CN108841854B - 一种获得胡萝卜突变体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得胡萝卜突变体的方法。本发明提供的获得胡萝卜突变体的方法，包括向目的胡萝卜中导入胡萝卜基因组编辑的载体，得到胡萝卜突变体；所述胡萝卜基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；所述sgRNA在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA具有如下结构5’‑N20NGG‑3’，N为A、G、C或T；所述胡萝卜基因组编辑的载体还含有Cas9蛋白的编码基因和AtU6‑26p启动子；AtU6‑26p启动子启动所述sgRNA编码基因的转录。将CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术应用于胡萝卜育种实践，可以快速转化现有的研究成果，有目的的实现重要农艺性状的改良。

Description

一种获得胡萝卜突变体的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种获得胡萝卜突变体的方法。
背景技术
基因组定点突变技术，是在基因组原位实现对基因的精确、定点、可遗传修饰。作为新兴的第三代人工核酸酶技术，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一，且被广泛应用于植物和农作物功能基因改良。CRISPR/Cas9系统首次在细菌中发现，由sgRNA和Cas9蛋白两部分组成(Jinek et al.，2012)。Cas9蛋白通过自身的核酸内切酶活性，对任何紧随PAM的靶点序列进行编辑，从而引起靶位点基因组DNA序列双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non-homologousend joining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology-directed repair，HDR)两种方式引入突变。
基因定点修饰作为反向遗传学研究的有力工具，能够通过对基因组定向准确修饰，有目的的提供遗传学和分子生物学研究材料，这对于胡萝卜功能基因组学的基础研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是获得胡萝卜突变体。
本发明首先保护一种获得胡萝卜突变体的方法，包括向目的胡萝卜中导入胡萝卜基因组编辑的载体，得到胡萝卜突变体；所述胡萝卜基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；所述sgRNA在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA具有如下结构5’-N20NGG-3’，N为A、G、C或T。
上述方法中，所述胡萝卜基因组编辑的载体还可含有Cas9蛋白的编码基因。
上述方法中，所述胡萝卜基因组编辑的载体还可含有启动子；所述启动子启动所述sgRNA编码基因的转录。所述启动子具体可为AtU6-26p启动子。
上述方法中，所述目的胡萝卜具体可为胡萝卜品种黑田五寸。
采用上述任一所述方法获得的胡萝卜突变体具体可为在靶标DNA处发生定点突变的植株。在靶标DNA处发生定点突变的类型可为碱基插入突变和/或碱基缺失突变。
本发明还保护一种胡萝卜基因组编辑的载体，其含有Cas9蛋白的编码基因、sgRNA编码基因和启动子；所述启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；所述sgRNA在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA具有如下结构5’-N20NGG-3’，N为A、G、C或T。
上述载体中，所述启动子可为AtU6-26p启动子。
上述任一所述的载体在获得胡萝卜突变体中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的载体在胡萝卜基因编辑中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护定向编辑胡萝卜基因组的方法。
本发明所保护的定向编辑胡萝卜基因组的方法，具体可为方法c1)，包括如下步骤：将上述任一所述的载体导入出发胡萝卜，实现出发胡萝卜中靶基因的定向编辑。
本发明所保护的定向编辑胡萝卜基因组的方法，具体可为方法c2)，包括如下步骤：
(1)根据出发胡萝卜中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
(2)构建表达所述crRNA的重组载体；
(3)将所述重组载体和Cas9蛋白的编码基因导入所述出发胡萝卜，实现出发胡萝卜中靶基因的定向编辑。
上述方法中，所述目的胡萝卜具体可为胡萝卜品种黑田五寸。
上述任一所述方法或上述任一所述载体在胡萝卜育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中，Cas9蛋白的编码基因和AtU6-26p启动子的核苷酸序列均可由载体pBSE401提供。所述胡萝卜基因组编辑的载体具体可为将sgRNA编码基因和载体pBSE401进行连接，得到的重组质粒。所述载体pBSE401具体记载与如下文献中：Xing et al.，2014.。
本发明的三个实施例中，向胡萝卜品种黑田五寸中导入实施例2提及的重组质粒pBSE401-32551(在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA为：5’-TGCCGCTTCATATATCCATATGG-3’)，得到DCAR_032551基因发生定点突变的植株共25株，其中碱基插入突变植株17株，碱基缺失突变植株8株；向胡萝卜品种黑田五寸中导入重组质粒(在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA为：5’-ATGGAGTCGTACTGCATAGGTGG-3’)，得到DCAR_028276基因发生定点突变的植株共11株；向胡萝卜品种黑田五寸中导入重组质粒(在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA为：5’-TAGAGATAGTGTATTGGATTTGG-3’)，得到DCAR_028276基因发生定点突变的植株共5株。
实验证明，采用本发明提供的方法可以获得胡萝卜突变体。将CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术应用于胡萝卜育种实践，可以快速转化现有的研究成果，有目的的实现重要农艺性状的改良。
附图说明
图1为转基因胡萝卜阳性植株DCAR_032551基因的定点编辑效果的测序分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
限制性内切酶BsaI、10×T4DNA Ligase Buffer、10×BSA和T4DNA Ligase均为NEB公司的产品。
载体pBSE401(记载与如下文献中：Xing et al.，2014.)上含有Cas9蛋白的编码基因和AtU6-26p启动子的核苷酸序列，AtU6-26p启动子用于启动sgRNA编码基因的转录。
光暗交替培养即光照培养和暗培养交替。光照培养时的光照强度为2000Lx。光暗交替培养的周期具体为：16h光照培养/8h黑暗培养。
胡萝卜品种黑田五寸为北京京研益农种业有限责任公司的产品；胡萝卜品种黑田五寸在下文中简称黑田五寸。MS粉末为Phytotech公司的产品，产品目录号为M519。植物凝胶为sigma公司的产品，产品目录号为P8169。
本发明涉及的培养基如下：
MS固体培养基：将4.43g MS粉末和30g蔗糖溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.8-6.0，然后加入3g植物凝胶，121℃高压灭菌20min。
1/2MS固体培养基：将2.22g MS粉末和30g蔗糖溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.8-6.0，然后加入3g植物凝胶，121℃高压灭菌20min。
1/2MS液体培养基：将2.22g MS粉末和30g蔗糖溶于1L蒸馏水，调节pH值至5.8-6.0，121℃高压灭菌20min。
YEB液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母提取物1g、蛋白胨5g、蔗糖5g和MgSO4·H2O0.5g溶于1L蒸馏水，调节pH值至7.0，121℃高压灭菌20min。
诱导培养基：含0.5mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、1mg/L草甘膦、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基。
共培养培养基：含0.5mg/L 2，4-D、5mg/L AgNO3和300mg/L特美汀(Timentin)的MS固体培养基。
初筛培养基：含0.5mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、5mg/L草甘膦、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基。
筛选培养基：含0.5mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、8mg/L草甘膦、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基。
分化培养基：含5mg/L草甘膦、5mg/L AgNO3和300mg/L Timentin的MS固体培养基。
实施例1、胡萝卜全基因组水平的Cas9作用位点的挖掘
目前，胡萝卜的全基因组序列已经发表，但预测CRISPR-Cas9靶位点的网站还未将胡萝卜纳入分析范围。因此，本发明的发明人经过大量实验，自行挖掘了胡萝卜全基因组水平的2,281,123个Cas9作用位点，覆盖基因数30,903个(占胡萝卜全部基因的96％)，能够满足绝大多数基因定点编辑的要求。
挖掘Cas9作用位点的具体方法为：扫描胡萝卜cDNA中序列为5’-N20NGG-3’的片段(N表示A、G、C和T中的任一种)，然后在全基因组水平进行脱靶效应的评估，得到由Cas9的作用位点组成的数据库。其中靶标位点PAM类型为NGG，而对于脱靶评估PAM类型为NGG和NAG；对于脱靶效应的评估，除了统计sgRNA全长序列碱基错配位点情况，还考察临近PAM的12bp种子序列的特异性。
实施例2、采用CRISPR/Cas9系统对胡萝卜DCAR_032551基因进行定点编辑
一、靶标片段32551的设计
设计靶标片段32551，靶标片段32551位于DCAR_032551基因上，双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-NX-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，X＝20。
靶标片段32551的核苷酸序列为：5’-TGCCGCTTCATATATCCATATGG-3’。
二、重组质粒pBSE401-32551的构建
(1)人工合成32551-T1-F：5'-ATTGGCCGCTTCATATATCCATA-3'(下划线部分为粘性末端)和32551-T1-R：5'-AAACTATGGATATATGAAGCGGC-3'(下划线部分为粘性末端)，32551-T1-F和32551-T1-R均为单链DNA分子。
(2)将32551-T1-F和32551-T1-R稀释至100μM，然后按摩尔比1:1混合，进行退火(退火程序为：95℃5min，自然冷却至25℃)，形成具有粘性末端的双链DNA分子。
(3)配制反应体系。反应体系为15μL，由2μL步骤(2)合成的双链DNA分子(浓度为100ng/μL)、2μL载体pBSE401(浓度为100ng/μL)、1.5μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1.5μL10×BSA、1μL限制性内切酶BsaI、1μL T4 DNA Ligase和6μL ddH2O组成。
(4)取步骤(3)配制的反应体系，进行反应(反应程序：37℃5h，50℃5min，80℃5min)，得到重组质粒pBSE401-32551。重组质粒pBSE401-32551中含有靶标片段32551。
三、胡萝卜的遗传转化
1、种子的消毒和培养
(1)取黑田五寸种子，置于30℃的温水中浸泡4h。
(2)完成步骤(1)后，取所述黑田五寸种子，先加入75％(v/v)乙醇水溶液表面消毒2min，在超净台中用灭菌水冲洗3遍；然后加入15％(m/v)的次氯酸钠水溶液消毒15min，在超净台中用灭菌水冲洗5遍。
(3)完成步骤(2)后，取所述黑田五寸种子，先用无菌滤纸吸干种子表面的水分，再置于1/2MS固体培养基，25℃暗培养7d。
2、农杆菌侵染液的制备
(1)将重组质粒pBSE401-32551转化根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。
(2)完成步骤(1)后，将所述阳性重组农杆菌接种到YEB液体培养基，28℃振荡培养，直至菌液的OD600nm值达到0.6左右。
(3)取步骤(2)得到的菌液，6000rpm离心2min，收集沉淀。
(4)取步骤(3)收集的沉淀，加入1/2MS液体培养基重悬，得到农杆菌侵染液。以1/2MS液体培养基为参照，调整农杆菌侵染液的OD600nm值达到0.6左右。
3、农杆菌侵染黑田五寸下胚轴
(1)取步骤1获得的黑田五寸下胚轴，切成0.5mm左右的小段，得到下胚轴节段。
(2)取全部下胚轴节段(作为外植体)，放入盛有步骤2制备的农杆菌侵染液离心管中，轻柔震荡侵染20min。。
(3)完成步骤(2)后，取侵染后的全部下胚轴节段，先在无菌滤纸上吸去多余农杆菌侵染液，再置于共培养培养基上，共培养3d。
共培养条件：25℃，暗培养。
4、初次诱导
取步骤3获得的全部下胚轴节段，先用无菌水冲洗三遍，吸干水分，再转移至诱导培养基上，25℃、光暗交替培养7-10d，得到愈伤组织。
5、筛选培养
(1)取步骤4获得的愈伤组织，全部转移至初筛培养基上，25℃、光暗交替培养7-10d，得到蓬松的愈伤组织。
(2)完成步骤(1)后，取蓬松的愈伤组织，全部转移至筛选培养基上，25℃、光暗交替培养7-10d，得到膨大的胚性愈伤组织。
6、分化培养
取步骤5获得的胚性愈伤组织，全部转移至分化培养基，25℃、光暗交替培养10-14d，得到出芽的胚性愈伤组织和未出芽的胚性愈伤组织。
将未出芽的胚性愈伤组织转移至分化培养基上，25℃、光暗交替培养10-14d，获得出芽的胚性愈伤组织。
7、生根培养
取步骤6获得的全部出芽的胚性愈伤组织，全部转移至1/2MS固体培养基上，25℃、光暗交替培养，得到84株拟转基因胡萝卜植株。
待84株拟转基因胡萝卜植株的根生长至两周，移至温室，常规培养。
四、拟转基因胡萝卜植株的分子检测
1、分别提取步骤三获得的拟转基因胡萝卜植株叶片的基因组DNA并以其作为模板，以VE-F：5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’和VE-R：5’-CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，4℃保持。
将拟转基因胡萝卜植株叶片的基因组DNA替换为等体积超纯水，作为空白对照。
将拟转基因胡萝卜植株叶片的基因组DNA替换为等体积重组质粒pBSE401-32551水溶液(浓度为0.1-1pg/μL)，作为阳性对照。
将拟转基因胡萝卜植株叶片的基因组DNA替换为未转基因的黑田五寸叶片的基因组DNA，作为阴性对照。
2、完成步骤1后，取10μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，进行如下判断：如果以某拟转基因胡萝卜植株叶片的基因组DNA为模板，能够扩增出约400bp的条带，则该拟转基因胡萝卜植株即为转基因胡萝卜阳性植株；空白对照和阴性对照均不能获得400bp的条带；阳性对照可以获得400bp的条带。
部分实验结果见图1。经检测，共获得65株转基因胡萝卜阳性植株。
五、PCR扩增产物测序分析DCAR_032551基因的编辑结果
1、分别提取步骤四获得的转基因胡萝卜阳性植株叶片的基因组DNA并以其作为模板，以CT1Se-F：5’-TACCTGTAGTCGGTGCTATTTC-3’和CT1Se-R：5’-TGGAGTAAGCCTCAAAGAACTG-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、取步骤1得到的PCR扩增产物，采用CT1Se-F进行测序分析。
3、将步骤2得到的测序结果与胡萝卜基因组序列进行比对，根据比对结果，寻找DCAR_032551基因发生定点突变的植株。
实验结果表明，DCAR_032551基因发生定点突变的植株共25株，其中碱基缺失突变植株17株(见图1中A)，碱基插入突变植株8株(见图1中B)。
由此可见，CRISPR/Cas9系统可以对胡萝卜DCAR_032551基因的定点编辑。
实施例3、CRISPR/Cas9系统对胡萝卜DCAR_028276基因的定点编辑
一、按照实施例2的方法，采用CRISPR/Cas9系统对胡萝卜DCAR_028276基因的转录起始位点进行定点编辑，仅以下几个地方不同：
步骤一中，靶标片段的核苷酸序列为：5’-ATGGAGTCGTACTGCATAGGTGG-3’；
步骤二中(1)，人工合成28276-T1-F：5'-ATTGTGGAGTCGTACTGCATAGG-3'和28276-T1-R：5'-AAACCCTATGCAGTACGACTCCA-3'，28276-T1-F和28276-T1-R均为单链DNA分子；
步骤五中(1)，是以28276-CT1Se-F：5’-GCCAACATACCCTCACGTCTC-3’和28276-CT1Se-R：5’-TCCTCCTTATCAGCAAACTCCTC-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
实验结果表明，共获得54株转基因胡萝卜阳性植株，其中DCAR_028276基因发生定点突变的植株共11株。
二、按照实施例2的方法，采用CRISPR/Cas9系统对胡萝卜DCAR_028276基因的蛋白功能区域进行定点编辑，仅以下几个地方不同：
步骤一中，靶标片段的核苷酸序列为：5’-TAGAGATAGTGTATTGGATTTGG-3’；
步骤二中(1)，人工合成28276-T2-F：5’-ATTGAGAGATAGTGTATTGGATT-3’和28276-T2-R：5’-AAACAATCCAATACACTATCTCT-3’，28276-T2-F和28276-T2-R均为单链DNA分子；
步骤五中(1)，是以28276-CT2Se-F：5’-ACTTCTGGTAACTGACTGGGATT-3’和28276-CT2Se-R：5’-TTCATCCTCCCATACACCATAA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
实验结果表明，共获得31株转基因胡萝卜阳性植株，其中DCAR_028276基因发生定点突变的植株共5株。
由此可见，CRISPR/Cas9系统可以对胡萝卜DCAR_032551基因的定点编辑。根据实施例1挖掘的2,281,123个Cas9作用位点，预期可以对胡萝卜的30,903个基因进行定点编辑。

Claims (8)

1.一种获得胡萝卜突变体的方法，包括向目的胡萝卜中导入胡萝卜基因组编辑的载体，得到胡萝卜突变体；所述胡萝卜基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；
所述sgRNA在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA为：5’-TGCCGCTTCATATATCCATATGG-3’；
所述胡萝卜基因组编辑的载体还含有Cas9蛋白的编码基因；
所述胡萝卜基因组编辑的载体还含有启动子；所述启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；
所述启动子为AtU6-26p启动子；
所述目的胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸；
与目的胡萝卜相比，胡萝卜突变体的DCAR_032551基因发生定点突变。
2.一种胡萝卜基因组编辑的载体，含有Cas9蛋白的编码基因、sgRNA编码基因和启动子；所述启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；所述sgRNA在胡萝卜基因组中识别的靶标DNA为：5’-TGCCGCTTCATATATCCATATGG-3’；
所述启动子为AtU6-26p启动子；
所述胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸。
3.权利要求2所述载体在获得胡萝卜突变体中的应用；所述胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸。
4.权利要求2所述载体在胡萝卜基因编辑中的应用；所述胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸。
5.一种定向编辑胡萝卜基因组的方法，包括如下步骤：将权利要求2所述载体导入出发胡萝卜，实现出发胡萝卜中靶基因的定向编辑；
所述出发胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸；
所述靶基因为DCAR_032551基因。
6.权利要求1所述的方法在胡萝卜育种中的应用；所述胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸。
7.权利要求2所述载体在胡萝卜育种中的应用；所述胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸。
8.权利要求5所述的方法在胡萝卜育种中的应用；所述胡萝卜为胡萝卜品种黑田五寸。
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