CN108770690A

CN108770690A - 一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法

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Publication number: CN108770690A
Application number: CN201810427769.XA
Authority: CN
Inventors: 林新春; 诸葛菲; 洪彬; 徐胤; 沈琦超
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zoomlion Tiansheng Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2018-11-09
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: CN108770690B

Abstract

一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，属于植物组织培养技术领域。其按下列步骤进行：1）无菌芽的获得；2）愈伤组织诱导培养；3）愈伤组织分化培养；4）再生苗生根培养；5）再生植株的移栽。采用本方法最高愈伤组织诱导率为91.7%，其中乳白色致密颗粒状愈伤组织诱导率为61.7%，最高幼苗分化率为46.67%，最高生根率为55%；能够使外植体高效诱导出愈伤组织，成功建立高效稳定的再生体系，为该竹子遗传转化和细胞工程研究创造有利条件，为利用转基因技术育种奠定了良好的基础。本方法实施步骤简单易行，实施条件宽松，效果非常显著。

Description

一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法。

背景技术

马来甜龙竹(Dendrocalamus asper）为牡竹属(Dendrocalamus）大型丛生竹类，笋味甘甜鲜脆，营养丰富，是优良的笋用竹种；竿可为造纸原料，亦宜庭园栽培，具有较高的经济价值和观赏价值。然而竹类植物因开花周期长，难预测，且不同竹种同时开花概率低，开花后竹子通常死亡，结实率低等生物学特性，使得人们很难通过杂交育种的方法选育优良的竹种。转基因技术是植物遗传育种的有效方法，但需要一个高效稳定的再生体系。然而竹子高效稳定的再生体系较难建立，目前关于竹子转基因的报道较少，仅限于丛生竹种，如麻竹（Dendrocalamus latiflorus）、版纳甜龙竹(Dendrocalamus hamiltonii)和梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）。

1982年，Metha等首次报道了利用体细胞胚胎发生途径成功建立印度箣竹（Bambusa arundinacea）再生体系。随后的30多年中，多个竹种的再生体系相继建立，但所选的外植体多为种胚和花药，而芽尖取材方便，更具有可行性。本专利以马来甜龙竹芽尖为外植体，诱导出愈伤组织并实现了植株再生，为遗传转化奠定坚实的基础，对此，尚未见有关资料的报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法的技术方案。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：

1）无菌芽的获得

将马来甜龙竹种子剥去外壳置于烧杯中，浸泡24 h，0.5%次氯酸钠溶液真空抽滤20min，无菌水冲洗干净后在体式显微镜下剥离种胚，将其接种到MS培养基中，待苗长大后移至芽增殖培养基进行培养，得到马来甜龙竹无菌苗体系；

2）愈伤组织诱导培养

取步骤1）得到的马来甜龙竹无菌苗体系，将0.5 cm长的带芽茎段接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到愈伤组织；

3）愈伤组织分化培养

取经过增殖培养的乳白色、致密颗粒状愈伤组织接种至分化培养基中进行分化培养，得到再生苗；

4）再生苗生根培养

将步骤3）得到的再生苗移入生根培养基中进行生根诱导培养；

5）再生植株的移栽

生根诱导培养后，选取根长势粗壮且植株健壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室下炼苗，炼苗后进行移栽培养。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤1）中芽增殖培养基为MS基本培养基添加2 mg•L^-1 6-BA、1 mg•L^-1 KT、0.5 mg•L^-1NAA、30 g•L^-1蔗糖和0.4%琼脂得到，芽增殖培养基pH为5.7。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤1）中培养条件为光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤2）中诱导培养基为MS培养基添加0-10 mg•L^-12,4-D和0-2 mg•L^-1NAA得到，诱导培养基pH为5.7；优选为诱导培养基为MS培养基添加3mg•L^-12,4-D和0.5-1 mg•L^-1NAA得到。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤2）中诱导培养条件为暗培养，温度25±2℃，诱导培养5周。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤3）中分化培养基为MS培养基添加0.5-2 mg•L^-1 6-BA、1-4 mg•L^-1 KT和0-0.5mg•L^-1的NAA得到，分化培养基pH为5.7，优选为分化培养基为MS培养基添加1 mg•L^-1 6-BA、1 mg•L^-1 KT和0.25 mg•L^-1NAA得到。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤3）中分化培养条件为：先进行0-6天弱光培养，光强10 μmol•m^-2•s^-1，后进行光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤4）中生根培养基为1/2 MS培养基添加0-10 mg•L^-1 IBA得到，生根培养基pH为5.7，优选为生根培养基为1/2 MS培养基添加3mg•L^-1 IBA得到。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤4）中生根培养条件为光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。

所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤5）中再生植株的移栽具体为生根诱导培养一个月后，选取根长势粗壮且植株健壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室360 μmol•m^-2•s^-1的强光下炼苗一周，再取出试管苗，用温水洗净根部的培养基，将植株移栽于泥炭：珍珠岩：蛭石的体积比为1：1：1的混合培养基质中，并进行单株套袋，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角，两周后完全脱袋，当植株长出新叶，生长稳定时移栽至温室。

本发明的有益效果是：采用本方法最高愈伤组织诱导率为91.7%，其中乳白色致密颗粒状愈伤组织诱导率为61.7%，最高幼苗分化率为46.67%，最高生根率为55%；能够使外植体高效诱导出愈伤组织，成功建立高效稳定的再生体系，为该竹子遗传转化和细胞工程研究创造有利条件，为利用转基因技术育种奠定了良好的基础。本方法实施步骤简单易行，实施条件宽松，效果非常显著。

附图说明

图1 为芽尖正在诱导的愈伤组织形态图。

图2 为乳白色、致密颗粒状愈伤组织形态图。

图3 为乳黄色、结构紧密、质地坚硬且具有瘤状和芽状结构的愈伤组织形态图。

图4 为黄褐色或半透明、表明的愈伤组织形态图。

图5 为变绿的愈伤组织形态图。

图6 为愈伤组织分化出苗形态图。

图7 为马来甜龙竹再生苗形态图。

图8 为马来甜龙竹再生苗生根形态图。

图9 为炼苗移栽后的植株形态图。

图10 为愈伤组织诱导阶段2,4-D不同浓度的诱导率对比图。

图11 为愈伤组织诱导阶段在添加3 mg•L^-1 2,4-D基础上NAA不同浓度的诱导率对比图。

图12 为再生苗诱导生根阶段IBA不同浓度的诱导率对比图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，并给出具体实施方式。

实施例

利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，按下列步骤进行：

1）无菌芽的获得

将马来甜龙竹种子剥去外壳置于烧杯中，浸泡24 h，0.5%次氯酸钠溶液真空抽滤20min，无菌水冲洗干净后在体式显微镜下剥离种胚，将其接种到MS固体培养基中，待苗长大后移芽增殖培养基即MS（Murashige and Skoog）基本培养基添加2 mg•L^-1 6-BA即6-苄基腺嘌呤、1 mg•L^-1 KT即激动素、0.5 mg•L^-1NAA即萘乙酸、30 g•L^-1蔗糖、0.4%琼脂得到，pH为5.7；培养条件为：光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃；

2）愈伤组织诱导培养

诱导愈伤组织所用的芽尖选用步骤1）已经建立好的无菌苗体系，将0.5 cm长的带芽茎段接种于诱导培养基中：愈伤组织诱导基本培养基为MS培养基添加的外源激素为2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸和NAA得到，2,4-D浓度为0-10 mg•L^-1，NAA浓度为0-2 mg•L^-1，30 g•L^-1蔗糖，0.4%琼脂；pH为5.7；诱导条件为：暗培养，温度25±2℃；诱导培养5周，愈伤组织形成，图1为芽尖正在诱导的愈伤组织形态图；

3）愈伤组织分化培养

将增殖培养的乳白色、致密颗粒状愈伤组织（如图2所示）接种在分化培养基中进行分化，分化基本培养基为MS培养基添加浓度为0.5-2 mg•L^-1的6-BA、浓度为1-4 mg•L^-1的KT和浓度为0-0.5 mg•L^-1的NAA，30 g•L^-1蔗糖，0.4%琼脂；pH为5.7；培养条件为：先进行0-6天弱光培养，光强10 μmol•m^-2•s^-1，后进行光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃；图3为乳黄色、结构紧密、质地坚硬且具有瘤状和芽状结构的愈伤组织形态图；图4为黄褐色或半透明、表明的愈伤组织形态图；图5为变绿的愈伤组织形态图；图6为愈伤组织分化出苗形态图；

4）再生苗生根培养

将愈伤组织分化培养基出的再生苗移入生根培养基中进行生根诱导；生根基本培养基为1/2 MS培养基添加浓度为0-10 mg•L^-1的IBA即吲哚丁酸，30 g•L^-1蔗糖，0.4%琼脂得到；pH为5.7；培养条件为：光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃；图7为马来甜龙竹再生苗形态图；

5）再生植株的移栽

一个月后，选取根长势粗壮且植株健壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室360 μmol•m^-2•s^-1的强光下炼苗一周，然后取出试管苗，用温水洗净根部的培养基，将植株移栽于泥炭：珍珠岩：蛭石的体积比为1：1：1的混合培养基质中，并进行单株套袋，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角，两周后完全脱袋，当植株长出新叶，生长稳定时移栽至温室；图8为炼苗移栽后的植株形态图。

试验例1：马来甜龙竹芽尖接种到不同浓度2,4-D培养基中愈伤组织诱导率情况对比

在愈伤组织诱导培养时，采用不同浓度的2,4-D培养基进行培养，2,4-D浓度梯度为0、0.3、1、3、10 mg•L^-1。从图10中可看出当不添加或添加低浓度2,4-D时，愈伤组织诱导率为0；在较高的2,4-D浓度下，马来甜龙竹芽尖可诱导出愈伤，且随着2,4-D浓度的升高，愈伤组织和致密颗粒状愈伤组织诱导率均呈现出先上升后下降的趋势，当2,4-D浓度为1 mg•L^-1时，愈伤组织和致密颗粒状愈伤组织诱导率较低，分别为35%和10%；当2,4-D浓度为3 mg•L^-1时，愈伤组织诱导率达70%，且致密颗粒状愈伤组织诱导率为45%，与其它处理差异显著；2,4-D浓度持续升高到10 mg•L^-1，愈伤组织和致密颗粒状愈伤组织诱导率均有所下降，仅55%和21.7%，且诱导出的愈伤组织有部分出现褐色斑点，说明过高浓度的2,4-D容易致使外植体和愈伤组织褐化。因此，3 mg•L^-1 2,4-D较适宜马来甜龙竹芽尖愈伤组织的诱导。

试验例2：愈伤组织诱导阶段在添加3 mg•L^-1 2,4-D基础上NAA不同浓度的诱导率对比

在愈伤组织诱导培养时，将马来甜龙竹芽尖接种到添加有3 mg•L^-1 2,4-D和不同浓度NAA培养基中愈伤组织诱导率情况进行对比。NAA浓度梯度为0、0.5、1、2 mg•L^-1。从图11中可以看出在添加低浓度（0.5、1 mg•L^-1）NAA时，愈伤组织诱导率没有显著差异，但致密颗粒状愈伤组织诱导率显著高于不添加NAA时；当NAA浓度升高至2 mg•L^-1，愈伤组织及致密颗粒状愈伤组织诱导率显著降低。因此，在愈伤组织诱导过程中可添加0.5-1mg•L^-1 NAA。

试验例3：马来甜龙竹再生苗接种到不同浓度IBA培养基中生根率情况对比

在进行再生苗生根培养时，将马来甜龙竹再生苗接种到不同浓度IBA培养基中生根率情况进行对比，IBA浓度梯度为0、0.3、1、3、10 mg•L^-1。如图12所示，再生苗的生根率随着IBA浓度的增加而升高。在未添加IBA的1/2MS培养基中经过4周的培养，再生苗亦可生根，生根率为40%，生根数量较少，一般为1~2条根，根细且长，部分根盘踞在试管底部；当IBA浓度为0.3-1 mg•L^-1时，培养3天后，再生苗开始陆续生根，4周后根数可达2-4条，细长，平均根长约4-5 cm，诱导率为45%；当IBA浓度升高至3 mg•L^-1时，培养3天后再生苗陆续被诱导生根，4周后根数可达3~5条，平均根长为4-5cm，根较粗壮，部分长有侧根，诱导率为55%；当IBA浓度升高至10 mg•L^-1时，培养7天左右再生苗开始生根，4周后平均诱导根数3-5条，诱导率为65%，平均根长为1.75 cm，与其他处理相比该处理根较粗短，弯曲，植株发黄长势较差。综上所述，马来甜龙竹再生苗诱导生根较适宜的IBA浓度为3 mg•L^-1。

试验例:4：马来甜龙竹愈伤组织分化条件对比

在进行愈伤组织分化时，采用正交实验处理的马来甜龙竹愈伤组织进行分化对比，如下表：

表1 正交实验处理的马来甜龙竹愈伤组织分化情况对比表

注：表中愈伤组织分化率代表平均值±标准误；多重比较采用Duncan法；同一栏中不同字母代表差异性显著（P<0.05）。K1，K2，K3指每个测试因子从低到高的三个水平。R=K_max-K_min

表1是马来甜龙竹愈伤组织分化情况的四因素三水平正交实验表。由R值可看出，弱光处理在芽分化中起作用最大（76.67），6-BA作用最小（0）。弱光处理6天的愈伤组织表面最先出现绿点，一般在接种4-6天陆续出现绿点，不进行弱光处理愈伤出现最晚，一般需要10天，继续培养绿点数增多，培养20天后，绿点率基本稳定，并陆续分化成苗。当弱光处理6天，在MS培养基中添加1 mg•L^-1 6-BA、1 mg•L^-1KT和0.25 mg•L^-1NAA时绿点率最高达46.67%，与其他处理差异显著，且有的愈伤同时分化出根和芽，再生苗的芽成簇，伸长生长良好。从正交实验数据分析结果可得，马来甜龙竹芽尖愈伤组织较适宜的分化条件是弱光处理6天，培养基为MS培养基添加1 mg•L^-1 6-BA、1 mg•L^-1 KT和0.25 mg•L^-1NAA。

Claims

1.一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于按下列步骤进行：

1）无菌芽的获得

2）愈伤组织诱导培养

3）愈伤组织分化培养

4）再生苗生根培养

5）再生植株的移栽

2.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤1）中芽增殖培养基为MS基本培养基添加2 mg•L^-1 6-BA、1 mg•L^-1KT、0.5 mg•L^-1NAA、30 g•L^-1蔗糖和0.4%琼脂得到，芽增殖培养基pH为5.7。

3.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤1）中培养条件为光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。

4.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤2）中诱导培养基为MS培养基添加0-10 mg•L^-12,4-D和0-2 mg•L^- ¹NAA得到，诱导培养基pH为5.7；优选为诱导培养基为MS培养基添加3mg•L^-12,4-D和0.5-1mg•L^-1NAA得到。

5.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤2）中诱导培养条件为暗培养，温度25±2℃，诱导培养5周。

6.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤3）中分化培养基为MS培养基添加0.5-2 mg•L^-1 6-BA、1-4 mg•L^-1KT和0-0.5 mg•L^-1的NAA得到，分化培养基pH为5.7，优选为分化培养基为MS培养基添加1mg•L^-1 6-BA、1 mg•L^-1 KT和0.25 mg•L^-1NAA得到。

7.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤3）中分化培养条件为：先进行0-6天弱光培养，光强10 μmol•m^-2•s^-1，后进行光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。

8.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤4）中生根培养基为1/2 MS培养基添加0-10 mg•L^-1 IBA得到，生根培养基pH为5.7，优选为生根培养基为1/2 MS培养基添加3mg•L^-1 IBA得到。

9.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤4）中生根培养条件为光培养，光强45 μmol•m^-2•s^-1，光周期16/8 h，温度25±2℃。

10.如权利要求1所述的一种利用马来甜龙竹芽尖进行高效稳定再生体系的建立方法，其特征在于所述的步骤5）中再生植株的移栽具体为生根诱导培养一个月后，选取根长势粗壮且植株健壮的再生苗进行驯化移栽，将其放在驯化室360 μmol•m^-2•s^-1的强光下炼苗一周，再取出试管苗，用温水洗净根部的培养基，将植株移栽于泥炭：珍珠岩：蛭石的体积比为1：1：1的混合培养基质中，并进行单株套袋，定期浇水，一周后剪去塑料袋两角，两周后完全脱袋，当植株长出新叶，生长稳定时移栽至温室。