CN114836464B - 一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化的方法，属于植物组培技术和植物转基因技术领域，所述方法包括获得羊草组培无菌愈伤组织、冻融法转化农杆菌感受态、活化根癌农杆菌、侵染羊草愈伤组织并共培养、植物转化材料的筛选培养、分化筛选培养基及培养条件和生根培养基及培养条件。本发明实现了添加生长素促进羊草再生效率的提高，获得具有转基因的再生植株。

Description

一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物组培技术和植物转基因技术领域，具体地涉及一种诱导羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)种子产生愈伤组织，并以这些愈伤组织作为根癌农杆菌侵染对象，成功地建立了羊草的遗传转化体系。
背景技术
羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)禾本科赖草属优质牧草及生态草，又称碱草，其耐盐能力强，可生长在盐碱地(pH8.5～11.5)上，是非盐生植物中耐盐性最高的物种之一，为异源四倍体C3植物，是典型的无性系根茎禾草，被誉为“禾本科牧草之王”，是我国比较有优势的生物资源。羊草不仅具有营养价值高、产量高、粗蛋白含量高、适口性好、叶量多等特性，而且具有抗旱、抗寒、耐盐碱、耐瘠薄、耐牧、抗逆性强，适应性广等优点，在改善我国北方草原生态环境、发展草原畜牧业方面发挥着重要作用，对我国发展草原畜牧业和退化草地、荒漠化治理方面具有举足轻重的作用。
近年来，由于荒漠化加剧导致的自然环境越来越恶劣，加之羊草本身具有的“三低”的(即结实率低、出苗率低、产草量低)问题，严重影响了我国推动人工草地生态环境改良及天然草地治理沙化的进度。此外，羊草具有非常强的耐盐碱能力，如果能够实现羊草遗传转化，将会极大地促进羊草对盐碱的耐受性分子机制的研究和相关功能基因的挖掘，以更快的速度培育更多优良的羊草新品种，并且可以获取对多种耐盐碱的工程植物。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtume faciens)里Ti质粒的T-DNA为媒介，将目的基因导入植物中，获得外源基因稳定表达的转基因株系，是研究植物基因功能和遗传改良的主要技术手段之一。
鉴于农杆菌侵染转化羊草的重要性，建立羊草高效组培快繁体系是首要条件。羊草组织培养可以选择成熟胚和幼穗为外植体，但不同的外植体在愈伤组织的诱导、分化、再生方面有很大差异。同时基因型是影响离体培养的主要因素之一。培养基及激素也是影响羊草组培的重要因素之一。农杆菌介导转化法是目前主要采用的遗传转化方法，农杆菌是一种革兰氏阴性菌，当植物收到伤害时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，这些物质会吸引农杆菌转移到这些细胞表面，同时农杆菌所携带的T-DNA就会转移到受伤的植物体中，并且最终整合到手体植物的DNA中，然后通过组培快繁再生出植株。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种通过农杆菌侵染愈伤组织，建立羊草的遗传转化体系的方法。利用本发明所述方法能够高效快捷的转化羊草愈伤组织，并且能得到羊草再生植株。
本发明采用下述技术方案予以实现：
一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法，具体包括以下步骤：
1)获得羊草组培无菌愈伤组织：以羊草的种子为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，外植体长出愈伤组织后，将愈伤组织在无菌的环境中转移到含相应植物激素组合的新鲜的继代培养基上，继代一次，继代培养的环境条件：温度为25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗；
所述的诱导培养基：MS基础培养基，5mg·L-1 2,4-D，30g·L-1 蔗糖，7.8g·L-1琼脂，pH5.8；
所述的继代培养基为：MS基础培养基，2mg·L-1 2,4-D，30 g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂；
将愈伤组织继代到分化培养基上；所述的分化培养基：MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-1 2,4-D，1mg·L-1ZT，潮霉素筛选浓度为2mg·L-1；
2)冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，冰上融化后，加入3uL的潮霉素(HYG)质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1分钟；然后37℃水浴3min加入950 μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3小时；离心浓缩菌液，用100μL YEP培养基回溶菌体，后将回溶后的菌体涂于加50mg·L-1卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养，长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因，保存阳性根癌农杆菌落；
3)活化根癌农杆菌：将步骤2)的阳性根癌农杆在培养基中培养至OD600值等于0.3，作为转化羊草愈伤组织的侵染液；
4)侵染羊草愈伤组织并共培养：选择步骤1)分化培养基上生长状况良好、致密有颗粒感的愈伤组织，作为根癌农杆菌侵染的外植体；把愈伤组织放到步骤3)的根癌农杆菌侵染液中，抽真空10min，超声5min，抽真空10min；倒去上层菌液，将侵染后的愈伤组织捞出放滤纸上吹干以除去过多的附着根癌农杆菌，期间需不断翻愈伤组织至干燥；然后将侵染后的愈伤组织在滤纸上共培养3天；
5)植物转化材料的筛选培养：经步骤4)侵染的植物组织材料与根癌农杆菌共培养3天之后，取出愈伤组织在无菌条件下转到筛选培养基上，暗培养筛选1.5-2月，每2周继代一次以保持抗生素筛选压力的稳定；
进一步，筛选培养基上：MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，2mg·L-1 2,4-D，300mg L-1特美汀，30mg·L-1潮霉素。
6)分化筛选培养基及培养条件：将步骤5)暗培养筛选后的愈伤组织转移到分化筛选培养基上，所述分化筛选培养基：MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-12,4-D，1mg·L-1ZT，300 mg L-1特美汀，2mg·L-1潮霉素，光照强度2000lx，15-25天继代一次；经过4-6周筛选培养之后，未转化材料死亡，转化材料能够继续生长；光周期为8小时光照，16小时黑暗；2-3月后，阳性愈伤组织进行分化；
7)生根培养基及培养条件：将步骤6)待分化苗在培养皿中长至4-6cm时，将分化苗继代在生根培养基上；在27℃下，光周期为 8小时光照，16小时黑暗，培养10-20天羊草生根。
进一步，所述的生根培养基的成分及终浓度：1/2MS基本培养基，15g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，300mg L-1特美汀。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明通过农根菌介导，通过根癌农杆菌系统导入外源基因并获得转基因植株。首先在植物组织培养过程中，基本培养基只能保证外植体生存的最低要求，在禾本科牧草外植体诱导愈伤组织的过程汇总，一般是2，4-D的添加才有利于愈伤组织的诱导。在愈伤组织的继代过程中，一般需要降低2，4-D的浓度，产生胚性的愈伤组织，确定了羊草愈伤组织的诱导及增殖继代培养条件。而在分化培养过程中，通常为6-BA与KT或NAA配合使用，而2，4-D作为一种生长素，常被用于植物愈伤组织的诱导，没有在植物组织分化中使用，本研究创造性的通过添加生长素2，4-D和ZT并筛选得到了适合侵染的羊草愈伤组组基因型LcF-01，使羊草分化率达到95％以上，得到了羊草愈伤组织分化而来的再生植株。进一步对农根菌介导的转化方法进行了研究，首次获得了带有HYG基因的转基因株系，为羊草品种 LcF-01的遗传转化体系的建立提供了一种可能性。此外，羊草抗逆性强耐寒，耐盐碱，羊草遗传转化体系的建立，方便了以羊草作为模型，研究其抗逆性的分子机制，挖掘羊草中抗逆相关的基因，通过基因工程手段，将挖掘到的相关基因应用到其他作物中，提高作物对不利环境的抵抗能力。
附图说明：
图1为植物激素对羊草分化诱导的影响图；
A.MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-1 2,4-D， 1mg·L-1ZT；
B.MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-1 2,4-D， 1mg·L-1KT；
C.MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-1ZT；
D.MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-1KT
图2羊草不同基因型愈伤组织分化诱导图；
图3为羊草分化潮霉素筛选压力实验中愈伤组织的分化图；
图4为羊草的遗传转化体系。
A)羊草愈伤根癌农杆菌侵染与共培养；B)羊草在愈伤筛选培养基上，愈伤组织产生新的抗性愈伤组织且可以再生出植株；C)再生出的愈伤组织的GUS染色阳性鉴定；D)阳性愈伤的再生植株.
图5为PCR分析羊草再生植株的凝胶电泳图。
PCR分析羊草阳性植株中中抗性基因HYG基因的存在情况(1:2 kb DNA marker；L1–L10:从羊草再生植株基因组DNA扩增的PCR产物；L11-L12:从根癌农杆菌(EHA105)菌落扩增的PCR产物；L13:从非转化植株基因组DNA扩增的PCR产物；20:去离子水扩增的PCR 产物)。
具体实施方式：
下面结合附图和实例对本发明做进一步详细说明。
本发明英文缩写的中文释义如下：
2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸
ZT:6-(4羟基-3-甲基-2-反丁烯基)氨基嘌呤
KT：6-糠基氨基嘌呤
所用到的羊草种子由黑龙江省农科院草业研究所提供，种子编号为黑龙江省农科院草业研究所对种子的编号。
实施例1：选择适合羊草分化基因型
1)选择羊草：选取6种不同来源的羊草种子，编号分别为：D1、 #1、#6、#12、#15和LcF-01，做分化诱导。所述的诱导培养基：MS 基础培养基，5mg·L-1 2,4-D，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂， pH5.8；
2)制备较利于羊草分化的愈伤组织：选择状态较好，即致密有颗粒感的愈伤组织。将愈伤组织在无菌的环境中转移到含相应植物激素组合的新鲜的继代培养基上，继代一次，继代培养的环境条件：温度为25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗；
所述的继代培养基为：MS基础培养基，2mg·L-1 2,4-D，30 g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂；
3)愈伤组织的分化诱导：将羊草不同基因型的愈伤组织置于分化培养基MSDZ(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1 mg·L-12，4-D，1mg·L-1ZT)培养基上培养。在培养1周后，愈伤组织开始分化，出现绿色芽点，2周后统计分化的愈伤组织的数量。
实验结果显示，LcF-01的愈伤组织能够最有效地进行分化，在最初1周时间内平均21块愈伤组织诱导分化可达15块，到第2周愈伤组织有20块进行分化，分化效率为95.2％(图2)、表1。
表1不同基因型的羊草分化情况
Figure BDA0003597516880000071
Figure BDA0003597516880000081
实施例2：筛选适合羊草分化的培养基
1)选取愈伤组织：选取生长状态一致有颗粒感且状态发白的羊草愈伤组织。
2)愈伤组织继代在不同条件培养基：将取好的愈伤组织分别继代在分化培养基MSDZ(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂， 1mg·L-12，4-D，1mg·L-1ZT)、MSDK培养基(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-12，4-D，1mg·L-1KT)以及MS培养基A(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-1ZT)和MS 培养基B(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-1KT)。
3)拍照记录愈伤组织分化生长状态。
在整个培养过程持续观察发现，在培养1周后，愈伤组织表面开始出现绿色芽点。实验结果显示，1mg/L 2，4-D和1.0mg/L ZT的 MSDZ培养基能够最有效地诱导愈伤组织的分化(图1)。该组合激素诱导羊草分化效率可达到70％以上，而其他三种组合分化效率不超过20％。因此确定1mg/L 2，4-D和1.0mg/L ZT的MSDZ培养基为愈伤组织分化的最佳培养基。本实施例第一次初步选出了适合羊草愈伤组织分化的培养基。
实施例3：羊草分化潮霉素筛选压力实验
1)将羊草愈伤组织分成小块，置于含浓度梯度增加的潮霉素 (0.5-5mg/L)的分化诱导培养基上进行抗生素的敏感性及筛选压力实验。经过三周的抗性筛选培养实验，发现羊草LcF-01的愈伤组织的分化对潮霉素很敏感。
2)取致密有颗粒感的羊草愈伤组织，置于含不同浓度梯度的分化培养基上(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-12， 4-D，1mg·L-1ZT)，潮霉素浓度梯度为0.5mg·L-1，2mg·L-1，5mg·L-1，诱导羊草再生苗(图3)。
3)统计记录诱导出不定芽的愈伤组织数目并进行拍照记。
将羊草愈伤组织分成小块，置于含浓度梯度增加的潮霉素(0.5-5 mg/L)的分化诱导培养基上进行抗生素的敏感性及筛选压力实验。经过三周的抗性筛选培养实验，发现羊草LcF-01的愈伤组织的分化对潮霉素很敏感。随着潮霉素浓度的增加及处理时间的延长，外植体的分化率急剧下降(图3)。当潮霉素的浓度达到5mg/L时，愈伤组织不再分化。当潮霉素的浓度达到2mg/L时，外植体处理一周后的分化率为35％，处理两周和三周后的分化率分别为19％和2％。在这个筛选压力下，潮霉素能够有效抑制野生型羊草的分化且能保证羊草部分愈伤组织能进行分化。
实施例4:根癌农杆菌介导的羊草遗传转化
1)冻融法转化根癌农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌EHA105 感受态细胞，冰上融化后，加入3uL的潮霉素(HYG)质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1分钟；然后37℃水浴3分钟加入950 μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3小时；5000 rpm离心1分钟以浓缩菌液，用100μL YEP回溶菌体，后将回溶后的菌体涂于加50mg·L-1卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养。长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因，保存阳性菌落。
2)将步骤1)获得的带有HYG质粒的根癌农杆菌从-80℃冰箱里取出，划线在相应抗性的根癌农杆菌固体培养基(YEP基础培养基， 16g·L-1琼脂)上，在28℃的条件下进行暗培养。2天后，根癌农杆菌固体培养基上长出了根癌农杆菌单克隆。然后将其接种到50mL含有相应抗性的根癌农杆菌液体培养基中(YEP基础培养基)，在28℃的条件下暗培养，转速为200rpm摇菌。当菌液浓度OD600值到达0.6到0.8 之间时，离心富集菌体。用50mL的侵染液(1/10MS+0.1g/LMES+5mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+100μM AS，pH 5.8) 重悬菌液至OD600值等于0.3，作为转化羊草愈伤组织的侵染液。重悬液中含有100μM乙酰丁香酮(AS)诱导根癌农杆菌Vir区基因活化，以促进根癌农杆菌T-DNA进入植物基因组并与其整合。该悬浮液用于后续的遗传转化实验。
3)侵染羊草愈伤组织并共培养：取羊草继代20-30天的愈伤组织，放到步骤3)获得的根癌农杆菌的侵染液中，抽真空10min，超声5min，抽真空10min，然后倒去上层菌液，将侵染后的愈伤组织捞出放无菌滤纸吸干多余菌液后在滤纸上吹干，期间需不断翻愈伤组织至干燥，共培养3天(图4中的A))。3天之后转移到筛选培养基(MS 基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，2mg·L-1 2,4-D，300mg L-1特美汀，30mg·L-1潮霉素)进行暗培养。羊草愈伤组织产生有抗性的白色愈伤组织(图4中的B))，进行继代培养，继代培养基同上(MS 基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，2mg·L-1 2,4-D，300mg L-1特美汀，30mg·L-1潮霉素)，15-25天继代一次，大约继代4-6周。
34)对新长出的愈伤组织进行GUS鉴定(图4中的C))，观察染色结果后，将具有抗性的愈伤组织转移到分化筛选培养基(MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，1mg·L-12,4-D，1mg·L-1ZT， 300mg L-1特美汀，2mg·L-1潮霉素)进行分化诱导(图4中的B))。在27℃下，光周期为8小时光照，光照强度2000lx，16小时黑暗， 15天继代一次，培养60-90天。
5)生根培养基及培养条件：用镊子将步骤4)的羊草转基因所出的芽与芽分开，继代在生根培养基上(1/2MS基本培养基，15g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，300mg L-1特美汀)。在27℃下，光周期为8 小时光照，16小时黑暗，培养15-30天羊草生根(图4中的D))。
实施例5：羊草转基因再生植株GUS染色鉴定和PCR检测
1)羊草转基因再生植株DNA提取：取新鲜的羊草转基因再生植株的叶片剪碎置于1.5mL离心管中，加入2×CTAB提取液1mL，使用研磨机震碎后充分混匀，65℃水浴45-60分钟，在水浴期间轻轻颠倒离心管4-6次。水浴结束后，待液体冷却至室温加入等体积的氯仿剧烈震荡15秒，12000rpm室温离心10分钟，取上清液转移到新的1.5mL离心管中，然后加入等体积的异丙醇震荡混匀，于-20℃冰箱中沉淀30分钟，12000rpm室温离心10分钟。然后用1mL70％乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5分钟，倒掉上清洗涤液。洗涤操作重复 1次，最后自然干燥DNA，去除残余乙醇溶液。加入去离子水溶解 DNA，NanoDrop超微量仪测定DNA浓度和比值。
2)PCR反应：青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成HYG基因的 PCR引物，HYG-F:5'-AAGGAATCGGTCAATACACTACATGG-3', HYG-R:5'-AAGACCAATGCGGAGCATATACG-3'。RCR扩增HYG基因，PCR反应总体系为20μL，分别加入HYG基因的上、下游引物各1μL(终浓度20pmol·L–1)，模板DNA2μL(约200ng)，2×MIX Buffer10μL，6μL的去离子水补齐20μL反应总体系。PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,28个循环；72℃延伸10分钟，然后取出PCR反应产物4℃恒温保存。各取10μLHYG基因的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳(1.0％)并拍照，点样时5μL 2 000bp Ladder Maker作为分子量标准。
通过再生植株的胶图观察得到HYG基因PCR产物大小为500bp (图5)符合预期。
总之，本发明建立了根癌农杆菌介导的羊草遗传转化系统，可以为其他单子叶植物遗传转化体系的建立提供借鉴及宝贵经验。羊草是大型草食动物的首选牧草，其品质优良，适口性好、营养价值高和抗逆性强。其转化体系的建立可以为其功能基因的研究提供途径，有助于挖掘羊草中抗逆相关基因并进行验证，为其他作物的增产增收提供基因资源库。

Claims (1)

1.一种根癌农杆菌介导的羊草遗传转化方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1） 获得羊草组培无菌愈伤组织：以羊草的种子为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，外植体长出愈伤组织后，将愈伤组织在无菌的环境中转移到含相应植物激素组合的新鲜的继代培养基上，继代一次，继代培养的环境条件：温度为25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗，然后将愈伤组织继代到分化培养基上；
所述的诱导培养基：MS基础培养基，5 mg·L-1 2,4-D， 30 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂，pH5.8；
所述的继代培养基为：MS基础培养基，2 mg·L-1 2,4-D， 30 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂；
所述的分化培养基：MS基础培养基，30 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂，1 mg·L-1 2,4-D，1 mg·L-1ZT；
2）冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，冰上融化后，加入3 uL的潮霉素质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1 分钟；然后37 ℃水浴3 min加入950 μL无抗生素的YEP培养基，28 ℃，200 rpm，振荡培养3 小时；离心浓缩菌液，用100 μLYEP培养基回溶菌体，后将回溶后的菌体涂于加50 mg·L-1卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养，长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因，保存阳性根癌农杆菌落；
3）活化根癌农杆菌：将步骤2）的阳性根癌农杆在培养基中培养至OD600值等于0.3，作为转化羊草愈伤组织的侵染液；
4）侵染羊草愈伤组织并共培养：选择步骤1）分化培养基上生长状况良好、致密有颗粒感的愈伤组织，作为根癌农杆菌侵染的外植体；把愈伤组织放到步骤3）的根癌农杆菌侵染液中，抽真空10min，超声5min，抽真空10min；倒去上层菌液，将侵染后的愈伤组织捞出放滤纸上吹干以除去过多的附着根癌农杆菌，期间需不断翻愈伤组织至干燥；然后将侵染后的愈伤组织在滤纸上共培养3天；
5）植物转化材料的筛选培养：经步骤4）侵染的植物组织材料与根癌农杆菌共培养3天之后，取出愈伤组织在无菌条件下转到筛选培养基上，暗培养筛选1.5-2月，每2周继代一次以保持抗生素筛选压力的稳定；
6）分化筛选培养基及培养条件：将步骤5）暗培养筛选后的愈伤组织转移到分化筛选培养基上，所述分化筛选培养基：MS基础培养基，30 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂，1 mg·L-12,4-D，1 mg·L-1ZT，300 mg L-1特美汀，2 mg·L-1潮霉素，光照强度2000lx，15-25天继代一次；经过4-6周筛选培养之后，未转化材料死亡，转化材料能够继续生长；光周期为8小时光照，16小时黑暗；2-3月后，阳性愈伤组织进行分化；
7） 生根培养基及培养条件：将步骤6）待分化苗在培养皿中长至4-6 cm时，将分化苗继代在生根培养基上；在27 ℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养10-20天羊草生根；
所述的筛选培养基：MS基础培养基，30 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂，2 mg·L-1 2,4-D，300 mg L-1特美汀，30 mg·L-1潮霉素；
所述的生根培养基的成分及终浓度：1/2 MS基本培养基，15 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂，300 mg L-1特美汀。
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