CN114875064B

CN114875064B - 杂交枫香基因编辑载体、其构建方法、及其应用

Info

Publication number: CN114875064B
Application number: CN202210715444.8A
Authority: CN
Inventors: 张金凤; 黄超; 江帅菲; 赵健; 范英明; 崔莹; 包芬
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN114875064A

Abstract

本发明公开了一种杂交枫香基因编辑载体、其构建方法及其应用方法，属于植物基因工程技术领域，设计2个靶点，以AtU3b和AtU3d为两个靶点的启动子，经过三轮PCR反应，构建杂交枫香PDS基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9‑PDS；将构建的基因编辑载体转入胚性愈伤组织中并进行了鉴定，成功获得基因编辑事件。本发明建立杂交枫香基因编辑载体，对杂交枫香植物基因进行精确编辑，产生PDS基因的碱基缺失或替换，基因编辑效率高，本发明的在杂交枫香中能高效、多靶点基因编辑的基因编辑载体极大地促进杂交枫香植物基因功能研究及性状改良。

Description

杂交枫香基因编辑载体、其构建方法、及其应用

技术领域

本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种以胚性愈伤组织为受体材料，立足已有的遗传转化体系，成功建立基因编辑体系的方法，特别涉及一种枫香属植物的基因编辑方法。

背景技术

枫香属(Liquidambar L.)植物为金缕梅科枫香亚科的高大落叶乔木，具有极高的观赏价值、使用价值和生态价值。常绿阔叶树种多数在秋季叶片变黄，逐渐凋落，而枫香在秋季经历较大的昼夜温差后，叶片逐渐转变为红色，是优良的观赏树木，唐朝诗人杜牧即有“停车坐爱枫林晚，霜叶红于二月花”的赞叹。同时，枫香树形优美，木材坚硬，作建筑用材有“梁阁千年枫”之说，是制造家具、胶合板和包装材料的理想用材。此外，枫香树有较为突出的生态价值，其涵养水源能力强，落叶量大，能优化土壤结构，改善林地生境。其中，以中国枫香为父本，北美枫香为母本进行控制授粉所获得的杂交枫香在生长性状方面表现出明显的杂种优势。

基因编辑技术是指人类基于基因工程中遗传转化等技术，将基因编辑工具导入到细胞中，从而实现对靶位点的碱基敲除、插入等。在细胞中，如果DNA双链断裂(double-strand break，DSB)，需要得到及时且准确地修复，但往往在修复中可能会出现错误，导致基因的移码突变，如碱基的插入或缺失(Goodarzi AA,Jeggo PA.The repair andsignaling responses to DNA double-strand breaks[J].Advances in Genetics,2013,82:1-45.)。在真核生物中，DNA单链损伤可通过以另一条链为模板进行准确的修复，而DNA双链损伤时主要依靠同源重组修复途径和非同源末端连接途径两种途径进行修复，正是由于生物体内两种修复机制的存在，生物体基因组的稳定和完整才得以维持。基因编辑特别是基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术在植物中依赖的是NHEJ途径。植物中DNA的修复以NHEJ途径为主，这种修复途径经常会导致基因组碱基的缺失、插入或者突变。随着CRISPR/Cas技术的不断完善，且已经在林木中成功应用，本发明拟在已建立的杂交枫香组织培养和体细胞胚胎发生高效再生技术的基础上，利用已有的细胞系对遗传转化条件进行探索，并尝试建立杂交枫香基因编辑体系，这对于探索杂交枫香基因组功能研究以及后续的遗传改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有研究中还没有采用基因编辑，通过转化获得基因编辑再生枫香属植株的技术，提供一种杂交枫香基因编辑载体、其构建方法，及其应用。

本发明是在已有的遗传转化体系基础上，构建CRISPR/Cas9载体，以易于表型检测的编码八氢番茄红素脱氢酶基因PDS(Phytoene desaturase)为编辑的靶基因。PDS基因能够催化无色的八氢番茄红素生成有色的类胡萝卜素，保证了其它下游类胡萝卜素的顺利合成，因此对其进行敲除以后会严重影响类胡萝卜素的生成，能够获得易于观察表型的白化苗，是检验CRISPR/Cas9效果的理想基因。基于以上初步建立一套杂交枫香基因编辑技术体系，为编辑事件的发生提供依据，并对转化后抗性愈伤组织的胚性影响进行初步讨论。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种杂交枫香植物基因编辑载体的构建方法，包括如下步骤：

A、从野生型杂交枫香胚性愈伤组织中克隆PDS基因部分序列，确定克隆得到的序列包含PDS基因第一外显子序列；

B、根据PDS目的基因设计两个靶点：PDS1、PDS2，其中PDS1、PDS2序列分别为：

PDS1：TTCGGAACTCGCCATCCTCCTGG；SEQ ID NO.5；

PDS2：GCAAGAACAAGGCCAAGGAAGGG；SEQ ID NO.6；

C、选择以拟南芥AtU3b和AtU3d为两个靶点的启动子，设计3个靶点接头引物；并合成2个Overlapping PCR引物对；

D、以质粒pYLgRNA-AtU3b为模板，以2个引物对U-F/gR-R；Guide1-PDS-gRT/Guide1-PDS-U3b，进行第一轮的Overlapping PCR反应，将质粒上的AtU3b启动子与sgRNA序列、靶点序列相连，获得第一轮PCR产物PDS-AtU3b-sgRNA；

以质粒pYLgRNA-AtU3d-LacZ为模板，以2个引物对U-F/gR-R；Guide2-PDS-gRT/Guide2-PDS-U3d，进行第一轮的Overlapping PCR反应，将质粒上的AtU3d启动子与sgRNA序列、靶点序列相连，获得第一轮PCR产物PDS-AtU3d-sgRNA；

E、以PDS-AtU3b-sgRNA为模板，以Pps-GGL、Pgs-GG2为引物，进行第二轮PCR反应，获得第二轮PCR的连接产物AtU3b-PDS1-sgRNA-Bsa I；

以PDS-AtU3d-sgRNA为模板，以Pps-GG2、Pgs-GGR为引物，进行第二轮PCR反应，获得第二轮PCR的连接产物LacZ-AtU3d-PDS2-sgRNA-Bsa I；

F、采用Golden Gate cloning方法，将第二轮PCR反应产物与质粒pYLCRISPR/Cas9进行酶切连接反应，即第三轮PCR反应，获得构建完整pYLCRISPR/Cas9-PDS载体。

其中，步骤A)中按照如下方法克隆PDS基因部分序列：

A1、对杂交枫香的PDS基因序列与转录组序列进行比对，分析获得杂交枫香第一外显子区域序列，SEQ ID NO.1；

A2、对杂交枫香胚性愈伤组织提取RNA，并反转录获得cDNA；对杂交枫香胚性愈伤组织提取DNA；

A3、针对分析所得第一外显子区域设计引物，以提取基因组DNA、cDNA为模板，进行PCR扩增并测序，用软件DNAMAN将测序结果与PDS基因序列进行比对，确定测得序列位于第一外显子区域。

其中，步骤C)中所述3个靶点接头引物为gRT#、U3b#、U3d#，其序列分别为：

gRT#：gttttagagctagaaat，SEQ ID NO.13；

U3b#：tgaccaatgttgctcc，SEQ ID NO.14；

U3d#：tgaccaatggtgctttg，SEQ ID NO.15。

特别是，所述2个Overlapping PCR引物对为Guide1-PDS-gRT/Guide1-PDS-U3b、Guide2-PDS-gRT/Guide2-PDS-U3d，其序列分别为：

Guide1-PDS-gRT：ttcggaactcgccatcctccgttttagagctagaaat，SEQ ID NO.16；

Guide1-PDS-U3b：ggaggatggcgagttccgaatgaccaatgttgctcc，SEQ ID NO.17；

Guide2-PDS-gRT：gcaagaacaaggccaaggaagttttagagctagaaat，SEQ ID NO.18；

Guide2-PDS-U3d：ttccttggccttgttcttgctgaccaatggtgctttg，SEQ ID NO.19。

其中，步骤D)中所述引物对U-F/gR-R的序列分别为：

U-F：ctccgttttacctgtggaatcg，SEQ ID NO.7；

gR-R：cggaggaaaattccatccac，SEQ ID NO.8。

特别是，步骤E)中所述引物Pps-GGL、Pgs-GG2的序列为：

Pps-GGL：ttcagaggtctctctcgactagtatggaatcggcagcaaagg，SEQ ID NO.9；

Pgs-GG2：agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc，SEQ ID NO.10；

特别是，步骤E)中所述引物Pps-GG2、Pgs-GGR的序列为：

Pps-GG2：ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg，SEQ ID NO.11；

Pgs-GGR：agcgtgggtctcgaccgacgcgtatccatccactccaagctc，SEQ ID NO.12。

其中，步骤F)中所述质粒pYLCRISPR/Cas9按照文献方法构建，Ma X,Zhang Q,ZhuQ.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284.。

特别是，还包括步骤G)，将第三轮PCR反应产物构建完整的pYLCRISPR/Cas9-PDS载体转化到大肠杆菌T1中，获得阳性菌落；接着对阳性菌落进行培养，并提取质粒，获得扩大量的杂交枫香植物基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-PDS。

其中，步骤G)中采用热激法将第三轮PCR产物转化大肠杆菌T1。

特别是，将第三轮PCR产物加入到大肠杆菌感受态细胞中，再加入LB液体培养基，进行培养；然后将菌液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，于恒温培养箱中，37℃培养，获得所述抗性大肠杆菌菌落。

尤其是，还包括对抗性菌落进行菌落PCR反应，并对菌落PCR产物进行电泳检测，筛选出具有目的判断的阳性菌落；然后对阳性菌落进行培养，并提取质粒。

特别是，所述菌落PCR反应的上下游引物为：

SP-T1：gcggtgtca tctatgttactag，SEQ ID NO.20；

SP-R：cccgacatagatgcaataacttc，SEQ ID NO.21。

特别是，还包括步骤H)，将步骤G)获得的pYLCRISPR/Cas9-PDS杂交枫香植物基因编辑载体转化农杆菌EHA105，即将载体pYLCRISPR/Cas9-PDS加入到农杆菌EHA105中，培养获得转化pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒的农杆菌。

尤其是，还包括对转化pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒的农杆菌进行菌落PCR反应，筛选阳性菌落，即成功转入pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒的农杆菌菌落；然后将阳性菌落加入到LB液体培养基中，培养获得菌液；然后加入与菌液等量的50％甘油(已灭菌)进行保菌，混匀后，存放于-80℃冰箱。

本发明另一方面提供一种按照上述方法构建而成的杂交枫香植物基因编辑载体。

本发明又一方面提供一种杂交枫香植物基因编辑载体在杂交枫香植物中进行基因编辑的应用，包括如下步骤：

1)将构建的杂交枫香植物基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-PD转化到农杆菌；然后对杂交枫香植物的胚性愈伤组织进行浸染处理，获得浸染愈伤组织；

2)将浸染愈伤组织转移至恢复培养基中，进行恢复培养，获得恢复培养胚性愈伤组织；

3)将恢复培养胚性愈伤组织转移至筛选培养基中，进行筛选培养，每3周更换一次筛选培养基，筛选获得抗性胚性组织；

4)将抗性胚性组织转移至成熟培养基中，进行成熟培养，获得成熟子叶体胚；然后移入萌发培养基中进行萌发培养，获得抗性植株。

其中，步骤1)中所述杂交枫香植物的胚性愈伤组织在进行浸染处理之前，还包括对杂交枫香植物的胚性愈伤组织进行液体增殖培养，即将杂交枫香植物的胚性愈伤组织放入液体增殖培养基中，于23±1℃，黑暗条件下，振荡培养7-10d，获得增殖的胚性愈伤组织。

特别是，步骤1)中所述浸染处理包括如下步骤：

1A)将杂交枫香植物的胚性愈伤组织加入到农杆菌浸染液中，进行浸染处理，浸染处理5-15min后，抽滤吸干愈伤组织表面的菌液；

1B)将愈伤组织连同滤纸一同转移到被液体共培养培养基润湿的滤纸上，于23±1℃、黑暗条件下进行浸染-共培养处理，获得浸染愈伤组织。

尤其是，步骤1A)中所述农杆菌浸染液按照如下方法制备而成，将阳性克隆农杆菌用液体共培养培养基(基本培养基(Merkle et al.,1998)+1mg 2,4-D+0.5mg 6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白，pH调至5.6～5.7)稀释而成。

尤其是，所述农杆菌浸染液在600nm波长下菌液OD值为0.2-0.3。

特别是，还包括测定农杆菌菌液在600nm波长下菌液OD值；根据OD₆₀₀值，对菌液进行稀释，直至农杆菌菌液OD₆₀₀＝0.2-0.3，制得农杆菌浸染液，其中稀释用培养基为液体共培养培养基(基本培养基(Merkle et al.,1998)+1mg 2,4-D+0.5mg 6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白，pH调至5.6～5.7)

其中，所述阳性克隆农杆菌按照如下方法获得：将构建的载体pYLCRISPR/Cas9-PDS加入到农杆菌EHA105中，摩擦管壁混匀，冰浴10min后，放入液氮中5min，然后再迅速取出放置于37℃水浴锅中5min，取出后立即再冰浴5min；向农杆菌中再加入不含抗生素的LB液体培养基，28℃恒温振荡器中培养3h后离心处理，收集菌体；将离心后的剩余液体与菌体吹打混匀，使用涂布棒涂布于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上于28℃恒温培养48-72h，获得转化pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒的农杆菌，即阳性克隆农杆菌。

其中，步骤2)中所述恢复培养基为：改良Blaydes基本培养基+1mg 2,4-D+0.5mg6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+300mg/LCef，pH调至5.6～5.7。

特别是，进行恢复培养之前，还包括用含头孢霉素的无菌水溶液冲洗浸染愈伤组织3-4次，每次20min；其中含头孢霉素的无菌水溶液的浓度为300mg/L(通常为250-350mg/L)。

尤其是，所述恢复培养条件为：23℃(通常为23±1℃)；黑暗条件；恢复培养7d(通常为6-8d)。

其中，步骤3)中所述筛选培养基为：改良Blaydes基本培养基+1mg 2,4-D+0.5mg6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+300mg/LCef+10mg/LHyg，pH调至5.6～5.7。

特别是，所述筛选培养条件为：23℃(通常为23±1℃)；黑暗条件；筛选培养28-42d。

其中，步骤4)中所述成熟培养基为：改良Blaydes基本培养基+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH调至5.6～5.7；所述萌发培养基为：改良Blaydes基本培养基+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH调至5.6～5.7。

特别是，所述成熟培养条件为：25℃(通常为25±2℃)；黑暗条件；成熟培养90d(通常为80-100d)；所述萌发培养条件为：25℃(通常为25±2℃)；黑暗条件；萌发培养60d(通常为50-70d)。

本发明的基因编辑载体是适用于单子叶和双子叶植物多重基因组编辑的高效率的CRISPR/Cas9载体系统。多个sgRNA表达盒可以在一轮克隆中组装成二元CRISPR/Cas9载体。本发明的基因编辑载体在杂交枫香植物中的效率高。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、初步研究了杂交枫香基因编辑体系。

2、以PDS为靶基因，双子叶植物基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9为载体骨架，成功构建重组质粒：pYLCRISPR/Cas9-PDS，本发明构建的基因编辑载体对杂交枫香植物基因进行精确编辑，产生PDS基因的碱基缺失或替换，显示了基因编辑的高效率。

3、利用这两个重组质粒和前期探索的遗传转化过程对杂交枫香胚性愈伤组织进行侵染，经过1-2月筛选培养，对抗性愈伤组织的靶序列的测序分析，PDS突变体检测到单碱基的缺失和替换。本发明的在杂交枫香中能高效、多靶点基因编辑的基因编辑载体极大地促进杂交枫香植物基因功能研究及性状改良。

附图说明

图1为PDS基因序列及CDS序列的PCR验证电泳图；

图2为PDS靶点RNA折叠分析图，其中A为靶点1的RNA折叠分析图；B为靶点2的折叠分析图；

图3为第二轮PCR反应产物电泳图，其中M:2K plus Marker；1：AtU3b-sgRNA，2：LacZ-AtU3d-sgRNA；

图4为大肠杆菌菌落PCR电泳图，其中M:2K plus Marker；标记1-8：大肠杆菌菌落PCR产物电泳泳道；

图5为农杆菌菌落PCR电泳图，其中M:2K plus Marker；标记1-5：农杆菌菌落PCR产物电泳泳道；

图6为抗性愈伤中HPT基因(750bp)的PCR验证电泳图，其中M：Trans5K DNAMarker；W:野生型；P1-P9：转pYLCRISPR/Cas9-PDS抗性愈伤组织；+：质粒阳性对照；

图7为杂交枫香抗性愈伤组织体胚萌发体胚苗，其中，A为体细胞胚胎萌发嵌合体植株，根部白色植株；B、C为体细胞胚胎萌发绿色和白色嵌合体植株，叶片白色植株；

图8为基因编辑抗性愈伤组织PDS片段PCR验证电泳图，其中P1,P2,P3,P4,P5,P6,P8,P9：PDS第一外显子部分序列PDS1；W：野生型；M:Marker；

图9为基因编辑抗性愈伤组织PDS基因编辑位点序列比对分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

1、杂交枫香胚性愈伤组织

本发明以杂交枫香(北美枫香为母本，枫香优树为父本)的胚性愈伤组织为实验材料。

2、植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节剂采用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)；抗生素选用潮霉素(Hyg)、头孢霉素(Cef)；诱导转化物选用乙酰丁香酮(AS)。

3、培养基

(1)改良的Blaydes培养基(Merkle et al.,1998)，如表1。

表1改良Blaydes培养基的配方

改良的Blaydes培养基为基本培养基，根据配制培养基的体积，向去离子水中依次加入所需的大量元素母液成分、微量元素母液成分和有机混合物母液成分和称量好的植物凝胶(固体培养基添加；液体培养基不添加植物凝胶)、蔗糖、水解酪蛋白，pH调整至5.8。在温度121℃下恒温灭菌15分钟。

改良的Blaydes培养基基本配方参考：Merkle SA,Neu KA,Battle PJ,BaileyRL.1998.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature andmature tissues of sweetgum(Liquidambar styraciflua).Plant Science 132:169-178.

(2)LB固体培养基：酵母抽提物5g/L+胰蛋白胨10g/L+NaCl 10g/L+卡那霉素(Kan)50mg/L+15g/L琼脂粉

(3)液体增殖培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L，通常为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(4)共培养培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+AS 50μM，通常为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L+AS 50μM。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(5)恢复培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+Cef 300mg/L，通常为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L+Cef 300mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(6)筛选培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶3％+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+Cef 300mg/L+Hyg 10mg/L，通常为改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA 0-1mg/L+Cef 300mg/L+Hyg 10mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(7)成熟培养基：基本培养基+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH调至5.6～5.7。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(8)萌发培养基：基本培养基+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH调至5.6～5.7。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

4、培养条件

(1)胚性组织的增殖培养、恢复培养、筛选培养、成熟培养、萌发培养的培养条件：黑暗条件，培养温度(25±2)℃。

(2)胚性组织增殖液体培养的培养条件：三角瓶，黑暗条件，培养温度(25±2)℃，摇床(100-120转/分)。

5、分子工具、试剂

植物表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H、pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b均按照华南农业大学生命科学学院刘耀光教授公开的方法进行构建，构建方法参见文献Ma X,Zhang Q,Zhu Q.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284.，具体操作如下：

Cas9p基因序列通过多轮overlapping PCR合成。使用Omega-PCR克隆方法,Cas9p与Pubi和P35S连接，并将连接产物再连接到来自pCAMBIA1300(CAMBIA，堪培拉，澳大利亚)的二元载体中，再将一个包含修饰过的ccdB，两侧有两个BsaI位点的片段连接到载体中，生成pYLCRISPR/Cas9。

从拟南芥中扩增出AtU3b、AtU3d启动子序列。通过overlapping PCR将sgRNA和启动子序列反向连接，得到pYLsgRNA-AtU3b和pYLsgRNA-AtU3d。

通过Omega-PCR克隆，将大肠杆菌启动子LacZ序列(全长198bp)插入pYLsgRNA-AtU3d，得到pYLsgRNA-AtU3d/LacZ。

载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H、pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b华南农业大学生命科学学院刘耀光教授以及本申请人均可以长期提供。

大肠杆菌(Escherichia coli)T1购自北京全式金生物技术公司；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105购自上海唯地生物技术有限公司；

BamHⅠ限制性内切酶、BsaⅠ限制性内切酶、KOD酶、T4 DNA Ligase(连接酶)等购于NEB(NEW ENGLAND BioLabs)公司；2×TSINGKE Master Mix(TSE003)购自北京擎科新业生物技术有限公司；

Trans2K Plus DNA Marker,质粒提取试剂盒,胶回收试剂盒购于北京全式金生物技术公司；

卡那霉素(Kan)贮存液为20mg/mL，-20℃储存。所用菌液保存剂为50％甘油，-20℃储存。

引物合成和基因序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司完成；

6、仪器设备

表2仪器设备

实施例1基因序列验证

杂交枫香PDS基因是类胡萝卜素合成的关键基因，对其敲除以后会严重影响类胡萝卜素的生成，能够获得易于观察表型的白化苗，是检验基因编辑效果的理想基因。为确保序列准确性，首先从野生型杂交枫香胚性愈伤组织中克隆相应序列，具体步骤如下：

在杂交枫香的基因组数据中查找PDS(Phytoene desaturase)基因序列号，并根据序列号找到相应基因序列。用软件DNAMAN将该基因组序列与转录组序列进行比对，分析第一外显子区域序列(SEQ ID NO.1)。

针对分析所得第一外显子区域及其上下游序列，利用Primer5.0设计引物，对基因组DNA和cDNA进行扩增并测序，用软件DNAMAN将测序结果与PDS基因序列进行比对，确定测得序列包含第一外显子区域。

使用CTAB法提取杂交枫香胚性愈伤组织DNA；

参照艾德莱RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)说明方法提取杂交枫香胚性愈伤组织RNA，然后以提取的RNA为模板进行反转录获得cDNA，参照全式金cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)。

分别以基因组DNA、cDNA作为模板，对PDS的第一外显子区域序列进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析、验证，PCR扩增验证电泳结果如图1，其中：标记1为PDS包含第一外显子序列进行PCR扩增(459bp)；标记2为PDS CDS包含第一外显子序列扩增(651bp)；M为Marker 2K plus。测序结果为PDS序列为SEQ ID NO.2，包含第一外显子序列；PDS部分CDS序列为SEQ ID NO.3，包含第一外显子序列。

实施例2靶点选择、引物设计

CRISPR/Cas9技术是目前为止最为完善的基因编辑技术，参照华南农业大学刘耀光教授课题组的pYLCRISPR/Cas9载体系统，pYLCRISPR/Cas9载体系统的构建方法参照文献(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants[J].MolecularPlant,2015,8(8):1274-1284.)，构建相应载体。

1、选择靶点

为增加打靶效率，本发明中每个基因选择两个靶点，具体步骤如下：

1A)使用在线软件CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计靶点：靶点的GC％最好在50％～70％；靶点内不能有连续4个以上的T，以防止被RNA Pol III作为转录终止信号；靶点内不能有Bsa I的酶切位点，以防后续载体构建被Bsa I酶切(GGTCTC)。

1B)RNA折叠分析：在靶点序列(20bp targe)后加入sgRNA序列(SEQ ID NO.4，GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT)，使用在线软件RNAfold WedSever(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)进行二级结构分析(如图2)。

观察靶序列与sgRNA序列产生的连续配对，连续配对不高于10bp的靶点，以防其与染色体DNA靶序列结合靶点受到抑制。

以满足1A、1B要求的靶点作为终选靶点，设计出2个PDS的靶点，如表3。

表3 PDS靶点

基因	靶点	％GC	序列号
				PDS1	TTCGGAACTCGCCATCCTCCTGG	60％	SEQ ID NO.5
PDS2	GCAAGAACAAGGCCAAGGAAGGG	50％	SEQ ID NO.6

2、通用引物设计

根据植物表达载体pYLCRISPR/Cas9、pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b引物的应用原理，双靶点通用引物设计序列如表4所示：

表4载体构建的通用引物

3、靶点接头设计

目标植株杂交枫香为双子叶植物，因此选择U3b和U3d为两个靶点的启动子，U3基因由RNA聚合酶III转录，转录起始位点是碱基A。U3启动子识别碱基A启动转录，且其末端为A碱基，所以由U3启动子驱动的sgRNA第一个碱基如果为A，应该去掉。因此，在设计接头引物时需要分情况讨论：

(1)如果目标区域NGG(PAM)上游第20个碱基是A，则把A碱基下游的19个碱基合成接头；(2)如果目标区域NGG(PAM)上游第20个碱基不是A，则把20个碱基合成接头。

根据以上接头引物设计原理，靶点序列接头引物设计如表5所示：

表5靶点序列接头引物设计

名称	序列(5`-3`)	序列号
			gRT#	GTTTTAGAGCTAGAAAT	SEQ ID NO.13
U3b#	TGACCAATGTTGCTCC	SEQ ID NO.14
			U3d#	TGACCAATGGTGCTTTG	SEQ ID NO.15

表6第一轮Overlapping PCR引物

实施例3构建PDS基因编辑载体(pYLCRISPR/Cas9-PDS)

1、构建sgRNA表达盒

本研究使用Overlapping PCR的方法构建sgRNA表达盒，表达盒包括靶序列和相应启动子，AtU3b/AtU3d启动子与文献中的相应序列相同，参考文献为Ma X,Zhang Q,Zhu Q.ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284.。

sgRNA表达盒的构建需要进行两轮PCR反应，其中：

第一轮PCR反应：克隆质粒载体上的AtU3b/AtU3d启动子和sgRNA序列，将其与选择的靶序列(如表3)相连，模板选用质粒pYLgRNA-AtU3b和pYLgRNA-AtU3d-LacZ；第二轮PCR反应：在第一轮PCR反应产物sgRNA两端添加特异性酶切位点Bsa I，用于后续酶切连接反应。

1A)第一轮Overlapping PCR反应

分别以质粒pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU3d-LacZ为模板，按照如表7所述的PCR反应体系分别进行第一轮PCR反应，PCR反应体系总体积分别为25μL，分别获得pYLgRNA-AtU3b第一轮PCR反应产物PDS-AtU3b-sgRNA(即AtU3b启动子、sgRNA序列与靶序列的连接产物，简称PDS-AtU3b-sgRNA)；pYLgRNA-AtU3d-LacZ第一轮PCR反应产物PDS-AtU3d-sgRNA(即AtU3d启动子、sgRNA序列与靶序列的连接产物，简称PDS-AtU3d-sgRNA)。

表7第一轮PCR反应体系

U3b启动子体系	U3d启动子体系	体积(μL)
			KOD酶	KOD酶	0.5
KOD Buffer(缓冲液)	KOD Buffer(缓冲液)	2.5
			dNTPs	dNTPs	2.5
MgSO4	MgSO4	1.5
			质粒pYLgRNA-AtU3b	质粒pYLgRNA-AtU3d-LacZ	1
Primer U-F(SEQ ID NO.7，5μM)	Primer U-F(SEQ ID NO.7,5μM)	1
			Primer gR-R(SEQ ID NO.8，5μM)	Primer gR-R(SEQ ID NO.8,5μM)	1
Guide1-PDS-gRT(SEQ ID NO.16,1μM)	Guide2-PDS-gRT(SEQ ID NO.18,1μM)	2.5
			Guide1-PDS-U3b(SEQ ID NO.17,1μM)	Guide2-PDS-U3d(SEQ ID NO.19,1μM)	2.5
ddH2O	ddH2O	10

第一轮PCR程序：94℃预变性2min，94℃变性10s，58℃退火15s，68℃延伸20s；重复28个循环；68℃终延伸7min。

第一轮PCR反应结束后，对第一轮PCR产物进行电泳检测，并对目的条带分别进行切胶回收、获得第一轮PCR产物PDS-AtU3b-sgRNA、PDS-AtU3d-sgRNA。

1B)第二轮PCR反应

第二轮PCR的目的是分别在第一轮PCR反应的产物sgRNA(即PDS-AtU3b-sgRNA、PDS-AtU3d-sgRNA)两端加入特异性酶切位点Bsa I。其中，

U3b启动子系列产物需要加入位置特异性引物对：

Pps-GGL(SEQ ID NO.9)；Pgs-GG2(SEQ ID NO.10)；

U3d启动子系列产物需要加入特异性引物对：

Pps-GG2(SEQ ID NO.11)；Pgs-GGR(SEQ ID NO.12)；

分别取第一轮PCR产物各1μL，分别加入9μL ddH2O，混匀后作为第二轮PCR反应模板(稀释10倍)，按照表8所述的反应体系分别进行相对应的第二轮PCR反应。第二轮PCR反应体系总体积为20μL，分别获得第二轮PCR的连接产物AtU3b-PDS1-sgRNA-Bsa I(包括AtU3b启动子、sgRNA序列、靶序列PDS1、Bsa I(简称AtU3b-sgRNA)、LacZ-AtU3d-PDS2-sgRNA-BsaI(包括LacZ启动子、AtU3d启动子、sgRNA序列、靶序列PDS2、Bsa I(简称LacZ-AtU3d-sgRNA)。

第二轮PCR程序如下：95℃预变性2min，95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s；重复25个循环；72℃终延伸5min。

表8第二轮PCR反应体系

U3b启动子体系	U3d启动子体系	体积(μL)
			Pfu酶	Pfu酶	0.5
Pfu Buffer(缓冲液)	Pfu Buffer(缓冲液)	4
			dNTPs	dNTPs	1.6
MgSO4	MgSO4	0.8
			模板PDS-AtU3b-sgRNA(稀释10倍)	模板PDS-AtU3d-sgRNA(稀释10倍)	1
引物Pps-GGL(SEQ ID NO.9)	引物Pps-GG2(SEQ ID NO.11)	1
			引物Pgs-GG2(SEQ ID NO.10)	引物Pgs-GGR(SEQ ID NO.12)	1
ddH₂O	ddH2O	10.1

第二轮PCR反应结束后，取5μL的PCR反应产物进行电泳检测，检查产物长度，如图3所示，其中，标记1为AtU3b-sgRNA，其长度是507bp；标记2为LacZ-AtU3d-sgRNA，其长度是486bp。

1C)PCR产物切胶回收

对检测长度正确的产物所对应的剩余产物分别进行切胶回收，其中切胶回收方法参照

Quick Gel Purification Kit试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)的操作方法进行。

1D)使用微量分光光度计分别对步骤1C)获得的sgRNA表达盒(即AtU3b-sgRNA、LacZ-AtU3d-sgRNA)分别进行浓度测定并记录。

2、组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体

采用Golden Gate cloning方法进行组装，将第二轮PCR扩增产物sgRNA表达盒(AtU3b-sgRNA、AtU3b-sgRNA)组装到pYLCRISPR/Cas9载体上，构建完整pYLCRISPR/Cas9-PDS载体(即第三轮PCR反应)，其中Golden Gate cloning方法按照与参考文献(Engler,2008)中的相同方法进行，参考文件具体为：Engler C,Kandzia R,Marillonnet S.A onepot,one step,precision cloning method with high throughput capability[J].PLoSOne,2008,3(11):e3647.，其中在组装过程中使用的Bsa I酶能够识别特定的序列(即5'...GGTCTC(N)1↓...3'；3'...CCAGAG(N)5↑...5')，但并不在特定序列位置进行切割，而是在特定序列下游隔几个碱基切开，间隔碱基数目随机。而Ⅱ类酶(Ⅱ型限制性核酸内切酶)必须识别回文序列才发生剪切，Bsa I酶克服了这一缺点；

第三轮PCR反应体系总体积为15μL，反应体系如表9所示。

表9 sgRNA表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9载体的PCR反应体系

第三轮PCR程序具体如下：

37℃，10min；10℃，5min；20℃，5min，执行三个循环；37℃，3min；10℃，5min；20℃，5min，执行十个循环；最终37℃，5min结束反应。

实施例4载体的大肠杆菌转化

1、载体转化入大肠杆菌

采用热激法将构建的pYLCRISPR/Cas9-PDS载体转化大肠杆菌T1，具体操作步骤如下：

1A、从液氮中取出大肠杆菌T1感受态细胞，放入碎冰中，待其融化后取50μL大肠杆菌感受态细胞放于1.5mL离心管中，加入实施例3制备的第三轮PCR反应连接产物(pYLCRISPR/Cas9-PDS载体，5μL)，轻轻弹动管壁使其混匀，放入碎冰中冰浴30min；然后置于45℃的恒温水浴锅中，42s后取出，立即冰浴2min；

1B、使用移液枪在超净工作台中向离心管中加入LB液体培养基(450μL，不含抗生素)，缓慢吹打混匀，于恒温振荡器中培养1h(37℃，200rpm)，后离心(5000×g，2min)；使用移液枪去除350μL上清液，留150μL左右，吹打混匀，使菌块均匀分散于悬液中；

1C、在超净工作台中使用涂布棒将步骤1B)的菌液涂布于LB固体培养基上(含50mg/L卡那霉素)；待菌液在培养基上干燥后，封口倒置于恒温培养箱中，37℃培养过夜，获得抗性菌落。

2、菌落PCR

2A、根据实验例3构建的载体pYLCRISPR/Cas9-PDS序列设计引物，上、下游引物：SP-T1(SEQ ID NO,20，gcggtgtcatctatgttactag)和SP-R(SEQ ID NO.21：cccgacatagatgcaataacttc)。

2B、用记号笔在步骤1)中的含卡那霉素的LB固体培养基上挑选单菌落，做好标记；在超净工作台中，使用灭菌枪头挑出1/2单菌落，加入至配置好的大肠杆菌菌落PCR反应体系中，将含有剩余菌落的培养基封口暂存于4℃冰箱，其中共挑取8个单菌落，标记为1-8。

2C、按照表10配置菌落PCR反应体系(10μL)，将挑取的菌落分别置于配制好的菌落PCR反应体系中，进行大肠杆菌菌落PCR反应；

表10菌落PCR反应体系

组分	体积(μL)
		SP-T1(10μM)	1
SP-R(10μM)	1
		2×TSINGKE Master Mix	8

菌落PCR反应程序如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，重复25个循环；72℃终延伸5min。

菌落PCR反应结束后，使用琼脂糖电泳对反应产物进行检测，检测结果图如图4。图中标记1-8分别为挑取的1-8个大肠杆菌菌落。目的片段SP-T1至SP-R之间的序列长度为1200bp左右，具有该长度条带显示的泳道所对应的菌落为阳性菌落，不具有该长度条带显示的泳道所对应的菌落为假阳性菌落。

2D、根据电泳检测结果，标记出含有阳性克隆的菌落，接着在超净工作台中，使用灭菌枪头挑取阳性克隆菌落，加入至LB液体培养基(5mL，不含抗生素)中，于恒温振荡器中培养过夜(37℃，200rpm)，获得大量含有载体pYLCRISPR/Cas9-PDS的大肠杆菌。

3、质粒提取

取2mL培养好的含有载体pYLCRISPR/Cas9-PDS的大肠杆菌菌液进行质粒提取，按照质粒提取试剂盒(北京全式金公司的质粒提取试剂盒(

Plasmid MiniPrepKit))的操作方法、操作说明进行质粒提取，获得pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒；

使用微量分光光度计对所提pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒进行浓度测定并记录，280ng/μL；

取5μLpYLCRISPR/Cas9-PDS质粒进行测序(委托北京擎科生物科技有限公司进行)，通过对测序结果(SEQ ID NO.22)与实施例2中的sgRNA进行比对，序列中包括两个sgRNA的质粒为正确质粒，比对正确的质粒用于转化农杆菌。

实施例5农杆菌转化、菌种保存

1、农杆菌转化

1A、从液氮中取出100μL农杆菌EHA105的感受态细胞，插入碎冰中，待其慢慢融化后分装为两管，每管50μL；

1B、分别取实施例4提取的1μg pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒(根据所提取的质粒浓度计算加入体积)加入每管的农杆菌中，轻轻摩擦管壁混匀，冰浴10min后，放入液氮中5min，然后再迅速取出放置于37℃水浴锅中5min，取出后立即再冰浴5min；

1C、无菌环境下，向两管农杆菌中再分别加入LB液体培养基(800μL，不含抗生素)，恒温振荡器中培养3h(28℃)，接着取出培养好的农杆菌，5000rmp离心1min，收集菌体，在无菌条件下去除700μL上清液；

1D、将离心后的剩余液体与菌体吹打混匀，使用涂布棒涂布于LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素)上；使用保鲜膜将涂布好的平皿封口，倒置于28℃恒温培养箱中，培养48-72h，获得转化pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒农杆菌(即筛选获得抗性工程质粒农杆菌)。

2、农杆菌菌落PCR

对步骤1)制备的转化pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒农杆菌进行菌落PCR反应，筛选阳性菌落，获得成功转入pYLCRISPR/Cas9-PDS质粒的农杆菌菌落。

除了选择5个农杆菌单菌落，使用灭菌枪头挑出1/2农杆菌单菌落，加入至配置好的菌落PCR反应体系中，将含有剩余农杆菌菌落的培养基封口暂存于4℃冰箱之外，其余与实施例4中“菌落PCR”相同。

农杆菌菌落PCR反应结束后，使用琼脂糖电泳对反应产物进行检测，检测结果如图5，目的条带片段SP-T1至SP-R之间的序列长度为1200bp左右，具有与该长度相符的条带出现的样品，即为含有阳性克隆的菌落(阳性克隆农杆菌菌落)，可用于浸染杂交枫香的阳性克隆农杆菌。

3、菌株保存

在超净工作台中，根据标记，使用灭菌枪头挑取阳性克隆农杆菌菌落，分别加入至5mL的LB液体培养基(不含抗生素)中，置于恒温振荡器中，37℃，200rpm，过夜培养，然后取3mL阳性克隆农杆菌菌液，并向其中加入等量的50％甘油(已灭菌)进行保菌，混匀后分装至1.5mL离心管中，存放于-80℃冰箱。

实施例6农杆菌介导的遗传转化

1、制备浸染液

取出溶解均匀的阳性克隆农杆菌菌液，使用分光光度计测定在600nm波长下菌液OD值；根据OD₆₀₀值，对菌液进行稀释直至OD₆₀₀＝0.2，制得农杆菌浸染液，其中稀释用培养基为液体共培养培养基(基本培养基(Merkle et al.,1998)+1mg 2,4-D+0.5mg 6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白，pH调至5.6～5.7)，取50mL稀释菌液用于侵染。

2、侵染与共培养

2A、胚性愈伤组织增殖培养

在超净工作台中，用镊子选取生长状况良好的杂交枫香胚性愈伤组织放入液体增殖培养基中，每1g愈伤组织放入盛有30mL液体增殖培养基的三角瓶(100mL)中，于23±1℃，黑暗条件下，摇床120r/min振荡培养10d，即进行愈伤组织的增殖培养，除去褐化严重的大块组织，剩余的组织用于后续遗传转化。

2B、浸染处理

在超净工作台中使用抽滤装置，抽滤吸干步骤2A)的杂交枫香增殖培养的愈伤组织表面的液体增殖培养基后，称取3g愈伤组织，加入至步骤1)制备的农杆菌浸染液中，进行侵染处理，其间摇动数次。

阳性克隆农杆菌浸染10min(通常为5-15min)后，再次抽滤吸干组织表面的菌液，将其连同滤纸一同转移到被液体共培养培养基润湿的滤纸上，于23±1℃、黑暗条件下进行浸染-共培养处理，获得浸染愈伤组织。

3、恢复培养

3A、愈伤组织浸染-共培养处理2d后，用头孢霉素的无菌水溶液冲洗浸染愈伤组织3-4次，每次20min；其中头孢霉素的无菌水溶液的浓度为300mg/L(通常为250-350mg/L)；然后抽滤吸干浸染愈伤组织表面的液体；

3B、将冲洗后的浸染愈伤组织转移至恢复培养基中，于23℃(通常为23±1℃)，黑暗条件下，进行恢复培养，获得恢复培养胚性愈伤组织，其中：胚性愈伤组织恢复培养基为：改良Blaydes基本培养基+1mg 2,4-D+0.5mg 6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+300mg/LCef，pH调至5.6～5.7。

4、筛选培养

恢复培养7d(通常为6-8d)后，将恢复培养胚性愈伤组织再转移至筛选培养基中，于23℃(通常为23±1℃)，黑暗条件下，进行筛选培养，每3周(通常为3-4周)更换1次筛选培养基，筛选培养28-42d，待有抗性愈伤组织长出后，将筛选所得抗性愈伤组织转移至新的筛选培养基中进行继代培养，获得抗性胚性组织，其中在继代培养过程中，每14d更换一次筛选培养基；其中：筛选培养基为：改良Blaydes基本培养基+1mg 2,4-D+0.5mg 6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+300mg/LCef+10mg/LHyg，pH调至5.6～5.7。

经过1～2个月的筛选培养后，获得多块潮霉素抗性愈伤组织，选择其中编号为P1-P9。

5、阳性鉴定

考虑到作用的基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-PDS上含有潮霉素磷酸转移酶基因(潮霉素抗性基因，hygromycin B phosphotransferase，HPT)。使用含有该载体的农杆菌侵染愈伤组织以后，转化成功的组织能够在含有一定浓度潮霉素的培养基上生长。野生型杂交枫香胚性愈伤组织中不含有HPT基因，不能在含有潮霉素的培养基上生长。为了防止假阳性抗性愈伤，需要在DNA水平上进一步鉴定。

对筛选培养获得的抗性胚性组织的DNA进行提取，并对HPT进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，能够观察到HPT条带的抗性愈伤组织即为转基因阳性愈伤组织，HPT条带大小为750bp，否则为假阳性抗性愈伤，实验以ddH2O为阴性对照。其中：潮霉素磷酸转移酶基因HPT引物设计如下：

HPT-F：5’-CTTGACATTGGGGAGTTTAGCGAGA-3’，SEQ ID NO.23

HPT-R：5’-CCCTTATCTGGGAACTACTCACACA-3’，SEQ ID NO.24

HPT的PCR过程中使用植株组织直扩试剂盒2×T5 Direct PCR Kit(Plant)(TSE011，购买自北京擎科新业生物技术有限公司)，体系如表11所示：

表11 HPT基因PCR扩增体系

组分	体积(μL)
		2×T5 Direct PCR Mix(Plant)	12.5
DNA(抗性胚性组织提取的DNA)	1
		HPT-F	1
HPT-R	1
		ddH2O	9.5

HPT基因PCR程序如下：98℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，重复30个循环；72℃终延伸5min。

HPT基因PCR结束反应，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6。

对筛选得到的潮霉素抗性愈伤组织进行阳性检测，提取愈伤组织DNA，根据HTP基因设计引物进行PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定。多块潮霉素抗性愈伤组织P1,P2,P3,P4,P5,P6,P8,P9中成功扩增出HTP基因，阴性对照无条带(见图6)。

实施例6A农杆菌介导的遗传转化

将实施例6的步骤4)中筛选培养获得抗性愈伤组织转移至熟培养基中，进行成熟培养，获得成熟子叶体胚，其中，成熟培养基为：改良Blaydes基本培养基+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH调至5.6～5.7；成熟培养条件为：(25±2)℃，黑暗条件下，成熟培养90d(通常为80-100d)，获得成熟子叶体胚，胚性组织发育成子叶胚；

然后将成熟子叶体胚移入萌发培养基中，进行萌发培养，获得抗性植株，其中，萌发培养基为：改良Blaydes基本培养基+30g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，pH调至5.6～5.7；萌发培养条件为：(25±2)℃，黑暗条件下，萌发培养60d(通常为50-70d)。

萌发培养获得的部分植株出现白绿镶嵌苗，如图7。

实施例7 PDS基因编辑结果分析

1、基因编辑方式鉴定

选择实施例6中潮霉素阳性鉴定所对应的阳性抗性愈伤组织(即转基因阳性愈伤组织，P1-P6,P8-P9)做进一步的靶点基因编辑方式鉴定。原则上应首先设计PCR扩增引物对，应将引物设计在靶点上下游各300bp区域。

本实施例中靶点均位于第一外显子区域，因此对第一外显子(SEQ ID NO.1)进行PCR扩增，PDS基因编辑鉴定引物设计如表12所示：

表12鉴定转基因抗性愈伤组织的PCR引物

引物名称	引物序列(5`→3`)	序列号
			PDS1-F	ATGACTCAATACGGATCAGTTTCTG	SEQ ID NO.25
PDS1-R	GCAATCACAACCTCTAATGGTTTAT	SEQ ID NO.26

鉴定转基因抗性愈伤组织的PCR体系为50μL，如表13所示：

表13鉴定转基因抗性愈伤组织的PCR反应体系

组分	体积(μL)
		2×T5 Direct PCR Mix(Plant)	25
DNA(抗性愈伤组织提取)	1
		上游引物(SEQ ID NO.25)	2
下游引物(SEQ ID NO.26)	2
		ddH₂O	20

鉴定转基因抗性愈伤组织的PCR程序如下：98℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，重复30个循环；72℃终延伸5min。

PCR结束反应后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图8所示，在标记编号为P1-P6,P8-P9号的抗性愈伤组织中成功扩增到目的基因，且片段大小正确(PDS459bp)。选择条带清晰的PCR产物送去测序，测序结果如图9，其中：P1-P6，P8-P9分别为实施例6中潮霉素阳性鉴定所对应的阳性抗性愈伤组织测序结果；W为野生型愈伤组织测序结果；黑框位置为PAM位点。

潮霉素抗性愈伤组织P1-P6,P8-P9与野生型愈伤组织的PDS第一外显子序列的比对结果如图9。

2、基因编辑结果分析

使用DNAMAN软件对测序结果与野生型杂交枫香的PDS第一外显子序列进行比对。比对结果如图8所示，转入了pYLCRISPR/Cas9-PDS的抗性愈伤组织中成功检测到碱基的缺失和替换，表明愈伤组织中发生了基因编辑事件。

在第一个PAM位点(TGG)上游23bp处有一个碱基A的缺失，在第二个PAM位点(GGG)上游发生了单碱基的替换G-A (39bp),T-A(42bp,87bp),A-T(88bp)。这些位点的变化可能会引起氨基酸的改变和表型的变化。

有关杂交枫香基因功能的研究相对滞后，对进行枫香遗传改良研究造成了巨大障碍。因此，基因编辑作为进行基因功能研究的重要技术手段，建立枫香基因编辑平台已经成为对枫香进一步遗传改良的迫切需要。但在国际上，对于枫香的基因功能及遗传改良研究较少。近年来，基因编辑技术取得了突飞猛进的发展，在许多方面体现了其科学研究价值，如植物基因功能研究、作物遗传改良等。然而，目前还没有适用于枫香的基因组编辑平台。建立枫香基因组编辑平台，对探究枫香基因功能研究、进行遗传改良十分重要。

本研究基于已获得的高效稳定的杂交枫香体胚发生体系，拟建立杂交枫香基因编辑平台，为开展杂交枫香基因功能研究和进行遗传改良奠定基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 杂交枫香基因编辑载体、其构建方法、及其应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactcaat acggatcagt ttctgcggtg aactttaact ggcaagttag tatgtttaac 60

tttcggaact cgccatcctc ctggagatgt ggatttccca ttggttcaga gaaaaccaat 120

aatgtactag cgtttggagg tagtgcttct atgggtctta gcataagaat accaaataca 180

aaagcccttg gagcaagaac aaggccaagg aagggcggct gccccttgaa gg 232

<210> 2

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactcaaatc ggatcagttt ctgcggtgaa cttcaactgg caagttagta tgtttaactt 60

tcggaactcg ccatcctcct ggagatgtgg atttcccatt ggttcagaga aaaccaataa 120

tgatctagcg tttggaggta gtgcttctat gggtcttagc ataagaattc cgaatacaaa 180

agcccttgga gcaagaacaa ggccaaggaa gggcggctgc cccttgaagg tttgcttgct 240

gtaaacttga gagtgtggtt taaccctcat taaacctcca aagggcaatg aatatttata 300

tgtttgatgt aaataaaata caggtagttt gcgtggacta tccaagacca gagcttgaca 360

atactgttaa tttcttagag gctgcttact tgtcatcatc tttccgcact tcttcccgtc 420

caaataaacc attaga 436

<210> 3

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcagtttct gcggtgaact tcaactggca agttagtatg tttaactttc ggaactcgcc 60

atcctcctgg agatgtggat ttcccattgg ttcagagaaa accaataatg atctagcgtt 120

tggaggtagt gcttctatgg gtcttagcat aagaattccg aatacaaaag cccttggagc 180

aagaacaagg ccaaggaagg gcggctgccc cttgaaggta gtttgcgtgg actatccaag 240

accagagctt gacaatactg ttaatttctt agaggctgct tacttgtcat catctttccg 300

cacttcttcc cgtccaaata aaccattaga ggttgtgatt gccggtgcag gtttggctgg 360

tttatcaact gcaaaatatt tggcagatgc aggtcacaaa cctttattgt tggaagcaag 420

agatgttcta ggtggaaagg tggctgcatg gaaagatgat gatggagact ggtatgagac 480

aggcctacat atattctttg gggcttaccc aaatgtgcag aacctgtttg gagaacttgg 540

cattaatgac cgattgcaat ggaaggagca ttctatgata ttcgccatgc caaataagcc 600

aggagaattc agccgctttg attt 624

<210> 4

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcggaactc gccatcctcc tgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaagaacaa ggccaaggaa ggg 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttttagagc tagaaat 17

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgaccaatgt tgctcc 16

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaccaatgg tgctttg 17

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttcggaactc gccatcctcc gttttagagc tagaaat 37

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggaggatggc gagttccgaa tgaccaatgt tgctcc 36

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcaagaacaa ggccaaggaa gttttagagc tagaaat 37

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttccttggcc ttgttcttgc tgaccaatgg tgctttg 37

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcggtgtcat ctatgttact ag 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cccgacatag atgcaataac ttc 23

<210> 22

<211> 1042

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gggccataac gatgtaggag atcgatgcat gcggccgcta gctcgagagg cgcgccaatg 60

ataccgacgc gtatccatcc actccaagct cttgaaaaaa agcaccgact cggtgccact 120

ttttcaagtt gataacggac tagccttatt ttaacttgct atttctagct ctaaaacgga 180

ggatggcgag ttccgaatga ccaatgttgc tccctcagtg ttatatatac aacaagattt 240

gtttagattt gagcgatgtg ggagaaatta ggagcttata tgaaacgcat acatgggtac 300

tgggcatggg tattagtgaa tctatggacg atagcccatt aaattacata aaaagcccac 360

ttatcttatt gctcgatata agctccatat ataaactgaa gttgatccta aaagttcact 420

tgtttcgtcc aacatagcca aaacagatct tcttaaaccc agacgccatt tgtttgattc 480

agttatccat cacaggctgc ataagaaaaa atttaaagta aatcctttgc tgccgattcc 540

agtgtcaggg tccatccact ccaagctctt gaaaaaaagc accgactcgg tgccactttt 600

tcaagttgat aacggactag ccttatttta acttgctatt tctagctcta aaacttcctt 660

ggccttgttc ttgctgacca atggtgcttt gtagccatat ataaagcagt tatttcttca 720

ctcgcttacc gatgtgggac gcaaaattcg taagaaaaaa gaaatcataa gcttatttag 780

ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 840

cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 900

cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagc atagctgcct cctttattag agcaatatag 960

tcctacaatg tcaacgcgtc ctttgctgcc gattcctact agtcgagact acggcgcgcc 1020

ttaccggtgc cccgatctag ta 1042

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cttgacattg gggagtttag cgaga 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cccttatctg ggaactactc acaca 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgactcaat acggatcagt ttctg 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcaatcacaa cctctaatgg tttat 25

Claims

1.一种杂交枫香植物基因编辑载体的构建方法，其特征是，包括如下步骤：

A、从野生型杂交枫香胚性愈伤组织中克隆PDS基因部分序列，确定克隆得到的序列包括PDS基因第一外显子序列；

B、根据PDS目的基因设计两个靶点：PDS1、PDS2，其中PDS1、PDS2序列分别为：SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.6；

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是，步骤D)中所述引物对U-F/gR-R的序列分别为SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.8。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是，步骤E)中所述引物Pps-GGL、Pgs-GG2的序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10；所述引物Pps-GG2、Pgs-GGR的序列为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12。

4.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是，还包括步骤G)，将第三轮PCR反应产物构建完整的pYLCRISPR/Cas9-PDS载体转化到大肠杆菌T1中，获得阳性菌落；接着对阳性菌落进行培养，并提取质粒，获得扩大量的杂交枫香植物基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-PDS。

5.一种杂交枫香植物基因编辑载体，其特征是按照如权利要求1-4任一所述方法构建而成。

6.如权利要求5所述杂交枫香植物基因编辑载体在杂交枫香植物中进行基因编辑的应用，其特征是，包括如下步骤：

7.如权利要求6所述的应用，其特征是，步骤1)中所述杂交枫香植物的胚性愈伤组织在进行浸染处理之前，还包括对杂交枫香植物的胚性愈伤组织进行液体增殖培养，即将杂交枫香植物的胚性愈伤组织放入液体增殖培养基中，于23±1℃，黑暗条件下，振荡培养7-10d，获得增殖的胚性愈伤组织。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征是，步骤1)中所述浸染处理包括如下步骤：

9.如权利要求6或7所述的应用，其特征是，步骤2)中所述恢复培养基为：改良Blaydes基本培养基+1mg 2,4-D+0.5mg 6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+300mg/LCef，pH调至5.6～5.7。

10.如权利要求6或7所述的应用，其特征是，步骤3)中所述筛选培养基为：改良Blaydes基本培养基+1mg 2,4-D+0.5mg 6-BA+40g/L蔗糖+1g/L酶水解酪蛋白+3g/L植物凝胶+300mg/LCef+10mg/LHyg，pH调至5.6～5.7。