CN112410367B - 一种瘦果遗传转化体系 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种遗传转化体系及其构建方法，涉及采用瘦果构建转化体系。以草莓为例，证实了瘦果作为遗传转化体系可大幅提高转化效率，缩短基因功能验证的周期，是一种有前景的、从根本上不同于以往所有遗传转化体系的独特体系。

Description

一种瘦果遗传转化体系

技术领域

本发明涉及一种遗传转化体系及其构建方法，涉及采用瘦果构建植物遗传转化体系，属于植物基因工程技术领域。本案是申请号为202010054750.2的分案申请。

背景技术

通过基因工程技术改变植物的遗传性状是成熟的技术手段。在植物基因工程中，科研人员多采用叶片、叶柄、叶芽等为侵染对象，建立遗传转化体系。应用于植物上的基因导入法主要有农杆菌介导法，基因枪法和电击法。

众所周知，瘦果是一类非常特殊的种子。与其他种子不同(如颖果、坚果等)，瘦果的形体较小，果皮坚硬且较厚、不开裂、吸水透气性差、与种皮较易分离，内含一粒种子。由于瘦果与常规果实、叶片、根等常用试材的特性完全不同，因而研发人员通常不使用瘦果直接作为农杆菌侵染的对象，也无法借鉴之前对常用试材的常规处理方法或经验，如通过划刻叶片表面、注射或浸润果实等方式来侵染瘦果，难以想象采用何种条件转化瘦果才能获得稳定转化的好效果。

在园艺作物中，草莓的果实是由许多小瘦果聚生在肉质的花托上而形成的聚合瘦果，俗称草莓的“种子”。草莓属于蔷薇科草莓属的双子叶植物，具有优良的风味，抗氧化能力和巨大的商业价值。与栽培草莓相比，二倍体草莓具有更短的代周期，四季结果，更小的植株和更好的抗性，以及一些独特的风味特征，如强烈的香气。由于具有很多优良的品质，二倍体野生草莓成为草莓传统育种和现代分子育种的丰富资源。此外，由于二倍体林地草莓(Fragaria vesca，Hawaii 4)的完整基因组已经测序完成，草莓特别是二倍体草莓已经成为研究果实发育和成熟调控机制的常用材料。草莓也被认为是用于验证具有长生长周期的基因功能一个理想的实验材料。

然而，在草莓中，传统方法常用农杆菌介导的叶盘法；专利CN104388443A使用微注射的方法，将混合的菌液从草莓果实顶部注入；专利CN109517839A对草莓未开的花蕾进行侵染；基于植物细胞的全能性原理，专利CN109735538A采用组培苗的叶片，用刀片划出3-4条伤口，转移至农杆菌菌液中浸泡；专利CN106047921A同时用叶柄和叶片做外植体进行转化。这些方法均存在费时、工作量大或转化效率低等缺点。因此，目前研究人员普遍的共识是：对于现有的遗传转化方法，高频率的植株再生体系和有效的侵染与选择方式是获得遗传转化成功的关键。因此，李小红等(根癌农杆菌介导的草莓遗传转化研究进展，李小红，汤浩茹，生物技术通报，2006年第6期，第23-27页)建议应继续收集更广泛的不同基因型的草莓品种,来构建更有利于遗传转化的再生受体系统。同时，科研人员也更多着眼于优化上述例举的传统实验方案中的各种条件、筛选更易受感染的草莓品种等方面的研究。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种不同于以往技术的、全新的遗传转化体系及其构建方法，尤其是涉及一种采用瘦果构建的遗传转化体系。

据发明人所知，在植物基因工程领域，还没有关于瘦果遗传转化体系的相关报道，尤其是未见采用农杆菌侵染瘦果建立遗传转化体系的技术。

本发明以草莓瘦果为例，阐述本发明的核心思想和主要内容。本发明还详细描述了构建瘦果遗传转化体系的全过程，包括但不限于一些关键步骤以及最佳的实验方案。

可以理解，本发明构建瘦果遗传转化体系的方法不限于草莓瘦果，而是能够普遍适用于在任何具有瘦果的植物中，以瘦果为试材，进行农杆菌侵染的遗传转化方法；或者以瘦果为遗传转化的侵染对象的方法；或者以瘦果为侵染宿主的方法。

本发明的草莓遗传转化体系的构建方法，至少包括如下2个步骤：

获取草莓瘦果。优选的，还可以对获取的草莓瘦果进行消毒处理。

农杆菌侵染。优选的，萌发瘦果与侵染后的农杆菌进行共培养和/或抑菌培养。

优选的，所述瘦果在侵染前经过萌发；所述萌发的适宜度为瘦果萌出白色小尖，或采用萌出白色小尖的瘦果，或刚刚萌发出白色胚根的瘦果。优选的，萌发时间为7天或一周；优选的，萌发过程采用光暗交替培养；更优选的，培养环境为23士1℃。

在本发明的一个示例中，本发明的体系及构建方法采用成熟的草莓瘦果。

优选的，所述草莓为八倍体、四倍体或二倍体草莓等。

更优选的，所述草莓为森林草莓‘Hawaii-4’等；

优选的，农杆菌为根癌农杆菌；更优选的，农杆菌为GV3101、EHA105、或LBA4404等。

本发明的一个示例中，草莓瘦果的获取和消毒采用已知的常规方法。

优选的，瘦果的获取方法为：取成熟的草莓果实，剪取适合的纱布，用纱布将草莓包裹住，边揉搓边流水冲洗，直到无果浆流出，自然阴干，第二天揉搓纱布，果肉与瘦果自然分开，收集瘦果于2ml离心管中备用。优选的，草莓瘦果的消毒方法为：取成熟的草莓瘦果，在超净工作台上将瘦果放于培养皿中，用1％的次氯酸钠浸泡10min，隔2min用1ml的移液枪吸打，或者摇晃均可，之后用无菌水洗3次，无菌滤纸吸干待用。

本发明的一个示例中，草莓瘦果在侵染前经过萌发培养。优选的，萌发过程采用光暗交替培养；更优选的，光暗周期为16h/8h；优选的，光照强度为30000LX(250μmol·m-2·s-1)；更优选的，培养环境为23士1℃。

本发明的一个示例中，瘦果在侵染前经过萌发；所述萌发的适宜度为瘦果萌出白色小尖，或采用萌出白色小尖的瘦果，或萌发培养7-10天的瘦果，或初步萌芽的瘦果，或刚刚萌发出白色胚根的瘦果。

优选的，瘦果在侵染前进行萌发培养的时间为7天或一周。

本发明的一个示例中，农杆菌侵染的条件为：采用摇床(28℃，180rmp)，侵染18h。

本发明的一个示例中，草莓瘦果在与农杆菌共培养过程中采用避光或黑暗培养。优选的，于24℃共培养3-4天。

优选的，共培养中采用瘦果萌发培养基。

本发明的一个示例中，抑菌培养过程中经过采用光暗交替培养；优选的，光暗周期为16h/8h；优选的，光照强度为30000LX(250μmol·m-2·s-1)。

在一个实施例中，瘦果萌发培养基FG，包括的成分有：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L。

在一个实施例中，抑菌培养培养基FT，包括的成分有：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，200mg/L特美汀。

在一个实施例中，农杆菌培养基LB，包括的成分有：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，抗生素浓度：利福平(20μg/ml),庆大霉素(50μg/ml),壮观霉素(100μg/ml。

优选的，所述瘦果萌发培养基FG高压灭菌后冷却至58℃分装培养皿备用。

优选的，筛选培养培养基FT高压灭菌后冷却至58℃加入特美汀分装培养皿备用。

优选的，农杆菌培养基LB高压灭菌后冷却至58℃加入利福平、庆大霉素、壮观霉素备用。

在一个实施例中，侵染液包括的成分有：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L。

在一个实施例中，抑菌培养后，进行阳性转化株的鉴别。优选的，采用荧光显微镜进行鉴别，例如在荧光体式显微镜下观察荧光，把无荧光的苗子去除，将有荧光的苗子记录为转化成功的阳性株，便于后续研究。

本发明所称的体系，是生物技术领域的常用叫法，例如PCR反应体系、遗传转化体系等，也可以称为系统、组合物、配套物、试剂盒、或方案等。

附图说明

图1转基因二倍体草莓‘Hawaii-4’的荧光检测图片。

图2萌发状态对瘦果侵染效率的影响。

图3侵染时间对瘦果侵染效率的影响。

具体实施方式

下面仅以草莓为例，对本发明的核心思路作进一步的详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、基础材料和试剂的使用

1、植物材料：二倍体草莓‘Hawaii-4’。

2、培养基配方及制作方法：

瘦果萌发培养基FG：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，pH5.8，高压灭菌后冷却至58℃分装培养皿备用。

筛选培养培养基FT：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，pH5.8，高压灭菌后冷却至58℃加入特美汀分装培养皿备用。

农杆菌培养基LB：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，高压灭菌后冷却至58℃加入利福平、庆大霉素、壮观霉素备用。

MS培养基粉剂：MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。

特美汀：Timentin(特美汀)是一种新型的有效抑制农杆菌的特效抗生素。抑制农杆菌的同时，对于植物材料的影响很小。特别适合比较难转化的材料的转基因过程，尤其是在农杆菌OD值高，很难被其它抗生素抑制时，效果很好。特美汀在组培实验中常用与抑制农杆菌生长，特别在胚性愈伤组织再生系统中，能达到很好的抑菌和再生效果。将特美汀配成10mg/ml供配制培养基使用。

利福平：利福平(Rifampicin)是一种所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用，对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有作用。将利福平配成25mg/ml供配制培养基使用。

庆大霉素：庆大霉素是为数不多的热稳定性的抗生素，因而广泛应用于培养基配置。庆大霉素系从放线菌科单孢子属发酵培养液中提得，系碱性化合物，是常用的氨基糖苷类抗生素。庆大霉素能与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。将庆大霉素配成50mg/ml供配制培养基使用。

壮观霉素：奇霉素(spectinomycin)，属于氨基糖苷的抗菌素。与链霉素不同，它不会发生mRNA的误读，但能与细菌的30S核蛋白体结合而阻碍蛋白质的生物合成。在壮观霉素的抗药性菌株，其30S核蛋白体中被称为“S5”的蛋白质可看到有变异。将壮观霉素配成100mg/ml供配制培养基使用。

3、菌株和植物表达载体

本发明中使用的菌株为农杆菌GV3101，植物表达载体使用GatewayTM技术的pK7GWIWG2(II)RR植物表达载体。

Gateway技术是基于已研究清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统(attB x attP→attL x attR)。BP和LR两个反应就构成了Gateway^TM技术。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。

实施例2、农杆菌侵染植物瘦果的稳定转化方法

1、瘦果的获取：取成熟的二倍体草莓‘Hawaii-4’草莓果实，剪取适合的纱布，用纱布将草莓包裹住，边揉搓边流水冲洗，直到无果浆流出，自然阴干，第二天揉搓纱布，果肉与瘦果自然分开，收集瘦果于2ml离心管中备用。

2、草莓瘦果消毒：取成熟草莓瘦果，在超净工作台上将瘦果放于培养皿中，用1％的次氯酸钠浸泡10min，隔2min用1ml的移液枪吸打，或者摇晃均可，之后用无菌水洗3次，无菌滤纸吸干待用。

3、草莓瘦果萌发：将100粒消毒后的草莓瘦果均匀分散在瘦果萌发培养基FG上。放于植物培养箱中培养，培养环境为23士1℃，光暗周期为16h/8h，光照强度30000LX(250μmol·m-2·s-1)。其中，瘦果萌发培养基FG配方为：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L。

4、农杆菌的培养：将包含pK7GWIWG2(II)RR载体的农杆菌GV3101于农杆菌培养基LB过夜培养5ml,6000rmp离心5min,菌体用25ml侵染液悬浮。其中，农杆菌培养基LB的配方为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；其中抗生素浓度为：利福平(20μg/ml),庆大霉素(50μg/ml),壮观霉素(100μg/ml。

5、侵染与共培养：取100粒萌发的草莓瘦果上述侵染液中，置于摇床(28℃，180rmp)侵染24h，之后将其放于瘦果萌发培养基FG中，黑暗条件下，24℃共培养3-4天。其中，侵染液配方为：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L。

6、筛选培养：将共培养后的瘦果转移筛选培养培养基FT上，放于植物培养箱中培养，培养温度为23士1℃，光暗周期为16h/8h，光照强度为30000LX(250μmol·m-2·s-1)。其中，筛选培养培养基FT的配方为：MS培养基粉剂4.4g/L，蔗糖20g/L，琼脂8g/L，200mg/L特美汀。

一般，研究人员根据普通种子萌发的经验，通常会认为光照对于瘦果的萌发是非常重要的。然而，我们试验发现，瘦果在光培养、暗培养、或暗培养2天后再进行光培养的3种处理下，瘦果的萌发率差异并不大。因此，本实施例采用了之前其他试验中的成熟的萌发条件，仅作为一种具体培养瘦果条件的示例。

以上述培养条件培养一周后，将瘦果长成的小苗子置于荧光体式显微镜下观察荧光，把无荧光的苗子去除，将发出荧光的苗子定性为转基因阳性植株。

经过统计，转基因阳性植株的比例为40％左右，而且转基因植株的营养器官和生殖器官均有荧光(图1)。

这种结果是超出预期的。因为农杆菌侵染植物是一个复杂的过程，农杆菌(例如根癌农杆菌)具有趋化性，因此，植物的受伤组织产生的一些糖类和酚类物质会吸引农杆菌向受伤组织集中，导致农杆菌对植物组织进行侵染。瘦果由于具有不同于叶片、根、茎等的生物学特性，在不经外力破坏瘦果坚硬、厚实的表面(如划刻)或不添加任何促进剂的前提下，很可能出现农杆菌根本无法侵入瘦果细胞内部的情况，而这将导致极低的阳性植株比例，甚至是零转化。然而，本实施例表明，不受伤的正常瘦果不仅能成功地被农杆菌侵染，而且侵染之后产生转基因阳性植株的比例也较高。

另外，研究人员最初对成功侵染的瘦果发育形成的转基因植株情况的预期也不乐观，认为转基因阳性植株中可能会出现较大比例的“不理想转基因植株”，即要么只有营养器官有荧光，要么只有生殖器官有荧光。然而，实验证明，转基因阳性植株的营养器官和生殖器官均有荧光，表明本发明以瘦果作农杆菌侵染的宿主构建而成的全新的植物遗传转化方法和体系是可靠的、稳定的。

实施例3、构建植物瘦果转化体系中的瘦果最佳萌发状态

为了探索植物瘦果遗传转化体系中的瘦果的最佳萌发状态，本实施例将瘦果的萌发状态分为3种：1代表瘦果未萌发出白色的小尖；2代表萌发出白色的小尖；3代表瘦果已经露出两个子叶。

本实验通过体式荧光显微镜观察GFP荧光和使用GUS染色液(Solarbio)观察GUS表达情况两种方法确定最适侵染条件。

侵染效率＝有GFP荧光的植株/总的植株或者GUS表达植株/总的植株。

在侵染过程中每个培养皿放置20个瘦果，3次重复。用方差分析法统计计算各变量对转化效率的影响，确定各因素对转化效率的显著性(P<0.05)。

可以看出，未萌发出白色小尖的瘦果侵染效率很低，已露出两片子叶的瘦果侵染效率较好，而萌发出白色的小尖的瘦果(或刚刚萌发出白色胚根的瘦果)，侵染效率最高(图2)。

这种结果是出乎意料的。按照科研人员之前对植物遗传转化的经验来看，已露出两片子叶的瘦果应该会比萌发初期的瘦果被侵染的效率更高。因为在已露出两片子叶的瘦果中，细胞的分化程度比萌发初期的瘦果中的高，可能更容易受到外部条件的影响，当与农杆菌接触时，已露出两片子叶的瘦果可能更多地被侵染，但实际结果相反。

本实施例的结果表明，瘦果可以在未萌发前即作为侵染宿主成功地被农杆菌侵染，但要想实现高效地侵染，需要在侵染前将瘦果先进行萌发培养，且培养时间不宜过长，大约7天，采用刚刚萌发出白色胚根的瘦果最为适宜。

因此，从实施例2和实施例3的结果可以看出，直接采用瘦果作为农杆菌的侵染对象时，研究人员无法依据已有的认识，例如传统遗传转化体系的构建方法和植物分类学的普通知识去预判“瘦果-农杆菌”构建的遗传转化体系的实验结果，例如能否成功侵染、稳定转化，或者哪种条件下侵染效率高等。瘦果作为一种全新的植物遗传转化的试材，不需要外力产生受伤组织，也不需要特殊的培养条件即可获得比较理想的侵染效率和阳性转化率，且省时省力，为植物遗传转化体系的优化提供了完全不同于以往的思路和方法。

实施例4、构建植物瘦果转化体系中的最佳侵染时间

将草莓瘦果放于侵染液中，侵染6h，12h，18h，24h，30h之后将其放于瘦果萌发培养基FG中，黑暗条件下，24℃共培养3-4d，之后将其转移至抑菌培养培养基FT上，放于植物培养箱中培养，培养温度为23士1℃，光暗周期为16h/8h，光照强度30000LX(250μmol·m-2·s-1)。

根据实施例3的侵染效率的确定方法，进行最佳侵染时间的筛选。

可以看出，侵染时间为18小时或24小时的时候，侵染效率高，尤其是侵染24小时的效率最高(图3)。也就是说，并不是侵染时间越长，侵染效果越好。

有趣的是，这个结果竟然与我们之前对叶片进行侵染试验得出的最佳侵染时间相同。而通常，叶片与瘦果在组织形态和细胞组成上差别迥异，我们发现，在多种基因工程试验条件的摸索中，大部分情况下，无法借鉴叶片与瘦果彼此的试验条件。因此，这种巧合也让我们决定在下一步的研究中，深入探寻农杆菌侵染植物过程中也许存在着的某些不为人知的关键因素。

实施例5、植物瘦果转化体系的稳定性-确定消除逃逸的抗生素浓度

以卡那霉素抗性的转基因植株(二倍体草莓Hawaii-4)对植物瘦果转化体系的稳定性进行测试。在此之前，本实施例通过在培养基上添加不同浓度的卡那霉素来培养未转化的瘦果的实验来研究草莓瘦果对卡那霉素的敏感性,确定最适卡那霉素浓度。

将没有转化的瘦果放于卡那霉素的浓度(即选择压力)为0，25，50，75，100mg/L的MS-selection培养基培养15天后，结果如下：

1、抗生素浓度为0mg/L时，95％瘦果萌发，植株长势正常，叶片颜色呈深绿色；

2、在抗生素浓度为25mg/L时，91.7％瘦果萌发，植株叶片颜色为浅绿色，除根系生长稍有迟缓外，继续表现为野生型生长；

3、当抗生素浓度增加到50mg/L时，41.7％的植株正常萌发，但萌发的幼苗第一片真叶不能够完全展开；

4、当抗生素浓度增加到75mg/L时，20％的植株仅仅能萌发，但是两片子叶的颜色呈现黄白相间的现象；

5、当抗生素浓度增加到100mg/L时，5％的植株能萌发，但大量植株出现褐化死亡。

据此可以得出：使用浓度为75mg/L卡那霉素作为筛选的抗生素便可消除逃逸。

实施例6、植物瘦果转化体系的稳定性-严格抗生素条件检验

在实施例5的基础上，以卡那霉素抗性的转基因植株(二倍体草莓Hawaii-4)对植物瘦果转化体系的稳定性进行测试。

试验采用含75mg/L卡那霉素的营养液浸湿石英砂，在石英砂上铺上未转化植株的瘦果和转基因植株(具卡那霉素抗性)的T0代瘦果并在10天后进行观察和检测。

结果发现，未转化植株的瘦果在卡那霉素存在下不能萌发，或者萌发2天后子叶开始变黄，不会生长真叶，根系生长完全受阻。

然而，T0代的转基因植株(抗性苗)可以在有卡那霉素的石英砂上发芽并继续正常生长。

之后，我们对这些转基因植株的T1代进行了检测，结果发现它们的电泳图中均含有卡那霉素抗性条带，表明这种抗性已经遗传到了T1子代。

这种检测可以采用本领域常用的PCR等方法，例如从温室栽培的转基因草莓植株的T1代摘取叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，以野生型植株叶片为对照。利用PCR技术扩增kana基因片段，PCR产物条带大小为400bp。

可见，在严格的抗生素筛选条件下，通过瘦果转化法不但可以成功地获得转基因植株，而且将能将其遗传特性稳定地传递给T1子代。因此，以瘦果作为农杆菌的侵染宿主来构建遗传转化体系是一种很有应用前景的遗传转化方法。

综上所述，本发明为了阐述植物瘦果遗传转化体系的构建，已经具体示例了一种以二倍体草莓‘Hawaii-4’的瘦果为侵染宿主的稳定的基因转化方法，其中包括示例了草莓瘦果的获取、草莓瘦果消毒、草莓瘦果萌发、农杆菌的培养、侵染与共培养和抑菌培养步骤，并证明了以瘦果构建的遗传转化体系可高效、稳定地进行侵染转化，缩短了基因功能验证的周期，是一种非常有前景的、全新的植物遗传转化体系，能解决目前的转化方法存在费时、工作量大和转化效率低等缺点。

同时，本发明还对影响侵染效率的各项因素进行了研究和试验，最终确定出了瘦果的最佳侵染或转化的条件。

由上可见，本发明的瘦果遗传转化体系及其构建方法与现有的植物遗传转化方法存在本质上的不同，其不是沿着现有的常规的思路进行改进或优化，而是不效仿任何已有成果，由研究人员大胆另辟蹊径、独立探索完成的开拓性研究。因此，从事生物技术研究的人员能够理解，本发明的对植物瘦果进行遗传转化的方法或体系是一般性的、对具有瘦果的植物普遍适用的方法和体系，其不专用于某种具有瘦果的植物，也不限用于某种特定的农杆菌、亦不依赖于某种待转化的外源基因或载体等因素。

因此，以上对本申请具体实施方式的描述详细地公开了本发明的技术细节，并举例说明了本发明的技术思路，旨在满足专利法的授权规定，但不应反而被认为是对本申请保护范围的限制。该领域的科研人员可以根据本申请，结合彼时的基因工程知识与技术作出各种改变或变形，只要未脱离本申请的核心思路与精神，均应属于本申请所附的权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）收集植物的瘦果；（2）用农杆菌侵染瘦果；其中，所述植物为草莓；所述瘦果在侵染前经过萌发；所述侵染的时间大于12小时但不超过30小时；所述萌发为刚萌发出白色胚根。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述侵染的时间为18小时或24小时。

3.植物瘦果作为遗传转化体系中的侵染对象的用途，其特征在于，先将瘦果进行萌发，再用农杆菌侵染萌发后的瘦果；其中，所述植物为草莓；所述侵染的时间大于12小时但不超过30小时；所述萌发为刚萌发出白色胚根。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述侵染的时间为18小时或24小时。

Images