FR2815971A1 - Promoteur de plante dirigeant fortement l'expression des genes dans les fruits - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un promoteur qui dirige fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par la séquence SEQ ID No. 1 de la liste de séquences en annexe, un fragment ou un dérivé de celle-ci constituant un promoteur modulé par une hormone et/ ou l'anaérobiose.
Description
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PROMOTEUR DE PLANTE DIRIGEANT FORTEMENT L'EXPRESSION DES GENES DANS LES FRUITS.
La présente invention concerne une séquence d'ADN possédant une activité de promoteur transcriptionnel dirigeant fortement l'expression du ou des gènes placés sous son contrôle dans les fruits d'une plante au cours du développement de ces fruits et plus particulièrement dans les phases de maturation. L'invention concerne également une molécule d'acide nucléique recombinant comme un vecteur comprenant ledit promoteur, ainsi que des cellules de plantes transgéniques et des plantes transgéniques ayant incorporé de manière stable dans leur génome ce promoteur.
Les progrès réalisés en matière d'ingénierie génétique ont conduit à créer des outils pour introduire des gènes exogènes dans le génome de plantes. Grâce à ce procédé de transformation génétique, il est actuellement possible de produire des plantes avec des caractéristiques agronomiques déterminées. Les fruits et légumes présentant un secteur d'une grande importance économique et sociale, l'optimisation de leur résistance aux pathogènes, de leur développement et de leurs qualités organoleptiques est une des préoccupations actuelles. Cette optimisation peut s'effectuer par le biais de la transgenèse en modulant l'expression de gènes cibles dans le fruit. Il est important de cibler, ou tout au plus de concentrer la régulation de ces gènes dans le fruit car une dérégulation dans la plante entière peut avoir des répercutions néfastes tant au niveau de la physiologie qu'au niveau de la productivité du plant.
La régulation de l'expression des gènes est notamment modulée par des régions régulatrices inhérentes aux gènes, les promoteurs. Des promoteurs dirigeant l'expression de gènes spécifiquement dans le fruit et à un moment précis de leur développement ont été isolés, chez la tomate, le fruit le plus communément étudié. Ainsi, le promoteur 2All dirige l'expression de gènes lors des premiers stades de développement du fruit avec une efficacité réduite (Van Haaren et Houck, 1991, Plant Mol.
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Biol., vol. 17, pages 615-30 ; Van Haaren et Houck, 1993, Plant Mol. Biol., vol. 21, pages 625-40 ; Brevet US No. 4 943 674). Les promoteurs TFM7 et TFM9 dirigent fortement l'expression des gènes au cours des premiers stades de développement du fruit (Brevet US No. 5 608 150). Les promoteurs E4 (Cordes et al., 1989, Plant Cell, vol. 1, pages 1025-34), E8 (Deikman et Fisher, 1988, EMBO J., vol.
7, pages 3315-20) et le promoteur de la polygalacturonase (Atkinson et al., 1998, Plant Mol. Biol., vol. 38, pages 449-60) dirigent l'expression au cours du développement tardif du fruit et de manière spécifique. Le faible nombre de brevets actuellement recensés montre la nécessité d'obtenir une palette plus large de promoteurs.
Il apparaît donc utile de disposer d'autres promoteurs avec des caractéristiques différentes et notamment des promoteurs dirigeant fortement l'expression des gènes dans les fruits au cours de leur développement et plus particulièrement dans la phase de maturation.
Ce but est atteint grâce aux travaux de la
Demanderesse sur le génome de fraises sauvages (Fragaria vesca cv Reine des vallées) qui lui ont permis d'identifier, d'isoler et de caractériser un nouveau promoteur aussi désigné ci-après FP2. Dans cette fraise sauvage, le promoteur FP2 contrôle l'expression du gène de la Cystathionine Gamma Synthase (CGS) impliquée dans la biosynthèse de la méthionine (Marty et al., 2000, Theor.
Demanderesse sur le génome de fraises sauvages (Fragaria vesca cv Reine des vallées) qui lui ont permis d'identifier, d'isoler et de caractériser un nouveau promoteur aussi désigné ci-après FP2. Dans cette fraise sauvage, le promoteur FP2 contrôle l'expression du gène de la Cystathionine Gamma Synthase (CGS) impliquée dans la biosynthèse de la méthionine (Marty et al., 2000, Theor.
Appl. Genet., vol. 100, pages 1129-36).
Le promoteur FP2 de l'invention est remarquable en ce qu'il dirige fortement l'expression des gènes dans les fruits, alors que cette expression est faible ou inexistante dans les autres organes. En effet, dans les mêmes conditions de détection, l'expression est extrêmement faible dans les feuilles et les fleurs, et non détectable dans d'autres organes comme les racines, les tiges et les graines. De plus, le promoteur de l'invention présente des propriétés remarquables d'adaptabilité à d'autres espèces fruitières, comme la tomate ou le raisin.
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L'invention a donc pour objet un promoteur qui dirige fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par la séquence SEQ ID No. l dans la liste de séquences en annexe, un fragment ou un dérivé de celle-ci constituant un promoteur modulé par une hormone et/ou l'anaérobiose.
Le promoteur de l'invention présente des propriétés remarquables d'inductibilité au cours du développement du fruit et cette inductibilité est, plus particulièrement, croissante dans les phases de maturation.
Tout particulièrement, l'invention se rapporte à la molécule d'acide nucléique comprise entre les nucléotides aux positions 7 et 948 de la séquence SEQ ID No. l de la liste de séquences en annexe.
Un promoteur selon l'invention peut être constitué ou comprendre un fragment de la séquence SEQ ID No. l dès lors que ce fragment est modulé par une hormone et/ou l'anaérobiose et présente des propriétés d'inductibilité au cours du développement du fruit et plus particulièrement dans la phase de maturation. Un tel promoteur comprend donc au moins un site de réponse à une hormone et/ou au moins un site de réponse à l'anaérobiose.
Un promoteur selon l'invention comprend avantageusement un site de réponse à l'une des hormones choisies parmi l'auxine et l'acide abscissique.
Parmi les séquences correspondant à des sites de réponse à l'anaérobiose, nous pouvons par exemple citer les séquences suivantes : AAACCA, TGGTTT et GGTTT. Un site de réponse à l'auxine peut, par exemple, répondre à une séquence choisie parmi les séquences suivantes : TGACX avec X égal à A ou à G, TGTCTG et AATATGTCAAAT. De la même façon, un site de réponse à l'acide abscissique peut, par exemple, répondre à une séquence choisie parmi les séquences suivantes : TXACACCYY avec X égal à G et Y égal à A ou avec X et Y égaux à T, CCATGCATGC et ACTCGTGTCT. Toute séquence correspondant à un site de réponse à l'anaérobiose ou à un
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site de réponse à une hormone telle que l'auxine ou l'acide abscissique connue de l'homme du métier entre dans le cadre de la présente invention. De plus, les travaux des inventeurs ont permis de montrer que l'auxine agit comme un répresseur au niveau du promoteur FP2 et que l'anaérobiose agit comme un répresseur fort au niveau du promoteur FP2.
On entend par dérivé d'une séquence de promoteur selon l'invention, la séquence SEQ ID No. l ou un fragment de celle-ci, modifiées par délétion, substitution ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides, et conservant une activité de promoteur dirigeant fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase de maturation. Il s'agit par exemple de séquences ayant au moins 60% et, de préférence, au moins 80% d'homologie avec la séquence No. l de la liste de séquence en annexe. De tels dérivés sont plus particulièrement les séquences des promoteurs d'autres rosacées homologues à celui du génome de fraise sauvage (Fragaria vesca cv Reine des vallées) isolé dans le cadre de la présente invention.
L'homme du métier est à même de déterminer, à partir des tests du type de ceux rapportés dans la partie expérimentale ci-après, si lesdits dérivés présentent une activité de promoteur orientant fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase de maturation conformément à la présente invention.
Il a été rapporté par les inventeurs dans l'art antérieur (Marty et al., 2000, Theor. Appl. Genet., vol.
100, pages 1129-36) la séquence du gène de la CGS impliquée dans la biosynthèse de la méthionine et en 5'de ce gène un fragment du promoteur FP2 contrôlant ce gène dans la fraise sauvage (Fragaria vesca cv Reine des vallées). Il s'agit du fragment situé entre les nucléotides aux positions 615 à 948 dans la séquence SEQ ID No. l. Or, cet article ne décrit, ni ne suggère les propriétés de ce promoteur ou d'un fragment de celui-ci telles que définies précédemment.
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Le promoteur selon l'invention ouvre des perspectives intéressantes dans le domaine industriel (pour la création de nouvelles variétés) mais aussi dans le domaine de la recherche fondamentale (étude de fonctions in vivo).
Ainsi, au niveau industriel, les gènes connus pour influencer la résistance aux pathogènes comme les gènes codant pour des protéines de défense ou connus pour influencer le développement et les qualités organoleptiques des fruits comme les gènes codant pour des enzymes impliquées dans la perte de fermeté, l'évolution de la couleur, le dégagement d'arômes, l'acquisition de la saveur peuvent être intégrés dans des fraisiers en aval du promoteur selon l'invention afin d'exacerber, pour les gènes en position sens, ou de réduire, pour les gènes en position anti-sens, les effets associés à ces gènes.
Au niveau de la recherche, la création de fraisiers transgéniques portant la construction de ce promoteur associé à un gène, soit supposé d'intérêt agronomique, soit de fonction mal définie, va permettre de comprendre le rôle dudit gène dans les processus de développement ou de maturation des fruits. C'est le seul outil actuel qui permette de comprendre le rôle de protéines in vivo.
En conclusion, ce type de promoteur permet de cibler l'expression d'un gène de manière spatio-temporelle dans le fruit et de manière croissante au cours des processus de maturation. Il diffère des promoteurs actuellement utilisés comme (i) le promoteur 35S CAMV qui dirige l'expression des gènes de manière constitutive dans la plante ou (ii) certains promoteurs de tomate (précités) qui dirigent l'expression des gènes dans les stades précoces ou tardifs du développement du fruit et parfois avec un rendement faible.
L'invention concerne donc aussi une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant une séquence de promoteur comme défini précédemment liée de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé
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sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placée en aval de ladite séquence d'ADN. La séquence de terminateur peut avantageusement être la région terminale NOS. Tous les gènes de sélection bien connus de l'homme du métier et notamment le gène nptII peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Le ou lesdits gène (s), autre (s) que le gène de sélection, sont avantageusement des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine d'intérêt agronomique.
Comme indiqué précédemment, il s'agit, par exemple, de protéines capables d'influencer les qualités organoleptiques des fruits, de préférence celles des fraisiers.
Une molécule d'acide nucléique recombinant selon l'invention peut être une cassette ou un vecteur pour l'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt dans une cellule végétale. Un vecteur utile pour la transformation d'un hôte de type plante comprend : - un ou plusieurs gènes qui code (nt) une ou plusieurs protéines d'intérêt, placé (s) sous le contrôle du promoteur de l'invention, - un gène pour une sélection génétique dans des cellules de plante, placé sous le contrôle du même promoteur ou d'un promoteur différent de celui ci-dessus.
L'invention concerne donc également des cellules végétales dans le génome desquelles est incorporée de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle du promoteur.
L'invention concerne encore une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi fortement exprimé dans les fruits de la plante au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase
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de maturation. Des plantes transgéniques selon l'invention peuvent être préparées de façon classique en transformant une cellule végétale avec ladite molécule d'acide nucléique puis en régénérant une plante à partir de la cellule transformée. Ainsi, toutes les techniques de transformation de cellules de plantes connues de l'homme du métier peuvent être mises en oeuvre dans le cadre de l'invention. De préférence, la transformation génétique est optimisée pour le fraisier sauvage en utilisant deux souches d'Agrobacterium tumefaciens testées pour leur virulence (AGL1 et C58GV2260).
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'isolement du promoteur de l'invention FP2 et la transformation de plantes avec des constructions la contenant, et où il sera fait référence aux figures en annexe dans lesquelles : - la figure 1 représente l'expression du gène de la CGS au cours du développement de la fraise sauvage et commerciale respectivement Fragaria vesca et Fragaria ananassa. Les ARN totaux sont hybridés avec les sondes CGS et ADNr 25S. SG, LG, W, B, BR, R, OR signifient respectivement fraise petite verte, fraise grosse verte, fraise blanche, fraise au stade tournant, fraise au stade tournant-mûre, fraise mûre, fraise blette.
- la figure 2 représente l'expression du gène de la CGS dans différents organes de la fraise sauvage. Les ARN totaux sont hybridés avec les sondes CGS et ADNr 25S. AL, YL, S, R, Flw, FvR, FaR signifient respectivement feuilles adultes, feuilles jeunes, tige, racines, fleurs, réceptacles mûrs de F. vesca et réceptacles mûrs de F. ananassa. Akl, Ak2 et Ak3 correspondent à trois stades de développement des achènes.
- la figure 3 représente l'effet de l'auxine sur l'expression du gène de la CGS. Les traitements hormonaux sont appliqués sur les réceptacles de fraise sauvage au stade tournant. Les ARN totaux sont hybridés avec les sondes CGS et ADNr 25S. T, TNAA, D et DNAA signifient fruit total,
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fruit total traité avec 1 uM d'auxine, fruit désachéné et fruit désachéné traité avec 1 uM d'auxine. la figure 4 représente l'organisation génomique du gène de la CGS chez la fraise sauvage et d'autres plantes. L'ADN génomique de fraise sauvage a été
digéré par EcoRI (EI), par EcoRV (EV), par HindIII (H) et par XhoI (X), alors que les ADN génomiques d'autres plantes ont été digérés par EcoRV. Fv, Fa, Pa et Pp signifient Fragaria vesca (fraise sauvage), Fragaria ananassa (fraise commerciale), Prunus armeniaca (abricot) et Prunus persica (pêche). la figure 5 représente la détection de polypeptides de CGS dans les réceptacles de fraise sauvage.
La CGS pure d'Arabi dopsi s thaliana et les protéines issues de réceptacles de fraise sauvage à différents stades de développement ont été traitées avec des anticorps dirigés contre la CGS d'Arabidopsis thaliana. SG, LG, W, B, BR, R, OR signifient respectivement fraise petite verte, fraise grosse verte, fraise blanche, fraise au stade tournant, fraise au stade tournant-mûre, fraise mûre, fraise blette. la figure 6 représente la révélation histochimique d'organes (feuille, tige, racine) de plantules de fraisiers sauvages transformés :
A : par pBi-FP2-gus (promoteur fruit-fort FP2).
Les organes ne présentent aucune coloration puisque FP2 dirige l'expression de manière forte dans les fruits et non dans les autres organes.
B : par pGIN (promoteur constitutif 35S). Les organes présentent une forte coloration bleue due à la transcription du gène gus et à l'activité de l'enzyme puisque le promoteur 35S dirige l'expression de manière constitutive dans tous les organes.
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1) Isolement du gène et analyse de l'expression et de l'accumulation des protéines au cours du développement de la fraise (sauvage et commerciale). a) Isolement du gène spécifique de fruit.
Un criblage différentiel d'une banque d'ADNc de fraise mûre a été réalisé avec des sondes d'ADNc issus de fraises vertes ou mûres. Les ADNc présents en abondance chez la fraise mûre et faiblement ou aucunement chez le fruit vert ont été sélectionnés. L'analyse préliminaire de l'expression d'un de ces ADNc montre une expression abondante et croissante au cours du développement du fruit.
L'analyse de la séquence de l'ADNc avec les banques de données montre une forte homologie (plus de 90% d'homologie au niveau de la séquence protéique) avec un gène de CGS issu d'Arabidopsis thaliana (Kim et Leustek, 1996, Plant Mol.
Biol., vol. 32, pages 1117-24). Cette protéine participe à la biosynthèse de la méthionine, acide aminé essentiel dans le métabolisme cellulaire de base mais aussi dans certaines voies de régulation. L'isolement du gène et de la région promotrice a été effectué par PCR inverse. Le gène présente 4.330 pb avec 11 exons intercalés de 10 introns. La région promotrice est constituée de 948 pb à partir du site de traduction (site ATG codant pour le début de la protéine). La séquence de cette région promotrice correspond à la séquence SEQ ID No. l dans la liste de séquences en annexe. b) Expression dans divers organes (technique de Northern-Blot).
L'expression de ce gène a été analysée au cours du développement de la fraise sauvage et commerciale (respectivement Fragaria vesca et Fragaria ananassa) et dans divers tissus de la plante-mère. Les messagers s'accumulent dans le fruit, dés le stade tournant chez la fraise sauvage alors qu'ils s'accumulent dés le développement du fruit chez la fraise commerciale. D'une manière générale, les messagers s'accumulent abondamment et de manière croissante pendant les phases de maturation (Fig. 1). Une très faible
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accumulation de messagers est détectée dans d'autres tissus tels que la feuille jeune et les fleurs (Fig. 2). Aucune expression n'est détectée dans d'autres organes tels que la racine, la tige et les graines de la fraise (les achènes). c) Répression du gène par l'auxine.
Une analyse de l'expression du gène a été effectuée en fonction du taux d'auxine présente naturellement dans les achènes de fraise. L'expression du gène cgs a été analysée sur des fraises exemptes d'achènes (fraises désachénées ayant donc un taux très faible d'auxine) et sur des fraises ayant subi une adjonction d'auxine exogène (fort taux d'auxine) comparées à des fraises témoin. Suivant le niveau d'expression du gène cgs (Fig. 3) il a pu être mis en évidence que l'auxine réprime de manière significative l'expression et peut donc agir comme un répresseur au niveau du promoteur. d) Présence du gène chez la fraise et d'autres espèces (technique de Southern-Blot).
Un seul gène chez la fraise sauvage a été mis en évidence (Fig. 4) corrélant des résultats similaires chez Arabi dopsi s thaliana (Kim et Leustek, 1996, Plant Mol.
Biol., vol. 32, pages 1117-24). Un seul allèle a pu être détecté chez d'autres espèces fruitières, notamment des rosacées (abricotier, pêcher, fraisier commercial). e) Corrélation spatio-temporelle entre l'accumulation des messagers et de la protéine (technique de Western-Blot).
L'accumulation de la protéine correspondante a été réalisée à partir d'anticorps dirigés contre la CGS d'Arabidopsis thaliana. L'accumulation de la protéine et de ses dérivés s'effectue de manière concomitante avec celle des messagers suggérant la bonne traduction des messagers (Fig. 5).
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2) Transformation génétique du fraisier avec le promoteur FP2. a) Fusion du promoteur et du gène aus.
La transformation génétique s'effectue par le biais d'Agrobacterium tumefaciens et de vecteurs binaires contenant la construction chimérique du promoteur fusionné avec le gène gus. Ce gène gus a la propriété de coder pour l'enzyme ss-glucuronidase dont l'activité est facilement détectable soit par coloration directe des tissus (technique histochimique), soit par enzymologie (technique de dosage fluorimétrique). Le plasmide binaire utilisé pour les transformations est le plasmide pBil0l, dérivé du vecteur pBINl9 (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res., vol. 11, pages 369-85). Ce vecteur possède (i) une origine de réplication RK2 à faible nombre de copies, (ii) un gène nptII permettant la sélection des bactéries transformées sur kanamycine, (iii) les bornes RB et LB assurant le transfert de l'ADN placé entre ces bornes. Cet ADN de transfert est constitué d'un gène nptII encadré du promoteur et terminateur NOS (NOS-Pr et NOS-Ter) permettant la sélection des plantes transformées, d'un gène gus de 1,87 Kb sans promoteur (gène issu du plasmide pRAJ260) inséré au site
KpnI dans la région de multiclonage, le terminateur NOS de 260 pb cloné SstI-EcoRI dans la région de multiclonage (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res., vol. 12, pages 8711-21).
KpnI dans la région de multiclonage, le terminateur NOS de 260 pb cloné SstI-EcoRI dans la région de multiclonage (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res., vol. 12, pages 8711-21).
Suivant la taille des promoteurs à insérer dans cette cassette et la conservation du cadre de lecture ouvert du gène gus, 3 plasmides pBI101 ont été construits distincts de 1 pb-pBI101. l, pBil0l. 2, pBil0l. 3). Le plasmide pBil0l. 2 a été utilisé pour réaliser la fusion entre le promoteur FP2 et le gène gus. La séquence promotrice a été amplifiée avec des amorces spécifiques auxquelles ont été ajoutées les séquences des sites de restriction [amorce 5'avec site XbaI souligné : AAATCTAGATCATACGTGACTCTCCAG (SEQ ID No. 2 dans la liste de séquences en annexe), amorce 3'avec site SmaI souligné : AAACCCGGGAAGCGGAGAATGAGTGAC (SEQ ID No. 3 dans la liste de séquences en annexe)]. Cet ADN amplifié de 1133 pb
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correspond à 942 pb de la région promotrice et à 179 pb du premier exon. Cet ADN digéré par XbaI-SmaI est inséré dans la cassette du plasmide pBil0l. 2 lui-même digéré par XbaISmaI. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pBi-FP2-gus et contient entre les bornes LB et RB : - le promoteur FP2 de 1133 pb, - le gène gus et NOS-Ter, - le gène nptII encadré de NOS-Pr et NOS-Ter. b) Virulence des Aqrobactéries C58GV2260 et AGL1.
Quatre souches d'agrobactéries, AGL1, C58GV2260, C58pMP90 et LBA4404 ont été testées pour leur virulence sur fraisiers. Deux souches, AGL1 et C58GV2260, ont donné des rendements d'infection et de transfert d'ADN considérables et ont été sélectionnées pour être transformées par la construction plasmidique décrite précédemment.
AGL1 : chromosome C58 (résistance à la Rifampicine), plasmide Ti de la souche B0542 (résistance à l'ampicilline).
C58GV2260 : chromosome C58 (résistance à la Rifampicine), plasmide Ti de la souche B6806 (résistance à l'ampicilline).
Une fois transformées par le vecteur, les souches ont été dénommées C et D respectivement. c) Transformation de fraisiers avec les souches C et D.
Un protocole efficace de transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens a été mis au point sur le fraisier sauvage. Des explants foliaires d'environ 0.5 cm2 sont découpés à partir de feuilles âgées d'environ 6 à 8 semaines sur des plants de fraisiers cultivés in vitro.
Ils sont transférés sur un milieu de régénération (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0.1% vitamine de Gamborg (B5), 18 uM de Benzyle Amino Purine, 2. 5 uM d'Acide Indol-3 butyrique). Vingt quatre heures après, les explants sont mis au contact des solutions d'Agrobactéries (C ou D). La
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concentration des Agrobactéries est évaluée à 1. 109 cellules/ml. La co-culture est réalisée à 28 oC pendant 1 heure avec agitation à 100 rpm. Les explants sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile et disposés sur le milieu de régénération en présence de 100 uM d'acétosyringone. Quarante huit heures après, les explants sont transférés sur le milieu de régénération avec 500 mg/1 de timentin. Les explants présentant des boursouflements et des formations calleuses sont repiqués toutes les 3 semaines sur du milieu de régénération neuf avec 500 mg/1 de timentin. Les premières pousses apparaissent 2 mois après transformation et sont repiquées individuellement sur du milieu d'élongation (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0,1% vitamine de Gamborg (B5), 2, 5 uM de Benzyle Amino Purine, 1, 25 uM d'Acide Indol-3 butyrique) en présence de 500 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Six semaines plus tard, les pousses suffisamment développées sont disposées sur un milieu d'enracinement (milieu MS/2,3% de sucrose, 0,1% vitamine de Gamborg (B5) ) en présence de 100 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Les plantes transformées produisent des racines environ 2 à 4 semaines après repiquage. Les plantules présentant des racines longues d'environ 2 cm sont acclimatées dans des pots avec du terreau dans des chambres de culture à 22 C avec une photopériode de 18 heures de lumière et 6 heures d'obscurité avant leur transfert dans des serres. d) Analyse préliminaire des transformants.
Une étude des plants transformés (plants d'environ 10-15 cm à ce jour) a été effectuée à différents niveaux : une amplification par PCR du gène gus permettant d'évaluer la présence de ce gène et par voie de conséquence du promoteur FP2 en amont, un dosage histochimique de l'activité GUS permettant d'évaluer la spécificité et l'efficacité du promoteur FP2 (comparé au promoteur constitutif 35S).
L'analyse par PCR a montré la présence du gène gus chez quelques plantes dont l'analyse histochimique
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effectuée sur les organes actuellement disponibles (racine, tige et feuille) n'a révélé aucune activité GUS (Fig. 6).
Cette révélation histochimique a été effectuée en parallèle sur des plants transformés possédant le promoteur constitutif 35S dont les organes présentent une coloration bleue intense révélant la fonctionnalité constitutive du promoteur 35S en comparaison avec le promoteur (FP2) considéré comme fruit-fort.
Dés que les plants de fraisiers fructifieront, l'activité GUS sera dosée (par enzymologie) sur différents stades de développement des fruits et notamment sur des fruits aux stades tournant et mature dans lesquels le promoteur FP2 devrait être fonctionnel.
De plus, la fonctionnalité in vivo du promoteur (FP2) est en cours d'analyse chez la tomate et sera prochainement analysée chez le raisin après transformation de ces plants avec le vecteur décrit précédemment.
Claims (8)
1) Un promoteur qui dirige fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par la séquence SEQ ID No. l de la liste de séquences en annexe, un fragment ou un dérivé de celle-ci constituant un promoteur modulé par une hormone et/ou l'anaérobiose.
2) Un promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par la molécule d'acide nucléique comprise entre les nucléotides aux positions 7 et 948 de la séquence SEQ ID No. l de la liste de séquences en annexe.
3) Un promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un site de réponse à une hormone et/ou au moins un site de réponse à l'anaérobiose.
4) Un promoteur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend un site de réponse à l'une des hormones choisies parmi l'auxine et l'acide abscissique.
5) Une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placée en aval de ladite séquence d'ADN.
6) Une molécule d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisée en ce que le ou lesdits gène (s), autre (s) que le gène de sélection, sont avantageusement des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine d'intérêt agronomique.
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7) Une cellule végétale dans le génome de laquelle est incorporée de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle dudit promoteur.
8) Une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi fortement exprimé dans les fruits de la plante au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase de maturation.
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| WILKINSON J Q ET AL: "IDENTIFICATION OF MRNAS WITH ENHANCED EXPRESSION IN RIPENING STRAWBERRY FRUIT USING POLYMERASE CHAIN REACTION DIFFERENTIAL DISPLAY", PLANT MOLECULAR BIOLOGY,NL,NIJHOFF PUBLISHERS, DORDRECHT, vol. 27, no. 6, 1 March 1995 (1995-03-01), pages 1097 - 1108, XP000670213, ISSN: 0167-4412 * |
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