CN107227313B - 一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，包括以下步骤：(1)农杆菌的活化培养；(2)浸染液的制备：将步骤(1)所得菌体加入MS液体培养基中，置于冰上使菌体完全溶于培养基中，再用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.4‑0.8，然后加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)和0.001％‑0.01％Triton‑100，摇匀；(3)超声处理与浸染：280‑320W，36‑45KHz条件下超声处理1‑3min；(4)共培养；(5)筛选；(6)植株再生。该转化系统完善，铁皮石斛原球茎的存活率高，经过各步骤及参数的优化，转化得到优良的抗性植株且转化率高，阳性转化率高达69.7％。

Description

一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法。
背景技术
铁皮石斛作为一种集观赏和药用价值于一身的重要中药材，主要分布于我国云南、贵州、浙江、四川等地。其含有石斛多糖、石斛碱、氨基酸等多种生物活性成分，味甘，性微寒，属补益药中的补阴药；具有滋阴润肺、生津益胃、清热止咳等功效。但由于其对生长环境要求特殊，多生长于高温多湿的热带、亚热带高山绝岭、悬崖峭壁之间，生长缓慢、自身繁殖能力极低。在人们长期掠夺式采挖与生存条件的破坏下，野生资源濒临灭绝，药材价格不断攀升。而现阶段有的杂交育种、选择育种、诱变育种以及组织育苗、温室或大棚进行后期培育的人工栽培方式由于其生产周期长、育种效率低、产量低、多糖含量不高等原因无法满足市场的需求。并且铁皮石斛资源品质不一、市场缺乏具优良性状的植株，存在如病虫害严重、难于控制开花以及花色花形不丰富等问题。利用转基因技术不仅能上调植物有益成分表达水平，还能增强其抗逆性和抗病虫能力，同时还能控制其生长发育进程，以利市场所需。
农杆菌介导法是利用农杆菌作为媒介进行基因转化的一种方法，与其他转基因方法相比，农杆菌转化方法有着明显的优势：转基因多是单拷贝或低拷贝数插入，并且优先插入转录活性区域；转化效率高，简单有效。并且随着人们对农杆菌介导转化法机理认识的深入，转化方法也不断得到改进。但是目前针对铁皮石斛这一重要中药材，一套农杆菌介导的系统完善且高效的转基因方法还尚未建立。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，可有效解决现有技术中农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化系统不完善，转化效率不高的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)农杆菌的活化培养
挑取农杆菌转化子于液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下活化，然后吸取培养液置于新的液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下扩大培养，培养至OD600＝0.7-0.9，离心，收集菌体；其中，液体培养基包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白胨、0.5％氯化钠、20mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L庆大霉素；
(2)浸染液的制备
将步骤(1)所得菌体加入MS液体培养基中，置于冰上使菌体完全溶于培养基中，再用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.4-0.8，然后加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)和0.001％-0.01％Triton-100，摇匀；
(3)超声处理与浸染
将铁皮石斛种子诱导分化出原球茎，对原球茎进行扩大培养，然后挑选生长状态良好，颜色呈嫩绿色，质地均匀且较为松散的原球茎置于280-320W，36-45KHz条件下超声处理1-3min，然后浸入浸染液中，于28℃，50r/min条件下浸染30min；其中，扩大培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L+活性炭0.2g/L；原球茎大小为3-5mm方块，可根据情况对原球茎进行切割使其满足所需大小要求；
(4)共培养
浸染结束后，倒掉浸染液，用滤纸吸干原球茎上多余浸染液，然后迅速将原球茎转移至共培养基上，进行暗培养；其中，共培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后再加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)；
(5)筛选
将共培养后的原球茎用无菌水冲洗4-5次，每次冲洗至无菌水为清澈透明状态，再用浓度为480-520mg/L的头孢溶液清洗1-2min，倒掉溶液，将原球茎用滤纸吸干水分，迅速置于筛选培养基中培养，培养温度为22-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为14h/天，将存活的原球茎接种至新配制的筛选培养基中培养至长出新的原球茎；其中，筛选培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后添加头孢500mg/L+潮霉素20mg/L；
(6)植株再生
将筛选得到的新原球茎接种于不含潮霉素的筛选培养基中培养，待分化出芽后转入生根培养基中培养至获得完整植株，然后进行PCR和染色检测鉴定；其中，生根培养基为MS+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L。
进一步地，农杆菌为GV3101。
进一步地，步骤(2)中用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.6。
进一步地，步骤(2)中调节菌液浓度后加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)和0.001％Triton-100。
进一步地，步骤(3)中300W，40KHz条件下超声处理1min。
进一步地，步骤(4)中置于20℃暗培养4天。
本发明提供的一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，具有以下有益效果：
不同的农杆菌毒性不同，对于不同的植物而言，不同的农杆菌及其浓度对其感染力也不同，因此遗传转化中选择适合的农杆菌十分重要。而且由于植物与农杆菌的最适生长温度不同，共培养时就要选择既不影响植物和菌体生长，又能提高农杆菌转化效率的温度及时间。对植物来说，表面活性剂是一类化合物，它们可以作为一种渗透剂，增强植物细胞质膜的敏感性，因而更有利于外源物质进入细胞内，因此植物遗传转化等研究中应用广泛。对于超声波，转化材料经适当的超声波处理，会因其空化效应、机械作用、热效应等而产生许多微小的伤口，使得外源基因更容易进入受体细胞，从而使农杆菌遗传转化效率提高，并且使转入的基因在受体内高效表达。
因此本发明对介导的农杆菌种类、浸染液浓度、表面活性剂种类和浓度、共培养时间、超声时间进行了优化，再结合各阶段的培养基来进行铁皮石斛的遗传转化，该转化系统完善，铁皮石斛原球茎的存活率高，经过各步骤及参数的优化，转化得到优良的抗性植株且转化率高，阳性转化率高达69.7％。
附图说明
图1为表面活性剂对原球茎存活率的影响结果图。
图2为不同的农杆菌对原球茎存活率的影响结果图。
图3为超声处理时间和表面活性剂的结合对原球茎存活率的影响结果图。
图4为培养温度和培养时间对原球茎存活率的影响结果图。
图5为采用本发明转化方法得到的抗性原球茎和转基因植株。
图6为PCR检测结果图。
图7为对抗性植株和野生植株的染色结果图。
具体实施方式
实施例1
一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)农杆菌的活化培养
挑取-80℃农杆菌转化子于5ml液体培养基中，置于28℃，200r/min，条件下活化，暗培养至适宜浓度时，吸取适量培养液置于新配制的液体培养基(三角瓶)中，置于28℃，200r/min条件下扩大培养，培养至OD600＝0.8左右，倒入50ml离心管中，于4000r/min下离心10min，弃上清，收集菌体；其中，液体培养基包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白胨、0.5％氯化钠、20mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L庆大霉素；
(2)浸染液的制备
将步骤(1)所得菌体加入MS液体培养基中，置于冰上使菌体完全溶于培养基中，再用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.4、0.6、0.8和1.0，然后加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)和表面活性剂，摇匀。
实验过程中选用Silwet-77、Tween20和Triton-100作为表面活性剂，浓度为0.01％和0.001％，以不添加表面活性剂作为对照，表面活性剂对原球茎存活率的影响结果见图1。
由图1可知，当以Silwet-77、Tween20作为表面活性剂时，对原球茎存活率有一定的影响，当Silwet-77、Tween20浓度均为0.001％时，对原球茎存活率影响不大，当浓度为0.01％时，对原球茎有抑制作用，而当以Triton-100作为表面活性剂时，会提高原球茎的存活率，进而提高转化成功率，当浓度为0.001％时，促进作用最明显(图1中星号所示)。
当其他条件不变，仅更改农杆菌种类，所使用的农杆菌为GV3101、LBA4404和EHA105，观察原球茎的存活率，其结果见图2。
由图2可知，采用不用的农杆菌介导，其原球茎的存活率不同，差异较大，用MS液体培养基调节菌液浓度时，对原球茎的存活率影响也很大，当OD600＝0.6和OD600＝0.8时，对LBA4404和EHA105介导的原球茎存活率影响不是很大，但对GV3101介导的原球茎存活率影响还是很大的，当采用GV3101介导，用MS液体培养基调节菌液OD600＝0.6，原球茎存活率最高(图2中星号所示)。
(3)超声处理与浸染
将铁皮石斛种子诱导分化出原球茎，对原球茎进行扩大培养，然后挑选生长状态良好，颜色呈嫩绿色，质地均匀且较为松散的原球茎分别置于300W，40KHz条件下超声处理1min、3min，然后浸入浸染液中，于28℃，50r/min条件下浸染30min；其中扩大培养时所用扩大培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L+活性炭0.2g/L。
本方案对超声处理时间和表面活性剂的结合进行了优化实验，其结果见图3。
由图3可知，当超声处理1min对原球茎的生长有促进作用，而处理3min对原球茎的生长没有明显影响，将超声处理后的原球茎浸入浸染液中，浸染液中的表面活性剂为0.001％Triton-100时，原球茎存活率最高(图中星号所示)。
(4)共培养
浸染结束后，倒掉浸染液，用滤纸吸干原球茎上多余浸染液，然后迅速将原球茎转移至共培养基上，置于暗环境中培养；其中，共培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后再加入100μmol/L乙酰丁香酮(AS)。
本方案对共培养的温度和时间进行了优化，培养条件分为3种：A、20℃培养3天、4天和5天；B、28℃培养36h、48h和60h；C、先在28℃培养，再转入20℃培养，具体为：先在28℃培养36h，再转入20℃培养3天；先在28℃培养48h，再转入20℃培养2天；先在28℃培养60h，再转入20℃培养1天。培养温度和培养时间对原球茎存活率的影响结果见图4。
由图4可知，培养温度和培养时间对原球茎的存活率均有影响，在20℃培养时，培养4天，原球茎的存活率达到最高；在28℃培养时，培养48h，原球茎的存活率达到最高；28℃转20℃时培养时，先在28℃培养48h，再转入20℃培养2天，原球茎的存活率达到最高。虽在28℃培养48h，再转入20℃培养2天以及28℃培养2天均能获得较高的存活率，但在后期培养过程中发现会出现农杆菌自身污染的情况，轻度污染会造成后期进行反复清洗，增加工作量，污染严重的会直接导致石斛死亡。因此，共培养条件选择在20℃培养4天。
(5)筛选
将共培养后的原球茎用无菌水冲洗4-5次，每次冲洗至无菌水为清澈透明状态，再用浓度为500mg/L的头孢溶液清洗1-2min，倒掉溶液，将原球茎用滤纸吸干水分，迅速置于筛选培养基中培养，培养温度为22-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为14h/天，将存活的原球茎接种至新配制的筛选培养基中培养至长出新的原球茎；其中，筛选培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后添加头孢500mg/L+潮霉素20mg/L；其中，头孢为普通头孢，固体粉末，将其配制成一定浓度的储存液，使用时再按比例进行稀释，其作用为抑制农杆菌过度生长及其他杂菌的污染。
(6)植株再生
将筛选得到的新原球茎接种于不含潮霉素的筛选培养基中培养，待分化出芽后转入生根培养基中培养至获得完整植株，然后进行PCR和染色检测鉴定；其中，生根培养基为MS+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L。
经过上述转化方法得到的抗性原球茎和转基因植株见图5，其中左图为抗性原球茎，右图为转基因植株。
PCR检测结果见图6，染色结果见图7(上面为转基因植株，下面为野生型植株)。从PCR结果看，阳性植株均出现588bp的条带，证明外源基因成功插入铁皮石斛基因组中。从染色结果来看，转入gus基因的转基因植株经染液染色后根和叶均有明显的蓝色，而未转基因的野生型植株在同样染液中染色后，并未出现蓝色。由此证明本方案的转化方法是成功有效的。
本发明对介导的农杆菌种类、浸染液浓度、表面活性剂种类和浓度、共培养时间、超声时间进行了优化，再结合各阶段的培养基来进行铁皮石斛的遗传转化，该转化系统完善，铁皮石斛原球茎的存活率高，经过各步骤及参数的优化，转化得到优良的抗性植株且转化率高，阳性转化率高达69.7％。
现有技术中所用培养基均是以1/2MS为基本培养基，而本方案采用的为MS为基本培养基。他们所用的激素为单独使用6-BA、NAA、或KT，本方案采用的为6-BA与NAA配合使用，这样更利于石斛原球茎的生长与分化。此外，一些的研究中在培养基中添加椰乳，虽然可以为石斛生长提供丰富的有机物，但是椰乳成本较高，要获得椰乳操作也较为麻烦。而本方案添加的土豆不仅可为石斛生长提供丰富的有机物，促进其生长，而且土豆取材方便，成本更低，适用性也更加广泛。
本方案选的89株里有62株达到阳性，不仅获得的转基因植株多，选出来做检测的数量也多，仍然得到更高的转化率，说明本方案简单高效且成本低。

Claims (3)

1.一种高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)农杆菌的活化培养
挑取农杆菌转化子于液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下活化，然后吸取培养液置于新的液体培养基中，置于26-28℃，180-200r/min条件下扩大培养，培养至OD600＝0.7-0.9，离心，收集菌体；其中，液体培养基包括：1％酵母提取物、1％胰蛋白胨、0.5％氯化钠、20mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L庆大霉素；其中，农杆菌为GV3101；
(2)浸染液的制备
将步骤(1)所得菌体加入MS液体培养基中，置于冰上使菌体完全溶于培养基中，再用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.4-0.8，然后加入100μmol/L乙酰丁香酮和0.001％Triton-100，摇匀；
(3)超声处理与浸染
将铁皮石斛种子诱导分化出原球茎，对原球茎进行扩大培养，然后挑选生长状态良好，颜色呈嫩绿色，质地均匀且较为松散的原球茎置于300W，40KHz条件下超声处理1min，然后浸入浸染液中，于28℃，50r/min条件下浸染30min；其中，扩大培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L+活性炭0.2g/L；
(4)共培养
浸染结束后，倒掉浸染液，用滤纸吸干原球茎上多余浸染液，然后将原球茎转移至共培养基上，进行暗培养；其中，共培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后再加入100μmol/L乙酰丁香酮；
(5)筛选
将共培养后的原球茎用无菌水冲洗4-5次，再用浓度为480-520mg/L的头孢溶液清洗1-2min，倒掉溶液，将原球茎用滤纸吸干水分，置于筛选培养基中培养，培养温度为22-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为14h/天，将存活的原球茎接种至新配制的筛选培养基中培养至长出新的原球茎；其中，筛选培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L，灭菌后添加头孢500mg/L+潮霉素20mg/L；
(6)植株再生
将筛选得到的新原球茎接种于不含潮霉素的筛选培养基中培养，待分化出芽后转入生根培养基中培养至获得完整植株；其中，生根培养基为MS+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4.8g/L+马铃薯20g/L。
2.根据权利要求1所述的高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中用MS液体培养基调节菌液至OD600＝0.6。
3.根据权利要求1所述的高效的农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中置于20℃暗培养4天。
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