CN110172476B

CN110172476B - 一种马缨杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法

Info

Publication number: CN110172476B
Application number: CN201910376273.9A
Authority: CN
Inventors: 裴翠明; 张露; 周艳丽; 饶华珏; 张雪君; 田伟; 章成君
Original assignee: Yuancheng Environment Co ltd
Current assignee: Yuancheng Environment Co ltd
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110172476A

Abstract

本发明提供一种适用于马缨杜鹃遗传转化和再生体系建立的方法，属于生物技术领域，其遗传转化方法包括：种子预处理后暗培养2‑6d；超声波处理20‑40min；将农杆菌转化，活化；农杆菌侵染20‑60min后共培养；脱菌；萌发培养、筛选培养、生根培养。其再生体系建立的方法包含：无菌苗培养；在添加卵磷脂的培养基中诱导愈伤组织并进行愈伤组织增殖培养；分化培养、壮苗培养、生根培养。本发明一种马缨杜鹃遗传转化的方法高效、稳定、简便、快速，利用分子调控机制建立的马缨杜鹃的再生体系更加高效，精确。

Description

一种马缨杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，进一步，涉及一种适用于马缨杜鹃的遗传转化和再生体系建立的方法。

背景技术

杜鹃花属(Rhododendron L.)，灌木或乔木，有时矮小成垫状，地坐或附生；植株无毛或被各式毛被或被鳞片。叶常绿或落叶、半落叶，互生，全缘，稀有不明显的小齿。花芽被多数形态大小有变异的芽鳞。杜鹃属中不同种类，具有较为广泛的观赏价值、园艺价值和药用价值。中国花卉协会杜鹃花分会统计显示，截至2008年底，我国国内有17个城市以杜鹃花为市花，杜鹃花的年宵花、盆栽杜鹃以及绿化杜鹃已经形成为较大的产业，杜鹃花生产面积已经超过2500公顷。然而，尽管我国野生杜鹃种类繁多，但应用于生产的杜鹃新品种，大多来自于国外，我国的杜鹃花新品种选育工作迫在眉睫。

植物基因工程自20世纪80年代诞生以来，转化技术和转化用的基因功能研究工作均取得了巨大进展。目前广泛应用的植物转基因方法包括基因枪法、农杆菌介导法、电击法等，均已取得成功。然而，这些方法均存在重复性差、转化周期冗长、整合频率低等缺点。为了克服这些难题，科学家们进行了不懈努力，研发了新的技术和方法，包括花粉管通道法、真空渗透法、胚型组织浸染法及农杆菌介导植物萌发种子法等，这些方法均不依赖于植物细胞组织培养的转化系统，具有操作简单、转化周期短等优点，使得转化研究更加便捷。

本发明采用农杆菌介导植物萌发种子法实现马缨杜鹃的遗传转化，在避免组织培养的基础上，加快了种子的萌发、提高了农杆菌的侵染效率、促进农杆菌T-DNA高效转移到植物细胞、促进农杆菌T-DNA整合到植物染色体并高效选择转化细胞，建立了一种高效、稳定、简便、快速的马缨杜鹃转基因途径。此外，本发明公开了一种适用于马缨杜鹃的再生条件，通过分子调控机制提高愈伤组织的诱导率和增殖率，效果更好更精确，建立了马缨杜鹃高效的再生体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、稳定、简便、快速的马缨杜鹃遗传转化的方法。本发明还有一个目的在于提供一种利用分子机制建立的马缨杜鹃的高效再生体系的方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

本发明公开一种适用于马缨杜鹃的遗传转化的方法，包括以下步骤：

种子预处理后黑暗预培养2-6天；

超声波处理；

农杆菌转化，重组体为pCAMBIA3301重组质粒，含有卡那霉素抗性基因nptⅡ、报告基因GusA和外源目的基因Bar；

农杆菌活化培养、侵染与共培养；

脱菌清洗；

萌发培养、筛选培养、生根培养。本发明采用农杆菌介导植物萌动种子的方法对马缨杜鹃进行遗传转化，取材不受时间和环境限制，容易获得，用农杆菌感染的萌动种子直接生根发芽成完整植株的方法，不用进行组织培养，时间花费少，遗传转化稳定，加快了获得转基因马缨杜鹃的进程。杜鹃种子在用农杆菌侵染前，在含有外源激素的培养基上经过一段时间的预培养，可以刺激细胞进行脱分化使细胞分裂，而处于分裂状态的细胞更易于感受和整合外源基因，从而提高转化频率。

作为优选，超声波处理时间为20-40min。超声波处理能改变质膜通透性，促进细胞内外的物质交换。超声波的生物学效应主要是由空化作用引起，当超声波在液体中传播时，将引起媒质分子以其平衡位置为中心的震动，在超声波压缩相内，分子间的距离缩小；而在稀疏相内，分子间距离将增大。如果声强足够大，液体受到的相应的负压也足够大，分子间的平衡距离将增大，以至超过相限距离，从而破坏液体结构的完整性，该作用可能导致空泡周围的细胞壁和质膜的击穿或可逆的质膜透性改变。但是高强度的超声波可导致细胞破碎和酶失活，而当超声波强度适宜时，这种改变是可逆的，细胞自身能修复壁和膜的破损，因而这种可修复的损伤可改变细胞质膜的通透性，促进细胞内外物质的交换，从而促进种子的萌发和农杆菌的侵染，本发明确定了适宜的超声波强度和时间范围，使农杆菌T-DNA高效转移到植物细胞。

作为优选，农杆菌的侵染时间为20-60min。种子伤口处会分泌出酚类化合物，该酚类化合物能够吸引农杆菌转移，适当的延长侵染时间可以使较多的农杆菌附着于种子伤口处；如果时间过长，在后期培养中容易褐化死亡，本发明确定了较佳的侵染时间，有利于T-DNA整合到植物染色体并高效选择转化细胞。

作为优选，农杆菌包括但不限于LBA4404。农杆菌介导的植物遗传转化过程中，菌株的类型起着关键性作用。不同农杆菌菌株对同一植物材料的遗传转化效率有很大差异。在植物的遗传转化过程中，常用的农杆菌菌株主要有LBA4404、EHA105、EHA101和AGL等，由于它们的染色体背景和所含质粒的不同，决定了它们浸染能力的不同，菌株对材料的转化能力一方面体现在农杆菌能否吸附在植物细胞表面、Vir区能否诱导表达、T-DNA能否转至植物细胞中并整合到植物基因组中；另一方面，菌株对植物材料的伤害程度也会影响到转化效率。因此，在实验过程中，选择合适的菌株，可以有效提高转化率。LBA4404为章鱼碱型农杆菌，染色体背景为Achs，该菌由于寄主范围广等特点被广泛用于一些植物，且LBA4404普通菌株的转化率高于EHA105超毒菌株。

作为优选，萌发培养的培养基中添加400-500mg/L头孢霉素。在农杆菌介导遗传转化中，萌动种子与农杆菌共培养后在其表面及浅层组织中仍附着或共生有少量农杆菌。为杀死和抑制农杆菌的继续生长，以便萌动能正常生长发育，有必要进行抑菌培养。相比羧苄青霉素，头孢霉素的抑菌效果较好，其所需的农杆菌有效抑制浓度较低。抗生素在对农杆菌生长起抑制作用的同时，对植物组织也有一定的毒害作用，当培养基中所添加的抗生素浓度较大时，会大大降低种子的萌发率。为减轻或消除这种毒副作用，本发明选用有效添加浓度400-500mg/L头孢霉素来抑制转化共培养后的农杆菌生长。

作为优选，共培养的培养基中添加500-1200mg/L的蚕蛹粉。蚕蛹粉具有丰富的营养，在共培养的Read培养基中加入适量蚕蛹粉可以促进种子萌发，同时可以调控G蛋白的表达，G蛋白是指能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有GTP水解酶活性的一类信号传导蛋白，能够协助农杆菌T-DNA和Vir蛋白进入植物细胞，促进农杆菌T-DNA高效转移到植物细胞，从而提高遗传转化率。

作为优选，共培养的培养基中添加20-30mg/L乙酰丁香酮。农杆菌T-DNA的转移和整合，需Ti质粒中相关Vir基因的表达调控。植物细胞受伤后所分泌的一些化学物质如酚类物质、酸性多糖和中性糖是Vir基因的诱导物，其中乙酰丁香酮被证明是诱导效果最好的酚类化合物，可以促进农杆菌对植物的转化。在外植体侵染转化过程中,添加一定量的乙酰丁香酮或对转化效率有明显的促进作用，但浓度较高时乙酰丁香酮对植物细胞具有一定杀伤力，从而使得转基因植株收获率低。

本发明公开一种马缨杜鹃的再生体系建立的方法，包括：

无菌苗培养；

诱导愈伤组织，在27.6-43.5mg/L的卵磷脂的培养基中进行诱导；

愈伤组织增殖培养，在33.3-51.7mg/L的卵磷脂的培养基中进行增殖培养；

分化培养、壮苗培养、生根培养。愈伤组织的诱导过程就是细胞脱分化的过程，即已分化的细胞，进行离体培养时，已停止分裂的细胞又重新恢复分裂，细胞改变原有的分化状态，失去原有结构和功能，成为具有未分化特性的细胞的过程，愈伤组织的诱导率取决于细胞分裂的能力，蛋白激酶CK2(Protein kinase CK2)，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于真核细胞中，通过磷酸化涉及细胞生长、增殖及凋亡等方面的众多底物，参与细胞调控，CK2是调节细胞生长的关键因子，几乎参与了细胞周期的每一个阶段，CK2通过有序地磷酸化Wee1、P1k1和Cdk1蛋白启动细胞的有丝分裂，蛋白激酶CK2的活性形式是以由两个催化亚基(α和/或α')和两个调节亚基β构成的不均一四聚体结构(α2β2、α'2β2、αα'β2)。催化亚基CK2α主要负责磷酸化特异性底物。细胞分裂与蛋白激酶CK2的基因表达具有高度相关性。细胞分裂素可以诱导分化的细胞脱分化为具有分生能力的薄壁细胞，进而形成植物的愈伤组织，同时一定浓度细胞分裂素也能够促进大量次生代谢产物产生，杜鹃的次生代谢产物大黄素Emodin(IC＝1.90μM)，分子式C₁₅H₁₀O₅，属于蒽醌类化合物，是蛋白激酶CK2抑制剂，主要作用位点集中在催化亚基CK2α，该类化合物的结构与腺嘌呤相似，凭借疏水作用和氢键与细胞内的高浓度ATP竞争结合到蛋白激酶的活性位点，属于ATP竞争性抑制剂。卵磷脂是一种油脂性混合物，包括磷酸、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯以及磷脂，营养丰富，然而一定浓度的卵磷脂能够抑制马缨杜鹃代谢大黄素，从而通过分子调控机制提高愈伤组织的诱导率和增殖率，效果更好更精确。根据本发明可以建立一个高效的马缨杜鹃离体培养再生体系，对于建立高效稳定的马缨杜鹃遗传转化具有重要的基础作用。

作为优选，生根培养的培养基中添加0.2-0.6mg/L NAA。适当的低浓度的生根调节物质可以较好的促进小叶杜鹃的生根，高浓度则开始产生抑制作用。

作为优选，生根培养的培养基中添加2-4g/L活性炭。活性炭为生根提供了黑暗的条件，既吸附了有害物质又提供了黑暗环境添加活性炭利于生根，但是添加量过大时会对生根产生抑制，这是因为活性炭的量过大，吸附了过多了生根调节物质和营养元素，致培养基恶化，最终不利于无菌苗的生根。在生根培养时，添加适量活性炭，无菌苗生根数量多、植株生长健壮、长势整齐。

本发明的有益效果为：

1)本发明公开了一种采用农杆菌介导植物萌发种子法实现马缨杜鹃的遗传转化的方法，在避免组织培养的基础上，加快了种子的萌发、提高了农杆菌的侵染效率、促进农杆菌T-DNA高效转移到植物细胞、促进农杆菌T-DNA整合到植物染色体并高效选择转化细胞，建立了一种高效、稳定、简便、快速的马缨杜鹃转基因途径；

2)本发明公开了一种马缨杜鹃再生体系建立的方法，通过分子调控机制提高愈伤组织的诱导率和增殖率，效果更好更精确，建立了马缨杜鹃高效的再生体系。

附图说明

图1为本发明的不同的处理过程下马缨杜鹃遗传转化效果的示意图；

图2为本发明的不同条件下共培养的种子中G蛋白含量的示意图；

图3为本发明的不同条件下马缨杜鹃愈伤组织诱导率、愈伤组织增殖率和生根率的示意图；

图4为本发明的大黄素含量标准曲线的示意图；

图5为本发明的不同条件下增殖中的愈伤组织大黄素含量的示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种马缨杜鹃遗传转化的方法，包含：

1)种子预培养：以100粒马缨杜鹃种子为试验材料，将灭菌后的杜鹃种子浸泡在含有2.0mg/L赤霉素的MS液体培养基中，于摇床上25℃，120rpm条件下慢速震荡培养24h，然后转移至装有用1/2MS液体培养基浸湿滤纸的平皿中，于25℃条件下进行黑暗预培养6d。

2)超声波处理：将预培养后的种子转移至装有1/2MS液体培养基的三角瓶中，于工作频率为36kHz，功率为100W的超声波下处理30min。

3)冻融法转化农杆菌：所用农杆菌为LBA4404，重组体为pCAMBIA3301重组质粒，含有卡那霉素抗性基因nptⅡ、报告基因GusA和外源目的基因Bar。

4)农杆菌的活化培养：挑取农杆菌单菌落进行活化，取活化的菌液250μL接种到含有50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基上，25℃、120rpm条件下振荡培养，次日取6mL菌液至新的含有50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基上，25℃、120rpm条件下振荡培养6h，当菌液OD₆₀₀＝0.4时，用于侵染转化。

5)农杆菌侵染与共培养：将超声波处理后的种子浸入活化好的菌液中，于摇床中振荡感染35min，使菌液与种子充分接触，将侵染过的种子取出，置于无菌滤纸上吸干种子表面附着的多余菌液，接种到含有25mg/L乙酰丁香酮和800mg/L的蚕蛹粉的1/2MS培养基上，25℃暗培养3d。

6)脱菌清洗：用无菌蒸馏水将共培养后的种子清洗4次，用无菌滤纸上吸干表面的多余液体。

7)种子的萌发：将脱菌后的种子转移到添加有500mg/L头孢霉素的Read培养基中培养。

8)筛选培养：将萌发后的幼苗转移至添加50mg/L卡那霉素的Read培养基中进行筛选。

9)生根培养：将筛选后的培养苗转移至Read培养基中进行生根培养。

10)GUS染色鉴定：将培养出的完整植株进行GUS组织化学染色。

实施例2：

一种马缨杜鹃遗传转化的方法，包含：

1)种子预培养：以100粒马缨杜鹃种子为试验材料，将灭菌后的杜鹃种子浸泡在含有1.0mg/L赤霉素的MS液体培养基中，于摇床上25℃，120rpm条件下慢速震荡培养24h，然后转移至装有用1/2MS液体培养基浸湿滤纸的平皿中，于25℃条件下进行黑暗预培养4d。

2)超声波处理：将预培养后的种子转移至装有1/2MS液体培养基的三角瓶中，于工作频率为36kHz，功率为100W的超声波下处理35min。

5)农杆菌侵染与共培养：将超声波处理后的种子浸入活化好的菌液中，于摇床中振荡感染40min，使菌液与种子充分接触，将侵染过的种子取出，置于无菌滤纸上吸干种子表面附着的多余菌液，接种到含有30mg/L乙酰丁香酮和800mg/L的蚕蛹粉的1/2MS培养基上，25℃暗培养3d。

10)GUS染色鉴定：将培养出的完整植株进行GUS组织化学染色。

实施例3：

一种马缨杜鹃遗传转化的方法，本实施例共培养的培养基中添加农杆菌为EHA105，其余部分和实施例2完全一致。

实施例4：

一种马缨杜鹃遗传转化的方法，本实施例共培养的培养基中添加1200mg/L的蚕蛹粉，其余部分和实施例2完全一致。

实施例5：

一种马缨杜鹃再生体系建立的方法，包含：

1)种子先经过75％乙醇灭菌3min，后再放入0.14％HgCl₂中反复灭菌20min，然后用灭菌蒸馏水反复冲洗种子4次，最后用干燥的灭菌滤纸将水分吸干，种子灭菌后，对种子预处理后置于添加1.0mg/L赤霉素，pH＝5.2的1/2MS液体培养基培养基中25℃暗培养6d，之后再在光强和光照周期分别为2000Lux和每天光照14h的条件下培养40d。

2)将步骤1)培育出的无菌苗的叶片接种到添加1.2mg/L 2，4-D、0.11mg/L NAA和31.5mg/L的卵磷脂，pH＝5.2-5.7的Read培养基中诱导愈伤组织，25℃暗培养。

3)将步骤2)诱导产生的愈伤组织转接至添加0.9mg/L ZT、0.14mg/L NAA和47.8mg/L的卵磷脂，pH＝5.2的Read培养基中，25℃黑暗条件下进行增殖培养。

4)将愈伤组织切成大小相同的小块转接到添加1.8mg/L ZT和0.13mg/L NAA，pH＝5.2的Read培养基中进行分化培养。

5)将分化出的芽转接至添加30g/L蔗糖、0.3mg/L NAA和2g/L活性炭，pH＝5.2的Read培养基中壮苗培养25d。

6)将壮苗培养后的无菌苗转接至添加35g/L蔗糖、0.6mg/L NAA、3g/L活性炭，pH＝5.2的Read培养基中进行生根培养。

步骤4)-步骤6)的培养条件为25℃、光照强度2000Lux、每天光照14h。

实施例6：

一种马缨杜鹃再生体系建立的方法，包含：

2)将步骤1)培育出的无菌苗的叶片接种到添加1.2mg/L 2，4-D、0.14mg/LNAA和43.5mg/L的卵磷脂，pH＝5.2的Read培养基中诱导愈伤组织，25℃暗培养。

3)将步骤2)诱导产生的愈伤组织转接至添加1.0mg/L ZT、1.0mg/L NAA和51.7mg/L的卵磷脂，pH＝5.2的Read培养基中，25℃黑暗条件下进行增殖培养。

6)将壮苗培养后的无菌苗转接至添加35g/L蔗糖、0.4mg/L NAA，4g/L活性炭，pH＝5.2的Read培养基中进行生根培养。

步骤4)-步骤6)的培养条件为24-26℃、光照强度2000-3000Lux、每天光照12-14h。

对比例1：

本对比例中不对种子进行预培养，其余部分和实施例2完全一致。

对比例2：

本对比例中不对种子进行超声波处理，其余部分和实施例2完全一致。

对比例3：

本对比例中农杆菌侵染时间为2h，其余部分和实施例2完全一致。

对比例4：

本对比例中不加入蚕蛹粉，其余部分和实施例2完全一致。结果见图1。

对比例5：

本对比例中愈伤组织的诱导培养基和愈伤组织的增殖培养基中不添加卵磷脂，生根培养基中未添加NAA和活性炭，其余部分和实施例6完全一致。

试验例1：

G蛋白含量的测定

将共培养后的萌动种子制成丙酮粉；

用40％-80％硫酸铵沉淀；

采用Sephadex G-200DEAE-Sepharose Fast Flow Sephacryl S-100RH柱层析后，得到纯化的1000KD G蛋白。

G蛋白含量＝纯化的G蛋白质量/萌动种子质量

结果见图2。

由图1可知，对比例1未对种子进行预培养，种子萌发苗数、筛选出的培养苗和Gus染色阳性植株数与实施例2相比明显较低；对比例2未对种子进行超声波处理，种子萌发苗数相差不大，筛选出的培养苗和Gus染色阳性植株数与实施例2相比明显较低；对比例3农杆菌侵染时间较长，种子萌发苗数较多，但筛选出的培养苗大大减少，与实施例2相比筛选出的培养苗和Gus染色阳性植株数也较低；实施例1、实施例2、实施例3的种子萌发苗数、筛选后的培养苗数、Gus染色阳性植株数均较好，且在实施例1的条件下效果最优。

由图1和图2可知，对比例4与实施例2相比，GTP酶含量明显偏低，筛选后的培养苗数、Gus染色阳性植株数也明显较少；实施例1、实施例2和实施例4的GTP酶含量水平均较高，筛选后的培养苗数、Gus染色阳性植株数也明显较多；这说明添加适量的蚕蛹粉能够促进马缨杜鹃的遗传转化，且在实施例1的条件下效果最好。

试验例2：

试验指标的统计

1)愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织外植体数/接种的外植体数×100％

2)愈伤增殖率＝愈伤组织鲜重/总愈伤组织数鲜重×100％

3)生根率＝生根苗数/培养苗总数×100％

试验例3：

大黄素的提取与测定

取增殖20d的愈伤组织0.1g，加入0.5mol/L盐酸4mL，氯仿3mL，60℃回流1h，倒入离心管，再加入3mL氯仿洗涤，4000r/min离心，取氯仿层置25mL容量瓶中，水浴蒸干，加入1.25mol/L氢氧化钠定容至25mL，黑暗放置0.5h，以1.25mol/L氢氧化钠为空白参照，测定530nm处吸光度。以大黄素为标准品，如图4为大黄素含量的标准曲线。结果见图5。

由图3和图5可知，对比例5的愈伤组织诱导率和愈伤增殖率与实施例6相比明显较小，但大黄素含量与实施例6相比则明显较高，大黄素抑制愈伤组织的诱导和增殖，对比例5的生根率与实施例6相比显著降低，NAA和活性炭对马缨杜鹃的生根有着重要的促进作用；实施例5和实施例6的大黄素含量均较低，且愈伤组织诱导率、愈伤增殖率、生根率均达到较高水平，且在实施例5的条件下效果最优。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种马缨杜鹃遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)种子预处理后黑暗预培养2-6天；

2)超声波处理；

3)农杆菌转化，重组体为pCAMBIA3301重组质粒，含有卡那霉素抗性基因nptⅡ、报告基因GusA和外源目的基因Bar；

4)农杆菌活化培养、侵染与共培养；

5)脱菌清洗；

6)萌发培养、筛选培养、生根培养；

所述共培养的培养基中添加500-1200mg/L的蚕蛹粉；

所述共培养的培养基中添加20-30mg/L乙酰丁香酮；

所述农杆菌为LBA4404。

2.根据权利要求1所述的马缨杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述超声波处理时间为20-40min。

3.根据权利要求2所述的马缨杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述农杆菌的侵染时间为20-60min。

4.根据权利要求1或2所述的马缨杜鹃遗传转化的方法，其特征在于：所述萌发培养的培养基中添加400-500mg/L头孢霉素。