CN112877356B - 一种杂交枫香遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杂交枫香胚性愈伤组织的遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。本发明方法包括：采用农杆菌对杂交枫香愈伤组织进行浸染处理，然后将浸染处理后的愈伤组织接种于筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选培养。通过对抗性愈伤组织的PCR阳性鉴定，利用本发明的遗传转化方法可在短时间内获得大量阳性抗性愈伤，即通过利用农杆菌介导法，建立杂交枫香高效遗传转化体系，本发明方法枫香遗传转化效率高，对于培育枫香新品种和基因功能验证具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种以胚性愈伤组织为受体材料，根癌农杆菌介导的杂交枫香遗传转化方法。
背景技术
枫香属(Liquidambar L.)植物为金缕梅科枫香亚科的高大落叶乔木，具有极高的观赏价值、使用价值和生态价值。常绿阔叶树种多数在秋季叶片变黄，逐渐凋落，而枫香在秋季经历较大的昼夜温差后，叶片逐渐转变为红色，是优良的观赏树木，唐朝诗人杜牧即有“停车坐爱枫林晚，霜叶红于二月花”的赞叹。同时，枫香树形优美，木材坚硬，作建筑用材有“梁阁千年枫”之说，是制造家具、胶合板和包装材料的理想用材。此外，枫香树有较为突出的生态价值，其涵养水源能力强，落叶量大，能优化土壤结构，改善林地生境。其中，以中国枫香为父本，北美枫香为母本进行控制授粉所获得的杂交枫香在生长性状方面表现出明显的杂种优势。
遗传转化是指同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。根据感受态建立方式，可以分为自然遗传转化(natural genetic transformation)和人工转化(artificialtransformation)，前者感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性；后者则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。
目前枫香属植物转基因研究普遍以叶片为受体材料的农杆菌介导的遗传转化方法，例如许林、刘冉冉、雷莎等人对枫香叶片进行预培养3d后，使用OD600为0.5的农杆菌菌液对其进行侵染，侵染10min，25℃共培养4d后进行筛选培养，初步获得21株阳性转化苗；又如乔桂荣等人使用OD600为0.5的农杆菌菌液对枫香叶片进行侵染，侵染8～10min，25℃共培养3d后进行筛选培养，成功获得转基因植株；Sullivan和Lagrimini(1993)利用含有gus：nptII的农杆菌对北美枫香叶片进行侵染，侵染7min，28℃共培养3d，成功获得转基因植株。上述方法虽然获得了转基因植株，但是使用叶片进行遗传转化，转化效率低，且易产生嵌合体，而且器官发生培养程序复杂，培养周期长。
本发明方法基于高效的杂交枫香体细胞胚胎发生体系，使用胚性愈伤组织进行遗传转化，一方面，愈伤组织分化程度低，显著减少嵌合体发生，是优良的受体材料；另一方面，体胚发生所需时间短，通过体细胞胚胎发生途径中获得高密度、高质量的体胚苗，比器官发生效率更高，大大缩短育种周期，加速功能验证的进程。
目前国内尚未有杂交枫香胚性愈伤组织遗传转化方面的研究，对进行杂交枫香遗传改良和基因功能研究造成了巨大障碍。
发明内容
本发明的目的是针对现有枫香属植物遗传转化中存在培养程序复杂、培养周期长等技术不足，提供了一种杂交枫香胚性愈伤组织遗传转化的方法，通过采用根癌农杆菌介导的遗传转化法对胚性愈伤组织进行遗传转化，为杂交枫香的遗传转化、品质改良和基因功能验证提供了一个新途径。
为实现上述目的，本发明一方面提供一种杂交枫香胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括采用农杆菌对杂交枫香愈伤组织进行浸染处理，然后将浸染处理后的愈伤组织接种于筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选培养。
其中，所述农杆菌选用EHA105农杆菌。
特别是，所述筛选培养基为含有潮霉素的固体培养基，其中所述固体培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L+Cef 300-400mg/L，调节pH值为5.8。
其中，所述筛选培养基中的潮霉素Hyg的浓度>0mg/L，优选为0-20mg/L，进一步优选为5-15mg/L，更进一步优选为10mg/L。
特别是，所述筛选培养基优选为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶2％+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L+Cef 300mg/L+Hyg 10mg/L。
尤其是，所述筛选培养的培养条件为：暗培养；培养温度为21-25℃，优选为23℃；培养时间为42-84d，优选为63d。
本发明另一方面提供了一种杂交枫香胚性愈伤组织的遗传转化方法，包括如下顺序进行的步骤：
1)制备浸染菌液
将农杆菌接种于共培养培养基中，进行液体悬浮培养，直至菌液的浓度OD600达到0.2-0.8，制得浸染菌液；
2)浸染处理
首先，将杂交枫香的胚性愈伤组织进入浸染菌液中，进行振荡处理；接着倒掉浸染菌液，并吸干愈伤组织表面的浸染菌液；然后将胚性愈伤组织转移至用共培养培养基润湿的滤纸上，于黑暗条件下进行浸染-共培养处理，获得浸染愈伤组织；
3)恢复培养
首先用含有头孢霉素的无菌水浸泡浸染愈伤组织3-4次；接着吸干愈伤组织表面的液体；然后将胚性愈伤组织转移至恢复培养基中，进行恢复培养，获得恢复培养愈伤组织；
4)筛选培养
将恢复培养愈伤组织转移至筛选培养基中，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织。
其中，步骤1)中所述共培养培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L+AS 50-100μM；优选为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L+AS 50μM。
特别是，所述液体悬浮培养的培养条件为：暗培养；培养温度为27-29℃，优选为28℃；液体悬浮培养过程中转速为100-120rpm。
尤其是，液体悬浮培养至浸染菌液的菌液浓度OD600为0.2。
特别是，28℃液体震荡悬浮培养，直至菌液均匀，制得浸染菌液，浸染菌液的菌液浓度OD600为0.2。
其中，所述农杆菌选用EHA105农杆菌。
特别是，还包括对农杆菌进行活化培养，即将-80℃冰箱保存的农杆菌接种至农杆菌活化培养基上，黑暗条件下，于(28±1)℃培养2-3d，获得活化农杆菌后，再进行所述液体悬浮培养。
尤其是，所述农杆菌活化培养基为：含有卡那霉素Kan的LB固体平板培养基，其中所述LB固体平板培养基为：酵母抽提物5g/L+胰蛋白胨10g/L+NaCl10g/L+15g/L琼脂粉。
特别是，所述农杆菌活化培养基中Kan的浓度为45-55mg/L，优选为50mg/L。
活化农杆菌的培养基优选为：酵母抽提物5g/L+胰蛋白胨10g/L+NaCl10g/L+Kan50mg/L+15g/L琼脂粉。
尤其是，用接种环将冰箱保存的EHA105农杆菌工程菌在培养皿内的活化培养基上划线，然后将平板培养皿倒置，放入恒温箱中暗培养，即对农杆菌进行活化培养；其中培养皿内的培养基为含有50mg/L Kan(即卡那霉素)的LB固体培养基，28℃恒温箱中暗培养2d。
特别是，将活化农杆菌用刮刀刮入共培养培养基中，于黑暗条件下，进行液体悬浮培养，制得所述浸染菌液。
其中，步骤2)中所述振荡处理时间为10-30min，优选为20min。
特别是，所述浸染-共培养处理的培养条件为：暗培养，培养温度23～28℃，优选为23℃；浸染-共培养的培养时间为2～4d，优选为2d。
尤其是，所述共培养培养基为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L+AS 50-100μM，调节pH值为5.2；优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L+AS 50μM。
对愈伤组织进行侵染处理，使得浸染液中的质粒进入愈伤组织中。农杆菌侵染植物材料后不能立即完成转化，需要在植物组织创伤处生存一段时间来完成T-DNA的转移，这段时间又称为“细胞调节期”。共培养时间过短侵染不充分，而共培养时间过长容易造成植物材料污染，大量研究表明，根癌农杆菌需要附着在受体材料表面2-4d才能成功转入。
特别是，所述胚性愈伤组织按照W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation of hybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)bysomatic embryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695)的方法进行外植体的灭菌和胚性愈伤组织诱导培养。
尤其是，还包括对胚性愈伤组织进行增殖培养后，再进行浸染处理，其中所述增殖培养为将胚性愈伤组织置于液体增殖培养基中，进行胚性愈伤组织液体增殖培养。
特别是，所述液体增殖培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 1-4mg/L+6-BA0-2mg/L，调节pH值为5.8；优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L。
尤其是，所述胚性愈伤组织的液体增殖培养的培养条件为：暗培养；培养温度为(25±2)℃；培养时间为7-12d，优选为10d。
尤其是，液体增殖培养过程中每1g愈伤组织放入盛有30mL液体增殖培养基中，进行所述的液体增殖培养。
特别是，将愈伤组织和液体增殖培养基置于三角瓶中，进行摇床振荡培养，其中，摇床振荡速率为(120±10)r/min。
尤其是，摇床液体振荡培养于(25±2℃)，黑暗条件，培养7-12d，优选为10d后，除去褐化严重的大块组织。
直接使用固体培养基上的组织，可能会有大块组织，不易被侵染，所以先进行悬浮培养，将组织摇散，使得更多的细胞能接触菌液，进而增大被侵染成功的概率。
其中，步骤3)中所述含头孢霉素的无菌水中头孢霉素的浓度为300-400mg/L，优选为300mg/L；浸泡时间为15-25min/次，优选为20min/次。
头孢霉素用于冲洗掉愈伤组织表面的菌液，头孢霉素用来抑菌，可以更好地抑制材料表面农杆菌的生长。
特别是，所述恢复培养基为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L+Cef(头孢霉素)300-400mg/L，调节pH值为5.8，优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L+Cef300mg/L；
尤其是，所述恢复培养的培养条件是：暗培养；培养温度为(25±2)℃；暗培养时间为6～8d，优选为7d。
其中，步骤4)中所述筛选培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L+Cef300-400mg/L+Hyg 0-20mg/L，调节pH值为5.8；优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L+Cef 300mg/L+Hyg 5-15mg/L；进一步优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L+Cef300mg/L+Hyg 10mg/L。
特别是，所述筛选培养的培养条件是：暗培养；培养温度为21-25℃，优选为23℃；暗培养时间为42-84d，优选为63-84d，进一步优选为63d。
抗性愈伤组织生长至直径为3±0.5mm时，转接至新的筛选培养基上。后续3-4周更换1次筛选培养基，更换培养基时仅转移抗性愈伤组织至新的培养基上，筛选2～3次后获得稳定的抗性愈伤组织。
特别是，所述筛选培养基按照如下步骤筛选获得：
A)将胚性愈伤组织分别接种至含有不同浓度潮霉素的固体增殖培养基上，记录初始接种的愈伤组织的鲜重，每隔7d测量愈伤鲜重；
B)计算愈伤鲜重增长率；计算愈伤组织鲜重增长率，愈伤组织鲜重增长率＝(第n天愈伤组织鲜重—第n-7天愈伤组织鲜重)/第n-7天愈伤组织鲜重；
C)在愈伤鲜重增长率保持负值的处理中选取低潮霉素浓度的培养基为所述的筛选培养基。本发明选择潮霉素浓度为10mg/L。
其中，步骤A)中固体增殖培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1 mg/L，优选为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L。
特别是，步骤A)中所述潮霉素浓度>0mg/L，优选为0-20mg/L，进一步优选为5-15mg/L，更进一步优选为10mg/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明方法利用农杆菌介导法，建立杂交枫香胚性愈伤遗传转化体系，其对培育枫香新品种，相关基因的功能研究，以及进一步建立基因功能快速验证体系具有重要意义。
2、本发明方法采用胚性愈伤组织作为受体材料进行遗传转化，一方面，愈伤组织分化程度低，可以降低嵌合体发生的可能性；另一方面，体胚发生所需时间短，通过体细胞胚胎发生途径中获得的高密度、高质量的体胚苗，比器官发生效率更高，大大缩短育种周期，加速功能验证的进程。
附图说明
图1为愈伤鲜重增长率随培养天数和潮霉素浓度的变化；
图2为Gus表达情况；
图3A为抗性愈伤组织在筛选培养基上生长；
图3B为图3A中抗性愈伤转移至新的筛选培养基上，进行筛选培养；
图4为抗性愈伤组织中目的基因(Gus、htp)的PCR检测图；
图5为抗性愈伤组织中检测农杆菌中毒蛋白基因VirD2的PCR检测图。
对抗性愈伤组织中农杆菌中毒蛋白基因VirD2的PCR检测，如果只对目的基因进行检测，检测到的可能是愈伤组织材料上残留的菌里面质粒上的基因，加上一个VirD2的检测，就可以排除材料上有农杆菌残留导致的假阳性
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
1、杂交枫香胚性愈伤组织
本发明以杂交枫香(北美枫香为母本，枫香优树为父本)的胚性愈伤组织为实验材料。
2、植物生长调节剂
本发明中所使用的植物生长调节剂采用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)；抗生素选用潮霉素(Hyg)、头孢霉素(Cef)、卡那霉素(Kan)；诱导转化物选用乙酰丁香酮(AS)。
潮霉素用作筛选抗生素；潮霉素购自Sigma公司，为浓度50mg/ml过滤灭菌的溶液；头孢霉素用作抑菌抗生素；AS(Aldrich分装)，以少量DMSO助溶后，用灭菌蒸馏水配制成1mg/ml母液，过滤灭菌后，4℃保存备用。
EHA105农杆菌工程菌株：购自上海唯地生物技术有限公司。
3、培养基
(1)改良的Blaydes培养基(Merkle et al.,1998)
表1改良Blaydes培养基的配方
改良的Blaydes培养基为基本培养基，根据配制培养基的体积，向去离子水中依次加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有机成分母液成分和称量好的植物凝胶、蔗糖、水解酪蛋白，pH调整至5.8。在温度121℃下恒温灭菌15分钟。
改良的Blaydes培养基基本配方参考：Merkle SA,Neu KA,Battle PJ,BaileyRL.1998.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature andmature tissues of sweetgum(Liquidambar styraciflua).Plant Science 132:169-178.
(2)LB固体培养基：酵母抽提物5g/L+胰蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+Kan 50mg/L+15g/L琼脂粉。
(2A)固体培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1 mg/L+Cef 300-400mg/L。
(3)液体增殖培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 1-4mg/L+6-BA 0-2mg/L。
(4)共培养培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L+AS 50-100μM。
(5)恢复培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L+Cef 300-400mg/L。
(6)筛选培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L+Cef 300-400mg/L+Hyg0-20mg/L。
上述培养基均调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟，备用。
4、培养条件
(1)胚性组织增殖液体培养：三角瓶，黑暗条件，培养温度(25±2)℃，摇床(110-130转/分)。
(2)农杆菌液体悬浮培养：暗培养，培养温度23-29℃；转速为100-120rpm。
(3)浸染-共培养：暗培养，培养温度23-28℃。
(4)胚性组织的恢复培养：暗培养，培养温度(25±2)℃。
(5)胚性组织的筛选培养：暗培养，培养温度21-25℃。
实施例1胚性愈伤组织诱导培养
参照W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation ofhybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)by somaticembryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695)的方法进行外植体的灭菌和胚性愈伤组织诱导培养。
外植体未成熟合子胚在诱导培养基上培养3-4周后，胚性组织的生长速度开始变慢且外植体开始褐化，此时将胚性组织选出进行胚性组织继代增殖培养，转至继代培养基上于黑暗条件、(25±2)℃下进行重复继代增殖培养(每3周继代培养一次)。
实施例1A抗性潮霉素浓度值筛选
配制含有不同浓度的潮霉素的固体增殖培养基，固体增殖培养基中潮霉素浓度分别为0、5、10、15、20mg/L，其中固体增殖培养基为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L。
选取实施例1诱导培养获得的、鲜重类似、生长状况良好的胚性愈伤组织分别接种至含有不同潮霉素浓度的固体增殖培养基上，每个潮霉素浓度重复3次。
每个固体培养皿内均接种7块生长状态良好的愈伤组织，在超净工作台中称量初始愈伤组织的鲜重并进行记录，每隔7d测量愈伤鲜重，计算愈伤鲜重增长率，其中愈伤鲜重增长率按照如下公式计算：
愈伤鲜重增长率＝(第n天愈伤组织鲜重—第n-7天愈伤组织鲜重)/第n-7天愈伤组织鲜重
愈伤鲜重增长率如图1所示。由图1可知，在培养1周时，所有愈伤组织鲜重均有所增加，鲜重增长率为正值。在培养2周时，在不含潮霉素的培养基上，愈伤鲜重增长率为20.25％；但在加入5mg/L潮霉素的培养基上，愈伤鲜重增长率呈现先降低后升高，愈伤组织在培养2周时，鲜重增长率降低，但仍然为正值；而培养3周，愈伤组织的现在增长率又升高，说明愈伤组织在14d后适应了该潮霉素浓度(5mg/L/)；但在加入10、15、20mg/L潮霉素的培养基上，愈伤鲜重增长率在培养7d后开始下降，之后保持负值，说明组织重量不断降低，部分组织开始褐化死亡。该结果表明，10mg/L的潮霉素足够有效抑制愈伤组织的增长，因此在后续的遗传转化试验中使用10mg/L潮霉素为愈伤组织增殖的选择压。
在愈伤鲜重增长率保持负值的处理中选取较低潮霉素浓度，该潮霉素浓度为愈伤组织潮霉素抗性临界值。本发明杂交枫香遗传转化的抗性筛选潮霉素浓度>0mg/L，优选为0-20mg/L，进一步优选为5-15mg/L，更进一步优选为10-15mg/L，优选为10mg/L。
本发明进行杂交枫香遗传转化中所用质粒的筛选标记基因是潮霉素抗性基因，潮霉素的作用是筛选获得抗性愈伤，即初步获得可能为转基因成功的愈伤组织。
实施例2
1、胚性愈伤组织液体增殖培养
选取实施例1诱导培养获得的生长状况良好的胚性愈伤组织放入液体增殖培养基中，每1g愈伤组织放入盛有30mL液体增殖培养基中，于三角瓶中进行胚性愈伤组织液体增殖培养；于100mL三角瓶中进行培养，每100mL的三角瓶中放置30mL液体增殖培养基；于25℃(通常为(25±2)℃)，黑暗条件，摇床120r/min(通常为110-130rpm)振荡培养10d(7-12d)后，去除褐化严重的大块的胚性愈伤组织，获得液体增殖培养的愈伤组织。
2、制备浸染液
2-1)农杆菌活化培养
取-80℃冰箱保存的试验用EHA105农杆菌工程菌株(购自上海唯地生物技术有限公司)，并接种在农杆菌活化培养基上，即用接种环在含有50mg/L Kan(卡那霉素)的LB固体平板培养基上划线，接着将平板倒置放入28℃温箱中暗培养2d，获得活化农杆菌；
2-2)制备浸染菌液
将活化农杆菌用刮刀刮入共培养培养基中，即将活化农杆菌接种于共培养培养基中，黑暗条件下，摇床震荡培养，进行液体悬浮培养，其中液体悬浮培养温度为28℃(通常为27-29℃)，转速为100-120rpm；直至用刮刀刮下的农杆菌菌块全部溶解，菌液均匀一致，培养至菌液的浓度OD600达到0.2(通常OD600为0.2-0.8)，得到侵染菌液；
共培养培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D1mg/L+6-BA 0.5mg/L+AS 50μM；
3、浸染处理
对液体增殖培养的胚性愈伤组织进行抽滤，称取1g愈伤组织浸入浸染菌液中，进行振荡培养，振荡培养10min(通常为10-30min)后，倒掉浸染菌液，并用抽滤装置吸干胚性愈伤组织表面的菌液；接着用共培养培养基将滤纸润湿，然后将吸干表面菌液的胚性细胞团(即胚性愈伤组织)转入用共培养基润湿的滤纸上，在黑暗条件下进行浸染-共培养，其中，浸染-共培养温度为23℃(通常为23-28℃)，共培养时间2d(通常为2-4d)，获得浸染愈伤组织；
共培养培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D1mg/L+6-BA 0.5mg/L+AS 50μM；
4、恢复培养
将浸染愈伤组织用加入300mg/L头孢霉素的无菌水浸泡3次(通常为3-4次)，每次浸泡20min(通常为15-25min)，接着使用抽滤装置吸干愈伤组织细胞团表面的废液；然后将愈伤组织转移至恢复培养基中，于黑暗条件下进行恢复培养，其中恢复培养的培养温度为23℃(通常为25±2℃)；培养时间为7d(通常为6-8d)；获得恢复培养愈伤组织；
恢复培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+Cef 300mg/L。
5、筛选培养
将恢复培养愈伤组织转移至筛选培养基，于黑暗条件下进行筛选培养，获得抗性愈伤组织，其中筛选培养的培养温度为23℃(通常为21-25℃)；培养时间为21d，获得第一次筛选的愈伤组织；在筛选培养过程中每3-4周更换1次筛选培养基；筛选次数为2-3次；筛选培养时间为42-84d。
筛选培养基为：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+Cef 300mg/L+Hyg 10mg/L；
实施例3
除了步骤2)制备浸染菌液过程中培养至菌液的浓度OD600达到0.5；步骤3)浸染培养处理过程中浸染处理过程中振荡培养时间为20min；浸染-共培养温度为25℃，培养时间为2d之外，其余与实施例2相同。
实施例4
除了步骤3)浸染-共培养处理过程中浸染处理过程中振荡浸染培养时间为20min；浸染-共培养温度为28℃，培养时间为3d之外，其余与实施例2相同。
实施例5
除了步骤2)制备浸染菌液过程中培养至菌液的浓度OD600达到0.5；步骤3)浸染培养处理过程中浸染处理过程中振荡浸染培养时间为30min；浸染-共培养温度为23℃，培养时间为3d之外，其余与实施例2相同。
实施例6
除了步骤3)浸染培养处理过程中浸染处理过程中振荡浸染培养时间为30min；浸染-共培养温度为25℃，培养时间为4d之外，其余与实施例2相同。
实施例7
除了步骤2)制备浸染菌液过程中培养至菌液的浓度OD600达到0.8；步骤3)浸染培养处理过程中浸染处理过程中振荡浸染培养时间为20min；浸染-共培养温度为23℃，培养时间为4d之外，其余与实施例2相同。
试验例1 GUS染色处理
在实施例2-7的筛选处理过程中，分别取筛选培养了7d的愈伤组织，使用GUS染色试剂对获得的抗性愈伤组织进行染色处理，并在显微镜下观察并统计Gus阳性斑点数，通过Gus基因表达检测转化效率，愈伤组织的Gus阳性斑点统计结果如表1所示。
实施例2中筛选培养7d的愈伤组织显微镜下观察Gus表达情况如图2，图2中的蓝点即为Gus的表达位点，这些位点在以后的筛选过程中有长成抗性愈伤的可能。
试验例2抗性愈伤组织统计
将实施例2-7筛选培养处理步骤第一次培养获得的生长至直径为3±0.5mm的抗性愈伤组织(如图3A，标尺大小为1000um)，在超净工作台中用镊子将抗性愈伤组织分别分离下来，再分别接种至新的筛选培养基中(如图3B，标尺大小为1cm)，继续进行筛选培养，在筛选培养过程中每3-4周更换1次筛选培养基，筛选培养3次后，统计获得的抗性愈伤组织的数量，并计算抗性愈伤数，其中抗性愈伤数按照公式(1)计算，统计结果如表1所示。
抗性愈伤数(个/g)＝抗性愈伤总数/被侵染愈伤重量(g)(1)
公式(1)中，抗性愈伤总数为筛选培养3次后，统计获得抗性愈伤组织个数，个；被浸染愈伤总量为1g，g。
表1杂交枫香遗传转化检测结果
试验例3基因htp、Gus的PCR检测
(8)对抗性愈伤组织中目的基因htp、Gus的PCR检测：
按新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320-03，天根生化科技(北京)有限公司)操作，对实施例2-7中筛选培养3次后的抗性愈伤组织进行DNA提取，将收集好的DNA放于-20℃，备用。
PCR所用试剂为2×TSINGKE Master Mix(TSE003，北京擎科新业生物技术有限公司)；PCR引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
以Gus,hpt序列为模板，
设计引物Gus：
F：5’CAGTGAAGGGCGAACAGTTC3’；
R：5’GCGAAATATTCCCGTGCACT3’，片段大小为557bp；
设计引物hpt：
F：5’ACA CTACATGGCGTGATTTCAT3’；
R：5’TCCACTATCGGCGAGTACTTCT3’，片段大小为453bp。
以上述提取的抗性愈伤组织DNA为模板进行PCR扩增。
PCR程序:94℃预变性4min，进入循环扩增阶段：94℃30s，55℃30s，72℃1min，循环30次；在72℃保温5min，结束反应，将PCR产物放于4℃保存。
将PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中恒压140V下进行电泳分离30min，检查目的条带，如图4。
由图4可知：经Hyg筛选得到的抗性细胞系，成功检测出Gus基因片段和hpt基因片段。其中，A、B、C、D、E、F分别为实施例2-7中的PCR阳性抗性细胞系编号，W为以ddH2O作为模板进行扩增以排除PCR体系水中杂质的污染作为阴性对照，+为以质粒EHA105菌液作为模板进行扩增作为阳性对照。检测结果表明本发明方法进行杂交枫香的遗传转化所获得的抗性愈伤组织DNA中有质粒的存在，本发明方法转化方法可行，转化效率高。
试验例4排除农杆菌污染导致的假阳性
为排除侵染所用农杆菌残留污染导致的试验例3中假阳性结果，以含有试验所用质粒的EHA105菌液为模板，对该菌中特有毒蛋白基因VirD2进行扩增。
对农杆菌毒性基因VirD2片段进行扩增，以VirD2为模板设计引物VirD2：F：5’TTCGTCACGGCATAGTCCTG3’，R：5’TTGCTCGGTACGGATGGAAG3’，片段大小为656bp。以上述提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR程序为：94℃预变性4min，进入循环扩增阶段：94℃30s，55℃30s，72℃1min，循环30次，最后在72℃保温5min，结束反应，将PCR产物放于4℃保存。将PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶中恒压140V下进行电泳分离30min，检查目的条带。
VirD2基因片段扩增结果如图5，由图5可知，农杆菌菌液成功扩增出该基因片段(阳性对照)，而试验例3中的其他抗性细胞系及未侵染组织均无该基因片段条带(图5)，其中A、B、C、D、E、F分别为实施例2-7中的PCR阳性抗性细胞系编号，W为以ddH2O作为模板进行扩增以排除PCR体系水中杂质的污染作为阴性对照，+为以质粒EHA105菌液作为模板进行扩增作为阳性对照。从图5的实验结果可知，排除了因农杆菌污染导致PCR结果阳性的可能，证明成功发生遗传转化。
统计获得的PCR阳性愈伤组织(PCR成功获得htp、Gus，但不能获得VirD2)的数量，并计算PCR阳性愈伤组织数，其中PCR阳性愈伤组织数按照公式(2)计算，统计结果如表1所示。
公式(2)中，统计获得PCR转基因阳性愈伤数，个；被浸染愈伤总量为1g，g。
本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1. 一种杂交枫香胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：
1）制备浸染菌液
将EHA105农杆菌接种于共培养培养基中，进行液体悬浮培养，直至菌液的浓度OD600达到0.2-0.8，制得浸染菌液，其中，所述共培养培养基为：改良Blaydes基本培养基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA 0-1 mg/L+ AS 50-100μM；
2）浸染处理
首先，将杂交枫香的胚性愈伤组织进入浸染菌液中，进行振荡处理；接着倒掉浸染菌液，并吸干愈伤组织表面的浸染菌液；然后将胚性愈伤组织转移至用共培养培养基润湿的滤纸上，于黑暗条件下进行浸染-共培养处理，获得浸染愈伤组织，其中所述共培养培养基为：改良Blaydes基本培养基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA0-1 mg/L+ AS 50-100μM；
3）恢复培养
首先用含有头孢霉素的无菌水冲洗浸染愈伤组织3-4次，其中所述含头孢霉素的无菌水中头孢霉素的浓度为300-400mg/L；冲洗时间为15-25min/次；接着吸干愈伤组织表面的液体；然后将胚性愈伤组织转移至恢复培养基中，进行恢复培养，获得恢复培养愈伤组织，其中所述恢复培养基为：改良Blaydes基本培养基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+ 植物凝胶0.5-3%+ 2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA 0-1 mg/L+Cef 300-400mg/L；
4）筛选培养
将恢复培养愈伤组织转移至筛选培养基中，进行筛选培养，获得抗性愈伤组织，其中所述筛选培养基为：改良Blaydes基本培养基 + 水解酪蛋白1g/L +蔗糖40 g/L+ 植物凝胶0.5-3%+ 2,4-D 0.5-2 mg/L + 6-BA 0-1 mg/L+Cef 300-400 mg/L +Hyg 0-20 mg/L；
其中所述改良Blaydes基本培养基配方如下（mg/L）：
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述筛选培养基中Hyg的浓度为5-15 mg/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述筛选培养基中Hyg的浓度为10mg/L。
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