CN112522304B - 一种栾树遗传转化方法 - Google Patents

一种栾树遗传转化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112522304B
CN112522304B CN202011575268.XA CN202011575268A CN112522304B CN 112522304 B CN112522304 B CN 112522304B CN 202011575268 A CN202011575268 A CN 202011575268A CN 112522304 B CN112522304 B CN 112522304B
Authority
CN
China
Prior art keywords
callus
culture medium
culture
screening
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011575268.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112522304A (zh
Inventor
王平
周韬
白磊
何其浩
孙吉康
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University of Forestry and Technology
Original Assignee
Central South University of Forestry and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University of Forestry and Technology filed Critical Central South University of Forestry and Technology
Priority to CN202011575268.XA priority Critical patent/CN112522304B/zh
Publication of CN112522304A publication Critical patent/CN112522304A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112522304B publication Critical patent/CN112522304B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种栾树遗传转化方法，包括:(1)栾树外植体的准备；(2)栾树愈伤组织快速诱导；(3)农杆菌菌液侵染和共培养；(4)愈伤组织脱菌、筛选培养；(5)不定芽分化培养；(6)生根培养。该栾树遗传转化方法，从栾树种子萌发获得无菌苗，以各组织部位诱导的愈伤组织为受体，以GFP基因为报告基因通过脓杆菌介导的方法进行遗传转化，利用潮霉素抗性位点梯度筛选阳性转化受体愈伤组织，以愈伤组织分化培育发育成完整植株，实现植物再生，建立起高效快速的栾树遗传转化体系。

Description

一种栾树遗传转化方法
技术领域
本发明涉及栾树遗传转化和组培技术领域，具体涉及一种可利用栾树愈伤组织为受体的农杆菌介导，潮霉素(Cef)梯度筛选阳性转化愈伤组织的遗传转化方法，其中还包含了栾树无菌苗快速获得以及愈伤组织诱导、分化、生根所需的高效培养基配比等系列完整的栾树遗传转化方法。
背景技术
栾树属无患子科栾树属植物，生长于石灰石风化产生的钙基土壤中，该植物耐盐渍、干旱及短期洪水，具有较深的根系，对环境具有很强的适应性。这些特征使栾树成为了我国南方重金属污染区植物修复的重要先锋树种，另外，栾树荫蔽力强，抗风能力强，对粉尘、二氧化硫和臭氧具有较强的抗性和治理作用。同时，栾树也具有良好的经济效应，其木材成黄白色，易加工，能用于一些木材类器具的制造与加工，叶可作为蓝色染料的来源，花可供药用，种子可以榨制工业用油。由此可见，选育出生长快速且繁育力高，可用于不同经济生产型或环境治理型栾树优株和无性系对栾树产业化生产与实际应用具有重要意义。
然而众所周知木本植物生长周期长、树体高大，且由于长期异交具有高度的杂合性，因此，传统育种并不能适应速生树木遗传改良需要，以及极难定向培育符合生产与环境治理的适用型苗木。林木遗传基因工程是林木科研研究的前沿领域，它不仅是研究植物基因功能的重要手段，也为定向培育遗传改良新的林木品种开辟了契机。将基因工程技术手段结合常规育种技术，可大为缩短木本植物的育种周期，定向培育优良特定品种。
目前，还未见栾树转基因体系的相关报道，每种植物的生长特性不同，通过农杆菌介导的转基因体系还涉及一整套的组培快繁方法，需要进行大量的探索实验。本发明前期也尝试了很多现有技术中报道的组培方法，但应用到本发明转基因体系中都没有获得理想的效果。如采用专利2018113475844中栾树种子萌发培养基，种子萌发率和萌发速度、愈伤组织诱导培养基的愈伤生长速度较慢，生根培养基生根率等均远不及本发明，采用专利201410267835.3；201410463255.1；201410607050.6；201510124023.8；201510231119.4；201610697486.8；201711019129.7中的不定芽分化、增殖培养基、生根培养基等配方效果也很不理想。总之，目前还没有一套完整的效果突出的栾树转基因快速组培方法，既能成功构建栾树转基因体系，也能从种子萌发、外植体茎诱导愈伤、愈伤组织分化不定芽、生根培养效率等各个方面达到非常优异的效果。
发明内容
本发明目的在于针对目前栾树遗传转化技术的空白，提供一种栾树快速遗传转化方法。以栾树愈伤组织为受体，进行农杆菌介导遗传转化，高效快速建立栾树遗传转化体系。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种栾树遗传转化方法，依次包括以下步骤：
(1)栾树外植体的准备；
(2)栾树愈伤组织快速诱导；
(3)农杆菌菌液侵染和共培养；
(4)愈伤组织脱菌、筛选培养；
(5)不定芽分化培养；
(6)生根培养。
所述的方法，步骤(1)的栾树外植体采用以下任一种方式获得：
1)将栾树种子浓硫酸浸泡，然后用碳酸氢钠溶液清洗中和、浸泡，消毒处理后进行促萌发培养，其中栾树种子促萌发固体培养基为DKW基本培养基，附加：琼脂粉4-5g/L，6BA，1.5-2.0mg/L，NAA，0.2-0.4mg/L，GA3，0.4-0.6mg/L，结冷胶1.0-1.5g/L；
2)选取休眠状芽的茎段，冲洗干净，切成带有1-2个芽的茎段，消毒处理，无菌水冲洗获得无菌外植体，将无菌外植体转移至培养基中使其生长；
将步骤1)或者步骤2)萌发后的栾树幼苗切割茎段与根系，诱导愈伤组织。
进一步的，步骤(1)的栾树外植体采用以下任一种方式获得：
1)将过6目筛的栾树种子进行65％-75％浓硫酸浸泡3-4分钟后，50-60g/L的碳酸氢钠溶液反复清洗种子彻底中和浓硫酸，再利用50-60g/L的碳酸氢钠水溶液浸泡种子10-12min，然后对种子进行消毒处理：70％乙醇40-50s，0.1％升汞2-10min，无菌水冲洗三次以上获得无菌种子，消毒处理后进行促萌发培养，其中栾树种子促萌发固体培养基为DKW基本培养基，附加6BA，2.0mg/L，NAA，0.4mg/L，GA3，0.4mg/L，结冷胶1.2g/L。浓硫酸优选为70％的浓硫酸，升汞处理时间根据种子状态调整，一般为7-8min。
2)选取休眠状芽的茎段，浸泡12h以上，流水冲洗3h以上，切成带有1-2个芽的茎段长约0.5-1cm，消毒处理：70％乙醇35-45s，0.1％升汞7-10min，(乙醇处理时间最长不超过50s，否则会对外植体造成很大的损伤，升汞处理时间根据外植体状态调整，一般不低于7min，不高于10min)，无菌水冲洗三次以上获得无菌外植体，将无菌外植体转移至培养基中使其生长至5-8cm；
将步骤1)或者步骤2)萌发后的栾树幼苗切割，其中茎段或根系切割为0.5-1cm，诱导愈伤组织。
所述的方法，步骤(2)栾树愈伤组织快速诱导具体包括：
将外植体在愈伤组织快速培养基上进行诱导，栾树愈伤组织快速诱导培养基为配方为1/2MS基础培养基，附加：琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L，6BA，2.0mg/L，IBA，0.2-0.25mg/L，2.4D，0.5-1.0mg/L，NAA，0.5mg/L，PVP，500mg/L，椰汁，10％-15％；优选为琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L，6BA，2.0mg/L，IBA，0.25mg/L，2.4D，1.0mg/L，NAA，0.5mg/L，PVP，500mg/L，椰汁，10％。
进一步的，愈伤组织诱导时选取5-8cm的无菌苗，用灭菌的刀片将其切成0.5-1cm左右的茎段或根段，转移至愈伤组织快速培养基中诱导培养20-30d。
进一步的，愈伤组织继代：将生长良好的愈伤组织，轻轻用镊子分成半径约为0.5cm的块，转移至继代培养基中扩大培养。继代培养基为MS培养基，附加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L,琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L；优选为琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L，6-BA，1.0mg/L，IBA0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L。
所述的方法，步骤(3)农杆菌菌液侵染和共培养包括以下步骤：
1)介导农杆菌菌液制备；
2)侵染和共培养
挑取愈伤组织，转入含农杆菌悬浮液中浸泡侵染，吸干多余菌液，将愈伤组织嵌入固体共培养基上，21-23℃暗培养2-3d。
进一步的，共培养使用的固体培养基配方为：MS培养基，附加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L，As，20-25mg/L,琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L,pH5.6-5.8。优选为6-BA，1.0mg/L，IBA0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，As20mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L，pH5.6。
本发明农杆菌制备：甘油菌室温融化转导后的LBA4404，吸取200μL涂布于LB平板，28℃，200rpm 24-48h，挑取单菌落，加入2mlLB培养液中(含50mg/L Kana、25mg/L Rif)，28℃下200rpm震荡培养过夜至OD6000.6-0.8,将其转入40mlLB液体培养基中(含50mg/L Kana、25mg/L Rif)，28℃下200rpm震荡培养16-24h，至菌液OD600值在0.5-0.8之间；4℃，4000rpm，5min离心弃上清，加入适量悬浮液重悬菌液至OD6000.4-0.6。
侵染时挑取颜色鲜绿的愈伤组织，转入农杆菌悬浮液浸泡20-30min，期间每隔几分钟轻轻晃动一次，转移至滤纸吸干多余水分与菌液。
共培养：将侵染过后的愈伤组织嵌入共培养培养基上21-23℃暗培养2-3d，肉眼可见愈伤组织上有少量农杆菌菌斑。
所述的方法，步骤(4)脱菌和筛选培养包括以下步骤：
1)脱菌：共培养后，挑取状态良好的愈伤组织于无菌水漂洗，用含有Cef的无菌水浸泡，无菌水漂洗，吹干愈伤表面水分；
2)筛选培养：共经过2次筛选获得阳性转化植株，第1次筛选培养：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基中7-10d；第2次筛选培养：将抗性愈伤组织全部转移至筛选培养基中，继代增殖培养形成成熟的愈伤块。
第1次筛选培养：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基S1中7-10d；第2次筛选培养：将抗性愈伤全部转移至筛选培养基S2中，继代增殖培养70-90d形成成熟的愈伤块，每隔20-23d更换一次新的培养基；筛选培养基S1配方为：MS培养基附加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L，Cef，280-320mg/L，Hyg，10mg/L，琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L。最优选为6BA，1.0mg/L，IBA，0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，Cef，300mg/L，Hyg，10mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L；筛选培养基S2配方为：MS培养基附加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L，Cef，180-220mg/L，Hyg，20mg/L，琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L；最优选为，6BA，1.0mg/L，IBA，0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，Cef，200mg/L，Hyg，20mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。
进一步的，步骤(4)脱菌和筛选培养优选包括以下步骤：
1)脱菌：共培养后，挑取状态良好的愈伤组织于无菌水漂洗，用含有450-550mg/LCef，最优选为500mg/L Cef无菌水浸泡，让黏附于愈伤上的菌块充分扩散到水中，无菌水漂洗，完全吹干至愈伤干燥表面无残留水分为止；
2)筛选培养：共经过3次筛选获得阳性转化植株，第1次筛选培养：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基S1中7-10d；第2次筛选培养：将抗性愈伤转移至筛选培养基S2中，培养20-30d形成成熟的愈伤块，；第3次筛选：将抗性愈伤组织转移至筛选培养基S3中，继代增殖培养70-90d形成成熟的愈伤组织块(每21d天更换一次新的培养基)。筛选培养基S1配方为：MS培养基附加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L，Cef，280-320mg/L，Hyg，10mg/L，琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L。最优选为6BA，1.0mg/L，IBA，0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，Cef，300mg/L，Hyg，10mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L；筛选培养基S2配方为：MS培养基附加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L，Cef，180-220mg/L，Hyg，20mg/L，琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L；最优选为琼脂粉，6BA，1.0mg/L，IBA，0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，Cef，200mg/L，Hyg，20mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。筛选培养基S3配方为：MS基础培养基加6-BA,0.5-1.0mg/L，IBA,0.05-0.1mg/L，TDZ,0.5mg/L，Cef130-160mg/L，Hyg 40-60mg/L，琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L；最优选为6-BA 1mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ 0.5mg/L，Cef 150mg/L，Hyg 50mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。
本发明脱菌时挑选共培养后状态良好的愈伤组织无菌水漂洗一次，用含500mg/LCef的无菌水浸泡3次，每次十分钟，期间轻轻摇动数次，让黏附于愈伤组织上的菌块充分扩散到水中，第三次浸泡时，转移至新的无菌50ml的离心管，无菌水漂洗3次，转移至滤纸上，完全吹干至愈伤组织表面无残留水分为止(20min以上)。
筛选培养阳性转化愈伤组织时，第1次筛选：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基S1中(7-10d)。第2次筛选：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基S2中，暗培养20-30d后有新的颗粒状愈伤组织产生。第3次筛选：将抗性愈伤组织全部转移至筛选培养基S3中，继代增殖培养70-90d形成成熟的愈伤组织块(每21d天更换一次新的培养基)。三次筛选下过稍优于二次筛选。
所述的方法，步骤(5)的不定芽分化培养包括：筛选后的愈伤组织进行不定芽分化培养，分化培养基配方为：1/2MS培养基附加6BA，2.0mg/L，IBA，0.25mg/L，2.4D，0.25-0.5mg/L，KT，1.0-2.0mg/L，2，4表油菜内酯，0.2-0.4mg/L，椰汁，10％-15％，PVP，200mg/L，茶多酚，1.5-2.0mg/L，琼脂粉，4-5g/L，结冷胶，1.0-1.5g/L；最优选为6BA，2.0mg/L，IBA，0.25mg/L，2，4D，0.5mg/L，KT，2.0mg/L，2，4表油菜内酯，0.4mg/L，椰汁，10％，PVP，200mg/L，茶多酚，2.0mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。
进一步的，将抗性愈伤组织块去掉褐化部分转移至诱导不定芽分化的培养基中，培养20-40d出现新的芽点。
步骤(6)生根培养基包括：已经分化出不定芽的愈伤组织进行生根的培养，生根培养基配方为：1/2MS培养基附加6BA，2.0mg/L，2，4表油菜素内脂，0.4mg/L，IBA，0.4mg/L，NAA，0.5-1.0mg/L，2，4D，0.5-1.0mg/L，KT，1.0-2.0mg/L，PVP，200mg/L,琼脂粉4-5g/L，结冷胶1.0-1.5g/L；优选为6BA，2.0mg/L，2，4表油菜素内脂，0.4mg/L，IBA，0.4mg/L，NAA，1.0mg/L，2，4D，1.0mg/L，KT，1.0mg/L，PVP，200mg/L，琼脂粉4g/L，结冷胶1.2g/L。
本发明步骤(1)中，栾树种子无菌苗的获得虽然要经历种子萌发周期，但愈伤组织诱导速率优于外植体，且杂菌感染率低。因此栾树遗传转化体系构建，以种子无菌苗诱导愈伤组织为主，外植体诱导愈伤组织为辅助(当较大量获得栾树愈伤组织时为节约材料与周期两者可结合适用)。
所述转导后的LBA4404(感受态菌种购买于上海生工有限公司)带有35S，超富集东南经天HMA3(AJF37113.1)Cd转运蛋白基因，GFP标签蛋白。
有益效果：填补了栾树遗传转化体系空白，与现有其它木本植物遗传转化技术相比，以栾树愈伤组织为受体，GFP为标签基因，通过农杆菌介导转化，经过愈伤组织筛选直接获得阳性转化植株，大幅降低了木本植物遗传转化周期，提高了阳性转化率。利用该技术可使栾树这一环境先锋树种达到遗传改良效果，有望获得土壤重金属污染问题中，吸附重金属能力强、抗性强的优良林木品种从而达到绿色有效治理环境的目的。
本发明的主要创新点和技术效果
(1)首次成功实现栾树遗传转化体系的建立。
(2)本发明的种子萌发无菌苗培养基大幅提升了萌发率，缩短了萌发时间，在3-5天内即可萌发；
(3)本发明的愈伤组织培养基能够更快的诱导栾树无菌苗形成愈伤组织，且形成的愈伤组织状态良好，颜色鲜绿，可以为后续的农杆菌侵染及外源基因的表达提供更好的材料，提高侵染的成功率，减少了材料的浪费，提高了效率。
(4)农杆菌共培养在21-23℃，大幅度增强了脱菌效果，但并不影响转染效率。
(5)本发明的不定芽分化培养基，有效促进了栾树愈伤组织分化，相比传统分化培养基的使用大为缩短了栾树分化周期，结冷胶的加入，可以避免愈伤组织在生长及诱导不定芽分化过程中发生玻璃化，使愈伤组织更坚韧，PVP的添加有效抑制了愈伤组织的褐化现象。
附图说明
图1是实施例1中栾树无菌苗；
图2是实施例2中栾树愈伤组织获得；
图3是实施例4中栾树愈伤组织与农杆菌共培养；
图4是实施例7中栾树阳性转化愈伤组织目的基因检测；
图5是21℃下与28℃下农杆菌转染效率的比较；
图6是实施例7中栾树阳性转化愈伤组织原生质体GFP激光共聚焦亚细胞定位；
图7是实施例8中栾树阳性转化愈伤组织分化幼苗；
图8是实施例9中栾树分化幼苗生根。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施方式，进一步阐明本发明，其具体实施方式仅用于本发明而不用于限制本发明。
以下实例中，所使用到的培养基配方如下，并未特别列出的视为常规培养基。
以下实施例中，使用的MS(Murashige and Skoog)基本培养基的构成和标准配方为：KNO3 1900mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2 440mg/L，H3BO36.2mg/L，ZnSO48.6mg/L，CuSO40.025mg/L，Na2-EDTA 37.3mg/L，肌醇100mg/L，VB6 0.5mg/L，VB1 0.1mg/L，NH4NO3 1650mg/L，MgSO4 370mg/L，KI 0.83mg/L，MnSO4 22.3mg/L，Na2MoO4 0.25mg/L，CoCl2 0.025mg/L，FeSO427.8mg/L，甘氨酸2mg/L，C6H5NO2 0.5mg/L，D(+)-蔗糖30g/L，固体MS基础培养基添加琼脂5g。
LB培养基的配方：5g/L酵母提取物,10g/L胰蛋白胨,5g/L NaCl。
实施例1栾树种子无菌苗的制备
利用5、6、10目筛筛选栾树种子，将大于目筛孔径的种子进行70％浓硫酸浸泡3-4分钟后，50g/L碳酸氢钠溶液反复清洗种子彻底中和浓硫酸，再利用50g/L的碳酸氢钠水溶液浸泡种子10-12min，消毒处理：70％乙醇45s，0.1％升汞2-10min，无菌水冲洗三次以上获得无菌种子，消毒处理后进行促萌发培养，其中栾树种子促萌发固体培养基DKW基本培养基，按照下表1附加：6BA，1.5mg/L、2.0mg/L，NAA，0.2mg/L、0.4mg/L，GA3，0.4mg/L、0.6mg/L，琼脂粉4g/L和结冷胶1.2g/L固定加入。置于25±2℃环境下，16/8h光照周期环境，光照强度为60μmol m-2s-1。
表1
Figure BDA0002863530230000081
通过一系列正交试验后获得最佳栾树种子促萌培养方法为，6目筛筛选栾树种子筛除低萌发率或无法萌发的种子，同时可充分利用种子资源，将大于6目筛孔径的种子进行70％浓硫酸浸泡3分钟后，碳酸氢钠溶液反复清洗种子彻底中和浓硫酸，再利用50g/L的碳酸氢钠水溶液浸泡种子10min，然后进行消毒处理：70％乙醇45s，0.1％升汞8min，无菌水冲洗三次以上获得无菌种子，消毒处理后进行促萌发培养，其中栾树种子促萌发固体培养基为DKW基本培养基，附加：6BA，2.0mg/L，NAA，0.4mg/L，GA3，0.4mg/L、琼脂粉4g/L和结冷胶1.2g/L。相较于目前已有的种子萌发的技术，本发明的培养基改良，大幅提升了种子的萌发率，缩短了栾树种子萌发周期，使其在3-4天内即可萌发，提高了无菌萌发苗的获得率，减少了成本，避免浪费。
实施例2外植体制备与愈伤组织的诱导
(1)选取休眠状芽的茎段，浸泡12h以上，流水冲洗3h以上，切成带有1-2个芽的茎段，消毒处理：70％乙醇45s，0.1％升汞8min，无菌水冲洗三次以上获得无菌外植体，转入YD培养基培养至长出新芽(无菌苗)。将无菌苗转移至继代培养基(同样是YD培养基)中，使其生长至5-8cm。YD培养基为MS基础培养基，附加6-BA 2mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ 0.5mg/L。置于25±2℃环境下，16/8h光照周期环境，光照强度为60μmol m-2s-1。
(2)选取5-8cm的无菌苗或实施例1中的无菌苗，用灭菌的刀片将其切成0.5cm左右的茎段，转移至栾树愈伤组织快速诱导培养基为配方为1/2MS基础培养基，按照表2附加：IBA，0.2mg/L、0.25mg/L，2.4D，0.5mg/L、1.0mg/L，椰汁，10％、15％；而6BA，2.0mg/L，NAA，0.5mg/L，PVP，500mg/L，琼脂粉4g/L和结冷胶1.2g/L固定加入。培养时间20-30d。
表2
Figure BDA0002863530230000091
置于25±2℃环境下培养，愈伤组织诱导、继代时，均为暗培养。
愈伤诱导时，在上述表2的最优配方激素添加，对结冷胶和琼脂粉的比例也进行了探究，见表3。
表3
Figure BDA0002863530230000101
(3)将生长良好的愈伤组织，轻轻用镊子分成半径约为0.5cm的块，转移至继代培养基中扩大培养。长至1cm大小左右即可用于农杆菌侵染。愈伤组织继代培养基为MS基础培养基，附加6-BA，0.5mg/L、1mg/L，IBA，0.05mg/L、0.1mg/L，TDZ，0mg/L、0.5mg/L，固定加琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。
表4
Figure BDA0002863530230000102
通过一系列正交实验后获得外植体最佳消毒时间为70％乙醇45s，0.1％升汞8min。消毒时间根据外植体状态不同用不同的时间，升汞消毒时间过长会导致外植体切口处褐化死亡，无法成功诱导愈伤组织；升汞消毒时间过短会导致外植体消毒不彻底，在后续的培养过程中容易发生污染，从而导致材料的浪费。其中外植体生长培养基为YD培养基，即MS基础培养基，附加6-BA 2mg/L，IBA0.1mg/L，TDZ 0.5mg/L。相较于过去的技术，加入TDZ后，外植体长出新的无菌苗的速度明显增加，而且状态也更好，对后续的愈伤组织诱导有着良好的促进作用。
将无菌苗切成0.5cm左右的茎段是因为，太长的茎段在进行操作时容易与瓶口发生接触，从而造成不必要的污染；太短的茎段在进行操作时，较难完美的接种在培养基上，从而造成不必要的污染，0.5cm左右的茎段，方便操作，也可以较好的诱导愈伤组织。其中愈伤组织诱导培养基为1/2MS基础培养基，附加：琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L，6BA，2.0mg/L，IBA，0.25mg/L，2.4D，1.0mg/L，NAA，0.5mg/L，PVP，500mg/L，椰汁，10％，椰汁中富含自然的KT激动素，可以促进细胞分裂，加速愈伤组织的诱导形成。与过去的技术相比，我们的新研制的栾树愈伤组织诱导培养基，可以更快的诱导栾树无菌苗形成愈伤组织，且形成的愈伤组织状态良好，颜色鲜绿，可以为后续的农杆菌侵染及外源基因的表达提供更好的材料，提高侵染的成功率，减少了材料的浪费，提高了效率。
将愈伤组织分离成数块扩增时，需要用镊子轻轻的分散，切忌产生新的伤痕，愈伤组织相对松散，只需要用镊子轻轻的拨动即可分散。最终长至1cm左右即可进行侵染。愈伤组织太小，会导致侵染失败，愈伤组织直接大批量死亡；愈伤组织太大，会浪费材料。继代培养基为MS基础培养基，附加6-BA 1mg/L，IBA0.1mg/L，TDZ 0.5mg/L，加琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。
实施例3农杆菌菌液制备
(1)将-80℃保存的已转化好带有35S启动子，超富集东南经天HMA3(AJF37113.1)Cd转运蛋白基因，GFP基因(用于转化检测)和抗性基因(用于筛选)的质粒pBI1302的农杆菌LBA4404菌液冰上融化(质粒pBI1302购自上海百格生物公司，通过化学转化法，转化至农杆菌中)，吸取200μL 涂布于LB平板(无抗生素)，28℃，200rpm 24-48h，至长出单菌落。
(2)挑取单菌落，接种到2ml含有适量抗生素的LB液体培养基中(含50mg/L Kana、25mg/L Rif)，28℃下200rpm震荡培养过夜至OD6000.6-0.8。
(3)将菌液接种到40mlLB液体培养基中(含50mg/L Kana、25mg/L Rif)，28℃下200rpm震荡培养14-16h，至菌液OD600值在0.5-0.8之间。
(4)将菌液于4℃，4000rpm，5min离心，弃上清，加入适量悬浮液重悬菌液至OD6000.4-0.6。重悬液为1/2MS基础培养基，附加蔗糖15g，乙酰丁香酮20mg/L，调pH至5.6。
1/2MS液体培养基重悬农杆菌时需要加入AS(乙酰丁香酮)，其可诱导农杆菌Vir基因活化,从而促进外源基因整合在宿主基因组上。
在转化过程中，农杆菌的培养，生长状态及纯度对转化效率具有重要作用。如果农杆菌本身生长不良，则其侵染能力大大下降。因此制备纯度高、生长旺盛、侵染能力强的农杆菌侵染液是转化成功的关键。这种侵染菌液也成为工程菌液，而转化农杆菌的质粒带有35S启动子适合双子叶植物的目的基因表达。
农杆菌的培养可分为固体平板培养和液体振荡培养。固体培养一般需要2-3天，液体培养生长更快，一般需要1-2天。农杆菌在液体培养基后，并不立即开始增殖，一般需要1-2小时才开始分裂。当生长开始后，细菌数目以一恒定的指数速率倍增，直至培养基成分改变和供养缺乏才停止增殖。当细菌增长速率达到对数指数时称之为对数生长状态。处于对数生长状态的农杆菌侵染能力最强。
研究表明，当农杆菌培养至OD600为0.5-0.8时，菌体处于对数生长期，此时侵染能力最强。
实施例4侵染与共培养
(1)挑取颜色鲜绿的愈伤组织，转入农杆菌悬浮液浸泡20-30min，期间每隔几分钟轻轻晃动一次，转移至滤纸吸干多余水分与菌液。
(2)将侵染过后的愈伤组织嵌入共培养培养基上23℃暗培养3d，肉眼可见愈伤组织上有少量农杆菌菌斑。共培养培养基为MS基础培养基，附加6-BA1mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，As 20mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L，调节pH至5.6。置于25±2℃环境下，暗培养。
侵染是指把工程菌接种到受体材料表面，方法就是将制备好的农杆菌菌液加入受体材料培养液中，浸泡一段时间后，进行共培养。在侵染过程中要掌握侵染时间，有助于减少后期培养过程中可能造成的污染，并可减轻细菌对植物的毒害作用。浸染时间太短，不能使足够多的农杆菌附着于外植体伤口处，从而降低遗传转化的频率。浸染时间过长，容易引起外植体的过敏反应，同时在后继培养过程中可能造成农杆菌污染，最终导致转化材料褐化死亡。
接种菌体后的外植体在细胞分裂、生长的同时，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者共同培养的过程为共培养。农杆菌和外植体共培养是整个转化过程中非常重要的环节，以为农杆菌附着，T-DNA的转移和整合都在这个时期内完成。研究表明，农杆菌转化时，并不“侵入”到植物细胞中，而是把T-DNA转移到植物细胞。农杆菌附着后不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后的菌株才能诱发肿瘤，这一段时间称为“细胞调节期”。因此，共培养时间必须长于16h。而共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞则因受到毒害而死亡。本实验中栾树愈伤组织经农杆菌侵染后，其共培养在固体培养基上进行。
侵染时要挑选状态良好的，颜色鲜绿的愈伤组织，颜色发暗的愈伤组织共培养过程中很容易死亡；在转移至共培养培养基之前，要转移至滤纸上吸干多余水分，可以适当吹干，带有多余水分的愈伤组织易引起农杆菌在培养基上弥散生长。
共培养时需要加入乙酰丁香酮As，As可诱导农杆菌Vir基因活化,从而促进外源基因整合在宿主基因组上。经过正交实验得，As浓度20mg/L有最好的效果。
图5是本发明21℃下与28℃下共培养，农杆菌转染效率的比较；低温利于脱菌，但同时又不会影响转化效率。
实施例5脱菌
(1)培养后，挑选状态良好的愈伤组织无菌水漂洗一次，用含500mg/L Cef的无菌水浸泡3次，每次十分钟，期间轻轻摇动数次，让黏附于愈伤组织上的菌块充分扩散到水中，第三次浸泡时，转移至新的无菌50ml的离心管，无菌水漂洗3次，转移至滤纸上，完全吹干至愈伤组织表面无残留水分为止(15-20min)。
愈伤组织培养一段时间后其表面及浅层组织中共生有大量农杆菌，为杀死和抑制农杆菌生长必须进行脱菌培养，从而使愈伤组织更好的生长发育。所谓脱菌培养即把共培养后的植物材料转移至含有抗生素悬浮液中。常用抗生素有羧苄青霉素、头孢霉素及羧噻吩青霉素。这些抗生素不仅对农杆菌有杀伤或抑制作用，而且对植物细胞同样有一定的生物效应。本实施例中使用头孢霉素杀死和抑制农杆菌生长的使用浓度为500mg/L。
实施例6筛选培养
(1)第1次筛选：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基S1中(7-10d)。S1为MS基础培养基,附加6-BA 1mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ 0.5mg/L，Cef300mg/L，Hyg 10mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。置于25±2℃环境下，暗培养。
(2)第2次筛选：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基S2中，暗培养20-30d后有新的颗粒状愈伤组织产生。S2为MS基础培养基,附加6-BA 1mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ0.5mg/L，Cef 200mg/L，Hyg 20mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。置于25±2℃环境下，暗培养。
(3)第3次筛选：将抗性愈伤组织转移至筛选培养基S3中，继代增殖培养70-90d形成成熟的愈伤组织块(每21d天更换一次新的培养基)。S3为MS基础培养基,附加6-BA 1mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ 0.5mg/L，Cef 150mg/L，Hyg50mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。置于25±2℃环境下，暗培养。
选择转化的细胞也是转化过程中一个重要环节。转化的细胞和非转化的细胞在生长发育过程中存在着竞争，如果转化细胞不能生长起来，转化就不能成功，因此选择培养是必不可少的步骤。
选择抗生素加入选择培养基后，对细胞的生长产生一种选择作用，称为选择压。本实施例中选择的标记基因用的是GFP。表达HMA3-GFP的基因的细胞表现出对抗潮霉素的抗性。因此实施例中用潮霉素作为选择压。梯度选择下，可以帮助细胞更好的适应，来更快速的选择出来侵染成功可以表达的愈伤组织，提高了效率。
按照选择压加入的时期不同，可分为三种，即前期选择、延迟选择和后期选择。前期选择是受体材料共培养后，在转入愈伤组织的一开始就加入选择压，即先选择后再生；后选择即先再生后选择。由于未转化的细胞在含选择压的培养基上不能生长，转化细胞生长能力太弱亦难于生长形成转化体；而在无选择压培养基中非转化细胞同样能生长，并对转化细胞有滋养作用，从而有利于转化细胞的生长，因此本实施例选用后期选择。
筛选过程中，选择抗生素的浓度和时间需要慢慢增加，使得转化成功的愈伤组织逐步适应。经过多次正交实验，我们发现Hyg的浓度按照10mg/L(7-10d)，20mg/L(20-30d)，50mg/L持续，培养70-90d形成成熟的愈伤组织块(每21d天更换一次新的培养基)。可以使得转化成功的愈伤组织顺利生长。
筛选过程中，还需要一直保持头孢霉素的浓度，抑制外部的农杆菌生长，并逐渐减少头孢霉素的浓度。
实施例7栾树阳性转化验证
(1)目的基因PCR验证
利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取栾树抗性筛选后的愈伤组织RNA，PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA合成试剂盒(TaKaRa公司)逆转录cDNA作为模板，利用Premier5设计目的基因东南景天HMA3(AJF37113.1)转运蛋白引物，
F：5′ATGGATTCTGGATTGGATGAAGTCA3′，
R：5′GGCATCCATCTGGCCTTTCGTCTTA3′
利用高保真酶进行PCR克隆，验证目的基因已顺利插入栾树基因转录组。
目的基因的顺利插入并不意味着具有生物学功能，而是要在植物基因的转录层面被顺利转录才能行驶后期生物学功能，因此本验证提取成功转染的阳性栾树愈伤组提取RNA逆转录cDNA作为模板，通过PCR验证目的基因被成功转录。与此同时栾树中并不存在东南景天HMA3基因，所以相比较Southern印迹杂交的探针法检测目的基因的插入，更为快捷，东南景天HMA3基因片段大小为2982bp。
(2)栾树原生质体制备及激光共聚焦观测GFP表达
取4g筛选后的愈伤组织，用镊子轻轻捣碎，于30ml酶解前溶液，每次5min，漂洗3次。酶解前溶液：0.4M D-Mannitol、20mM MES。用100目的滤网过滤溶液，将愈伤组织转移至酶解液中。酶解液：20mM MES、0.4M D-Mannitol、20mM KCl、0.40％macerozyme R-10、1.50％Cellulase R-10，加ddH2O至10ml，用KOH调pH至5.7，55℃，10min，冷却至室温后加入随后试剂至终浓度，10mM CaCl2，0.1％BSA。加ddH2O至30ml。锡纸包裹避光，于摇床中26℃，50rpm摇荡，酶解6-10h，去除离心管上层液2ml。用100目滤网过滤，尽量减少滤液流动距离，动作轻柔，用等体积W5溶液(154mM NaCl,125mM CaCl2,5mM KCl，5mM glucose，0.03％MES，KOH调pH至5.8，高温高压灭菌20min，4℃，可保存一个月。可以保持原生质体的渗透压，防止原生质体破裂。)清洗离心管及滤渣至酶解后溶液中，终止反应。去除滤渣，得到滤液后，显微镜观察完整细胞比例。在激光共聚焦下观测细胞中GFP的瞬时表达。
目的基因与GFP为融合表达基因，且HMA3为跨膜转运蛋白，在激光共聚焦下GFP发出绿色荧光，其表达模式与目的基因一致，都在栾树原生质体细胞膜附近。
实施例8愈伤组织进行不定芽分化培养
将筛选完的栾树愈伤组织移入栾树分化培养基，配方为1/2MS培养基，附加：6BA，2.0mg/L，IBA0.25mg/L，2，4-D，0.25mg/L、0.5mg/L，KT，1mg/L、2mg/L，2，4表油菜素内脂0.2mg/L、0.4mg/L，茶多酚1.5mg/L、2.0mg/L，椰汁10％，PVP，200mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。置于25±2℃环境下，16/8h光照周期环境，光照强度为60μmol m-2s-1。
表5
Figure BDA0002863530230000161
栾树分化培养基培养基适用于栾树的愈伤组织分化，其中激动素KT、椰汁、2，4表油菜内酯的添加可以有促进细胞分化，有效促进了栾树愈伤组织分化，相比传统分化培养基的使用大为缩短了栾树分化周期，结冷胶的加入，可以避免愈伤组织在生长及诱导不定芽分化过程中发生玻璃化，使愈伤组织更坚韧，PVP的添加有效抑制了愈伤组织的褐化现象。
实施例9愈伤组织生根分化培养
将已经分化出不定芽的愈伤组织转移入栾树生根培养基，配方为1/2MS培养基，附加：6BA，2.0mg/L，2，4表油菜素内脂，0.4mg/L，IBA，0.2mg/L、0.4mg/L，NAA，0.5mg/L、1.0mg/L，2，4-D，0.5mg/L、1.0mg/L，KT，1.0mg/L、2.0mg/L，PVP，200mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L。置于25±2℃环境下，16/8h光照周期环境，光照强度为60μmol m-2s-1。
见表6。
表6
Figure BDA0002863530230000171
栾树愈伤组织生根培养基，相较于不定芽分化培养基，减少了KT激动素与椰汁的使用，同时增加了IBA和NAA的使用量，使得生长素/细胞分裂素的比例升高，有效促进了生根，多种生长素的联合使用，相较于之前的培养基，可以更快的诱导愈伤组织生根，同时加入PVP，可以有效减少愈伤组织培养过程中发生的褐化现象。
序列表
<110> 中南林业科技大学
<120> 一种栾树遗传转化方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggattctg gattggatga agtca 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcatccatc tggcctttcg tctta 25

Claims (1)

1.一种栾树遗传转化方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
（1）栾树外植体的准备，采用以下任一种方式获得：
1）将过6目筛的栾树种子进行65%-75%浓硫酸浸泡3-4分钟后，50-60g/L的碳酸氢钠溶液反复清洗种子彻底中和浓硫酸，再利用50-60g/L的碳酸氢钠水溶液浸泡种子10-12min，然后对种子进行消毒处理：70%乙醇40-50s，0.1%升汞2-10min，无菌水冲洗三次以上获得无菌种子，消毒处理后进行促萌发培养，其中栾树种子促萌发固体培养基为DKW基本培养基，附加6BA，2.0mg/L，NAA，0.4mg/L ，GA3，0.4mg/L，结冷胶，1.2g/L，琼脂粉，4g/L；
2）选取休眠状芽的茎段，浸泡12h以上，流水冲洗3h以上，切成带有1-2个芽的茎段长0.5-1cm，消毒处理：70%乙醇35-45s，0.1%升汞7-10min，无菌水冲洗三次以上获得无菌外植体，将无菌外植体转移至培养基中使其生长至5-8cm；培养基为MS基础培养基，附加6-BA2mg/L，IBA 0.1mg/L ，TDZ 0.5mg/L；
将步骤1）或者步骤2）萌发后的栾树幼苗切割，其中茎段或根系切割为0.5-1cm，诱导愈伤组织；
（2）栾树愈伤组织快速诱导；
将外植体在愈伤组织快速培养基上进行诱导，栾树愈伤组织快速诱导培养基配方为1/2MS基础培养基，附加：琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L，6BA，2.0mg/L，IBA，0.25mg/L，2.4D，1.0mg/L，NAA，0.5mg/L，PVP，500mg/L，椰汁，10%；
将生长良好的愈伤组织，转移至继代培养基中扩大培养用于农杆菌侵染；继代培养基为MS基础培养基，附加6-BA，1mg/L，IBA，0.1mg/L，TDZ，0.5mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L；
（3）农杆菌菌液侵染和共培养；
1）介导农杆菌菌液制备：
a将-80℃保存的已转化好带有35S启动子，GFP基因和抗性基因的质粒pBI1302的农杆菌LBA4404菌液冰上融化，吸取200μL涂布于无抗生素LB平板，28℃，200rpm 24-48h，至长出单菌落；
b挑取单菌落，接种到2ml含50mg/L Kana、25mg/L Rif的LB液体培养基中，28℃下200rpm震荡培养过夜至OD6000.6-0.8；
c将菌液接种到40ml含50mg/L Kana、25mg/L Rif 的LB液体培养基中，28℃下200rpm震荡培养14-16h，至菌液OD600值在0.5-0.8之间；
d将菌液于4℃，4000rpm，5min离心，弃上清，加入适量悬浮液重悬菌液至OD6000.4-0.6；重悬液为1/2MS基础培养基，附加蔗糖 15g，乙酰丁香酮20mg/L，调pH至5.6；
2）侵染和共培养
挑取愈伤组织，转入含农杆菌悬浮液中浸泡侵染20-30min，吸干多余菌液，将愈伤组织嵌入固体共培养基上，共培养培养基为MS基础培养基，附加6-BA 1mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ0.5mg/L，As 20mg/L，琼脂粉4g/L，结冷胶1.2g/L，pH5.6；21-23℃暗培养 2-3d；
（4）愈伤组织脱菌、筛选培养；
1）脱菌：共培养后，挑取状态良好的愈伤组织于无菌水漂洗，用含有 400-500mg/L Cef的无菌水浸泡，让黏附于愈伤上的菌块充分扩散到水中，无菌水漂洗，完全吹干至愈伤干燥表面无残留水分为止；
2）筛选培养：共经过3次筛选获得阳性转化植株，第 1 次筛选培养：将状态良好的愈伤组织转移至筛选培养基 S1 中 7-10d；第 2次筛选培养： 将抗性愈伤转移至筛选培养基S2 中，培养 20-30d 形成成熟的愈伤块；第3次筛选：将抗性愈伤组织转移至筛选培养基S3中，继代增殖培养70-90d形成成熟的愈伤组织块，每21d天更换一次新的培养基；筛选培养基S1配方为：MS培养基附加6BA， 1.0mg/L，IBA ，0.1mg/L ，TDZ，0.5mg/L，Cef，300mg/L，Hyg，10mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L；筛选培养基S2配方为：MS培养基附加 6BA，1.0mg/L，IBA， 0.1mg/L ，TDZ，0.5mg/L，Cef，200mg/L ，Hyg，20mg/L，琼脂粉，4g/L，结冷胶，1.2g/L；筛选培养基S3配方为：MS基础培养基加 6-BA 1mg/L，IBA 0.1mg/L，TDZ 0.5mg/L，Cef 150mg/L，Hyg 50mg/L，琼脂粉4g/L，结冷胶1.2g/L；
（5）不定芽分化培养：
筛选后的愈伤组织进行不定芽分化培养，分化培养基配方为：1/2MS培养基附加 6BA2.0mg/L，IBA 0.25mg/L，2，4D 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，2，4表油菜内酯 0.4mg/L，椰汁 10%，PVP 200mg/L，茶多酚 2.0mg/L，琼脂粉 4g/L，结冷胶 1.2g/L；
（6）生根培养：
已经分化出不定芽的愈伤组织进行生根的培养，生根培养基配方为：1/2MS培养基附加6BA 2.0mg/L，2，4表油菜素内脂 0.4mg/L，IBA 0.4mg/L，NAA 1.0mg/L，2，4D 1.0mg/L，KT1.0mg/L，PVP 200mg/L，琼脂粉4g/L，结冷胶1.2g/L。
CN202011575268.XA 2020-12-28 2020-12-28 一种栾树遗传转化方法 Active CN112522304B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011575268.XA CN112522304B (zh) 2020-12-28 2020-12-28 一种栾树遗传转化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011575268.XA CN112522304B (zh) 2020-12-28 2020-12-28 一种栾树遗传转化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112522304A CN112522304A (zh) 2021-03-19
CN112522304B true CN112522304B (zh) 2022-06-14

Family

ID=74976791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011575268.XA Active CN112522304B (zh) 2020-12-28 2020-12-28 一种栾树遗传转化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112522304B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410679B (zh) * 2022-03-10 2024-01-09 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 山鸡椒的遗传转化方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USPP17409P2 (en) * 2005-08-18 2007-02-13 Henny Kolster Koelreuteria plant named ‘CORAL SUN’
CN104082136A (zh) * 2014-06-16 2014-10-08 郎溪县双明生态农业有限公司 一种栾树的快速繁殖方法
CN104273038A (zh) * 2014-10-31 2015-01-14 陈建中 一种黄山栾树的组培方法
CN106376458A (zh) * 2016-08-19 2017-02-08 江苏艺轩园林景观工程有限公司 栾树的繁育方法
CN109220809A (zh) * 2018-11-13 2019-01-18 北京林业大学 栾树体细胞胚胎发生及植株再生的培养方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USPP17409P2 (en) * 2005-08-18 2007-02-13 Henny Kolster Koelreuteria plant named ‘CORAL SUN’
CN104082136A (zh) * 2014-06-16 2014-10-08 郎溪县双明生态农业有限公司 一种栾树的快速繁殖方法
CN104273038A (zh) * 2014-10-31 2015-01-14 陈建中 一种黄山栾树的组培方法
CN106376458A (zh) * 2016-08-19 2017-02-08 江苏艺轩园林景观工程有限公司 栾树的繁育方法
CN109220809A (zh) * 2018-11-13 2019-01-18 北京林业大学 栾树体细胞胚胎发生及植株再生的培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨雄.栾树离体高效再生体系的建立.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》.2020,(第04期),第D048-186页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112522304A (zh) 2021-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vergne et al. Somatic embryogenesis and transformation of the diploid Rosa chinensis cv Old Blush
CN105543278B (zh) 一种砀山酥梨遗传转化方法
CN110172473B (zh) 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS
CN104561089A (zh) 一种转基因甜瓜组培苗的培育方法及应用
CA2505499C (en) Methods of plant regeneration and transformation
Olhoft et al. Soybean (Glycine max) transformation using mature cotyledonary node explants
CN112522304B (zh) 一种栾树遗传转化方法
CN113265421B (zh) 一种农杆菌介导的短枝木麻黄愈伤转基因体系的建立方法
CN102191269B (zh) 以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法
WO2015099674A1 (en) Sugarcane regeneration and transformation methods
CN110295191B (zh) 一种二倍体毛白杨的遗传转化方法
CN107794278B (zh) 一种基于潮霉素筛选的毛果杨快速转基因方法
CN114606257B (zh) 石榴农杆菌遗传转化的方法
CN113973658B (zh) 一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法
CN109042297B (zh) 一种玉米自交系sl1303幼胚转化方法
CN113755521A (zh) 一种由农杆菌介导的草莓‘甜查理’遗传转化体系的构建方法
CN113215191A (zh) 农杆菌介导的红椿遗传转化方法
CN113430223A (zh) 一种马铃薯叶片的快速遗传转化方法
JP2004201509A (ja) シバ属植物の再分化植物体及び形質転換植物体
CN111621519A (zh) 一种多肉植物的遗传转化方法和应用
AU729635B2 (en) A method for producing the transformants of coffee plants and transgenic coffee plants
CN1125878C (zh) 一种建立玉米转基因受体体系的方法及受体体系的应用
CN1596617A (zh) 一种建立早熟禾遗传转化体系的方法及应用
CN108004266B (zh) 一种蓝猪耳遗传转化方法
CN1633839A (zh) 一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant