CN108004266B - 一种蓝猪耳遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓝猪耳遗传转化方法，该方法涉及遗传工程技术领域，具有操作简单，能快速有效的获得转基因植株的特点。该方法在传统的农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化中，加入了表面活性剂——Silwet L‑77，降低了叶片表面张力，使农杆菌充分接触叶片伤口，获得了较高的遗传转化效率。由于传统的遗传转化多采用叶盘诱导丛生芽来获得转基因株系，获得的抗性苗阳性率低，本方法利用愈伤诱导丛生芽的方法获得转基因苗，大大增加了阳性率。本方法对传统的遗传转化过程进行了优化，缩短了转化周期，获得了可稳定遗传的转基因植株，这个优良的转化系统为应用基因工程手段研究被子植物双受精的细胞与分子机制奠定基础。

Description

一种蓝猪耳遗传转化方法

技术领域

本发明涉及转基因及组织培养技术领域，特别涉及一种蓝猪耳遗传转化方法。

背景技术

蓝猪耳(Torenia fournieri)又名夏堇，属双子叶植物门，合瓣花亚纲，玄参科蓝猪耳属。被子植物的胚囊大多数都是紧密包裹在胚珠珠心组织里，生殖过程的受精机理及代谢活动需借助经典结构植物学研究技术如半薄、超薄切片及组织透明法等[You R L etal.,1985；Jensen W A et al.,1965；Malamy et al.,1997]，才能做进一步研究。若动态的观察被子植物受精过程中卵细胞的变化状态，蓝猪耳更为适合。蓝猪耳雌配子成熟的过程中，胚囊会从珠孔端伸出珠被组织之外。待卵器完全成熟，在光学显微镜下清晰可见。这种特殊的半裸露胚囊结构，为研究被子植物生殖生物学和发育生物学提供了很好的研究材料，对高等植物双受精机理和早期胚胎发育的研究具有重要的意义。

完整的植物组织培养系统与根癌农杆菌介导的遗传转化系统组成了转基因植物构建的一般系统。蓝猪耳茎段和叶片在不同浓度的生长激素相配合的作用下可以诱导出根、芽和愈伤组织等植物器官：1/2MS、6-BA、NAA相结合可以诱导不定芽的产生，而MS、6-BA、2,4-D配合可诱导愈伤组织，生根培养基为1/2MS[Chlyahet al.,1973；Kamadaet al.,1979；佟晓楠等，2004；宾金华等，2004；李梅兰等；2005]；同时花芽和胚也可以作为蓝猪耳组织培养的外植体诱导出植物组织[Tanimotoet al.,1981；Tanimotoet al.,1985]。Aida在1996年就对蓝猪耳分子育种进行了相关研究，初步建立了农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化系统。Fukusaki成功诱导出白色和浅色花瓣的转基因株系[Fukuaak et al.,2005]。在蓝猪耳遗传转化的过程中，常以叶片作为外植体，且共培养阶段比较重要，其中菌液浸染植物材料的时间以10～20min为宜，共培养7天转化率达27％以上[Chen B C et al.,2005]。李梅兰认为在共培养阶段暗培养4天效果最佳，且与诱导愈伤再生体系相比，诱芽时间较短，转化效率相同[Li M L et al.,2006]；龙海涛等人利用愈伤诱导系统对蓝猪耳进行遗传转化，该方法转化率达13％～14％[Long H T et al.,2008]。浸染过程是转化过程中重要的步骤，浸染效率直接关系到后期材料的转化率。

发明内容

本发明在已有研究的基础上对浸染条件及后续流程进行了优化，首次在蓝猪耳转化的过程中加入了Silwet L-77，使农杆菌的浸染效率得到了显著提高；并且添加了头孢清洗步骤来去除农杆菌污染，固体培养基上降低了头孢浓度，减少了对抗性芽生长的抑制。通过定位于卵细胞的特异性启动子DD45(DD45是一种特异性表达于卵细胞的启动子，在单子叶植物水稻与双子叶植物拟南芥体内均可表达)，构建载体DD45：MT-GFP，对蓝猪耳卵细胞线粒体进行特异性标记，结果表明，本发明的蓝猪耳遗传转化方法转化率高，且可以稳定遗传。

本发明的目的是按以下技术方案实现的：一种蓝猪耳遗传转化方法所述方法包括：

(1)共培养阶段：将蓝猪耳无菌苗叶片剪成边长小于1cm的小片后，放入到OD600＝0.7的菌液中5min；所述菌液中含有0.01vol％Silwet L-77、20μmol/LAS；然后将叶片转移至共培养培养基中23～25℃避光培养4～7天；共培养阶段所用的固体培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D 0.1mg/L；AS 200μmol/L；

(2)愈伤诱导阶段：将步骤1共培养之后的材料转移至愈伤诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养，培养三周；愈伤诱导培养基基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef 300mg/L；

(3)芽诱导阶段：将步骤2获得的抗性愈伤组织转移至芽诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养7天，诱导出抗性芽，芽诱导培养基成分是：1/2MS；6-BA1.0mg/L；IAA0.1mg/L；Cef 300mg/L；

(4)抗性芽筛选阶段：将步骤3培养后的材料转移至筛选抗性芽培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养三周，得到2～3cm高的墨绿色小苗；抗性芽培养基培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；IAA 0.1mg/L；Kan 200mg/L；Cef 300mg/L。

(5)生根阶段培养：将步骤4的墨绿色小苗剪下，扦插至生根培养基，待小苗长至4-6cm即可炼苗，移栽至花盆，生根培养基成分是：1/2MS；IAA0.4mg/L；Kan 50mg/L。

进一步地，所述蓝猪耳无菌苗叶片来源于3-5周苗龄的外植体的叶片。

进一步地，菌液为农杆菌菌液，培养农杆菌的培养基为液体LB培养基。

进一步地，其特征在于，所述农杆菌菌株是GV3101。

本发明具有以下积极效果：

1、蓝猪耳是发育生物学模式植物，其半裸露的胚囊极大的降低了对被子生物生殖生物学的研究难度，而此优良的转基因系统的建立，大大的缩短了蓝猪耳的研究难度，为被子植物双受精的研究奠定了基础。

2、本发明在实验方法中加入了表面活性剂增强了农杆菌的浸染效率，从而蓝猪耳遗传转化率也得到了提高。

3、本发明加入除菌环节，有效的预防了农杆菌过渡生长带来的材料污染。

4、本发明首先利用低浓度的抗生素对叶片进行抗性愈伤组织的诱导，随后利用物抗培养基让抗性愈伤组织充分分化，产生不定芽，随后又利用高浓度的抗生素筛选抗性芽，此过程完整进行使农杆菌介导的遗传转化获得了高阳性率的转基因株系。

附图说明

图1为蓝猪耳遗传转化的过程图。A-B是共培养阶段的材料，C-D是抗性愈伤诱导阶段的材料，E-F是芽诱导阶段的材料，G-H是抗性芽诱导阶段的材料，I是生根阶段的材料，J是阳性苗。

图2是转基因蓝猪耳基因组的PCR扩增检测图。其中C+、C-分别是阳性和阴性对照，P1-P10即为所检测得转基因植株。

图3ABC均为转基因植株的荧光观察图，其中BC采用绿色荧光标记，其中的荧光点即为蓝猪耳卵细胞的线粒体。

具体实施方式

为使本邻域技术人员更好地理解，将一些术语解释如下。

吲哚乙酸，英文名为indole-3-acetic acid，缩写为IAA。

6-苄氨基嘌呤，英文名为6-Benzylaminopurine，缩写为6-BA。

2,4-二氯苯氧乙酸，英文名为2,4-dichlorophenoxy，缩写为2,4-D。

卡那霉素，英文名为Kanamycin，缩写为Kan。

利福平，英文名为Rifampin，缩写为Rif。

庆大霉素，英文名为Gentamicin，缩写为Gen。

头孢噻肟钠，英文名为Cefotaxime Sodium，缩写为Cef。

乙酰丁香酮，英文名为Acetosyringone，缩写为AS。

Silwet L-77，表面活性剂的一种，可降低液体表面张力。

MS培养基，英文名为MS culture medium，缩写名为MS。

下面结合附图、实施例对本发明作进一步描述：

生长素及其他抗生素的配制

本发明用到的生长激素有IAA、6-BA、2，4-D，其中6-BA配制时用少量NaOH(1mol/L)溶解，随后定容至所需体积；2,4-D和IAA需用少量无水乙醇溶剂，随后定容；以上生长激素定容至所需浓度之后均需要过滤除菌；本发明用到的抗生素有Kan、Rif、Gen、Cef；利福平用甲醇溶解，不需要过滤除菌，其他抗生素用水溶解后，需过滤除菌；AS可增强农杆菌毒性，该药品有毒，用二甲基亚砜(DMSO)来溶解，不需要过滤除菌。

无菌苗培养

本发明所用的材料是生长3～5周蓝猪耳无菌苗，此阶段蓝猪耳的叶片呈墨绿色，并且完全舒展，细胞分裂旺盛，是最佳的遗传转化时期；蓝猪耳无菌苗用MS0种植，16h光照8小时黑暗，光照强度800μmol/m2·s，23～25℃培养。

侵染与共培养阶段

本发明是利用农杆菌介导的遗传转化方法，由两部分组成：农杆菌和外植体；农杆菌的菌液在扩摇至OD600＝1.4～1.5之后，用新鲜的液体LB培养基等体积稀释至OD600＝0.7备用；蓝猪耳叶片剪成1cm×1cm的小叶片，随后在备用的菌液里加入Silwet L-77(0.01vol％)和AS(20μmol/L)；充分溶解，将叶片放至菌液中，轻轻摇晃5min，随后滤纸吸干菌液，然后铺至培养基上(图1A-B)；需要暗培养4～7天，叶片周围有半透明的白色菌液出现时需进行下一阶段处理。共培养阶段所用的固体培养基成分是：MS；6-BA 1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；AS 200μmol/L。

除菌与筛选阶段培养

共培养之后，叶片周围会出现淡白色的菌液，此时应立即进行除菌操作：在无菌水中加入200mg/L的头孢噻肟钠，对叶片进行清洗。

共培养之后需对材料进行抗性愈伤的筛选，将第一阶段共培养之后的材料转移至愈伤诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养，培养三周；愈伤诱导培养基基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D 0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef 300mg/L；本发明进行了最佳抗生素(Kan)浓度的筛选，发现200mg/L可以使野生型小苗变黄(图1C-D)；

待抗性愈伤充分分化之后，随后转移至第三阶段培养基，23～25℃、8h黑暗16h光照培养7天，诱导出抗性芽，该阶段培养基成分是：1/2MS；6-BA1.0mg/L；IAA0.1mg/L；Cef300mg/L；该阶段对抗性愈伤诱导，使其分化出不定芽，此阶段时间不宜过长，且培养基无抗生素(图1E-F)；

随后第二次筛选开始，为抗性芽筛选阶段：将培养后的材料转移至筛选抗性芽培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养三周，得到2～3cm高的墨绿色小苗；抗性芽培养基培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；IAA0.1mg/L；Kan 200mg/L；Cef 300mg/L；此时抗生素浓度变为200mg/L，可保证抗性苗阳性率，第四阶段培养之后，愈伤组织会分化出大量的不定芽(图G-H)。

最后,待小芽长至2～3cm高时，即可剪下插至生根培养基(瓶)中生根，一周之后即可长出根来(图I)，培养至4～6cm高时即可炼苗，移栽至花盆中(图J)。

阳性苗鉴定

本发明所转载体特异性定位于卵细胞的线粒体，可使线粒体发绿色荧光，可以通过两种方法鉴定阳性苗：一是PCR检测，利用特异性引物，对抗性苗的基因组进行PCR扩增，设置阳性及阴性对照，通过琼脂糖凝胶电泳获得电泳图(图2)，检测结果发现所转基因已经整合到了蓝猪耳基因组中；二是待抗性苗开花之后，在荧光显微镜下观察卵细胞，若有绿色荧光(灰度处理后为图BC中的亮点)，则该植株是阳性苗，转基因株系构建成功(图3)。

经过统计分析发现依照本方法遗传转化率达50.09％，而未加Silwet L-77的转化率为11.82％，且阳性率高达97％。本方法在蓝猪耳遗传转化过程中，创新性的加入了表面活性剂(Silwet L-77)，使农杆菌侵染效率增强，缩短了侵染时间，建立了更高效率的遗传转化途径，并且通过后续实验发现，该转基因植株可以稳定遗传，现已经获得纯合植株。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本邻域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种蓝猪耳遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）共培养阶段：将蓝猪耳无菌苗叶片剪成边长小于1cm的小片后，放入到OD600=0.7的菌液中5min；所述菌液中含有体积百分比为0.01%Silwet L-77、20μmol/L AS；然后将叶片转移至共培养培养基中23~25℃避光培养4~7天；共培养阶段所用的固体培养基成分是：MS；6-BA 1.0mg/L；2,4-D 0.1mg/L；AS 200μmol/L；共培养之后，在无菌水中加入200mg/L的头孢噻肟钠，对叶片进行清洗；所述菌液为农杆菌菌液，培养农杆菌的培养基为液体LB培养基；

（2）愈伤诱导阶段：将步骤（1）共培养之后的材料转移至愈伤诱导培养基上，23~25℃、8h黑暗16h光照培养，培养三周；愈伤诱导培养基基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；Kan200mg /L；Cef 300mg/L；

（3）芽诱导阶段：将步骤（2）获得的抗性愈伤组织转移至芽诱导培养基上，23~25℃、8h黑暗16h光照培养7天，诱导出抗性芽，芽诱导培养基成分是：1/2MS；6-BA1.0mg/L；IAA0.1mg/L；Cef 300mg/L；

（4）抗性芽筛选阶段：将步骤（3）培养后的材料转移至筛选抗性芽培养基上，23~25℃、8h黑暗16h光照培养三周，得到2~3cm高的墨绿色小苗；抗性芽培养基培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；IAA 0.1mg/L；Kan 200mg/L；Cef 300mg/L；

（5）生根阶段培养：将步骤（4）的墨绿色小苗剪下，扦插至生根培养基，待小苗长至4~6cm即炼苗，移栽至花盆，生根培养基成分是：1/2MS；IAA0.4mg/L；Kan 50mg/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蓝猪耳无菌苗叶片来源于3~5周苗龄的无菌苗的叶片。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌菌株是GV3101。

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