蒿无菌苗的准备，菌株的活化和浸染菌液的制备，黄花蒿节间茎作为转化外植体与菌液共培养，然后把经过共培养的外植体挑出，转入到选择培养基上进行脱菌和选择培养，将选择培养基中产生的抗性植株转入到选择伸长培养基和选择生根培养基中先后进行伸长培养、生根培养，直至抗性芽再生为完整的植株。对获得的抗性植株分别进行了GUS检测和PCR检测，结果表明外源基因已经整合到黄花蒿的基因组中。本发明具有操作简单、取材方便、转化效率高，可广泛用于黄花蒿的基因工程操作中。
Description
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种黄花蒿高效遗传转化方法及应用。
背景技术：
青蒿素是我国学者首次从黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物，是治疗疟疾的特效药，国际市场需求量日益增长。进一步的药理研究证明，青蒿素及其相似物对多种人类和动物肿瘤细胞均具有毒性作用，包括乳腺癌细胞、血癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞等，而对正常细胞损伤很小，并且与传统化疗药不存在交叉耐药。因此，青蒿素及其类似物有望被开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，具有广泛的应用前景，从而导致青蒿素的市场进一步扩大，青蒿素的需求量将进一步上升。
然而，目前药用青蒿素均是从青蒿植株中提取分离而得，由于其含量低，提取环节复杂，安全隐患大，导致青蒿素的生产成本过高。因此，如何有效制备青蒿素是近年来备受关注的难点与热点问题。国内外学者通过栽培、传统遗传育种、组织培养和发根培养等方式试图培育高产植株或生产青蒿素，但迄今为止均未取得令人满意的结果。
随着现代分子生物学和基因工程技术的迅速发展，通过基因调控手段大幅度提高植株中青蒿素的含量将成为彻底解决青蒿素生产成本过高问题的必然趋势。Vergauwe和Han等分别报道了根癌农杆菌介导的黄花蒿转化方法，虽然Vergauwe等利用万古霉素(vancomycin)作为农杆菌抑制剂，成功地得到转基因植物，但vancomycin十分昂贵，且严重推延了再生苗的产生。Han等虽然以头孢霉素为农杆菌抑制剂也得到了转基因植株，且仅局限于特定的基因型植株和特定的表达载体。此外，这两种转化体系均存在转化率低和转化时间长的缺点，未得到推广应用。因此，构建成本低、转化率高、重复性好的黄花蒿遗传转化再生体系仍然是黄花蒿资源改良急需解决的主要问题。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种黄花蒿的遗传转化方法，以黄花蒿的节间茎为转基因的受体材料，采用农杆菌介导法将外源基因导入黄花蒿受体细胞中，经过选择再生获得转化植株，以缩短现有技术获得转基因植株的时间，提高现有黄花蒿遗传转化的效率。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种黄花蒿的遗传转化方法，该方法包括如下步骤：
1)、黄花蒿无菌苗的准备：将黄花蒿种子灭菌后接种于1/2MS培养基上，在每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％的条件下培养，7天后转至MS培养基，每40天继代繁殖一次；
2)、菌株的活化及浸染菌液的制备：将携带目的基因的农杆菌划线培养在含有100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养2天，使其活化，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养，取达到对数生长期的菌液即OD600为0.6-0.7，离心，弃上清液，收集菌体悬浮于MS液体培养基稀释至OD600＝0.3，加入80-120μM乙酰丁香酮，得到用于转化的浸染液；
3)、侵染和共培养：取继代苗龄为30-40天的黄花蒿无菌苗枝梢，去叶芽，切成1-3厘米长的茎，置于步骤2中的侵染液，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，浸染时间为15-30min；取出侵染过的外植体，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基：MS培养基+100μM乙酰丁香酮，于25℃、黑暗条件下共培养48-60h；
4)、不定芽的诱导I期：将共培养后的外植体转移至诱导培养基：MS+0.1mg/L噻二唑苯基脲(TDZ)，并添加400mg/L羧苄西林(Carb)和25mg/L卡那霉素(Kan)，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；
5)、不定芽的诱导II期：2周后，将步骤4中的外植体转入含300mg/L羧苄西林(Carb)、25mg/L卡那霉素(Kan)、0.05mg/L 1-萘乙酸(NAA)和0.5mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)的MS培养基，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；
6)、选择性生长培养：3周后，将步骤5中的培养材料转入含300mg/L羧苄西林(Carb)、25mg/L卡那霉素(Kan)和0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)的MS培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；
7)、诱导生根：当步骤6中的再生芽达到2厘米高时转入含100mg/L羧苄西林(Carb)、25mg/L卡那霉素(Kan)和0.1mg/L 1-萘乙酸(NAA)的1/2MS培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；诱导其生根，使其形成完整的黄花蒿转基因植株。
上述将黄花蒿种子灭菌是指取黄花蒿种子，用70-75％(v/v)酒精浸泡种子1-2分钟后，用5％(m/v)NaOCl浸泡消毒15-20分钟，然后用无菌水冲洗3-4遍。
本发明所使用的农杆菌菌株为AGL0，质粒载体为pBI121、pBin 19、或Impactvector1.1(农杆菌和质粒均由荷兰Wageningen大学Maarten Jangsma教授惠赠)。将农杆菌菌株AGL0浸染后的黄花蒿节间茎，经共培养、选择性再生培养、选择性伸长培养和选择性生根培养后，多次反复实验表明转化后均能得到黄花蒿的再生完整植株，对再生植株进行了GUS染色检测和PCR检测，分析结果表明外源基因已经整合到黄花蒿基因组中。依照本发明的方法，其它目的外源基因也能应用本发明的转化和再生方法导入黄花蒿，从而拓宽黄花蒿育种途径。
本发明的优点是：成本低；不定芽再生率高，不定芽诱导率达60％以上；不定芽再生速度快；直接产生再生芽，不经过愈伤组织；共培养基和筛选培养基能适合多品种和多种类型基因的遗传转化；再生转化植株没有嵌合现象。
具体实施方式：
下面，本发明将用实施例进行进一步地说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1湖南长沙地区黄花蒿遗传转化实例
选用湖南农业大学黄花蒿实验基地成熟的黄花蒿种子，用体积浓度70％的酒精浸泡种子2分钟后，用5％NaOCl(m/v)浸泡消毒15分钟，然后用无菌水冲洗3遍。将灭菌后的黄花蒿种子接种于1/2MS培养基上，在光照强度为3000lux，每天16小时光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％的条件下培养，一星期后转至MS培养基，每40d继代繁殖一次。
将携带目的基因表达载体pBI121-GUS的农杆菌AGL0划线培养在含有100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养2天，使其活化，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养，将达到菌对数生长期的菌液(OD600＝0.6)离心，弃上清液，用MS液体培养基悬浮，直至OD600＝0.3，加入80uM乙酰丁香酮，从而得到用于转化的浸染液。
取继代苗龄约为30天的黄花蒿无菌苗枝梢，去叶芽，切成1厘米长的茎作为遗传转化的外植体，总共200个外植体，置于侵染液，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，时间分别为20min。侵染完毕后取出外植体用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基：MS+100uM乙酰丁香酮，于25℃、黑暗条件下共培养48h。共培养结束后将外植体转移至诱导培养基：MS+0.1mg/L噻二唑苯基脲，并添加400mg/L Carb和25mg/L Kan，每周更换新鲜培养基，培养条件为光照强度3000lux，每天16小时光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％。2周后将外植体转入含300mg/L Carb、25mg/L Kan、0.05mg/L NAA和0.5mg/L 6-BA的MS培养基，每周更换新鲜培养基，3周后将培养材料转入含300mg/L Carb、25mg/L Kan和0.2mg/L 6-BA的MS培养基，直到再生芽达到2厘米高时转入含100mg/L Carb、25mg/L Kan和0.1mg/L NAA的1/2MS培养基，诱导生根。最后获得46株抗性苗。
为了更一步验证，随机选取在选择培养基上产生20株抗性植株上进行了GUS检测，其中19株抗性植株都检测到了GUS表达。进一步GUS染色阳性植株进行PCR检测。用NPTII基因设计引物，上游引物为PF：5’-GATTGAACAAGATGGATT-3’，下游引物为PR：5’-CATTTTCCACCATGATATTC-3’，扩增600bp的NPTII基因片段，所检测的植株中均扩增出了目的片段。
实施例2广西桂林地区黄花蒿遗传转化实例
选用桂林野生成熟的黄花蒿种子，用体积浓度75％的酒精浸泡种子1分钟后，用5％NaOCl(m/v)浸泡消毒20分钟，然后用无菌水冲洗4遍。将灭菌后的黄花蒿种子接种于1/2MS基本培养基上，培养条件和继代方式与实例1相同。
将携带目的基因表达载体pBin19-GUS的农杆菌AGL0划线培养在含有100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养2天，使其活化，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养，将达到菌对数生长期(OD600＝0.7)的菌液离心，弃上清液，于MS液体培养基悬浮，直至OD600＝0.3，加入120μM乙酰丁香酮，从而得到用于转化的浸染液。
取继代苗龄约为35天的黄花蒿无菌苗枝梢，去叶芽，切成1.5厘米长的茎作为遗传转化的外植体，总共300个外植体，置于侵染液，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，时间分别为25min。侵染完毕后取出外植体用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基：MS+100μM乙酰丁香酮，于25℃、黑暗条件下共培养48h。共培养结束后将外植体转移至诱导培养基：MS+0.1mg/L噻二唑苯基脲，并添加400mg/L Carb和25mg/L Kan，每周更换新鲜培养基，培养条件为光照强度3000lux，每天16小时光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％。2周后将外植体转入含300mg/L Carb、25mg/L Kan、0.05mg/L NAA和0.5mg/L 6-BA的MS培养基，每周更换新鲜培养基，3周后将培养材料转入含300mg/L Carb、25mg/L Kan和0.2mg/L 6-BA的MS培养基，直到再生芽达到2厘米高时转入含100mg/L Carb、25mg/L Kan和0.1mg/L NAA的1/2MS培养基，诱导生根。最后获得46株抗性苗。
为了更一步验证，随机选取在选择培养基上产生20株抗性植株上进行了GUS检测，所有抗性植株都检测到了GUS表达，而非抗性对照植株则无GUS反应。用与实例1同样的方法，进一步对GUS染色阳性植株进行PCR检测，所检测的植株中均扩增出了目的片段。
实施例3重庆酋阳地区黄花蒿遗传转化实例
选用酋阳地区野生的黄花蒿种子，用体积浓度为75％的酒精浸泡种子90秒，用5％NaOCl(m/v)浸泡消毒18分钟，然后用无菌水冲洗3遍。将灭菌后的黄花蒿种子接种于1/2MS基本培养基上，培养条件和继代方式与实例1相同。
将携带目的基因表达载体Impactvector1.1-GUS的农杆菌AGL0划线培养在含有100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养2天，待长出菌落后，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养，将达到菌对数生长期(OD600＝0.6)的菌液离心，弃上清液，用MS液体培养基悬浮，直至OD600＝0.3，加入120μM乙酰丁香酮，从而得到用于转化的浸染液。
取继代苗龄约为40天的黄花蒿无菌苗枝梢，去叶芽，切成2厘米长的茎作为遗传转化的外植体，总共500个外植体，置于侵染液，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，时间为15min。侵染完毕后取出外植体用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基：MS+100uM乙酰丁香酮，于25℃、黑暗条件下共培养60h。共培养结束后将外植体转移至诱导培养基：MS+0.1mg/L噻二唑苯基脲，并添加400mg/L Carb和25mg/L Kan，每周更换新鲜培养基，培养条件为光照强度3000lux，每天16小时光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％。2周后将外植体转入含300mg/L Carb、25mg/L Kan、0.05mg/L NAA和0.5mg/L6-BA的MS培养基，每周更换新鲜培养基，3周后将培养材料转入含300mg/LCarb、25mg/L Kan和0.2mg/L 6-BA的MS培养基，直到再生芽达到2厘米高时转入含100mg/L Carb、25mg/L Kan和0.1mg/L NAA的1/2MS培养基，诱导生根。最后获得46株抗性苗。
为了更一步验证，随机选取在选择培养基上产生30株抗性植株上进行了GUS检测，其中28株抗性植株都检测到了GUS表达，用与实例1同样的方法，进一步对GUS染色阳性植株进行PCR检测，所检测的植株中27株扩增出了目的片段。
本发明中，除非特别说明，所采用的MS培养基来自公开报道的MS培养基，该培养基包括无机成分，有机成分，铁盐，蔗糖和琼脂粉。按照常规的高压蒸汽灭菌方法灭菌(121℃下灭菌20分钟)。文中的1/2MS培养基也属于本领域内的常规技术，指MS盐和维生素减半，其它不变。本发明中的LB液体培养基、及LB固体培养基的配制也属于本领域内的常规技术。
Claims (4)
1.一种黄花蒿的遗传转化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)、黄花蒿无菌苗的准备：将黄花蒿种子灭菌后接种于1/2MS培养基上，在每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％的条件下培养，7天后转至MS培养基，每40天继代一次；
2)、菌株的活化及浸染菌液的制备：将携带目的基因的农杆菌划线培养在含有100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，28℃黑暗培养两天，使其活化，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养，取达到对数生长期的菌液即OD600为0.6-0.7，离心，弃上清液，收集菌体悬浮于MS液体培养基中稀释至OD600＝0.3，加入80-120μmol/L乙酰丁香酮，得到用于转化的浸染液；
3)、侵染和共培养：取继代苗龄为30-40天的黄花蒿无菌苗枝梢，去叶芽，切成1-3厘米长的茎，置于步骤2中的侵染液中，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，侵染时间为15-30min；取出侵染过的外植体，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基：MS培养基+100μmol/L乙酰丁香酮，于25℃、黑暗条件下共培养48-60h；
4)、不定芽的诱导I期：将共培养后的外植体转移至添加有0.1mg/L噻二唑苯基脲、400mg/L羧苄西林及25mg/L卡那霉素的MS培养基中进行诱导培养，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；
5)、不定芽的诱导II期：2周后，将步骤4中的外植体转入含300mg/L羧苄西林、25mg/L卡那霉素、0.05mg/L 1-萘乙酸和0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤的MS培养基，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；
6)、选择性伸长培养：3周后，将步骤5中的培养材料转入含300mg/L羧苄西林、25mg/L卡那霉素和0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤的MS培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；
7)、诱导生根：当步骤6中的再生芽达到2厘米高时转入含100mg/L羧苄西林、25mg/L卡那霉素和0.1mg/L1-萘乙酸的1/2MS培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；诱导其生根，使其形成完整的黄花蒿转基因植株。
2.如权利要求1所述的黄花蒿的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤1中将黄花蒿种子灭菌是指取黄花蒿种子，用70-75％(v/v)酒精浸泡种子1-2分钟后，用5％(m/v)NaOCl浸泡消毒15-20分钟，然后用无菌水冲洗3-4遍。
3.如权利要求1所述的黄花蒿的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤2中乙酰丁香酮的最佳浓度为100μmol/L。
4.如权利要求1所述的黄花蒿的遗传转化方法，其特征在于：所述步骤3中以黄花蒿节间茎为转化材料。
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