JP2005516589A - 植物ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明は、アルファ−アミラーゼ活性および／またはデンプン結合活性および／またはプラスチドを標的とするシグナルを有する単離ポリペプチドならびにポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、ＤＮＡ構築物、ポリヌクレオチド配列を組み入れるベクターおよび宿主細胞、植物、特にプラスチド中のデンプン含量を変調する、ならびにプラスチド特異的デンプンを改変するための方法に関する。出願人らは、プラスチドを標的とするシグナルおよびデンプン結合活性を有するアルファ−アミラーゼのクラスを確認した。

Description

（発明の分野）
本発明は、アルファ−アミラーゼ(α−アミラーゼ)活性および／またはデンプン結合活性および／またはプラスチドを標的とするシグナルを有する単離ポリペプチドならびにポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、遺伝子構築物、ポリヌクレオチド配列を組み入れるベクターおよび宿主細胞、植物、特にプラスチド中のデンプン含量を変調する、ならびにプラスチド特異的デンプンを改変するための方法に関する。
（発明の背景）
デンプンは、大部分の植物にとって重要な炭素貯蔵分子である。デンプンは不溶性であり、植物細胞のプラスチド内に貯蔵される。デンプンは、その機能により２つの基本的グループのうちの一方に区分することができる。第１に、移動(transitory)(または、日周(diurnal))デンプンは、昼の間に光合成組織において生産され、夜間には糖に分解され、植物の他の部分に運ばれる。受容組織は、糖を異化経路に直接供給し、または長期の貯蔵のためにデンプンを再合成することがある。この貯蔵デンプンは、第２のグループを形成し、根、塊茎、樹皮／木および成育中の果実を含む様々な器官において生産される。

α−アミラーゼ(E.C.3.2.1.1)は、デンプンの内部加水分解酵素であり、デンプン分子内のα−1,4−グルカン結合を切断する。この酵素は、３つのドメインからなり、ドメインＡは、(β／α)８バレルに折り重なり、酵素の触媒残基を含み、ドメインＢは、ドメインＡの３番目のβ鎖と３番目のαラセンの間から突き出している大きなループであり、ドメインＣは、(β／α)₈バレルのＣ末端に位置し、β鎖からなっている。ドメインＢおよびＣの機能はほとんど不明であるが、ドメインＢは、オオムギα−アミラーゼの、基質結合、触媒、および低いｐＨにおける安定性を含むいくつかのアイソザイム特異的性質に影響を及ぼすことが分かっている。

植物α−アミラーゼに関する研究の多くは、単子葉植物、特に穀類のオオムギおよびコメからの酵素に重点を置いてきた。α−アミラーゼは、穀物の発芽に重要な役割を果たしており、糊粉層から、α−アミラーゼがデンプンの加水分解を開始する胚乳中に分泌される。しかしながら、α−アミラーゼは、発芽中の種子の組織に限られてはいない。α−アミラーゼ活性は、細胞壁およびアミロプラストに局在化され、オオムギの水ストレスを受けた葉、および培養コメ細胞でも検出されている。単子葉植物におけるα−アミラーゼ遺伝子の分子研究から、各植物における多数の遺伝子、例えばコメにおける少なくとも10個の遺伝子によって代表される大きいがよく保存されたファミリーが明らかにされている。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質はすべて、それらのタンパク質を細胞性分泌経路に導くと考えられているＮ末端シグナルペプチドを有している。細胞内の場所を標的とする単子葉植物α−アミラーゼは、今日まで確認されていない。

双子葉植物α−アミラーゼは、単子葉植物酵素に比べ、ほとんど注目されてこなかった。今日まで、双子葉植物においては、主に発芽中の子葉においてほんの一握りのα−アミラーゼ遺伝子が確認されているに過ぎず、その大部分は、すでに特徴が明らかにされた単子葉植物遺伝子との高い相同性を持つ。単子葉植物と同様に、大部分の双子葉植物α−アミラーゼは、推定上のシグナルペプチドを有している。

知られている双子葉植物α−アミラーゼの場合、具体的な機能および細胞下の局在化は未だ解明されていない。植物、特にプラスチドにおけるデンプン貯蔵の重要性を考えると、プラスチドにおける機能に関係するα−アミラーゼを同定することが望ましいであろう。

また、このようなプラスチド局在性α−アミラーゼをプラスチドに導くポリペプチドシグナル配列を同定することが望ましいであろう。このようなプラスチドを標的とするシグナルをコードするヌクレオチド配列は、プラスチドを標的とするシグナルを含むキメラタンパク質を、トランスジェニック植物のプラスチドに導くために利用できる可能性がある。この区分化は、プラスチド外部の細胞の内容物に対する発現タンパク質のいかなる毒作用も回避する可能性がある。さらに、プラスチド局在化は、発現タンパク質に対する細胞質因子の有害作用を回避する可能性がある。また、プラスチド因子と相互作用することを意図したポリペプチドがプラスチドを標的とすることは有利であろう。

さらに、植物におけるデンプン結合に関与するポリペプチド配列を確認することが望ましいであろう。このようなデンプン結合配列が含まれるキメラ組み換えタンパク質を生産できる可能性がある。このような組み換えタンパク質は、工業プロセスにおいて高い価値を有する可能性がある。例えば、組み換えタンパク質を用い、生分解性フィルムなどのポリマー基材としてデンプンまたはデンプン誘導体を用いる工業材料を改変できる可能性がある。

今回、出願人らは、プラスチドを標的とするシグナルを含む新規α−アミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをリンゴから確認し、単離した。本発明は、このポリヌクレオチド、その相同体および植物におけるその発現／機能を広く対象とする。

また、出願人らは、α−アミラーゼのプラスチドターゲティングに関与するペプチドモチーフを、植物α−アミラーゼにおいて初めて確認した。また、本発明は、トランスジェニック植物におけるキメラタンパク質のプラスチドターゲティングを容易にするためのこの配列およびその相同体の利用法に関する。

さらに、出願人らは、α−アミラーゼのデンプン結合に関与するポリペプチドモチーフを、植物α−アミラーゼにおいて初めて確認した。さらに、本発明は、デンプン結合特性を持つ組み換えキメラタンパク質を生産するためのこれらのペプチド配列の利用法に関する。

（発明の概要）
第１の態様では、本発明は、プラスチドα−アミラーゼをコードする単離ポリペプチドを提供する。

他の態様では、本発明は、配列番号２のＭｄａｍｙ１０アミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、または機能的に等価なその変異体を提供する。また、本発明は、単離成熟ポリペプチドを提供する。

他の態様では、本発明は、配列番号２のＭｄａｍｙ１０アミノ酸配列を有する、プラスチドを標的とするα−アミラーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、または機能的に等価なその変異体を提供する。

前記ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列の一部またはすべてを含むことが好ましい。

一実施形態では、α−アミラーゼの新規Ｎ末端ドメインをコードし、配列番号３の配列を含む本発明のポリヌクレオチド配列を提供する。

また、本発明は、配列番号４を含むＮ末端ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチド配列または機能的に等価なその変異体を提供する。

また、本発明は、配列番号５の新規デンプン結合ドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または機能的に等価なその変異体を提供する。

また、本発明は、配列番号６のポリヌクレオチド配列を提供する。

また、配列番号７、配列番号８、配列番号10の残基１〜70および配列番号53の残基１〜53から選択される、プラスチド標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または機能的に等価なその変異体を提供する。

また、本発明は、定義済みのポリペプチドモチーフ対の少なくとも１個、好ましくは２個の反復を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。モチーフ対は、ファミリー３α−アミラーゼのＮ末端半分、すなわちＭｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３、Ｏｓａｍｙ１０(コメ、Oryza sativa由来)、およびキーウィフルーツ(Actinidia chinensis)からの断片１のアライニングによって定義することができる(図８)：

または機能的に等価なその変異体。
(この表示法では、大文字は、保存されたアミノ酸を表すが、括弧内の文字は、部分的に保存されたアミノ酸を表し、ｙは、疎水性残基を表し、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、[Ｘ]₄〜₆は、連続した４〜６個の不特定のアミノ酸を表す。)
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであることが好ましい。

他の推定上のデンプン結合タンパク質からの配列が含まれる場合、モチーフをより大まかに定義することができる。付け加える配列は、ジャガイモからのＲ１タンパク質、Arabidopsisからのその相同体、Ｓｅｘ１、およびArabidopsisからの推定上のデンプン枝作り酵素(SBE様)とした(図９)。得られるモチーフは、

または機能的に等価なその変異体である。上記と同一の表示法を用いる。

ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであることが好ましい。

さらに、本発明は、上記で定義したポリヌクレオチドが含まれる遺伝子構築物を提供する。

より具体的には、本発明は、５’〜３’方向に、
（ａ）プロモーター配列、
（ｂ）本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチドまたは機能的に等価なその変異体、および
（ｃ）終止配列
を含む遺伝子構築物を提供する。

ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。

一実施形態では、オープンリーディングフレームは、センス配向である。

代替実施形態では、オープンリーディングフレームは、アンチセンス配向である。

さらに他の実施形態では、本発明は、５’〜３’方向に、
（ａ）プロモーター配列、
（ｂ）本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの非コーディング領域または機能的に等価なその変異体、および
（ｃ）終止配列
を含む遺伝子構築物を提供する。

ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７および配列番号８から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。

この場合も、非コーディング領域は、センスまたはアンチセンス配向である。

さらに他の実施形態では、本発明は、５’〜３’方向に、
（ａ）プロモーター配列、
（ｂ）本発明のポリペプチドをコードする配列の少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または機能的に等価などちらかの変異体、および
（ｃ）終止配列
を含む遺伝子構築物を提供する。

一実施形態では、（ｂ）における遺伝子構築物のポリヌクレオチドには、転写物からヘアピン構造が形成できるような逆方向反復が含まれる。

各実施形態では、遺伝子構築物に、形質転換細胞を確認するためのマーカーが含まれることが好ましい。

他の態様では、本発明は、上記で定義した遺伝子構築物が含まれる宿主細胞を提供する。

さらに他の態様では、本発明は、上記で定義した遺伝子構築物が含まれるトランスジェニック植物細胞、ならびにそのような細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。

さらに他の態様では、本発明は、配列番号２における配列のポリペプチドもしくは機能的に等価なその変異体の発現および／または活性を変えるために改変された植物を提供する。

他の態様では、本発明は、Ｍｄａｍｙ１０配列番号２もしくは配列番号４を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物または機能的に等価なその変異体を含み、前記植物内の前記ポリペプチドの発現および／または活性が妨害されている植物を提供する。

このような植物は、プラスチド内およびデンプンが貯蔵される器官(例えば、葉、塊茎、根、樹皮／木、果実)内にデンプンを蓄積し、さらにデンプンの構造および組成は変化を受けている。さらに、形質転換組織では一次代謝が変化を受け、植物は、様々な器官の間の糖輸送に変化を受けている。

他の態様では、本発明は、配列番号４および配列番号５から選択されるポリペプチドを機能的に発現しないように遺伝子操作された植物を提供する。

このような植物では、ポリペプチドのデンプン結合能力が低下し、影響を受けたタンパク質は、デンプン代謝において機能できないことを意味する。

一形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの機能的発現は、直接的に妨害されている。

別の形態では、ポリヌクレオチドによってコードされる前記ポリペプチドの機能的発現は、前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの機能的発現を妨害することなどを介して間接的に妨害される。

本明細書で使用する「植物」は、裸子植物、被子植物、単子葉植物および双子葉植物、葉、根、花、果実、樹皮／木、塊茎などの植物部分、挿し木、種、組織培養物、細胞培養物ならびに植物細胞を意味するが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用する前記ポリペプチドの「機能的発現」は、植物内で発現され、機能的であるポリペプチドの量を指す。例えば、ポリペプチドを機能的に発現しない植物は、そのポリペプチドの発現が全く存在しないこと、あるいはポリペプチドは発現されるが、もはやこれまでの機能を果たさないことを意味することができる。

発現および／または活性の妨害は、ポリヌクレオチド自体もしくはその調節要素の変異(フレームシフト、欠失、挿入またはノックアウト変異など)またはダウンレギュレーション(アンチセンスまたは同時抑制など)によっても、または遺伝子の異常もしくは発現低下を得ることができる当業者に知られている他のいかなる方法であってもよい。したがって、妨害は、Ｍｄａｍｙ１０の発現のダウンレギュレーションによって特異的に引き起こすことができる。

本発明のポリペプチドの発現レベルを減少するように設計された実験により、様々なトランスジェニック植物における発現レベルの範囲が得られることは理解されるであろう。様々なレベルの発現により、様々なレベルのα−アミラーゼ活性が得られ、いずれも有用な植物を提供することができる。

また、本発明は、植物のデンプン含量を変調するための方法であって、プラスチドを標的とするα−アミラーゼをコードする遺伝子の発現を変化させるための遺伝子組み換えにより、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７および配列番号８から選択されるポリペプチドの発現および／活性を増大または低減させることを含む方法を提供する。

デンプン代謝は、本発明の遺伝子構築物を植物に導入し、植物内でポリペプチドを発現することによって変化させることができる。

また、本発明は、広く、植物を含む生物体のデンプン含量を変調するための本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用法に関する。

また、Ｎ末端の使用法ならびにデンプン結合ドメインおよび／または特異的デンプン結合モチーフの、そのようなデンプン結合ドメインおよび／またはモチーフを含む組み換え発現されたキメラポリペプチドの製造における使用法を具体的に企図している。このような組み換えキメラポリペプチドは、デンプンと結合する能力を有している可能性がある。

また、トランスジェニック的に発現されたポリペプチドを、トランスジェニック植物のプラスチドに導くキメラ遺伝子構築物を調製するための、本発明のプラスチドを標的とするモチーフをコードするポリヌクレオチド配列の使用法を具体的に企図している。

本発明は、上記のように広く定義されているが、当業者は、本発明がこれらに限定されるものではないこと、および本発明には、以下の説明が例示する実施形態が含まれていることを理解しているであろう。

（図面の簡単な説明）
さらに、付随する図面を参照することにより、本発明はより良く理解されるであろう。

図１は、ファミリー３α−アミラーゼ配列とリンゴα−アミラーゼ８(Ｍｄａｍｙ８)との比較アラインメントを示す図である。Ｍｄａｍｙ８は、サイトゾルを標的とするα−アミラーゼである。配列によってコードされる４個のタンパク質ドメインを区別するため、各バーに陰影をつける。Ａ、ＢおよびＣは、構造ドメインＡ、ＢおよびＣを表し、すべてのα−アミラーゼで見つかる。新規ドメインは、ファミリー３α−アミラーゼでのみ見つかるＮ末端ドメインを指す。Ｍｄａｍｙ８、Ａｔａｍｙ３、Ｍｄａｍｙ１０、およびＯｓａｍｙ１０はすべて、完全長配列を表す。Ｍｄａｍｙ１１ならびにキーウィフルーツ、ブルーベリー、コーヒー、ワタ、およびバラからの配列はすべて、部分配列を表す。

図２は、Ｍｄａｍｙ１０のヌクレオチド配列を示す図である。プラスチドを標的とするペプチドをコードするヌクレオチド(ヌクレオチド55〜237)を太字で示し、新規なデンプン結合ドメインをコードするヌクレオチドに下線を引く(238〜1503)。

図３は、Ｍｄａｍｙ１０のアミノ酸配列を示す図である。プラスチドを標的とするペプチド(アミノ酸１〜61)を太字で示し、新規なデンプン結合ドメインに下線を引く(62〜483)。

図４は、Ａｔａｍｙ３のヌクレオチド配列を示す図である。プラスチドを標的とするペプチドをコードするヌクレオチド(ヌクレオチド１〜165)を太字で示し、新規なデンプン結合ドメインをコードするヌクレオチドに下線を引く(166〜1410)。

図５は、Ａｔａｍｙ３のアミノ酸配列を示す図である。プラスチドを標的とするペプチド(アミノ酸１〜55)を太字で示し、新規なデンプン結合ドメインに下線を引く(56〜470)。

図６は、Ｏｓａｍｙ１０のヌクレオチド配列を示す図である。プラスチドを標的とするペプチドをコードするヌクレオチド(ヌクレオチド１〜159)を太字で示し、新規なデンプン結合ドメインをコードするヌクレオチドに下線を引く(160〜1371)。

図７は、Ｏｓａｍｙ１０のアミノ酸配列を示す図である。プラスチドを標的とするペプチド(アミノ酸１〜53)を太字で示し、新規なデンプン結合ドメインに下線を引く(54〜457)。

図８は、ファミリー３α−アミラーゼのデンプン結合ドメインからのポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。配列タイトルは、配列自体の左に示す。キーウィフルーツ配列は、配列１(配列番号21)を指す。文字「ａ」は、その配列が、配列内のモチーフ対の１番目(Ｎ末端に最も近い)の反復であることを示している。「ｂ」は、モチーフ対の２番目の(Ｃ末端に最も近い)反復を示している。陰影付けは、配列保存を示し、黒は完全な保存、灰色地に白文字は、高度な保存、灰色地に黒文字は、中程度の保存である。

図９は、ファミリー３のα−アミラーゼのデンプン結合ドメインと、さらにジャガイモからのＲ１タンパク質(Genbank-CAA70725)、Arabidopsisからのその相同体、Ｓｅｘ１(Genbank-AAG47821)、およびArabidopsisからの推定上のデンプン枝作り酵素(SBE様)(Genbank-BAB02827)からのポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。配列タイトルは、配列自体の左に示す。キーウィフルーツ配列は、配列１(配列番号21)を指す。文字「ａ」は、その配列が、配列内のモチーフ対の１番目(Ｎ末端に最も近い)の反復であることを示している。「ｂ」は、モチーフ対の２番目の(Ｃ末端に最も近い)反復を示している。陰影付けは、配列保存を示し、黒は完全な保存、灰色地に白文字は、高度な保存、灰色地に黒文字は、中程度の保存である。

図10は、多くの植物種からのゲノムＤＮＡに対するプライマーＮｅｗＵＮＩｆ２およびＮｅｗＵＮＩｒ２によるＰＣＲの結果を示す図である(レーン１；マツ。レーン２；ジャガイモ。レーン３；タマネギ。レーン４；バラ。レーン５；オリーブ。レーン６；コーヒー。レーン７；バナナ。レーン８；マンゴー。レーン９；ワタ。レーン１０；１ｋｂ＋ＤＮＡラダー(Bio-Rad Laboratories)。指示サイズを右に示す。試料は、0.8％アガロースゲルにより電気泳動させ、臭化エチジウムで染色した。

図11は、N.benthamiana上皮細胞において発現されたGFP融合遺伝子構築物の蛍光顕微鏡画像を示す図である。左上、ＧＦＰ単独(pDS-GFP-ART27)、ＧＦＰ植物フィルタセットを使用；バーは50μｍを表す。右上、ｃＴＰ−ＧＦＰ(pcTP-ART27)、ＵＶフィルタセットを使用；バーは50μｍを表す。左下、ｃＴＰ−ＧＦＰ、ＧＦＰ植物フィルタセットを使用；バーは50μｍを表す。右下、ｃＴＰ−ＧＦＰ、ＧＦＰ植物フィルタセットを使用；バーは10μｍを表す。

図12は、ｐＥＴ−３０ａをベースとするＧＦＰ構築物を含むＩＰＴＧ誘導E.coliからのタンパク質のSDS-PAGE(A)およびウエスタンブロット(B)を示す図である。ウエスタンは、抗ＧＦＰ抗体で探索した。レーン１〜４は、不溶性タンパク質分画である。レーン６〜９は、可溶性タンパク質分画である。レーン１および６−ｐＥＴ−３０ａ；レーン２および７−ｐＧＦＰ−ＥＴ−３０ｂ；レーン３および８−ｐＮｔｅｒｍ−ＥＴ−３０ｂ；レーン４および９−ｐＳＢＤ−ＥＴ−３０ａ；レーン５−Prestained Broad Range SDS-PAGE Standard(Bio-Rad)−サイズは図の右に示す。

図13は、ヨウ素で染色されたアミロペクチン含有ゲル上のタンパク質試料を示す図である。ゲルＡ：レーン１は、ｐＥＴ−３０ａを発現するE.coliからの粗製タンパク質抽出物を含む。レーン２は、ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａを発現するE.coliからの粗製タンパク質抽出物を含む。レーン３は、結合緩衝液中で脱塩された粗製のｐＥＴ−３０ａ抽出物を含む。レーン４は、結合緩衝液中で脱塩された粗製のｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａ抽出物を含む。ゲルＢ：レーン５、７および９は、連続した2.5 ｍＬの分画からのニッケル精製ｐＥＴ−３０ａタンパク質を含む。レーン６、８および１０は、連続した2.5 ｍＬの分画からのニッケル精製ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａタンパク質を含む。レーン11は、ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａを発現するE.coliからの粗製タンパク質抽出物を含む。

図14は、ヨウ素で染色されたデンプン移動ゲルを示す図である。レーン１は、ｐＥＴ−３０ａのみを発現するE.coliからの粗製タンパク質抽出物を含む。レーン２；ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａを発現するE.coliからの粗製タンパク質抽出物。レーン３；リンゴの葉から抽出されたタンパク質。レーン４；Arabidopsisの葉から抽出されたタンパク質。レーン５；ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａを発現するE.coliからの粗製タンパク質抽出物。

図15は、ｐＥＴ−３０ａおよびｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａプラスミドを含むＩＰＴＧ誘導E.coli由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(A)およびウエスタンブロット(B)を示す図である。ウエスタンは、抗Ｈｉｓ₆抗体で探索した。レーン１−粗製ｐＥＴ−３０ａ；レーン２−粗製ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａ；レーン３−脱塩ｐＥＴ−３０ａ；レーン４−脱塩ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａ；レーン５−Pre-stained Broad Range SDS-PAGE Standard(Bio-Rad)−サイズは図の右に示す；レーン６−ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａ、精製分画１；レーン７−ｐＥＴ−３０ａ、精製分画２；レーン８−ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａ、精製分画２；レーン９−ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａ、精製分画３(セミドライブロッティングの前にレーンの一部を取り除いたため、ブロット(B)上に完全には現れない)。

図16は、10種の異なる組織からのArabidopsisα−アミラーゼ転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す図である。各Arabidopsisα−アミラーゼの一部(Ａｔａｍｙ１、２、または３)を増幅するように設計されたプライマーを用い、ＰＣＲ増幅を30サイクル行った。組織：１：吸水膨潤(imbibed)種子、２：子葉が出ている種子、３：(２)からの子葉のみ、４：丸ごとの苗木(whole seedling)(２葉)、５：(４)からの葉のみ、６：根、７：完全ロゼット植物、８：成長している茎からの葉、９：若い種子のさや、10：老化植物(種子のさやがない)。

（発明の説明）
上記で概述したように、出願人らは、植物のプラスチドを標的とする新規α−アミラーゼを確認した。好ましい実施形態では、植物は、結実植物である。また、新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、植物のMalus x domestica、Arabidopsis thalianaおよびOryza sativaに由来する。

一ポリペプチドＭｄａｍｙ１０のアミノ酸配列、およびそれをコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれ図３および２に示す。しかしながら、本発明は、図３および２に示す具体的なアミノ酸／ヌクレオチド配列を有するポリペプチド／ポリヌクレオチドのみに限定されないことは理解されるであろう。それよりむしろ、本発明は、図３および２のポリペプチド／ポリヌクレオチドの機能的に等価な変異体にまで及ぶ。

本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味し、ＤＮＡならびにｈｎＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子、センスとアンチセンス鎖の双方を含む対応するＲＮＡ分子が含まれ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組み換えＤＮＡ、ならびに完全または部分合成ポリヌクレオチドを包含する。ｈｎＲＮＡ分子はイントロンを含み、一般的には１：１でＤＮＡ分子に対応している。ｍＲＮＡ分子は、イントロンが切除されたｈｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応している。ポリヌクレオチドは、全遺伝子、またはその任意の部分からなることができる。動作可能のアンチセンスポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレオチドの断片を含み、したがって、「ポリヌクレオチド」の定義には、このような動作可能なアンチセンス断片すべてが含まれる。

本明細書で使用する用語「ポリペプチド」には、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。

語句「機能的に等価な変異体」は、実質的に等価な機能性を維持しつつ、ポリペプチドのアミノ酸／ヌクレオチド配列を変化させることが可能であると理解される。例えば、あるポリペプチドは、等価なポリペプチドが免疫学的に交差反応性であり、元のポリペプチドと少なくとも実質的に同一な機能を有する場合、具体的な機能に関して別のポリペプチドの機能的等価体と見なすことができる。例えば、等価体は、ポリペプチドの断片、ポリペプチドと別のポリペプチドもしくはキャリアとの融合物、またはアミノ酸が追加された断片の融合物であってもよい。

変異体ポリヌクレオチド配列には、イントロンのサイズ、組成、位置、および数、ならびに非翻訳末端領域のサイズおよび組成が異なる等価な配列が含まれる。

機能的に等価なポリヌクレオチドは、機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

Ｍｄａｍｙ１０の重要なＮ末端ポリペプチド領域をコードするポリヌクレオチド配列を図２に示す。Ｍｄａｍｙ１０からの対応するＮ末端アミノ酸配列を図３に示す。当初、大きなＮ末端伸長(約460〜480個のアミノ酸)が、Ｍｄａｍｙ１０およびArabidopsisからの相同体Ａｔａｍｙ３(GenBank Accession No.A7050398；図４および５)において見いだされた。プラスチドを標的とする他の配列は、出願人らにより、リンゴから(Ｍｄａｍｙ１１)、その後コメから(Ｏｓａｍｙ１０；図６および７)確認された。これらのＮ末端伸長には、Ｍｄａｍｙ１０における61個のアミノ酸(配列番号２および配列番号７)、Ｍｄａｍｙ１１における70個のアミノ酸(配列番号10)、Ａｔａｍｙ３における55個のアミノ酸(配列番号17および配列番号８)およびＯｓａｍｙ１０における53個のアミノ酸(配列番号53)の、プラスチドを標的とするペプチドが含まれる。

また、Ｎ末端領域には、強力なデンプン結合領域(配列番号５)、および前述の強力な特異的デンプン結合モチーフが含まれることが判明した。残りのＣ末端領域(Ｍｄａｍｙ１０における最後の420個のアミノ酸、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０における最後の416個)には、α−アミラーゼ領域が含まれる。Ｍｄａｍｙ１１配列は、５’ポリペプチド断片(配列番号10)のアミノ酸71〜243中に、デンプン結合ドメインの大部分を含んでおり、デンプン結合モチーフの完全な対、および中心断片のアミノ酸１〜107(配列番号12)が含まれ、デンプン結合モチーフ２の一部が含まれている。中心断片のアミノ酸108〜172および３’断片の１〜142(配列番号14)はすべて、α−アミラーゼ領域の一部を構成している。

また、出願人らは、Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０がα−アミラーゼの異なるファミリーを形成していると判断し、これらをファミリー３α−アミラーゼと名付けた。このことは、それらのプラスチドターゲティングによってばかりでなくイントロンの数および分布に基づいて判断した。Ａｔａｍｙ３およびＯｓａｍｙ１０は、それらのコーディング配列を遮断する12個のイントロンを有し、イントロンを含むそれらの完全ゲノム配列は、それぞれ配列番号55および配列番号54である。それらのイントロンのうち６個は、以下の表１に示すように、遺伝子のα−アミラーゼコーディング領域内(３’側の半分)にある。

ファミリー１およびファミリー３のα−アミラーゼ遺伝子におけるイントロンの分布。コドン番号は、Ａｔａｍｙ３のアミノ酸配列(図５)に対応し、かつ相当する。イントロンの存在を＋記号で示し、非存在を−記号で示す。ゲノムＤＮＡ配列が存在しないＭｄａｍｙ１０およびＭｄａｍｙ１１の領域には？印を付ける。Ａｔａｍｙ３のアミノ酸１〜470の領域は、Ｈｖａｍｙ２−２およびａｍｙＶｍ１と等価ではないため、これらの領域にはｎ／ａと記入した。出願人らは、ファミリー１およびファミリー３の遺伝子中に合計15個の異なるイントロン位置を明らかにし、それらに、Ａｔａｍｙ３遺伝子配列の５’から番号を付け、コドン番号および相によって定義する。１番目の塩基の後ろでトリプレットを分離するイントロンの場合、コドン番号の後ろに−１を続ける。２番目の塩基の後ろでトリプレットを分離するイントロンの場合、コドン番号の後ろに−２を続ける。トリプレット間に収まるイントロンの場合、イントロンの３’が位置するコドンの番号を示し、−０を続ける。GenBank Accession番号：Ｈｖａｍｙ２−２(AAA98790)、ＡｍｙＶｍ１(CAA37217)。

３種類のα−アミラーゼはすべて、35〜54塩基対の短い５’非翻訳領域(UTR)を有している。しかしながら、Ｍｄａｍｙ１０は、557塩基対までの極めて長い３’ＵＴＲを有している。

Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１およびＡｔａｍｙ３のＵＴＲの特徴付けについての情報を表２に提供する。

このα−アミラーゼファミリーを特徴付けている独自のイントロン構造も、α−アミラーゼの発現に影響を及ぼすと考えられる。

ポリペプチドの活性を担う構造を維持しつつ、アミノ酸の様々な置換が可能であることは理解されるであろう。保存的置換は、特許文献、例えば米国特許第5,264,558号または第5,487,983号に記載されている。すなわち、例えば、非極性脂肪族中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシン間の交換が可能であろうと予想される。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸であるセリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミン間の置換を行うことができる。荷電した酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸間の置換は、荷電した塩基性アミノ酸であるリジンおよびアルギニン間の置換と同様に行うことができる。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシンを含む芳香族アミノ酸間の置換も可能である。このような置換および交換は、当業者によく知られている。

同様に、特定の産物をコードするヌクレオチド配列は、単なる核酸コードの縮重によって、著しく異なることがある。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のアラインメントを行い、公に利用できるコンピュータアルゴリズムを用い、特定の領域における同一のヌクレオチドの割合を別の配列に対して決定することができる。アラインメントを行い、ポリヌクレオチド配列の類似性を確認するための２例のアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリペプチド配列の類似性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。ＢＬＡＳＴＮソフトウェアとＢＬＡＳＴＰソフトウェアは共に、/blast/executables/によりＮＣＢＩ匿名FTPサーバ(ftp://ncbi.nlm.nih.gov)上で入手可能である。ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン2.0.4[1998年２月24日]は、本発明による変異体の付属文書に記載されているデフォルトパラメータに設定する。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの使用法は、ＮＣＢＩのウェブサイトのＵＲＬ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.htmlおよびAltschul、Stephen F.、他(1997)の発表に記載されている。コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡは、インターネット上のftpサイト、ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta/において入手可能である。本発明による変異体の決定に使用するためには、付属文書に記載のデフォルトパラメータに設定されアルゴリズムと共に配布されている1996年２月のバージョン2.0u4が好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、(PearsonおよびLipman1988、Pearson1990)に記載されている。

以下のランニングパラメータは、Ｅ値(下記の)および同一性比率に役立つＢＬＡＳＴＮを用いるアラインメントおよび類似性の決定にとって好ましい。Ｕｎｉｘランニングコマンド：blastall -P blastn -d embldb -e 10 -G 1 -E 1 -r 2 -v 50 -b 50 -I queryseq -ｏ results；およびパラメータデフォルト値：
−ｐ プログラム名[文字列]
−ｄ データベース[文字列]
−ｅ 期待値(Ｅ)[実数]
−Ｇ ギャップを開くためのコスト(０は、デフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−Ｅ キャップを延長するためのコスト(０は、デフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−ｒ ヌクレオチドマッチに対する報酬(blastnのみ)[整数]
−ｖ 一行説明文の数(V)[整数]
−ｂ 示すアラインメントの数(B)[整数]
−ｉ クエリーファイル[ファイルイン]
−ｏ ＢＬＡＳＴレポート出力ファイル[ファイルアウト]選択肢
ＢＬＡＳＴＰの場合、以下のランニングパラメータが好ましい：blastall -p blastp -d swissprotdb -e 10 -G 1 -E 1 -v 50 -b 50 -I queryseq -o results
−ｐ プログラム名[文字列]
−ｄ データベース[文字列]
−ｅ 期待値(E)[実数]
−Ｇ ギャップを開くためのコスト(０は、デフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−Ｅ キャップを延長するためのコスト(０は、デフォルト挙動を呼び出す)[整数]
−ｖ 一行説明文の数(v)[整数]
−ｂ 示すアラインメントの数(b)[整数]
−ｉ クエリーファイル[ファイルイン]
−ｏ ＢＬＡＳＴレポート出力ファイル[ファイルアウト]選択肢
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、または類似のアルゴリズムによって取り出されたクエリー配列による１個または複数のデータベース配列との「ヒット」は、アラインメントして配列の類似部分を確認する。ヒットは、類似性の程度および配列重複部分の長さの順に配置する。データベース配列とのヒットは、一般的に、クエリー配列のほんのわずかな配列長上の重複部分を表す。

また、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムは、アラインメントに関する「期待」すなわちＥ値を取り出す。Ｅ値は、特定のサイズのデータベースを検索する場合、特定数の連続した配列上で偶然に見ることを「期待」できるヒットの数を示している。期待値は、好ましいＥＭＢＬデータベースなどのデータベースとのヒットが、真の類似性を示しているか否かを決定するための有意性閾値として使用される。例えば、あるヒットに割り当てられた0.1というＥ値は、ＥＭＢＬデータベースのサイズのデータベースにおいて、一般に、類似したスコアを持つ配列のうちアラインメントされた部分上で、単なる偶然により0.1のマッチを見ることが期待できることを意味していると解釈される。この基準により、配列のうちアラインメントされマッチした部分は、同一である可能性を90％有することになる。アラインメントされマッチした部分上で0.01以下のＥ値を有する配列の場合、ＥＭＢＬデータベースで偶然にマッチが見つかる確率は、ＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いると１％以下である。

一実施形態によれば、本発明の各ポリヌクレオチドに関して、「変異体」ポリヌクレオチドは、本発明の各ポリヌクレオチドと同数以下の核酸を有し、本発明のポリヌクレオチドと比較した場合、0.01以下のＥ値を生じる配列を含むことが好ましい。すなわち、変異体ポリヌクレオチドは、上記のパラメータに設定されたＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて0.01以下のＥ値を有すると測定され、本発明のポリヌクレオチドと同一であるという確率を少なくとも99％有する任意の配列である。

変異体ポリヌクレオチド配列は、一般的に、列挙したポリヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズする。本明細書で使用する「厳密な条件」は、６×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳの溶液中で予備洗浄すること；65℃、６×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳにおいて一夜ハイブリダイズさせること；続く、各々１×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中、65℃における30分間の洗浄を２回と各々0.2×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中、65℃における30分間の洗浄を２回行うことを指す。本発明の変異体ポリヌクレオチド配列は、長さが少なくとも50個のヌクレオチドである。

また、変異体ポリヌクレオチドには、本明細書に列挙する配列中に示されるそれぞれのネイティブなヌクレオチド配列のヌクレオチドに対し、少なくとも60％、一般的に70％、好ましくは80％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％、極めて好ましくは98％、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列が含まれる。

一般に、α−アミラーゼ、デンプン結合ドメイン／モチーフ、プラスチドを標的とするシグナルおよび本発明の他のポリペプチドをコードする配列は、開示された配列と、少なくとも50％、一般的に少なくとも60％、好ましくは70％、さらに80％、85％、90％、95％、98％、最も好ましくは99％以上の相同性があるはずである。すなわち、配列類似性は、50％から99％以上まで及んでもよい。

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の断片を包含する。ポリヌクレオチド断片は、ネイティブなタンパク質の生物活性を保持するタンパク質断片をコードすることができる。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして用いられる断片は、一般的に、生物活性配列をコードしない。ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも15、20、30、50、100、200、400または1000個の連続したヌクレオチドから、本明細書に開示されているネイティブな完全長のポリヌクレオチド配列まで及んでもよい。

本発明のポリペプチドの断片は、少なくとも５、10、15、30、50、75、100、150、200、400または500個の連続したアミノ酸から、本発明の完全長ポリペプチドにおけるアミノ酸の総数まで及んでもよい。

また、変異体は、そのような変異体が、機能的に等価な本発明のタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片を依然として提供する場合、同種または他種の遺伝子(α−アミラーゼを含む)からの１個または複数のヌクレオチドまたはドメイン／モチーフ(コーディング、非コーディングまたはイントロン領域からの)の再配列、転換または交換を可能にすることを意図している。

Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０の相同体が他の植物中に存在することを明確に企図していることは言うまでもない。そのような相同体は、本明細書で使用する語句と同様、Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０の「機能的に等価な変異体」である。これらの遺伝子には多くの相同体の例が存在し、実験の項にいくつかを記載する。Ｍｄａｍｙ１０、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０はすべて、完全長配列である。Ｍｄａｍｙ１１ならびにキーウィフルーツ(Actinidia chinensis)、ブルーベリー(Vaccinium corymbosum)、コーヒー(Coffea arabica)、ワタ(Gossypium hirsutum)、およびバラ(Rosa woodsii)からの配列はすべて、部分配列である。各配列の範囲を、ファミリー３α−アミラーゼのＮ末端ドメインの等価体を有しない、サイトゾルを標的とするファミリー２のα−アミラーゼであるリンゴのα−アミラーゼＭｄａｍｙ８と対比して図１に示す。表３は、ヌクレオチドレベルとアミノ酸レベルの双方における各相同体についてのＭｄａｍｙ１０との同一性比率を示している。

Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０の相同体に相当する多くのＥＳＴを公開データベース中に見いだすことができる。これらのＥＳＴの一部は、Ｍｄａｍｙ１０のＮ末端ドメインに相当し、プラスチドを標的とするシグナルおよび／またはデンプン結合ドメインの一部またはすべてが含まれる；これらのＥＳＴの例(Genbankアクセッション番号を列挙する)：

他のＥＳＴは、Ｍｄａｍｙ１０のα−アミラーゼドメインに相当する。；これらのＥＳＴの例(Genbankアクセッション番号を列挙する)：

このＥＳＴリストは、双子葉および単子葉被子植物、ならびに裸子植物Pinus taedaからの配列を含んでいる。列挙した相同体以外に、Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０の相同体が存在することは明確に企図している。

本発明のポリヌクレオチド配列は、融合タンパク質をコードできるように、１個または複数の追加ポリペプチドをコードする１個または複数の追加配列、またはその断片をさらに含むことができる。本発明のポリペプチドの新規Ｎ末端領域、または１個もしくは複数のデンプン結合ドメイン／モチーフをコードする配列が含まれるキメラ遺伝子構築物を用い、デンプンと結合することができるキメラタンパク質を製造することができる。このような組み換え発現用の系には、哺乳動物、細菌、真菌および昆虫系が含まれるが、これらに限定されるものではない。

Malus x domestica以外の植物からＭｄａｍｙ１０およびＭｄａｍｙ１１の相同体であるＤＮＡ配列を確認し(コンピュータ支援データベース検索により)、そのような植物から調製したｃＤＮＡライブラリのハイスループットシークエンシングを経て単離することができる。あるいは、配列番号１、９、11および13で示される、Ｍｄａｍｙ１０およびＭｄａｍｙ１１の配列をベースとするオリゴヌクレオチドプローブを合成して使用し、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技法により、他の植物からのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリ中の陽性クローンを確認することができる。プローブは、長さが少なくとも約10個、好ましくは少なくとも約15個、最も好ましくは少なくとも約20個のヌクレオチドでなければならない。このようなオリゴヌクレオチドプローブと共に使用するのに適当なハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ技法は当技術分野でよく知られている。陽性クローンは、制限酵素消化、ＤＮＡシークエンシングなどによって分析することができる。

本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野でよく知られている技法を用い、合成手段によって作製することができる。オリゴヌクレオチドの自動合成用機器は、Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City、CA)などの供給業者から市販されており、製造者の使用説明書に従って操作することができる。

本発明のポリペプチド／ポリヌクレオチドを確認することの一番の重要性は、それらが、植物、特に葉緑体などの植物プラスチドにおけるデンプン含量の変調を可能にすることである。変調には、ポリペプチドの発現および／または活性の低下(すなわち、サイレンシング)が含まれる。

これを行うためには、従来のいかなる技法を用いてもよい。介入は、転写後または転写前に生じることがある。さらに、介入は、遺伝子自体または遺伝子に関連し、コードされているポリペプチドの発現に影響する調節要素に焦点を合わせてもよい。本明細書では、「調節要素」は可能な最も広い意味で使用され、当該ポリヌクレオチド／ポリペプチドと相互作用する他のポリヌクレオチド／ポリペプチドが含まれる。

転写前の介入は、遺伝子自体またはその調節要素の変異を含むことができる。このような変異は、点変異、フレームシフト変異、挿入変異または欠失変異であってもよい。これら後者の変異には、遺伝子の発現が完全に取り除かれたいわゆる「ノックアウト」変異が含まれる。

転写後の介入の例には、同時抑制もしくはアンチセンス戦略、ドミナントネガティブな手法、またはリボザイムに標的遺伝子の転写後ＲＮＡを消化させる、さもなければ致命的にする技法が含まれる。

同時抑制は、例えばNapoli他(1990)およびde Carvalho Niebel他(1995)により論じられた方法と類似の方法で行うことができる。場合により、構成的プロモーターの使用による当該遺伝子の過剰発現を含むことができる。また、遺伝子からのイントロンまたは５’もしくは３’非翻訳領域(UTR)などの、遺伝子の非コーディング領域による植物の形質転換を含むことができる。

アンチセンス戦略は、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を妨害することができる発現／転写産物の発現または転写を含む。これは、通常、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし二重鎖を形成する発現／転写産物を介するものである。

発現／転写産物は比較的小さな分子であり、それでもなおｍＲＮＡ翻訳を妨害することができる。しかしながら、同じ結果は、アンチセンス配向の遺伝子の転写によって産生されるＲＮＡが内因性標的ｍＲＮＡのすべてまたは一部と相補的であるように、アンチセンス配向で全ポリヌクレオチドを発現することによって得られる。

アンチセンス戦略は、一般にRobinson-Benion他(1995)およびKawasaki他(1996)により記載されている。

遺伝子サイレンシングのために設計された遺伝子構築物には、逆方向反復が含まれる。「逆方向反復」は、反復の後半が相補鎖、例えば

で反復される配列である。生成した転写物は、反復領域間に少なくとも３〜５ｂｐのスペーサーが存在するならば、相補的塩基対形成を受けてヘアピン構造を形成する。

別の手法は、標的遺伝子サイレンシングに使用できる可能性のあるｍｉＲＮＡ(Llave他、2002)に相当する転写物を標的とする小さなアンチセンスＲＮＡを作製することである。

ドミナントネガティブな手法は、デンプン結合ドメインを含むが、触媒ドメインを欠く改変プラスチドα−アミラーゼポリペプチドの発現を含む。結果は、タンパク質は目的どおりデンプンと結合するがデンプンを消化できず、同時に内因性α−アミラーゼの結合をブロックすることである。

ポリペプチド発現の調節へのリボザイム手法は、リボザイム遺伝子構築物に適切な配列または部分配列(例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ)を挿入するものである(McIntyre、1996)。リボザイムは、各々が、本発明のポリヌクレオチドのうち１つによってコードされるｍＲＮＡ分子の少なくとも５個の連続したヌクレオチドを含む２つの領域に相補的なハイブリダイズする領域を含む合成ＲＮＡ分子である。リボザイムは、極めて特異的なエンドヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡを自己触媒的に切断する。

あるいは、変調は、ポリヌクレオチドの過剰発現、または宿主のゲノムにおけるポリヌクレオチドのコピー数を増加させることによるポリペプチドの発現または活性の増加を含むことができる。

上記の戦略を実行するため、本発明は、遺伝子構築物も提供する。遺伝子構築物には、所期のＤＮＡ(センスもしくはアンチセンス配向の本発明のポリヌクレオチド配列または適切なリボザイムをコードするポリヌクレオチドの１個または複数のコピーなど)、転写されるＤＮＡ配列と動作可能に連結されている(遺伝子の発現を制御する)プロモーター配列および終止配列が含まれる。プロモーター配列は、一般に、転写されるＤＮＡ配列の５’末端に位置し、ＤＮＡ配列の転写を開始するために用いられる。プロモーター配列は、一般に遺伝子の５’非コーディング領域に見いだされるが、イントロン(Luehrsen、1991)またはコーディング領域に存在することがある。

本発明の遺伝子構築物において有用に用いることができる様々なプロモーター配列は、当技術分野でよく知られている。プロモーター配列、および終止配列もまた、標的宿主においてプロモーターが機能性であれば、標的植物宿主に対して内因性または外因性のどちらであってもよい。例えば、プロモーターおよび終止配列は、他の植物種、植物ウイルス、細菌プラスミドなどに由来してもよい。プロモーターおよび終止配列は、α−アミラーゼ遺伝子と内因的に関係のある配列であることが好ましい。

プロモーターの選択に影響を及ぼす因子には、遺伝子構築物の望ましい組織特異性、ならびに転写および翻訳のタイミングが含まれる。例えば、35S Cauliflower Mosaic Virus(CaMV 35S)プロモーターなどの構成的プロモーターは、植物のすべての部分において転写に影響する。組織特異的プロモーターを使用することにより、当該組織のみで望ましいセンスまたはアンチセンスＲＮＡが産生される。誘導プロモーター配列を用いる遺伝子構築物により、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度を、光、熱、嫌気性ストレス、栄養状態の変化などの外部刺激によって変調することができる。時間的に調節されたプロモーターを用い、形質転換細胞の作製中の特定の時間に、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始の速度の変調を行うことができる。当該遺伝子からの元のプロモーター、または形質転換される生物における特異的な組織を標的とする遺伝子からのプロモーターを用いることが好ましい。本発明において有用に用いることができるプロモーターの他の例には、マンノピンシンターゼ(mas)、オクトピンシンターゼ(ocs)およびChua他(1989)によって概説されているプロモーターが含まれる。

転写されるＤＮＡ配列の３’に位置する終止配列は、プロモーター配列と同じ遺伝子に由来する、または異なる遺伝子に由来してもよい。Agrobacterium tumefaciensノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端などの当技術分野で知られている多くの終止配列を本発明で有用に用いることができる。しかしながら、好ましい終止配列は、元の遺伝子由来、または形質転換される標的Malus種由来の配列である。

また、本発明の遺伝子構築物は、細胞内で有効で、遺伝子構築物を含む形質転換細胞の検出を可能にする選択マーカーを含むことができる。このようなマーカーは、当技術分野ではよく知られており、通常、１個または複数の毒素に対する耐性を付与する。このようなマーカーの一例は、ＮＰＴＩＩ遺伝子で、その発現の結果、通常は中程度の濃度において植物細胞に有毒である抗生物質カナマイシンまたはハイグロマイシンに対する耐性がもたらされる(Rogers他、1988)。あるいは、形質転換細胞における所望の遺伝子構築物の存在は、ＰＣＲまたはサザンブロッティングなどの当技術分野でよく知られている他の技法により判定することができる。

本発明の遺伝子構築物の成分を動作可能に連結するための技法は、当技術分野でよく知られており、例えば、Maniatis他(1989)によって記載された１個または複数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーの使用法が含まれる。遺伝子構築物は、少なくとも１つの系、例えば、E.coliにおいて複製能力のあるベクターと連結してもよく、それによって、各操作後に得られる遺伝子構築物を配列決定し、操作の正確さを判断することができる。

本発明の遺伝子構築物を用い、農業用、装飾用および園芸用植物を含む様々な植物を形質転換することができる。好ましい実施形態では、遺伝子構築物を用いてリンゴ、バナナ、キーウィフルーツ、マツ、トマト、ワタ、バラ、オリーブ、コメ、ブルーベリー、Arabidopsis、およびジャガイモ植物を形質転換する。

前述のように、本発明のポリヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームが含まれ、オープンリーディングフレームがセンス方向に配向している遺伝子構築物による植物の形質転換は、場合によっては同時抑制により、ポリペプチドの発現の減少につながることがある。アンチセンス配向の遺伝子のオープンリーディングフレームまたは非コーディング(非翻訳)領域を含む遺伝子構築物による植物の形質転換は、形質転換植物におけるポリペプチドの発現の減少につながることになる。

また、細菌(例えば、E.coli、Agrobacterium)、真菌、昆虫、および動物細胞などのよく知られている原核細胞および真核細胞を含む他の非植物宿主の形質転換が可能であり、予想されていることは理解されるであろう。このことは、本発明の組み換えポリペプチドまたはその変異体の生産を可能にするであろう。組み換えタンパク質を生産するための無細胞系(例えば、Roche Rapid Translation System)の使用も予想されている(Zubay、1973)。

このような宿主で生産される本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、よく知られている技法を用い、それらから単離し、かつ精製することができる。

標的植物のゲノム中に遺伝子構築物を安定に組み入れるための技法は当技術分野ではよく知られており、Agrobacterium tumefaciens仲介性導入、電気穿孔法、原形質融合、生殖器官内注入、未成熟胚内注入、高速発射(projectile)導入、花浸漬法(floral dipping)などが含まれる。技法の選択は、形質転換される標的植物によって異なる。

細胞が形質転換されたら、ゲノムに組み入れられた遺伝子構築物を有する細胞を、前述のカナマイシン耐性マーカーなどのマーカーにより選択することができる。次いで、当技術分野でよく知られている技法を用い、トランスジェニック細胞を適切な培地中で培養して植物全体を再生する。原形質の場合、適切な浸透圧条件下で細胞壁を再形成させる。種子または胚の場合、適切な発芽またはカルス開始培地を用いる。外植体については、適切な再生培地を用いる。

前述の方法に加えて、裸子植物、被子植物、単子葉植物および双子葉植物を含む広範囲の植物種中に遺伝子構築物を移動するためのいくつかの方法が当技術分野で知られている(例えば、GlickおよびThompson(1993)、Birch(1997)およびForester他(1997)を参照)。木の再生の総説については、Dunstan他(1995)を参照されたい。

得られる形質転換植物は、当技術分野でよく知られている方法を用い、有性生殖的または無性生殖的に再生し、代々のトランスジェニック植物を得ることができる。

本明細書中で提供されるヌクレオチド配列情報は、例えば、他の生物体または組織、特に植物から核酸変異体を確認するため、およびＭｄａｍｙ１０もしくはＭｄａｍｙ１１、またはデンプン含量が変調される植物を作製するための加速育種プログラムで植物を有用にならしめるそれらの等価体に変異を持つ植物を予め選択するためのプログラムにも有用である。より具体的には、本明細書中で提供されるヌクレオチド配列情報を用い、Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、またはそれらの変異体を探索または増幅するためのプローブおよびプライマーを設計することができる。プローブまたはＰＣＲで使用するオリゴヌクレオチドは、長さが約30個以下のヌクレオチドであってもよい。一般に、具体的なプライマーは、長さが14個以上のヌクレオチドである。最適な特異性および対費用効果から、長さ16〜24個のヌクレオチドのプライマーが好ましい。当業者は、ＰＣＲなどのプロセスで使用するためのプライマーの設計に精通している。

必要に応じて、探索は、本明細書に開示された遺伝子の全制限断片について行うことができる。当然、図２に基づく配列またはそれらの相補体を用いてもよい。

このようなプローブおよびプライマーも、本発明の諸態様を形成する。

本発明によって提供される配列情報を用い、任意の種から本発明のポリヌクレオチドの変異体を見いだすための方法には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング、ＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムライブラリのスクリーニングならびにＥＳＴ、ｃＤＮＡおよびゲノムデータベースのコンピュータ支援検索が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような方法は、当業者によく知られている。

次に、以下の非限定的実験を参照しながら本発明を例示する。

（実験）
材料および方法
本研究で使用したオリゴヌクレオチド：
配列は、５’から３’末端までとする：

植物材料の試料採取
成熟リンゴ果実(Malus x domestica)は、ニュージーランドのオークランドにおいて成熟したリンゴの木から収穫した。これらの果実は、標準的な市販の箱に入れ、４℃で８日間貯蔵した。組織試料を採取し、直ちに液体窒素中で冷凍し、ＲＮＡの抽出に使用するまで-80℃で保存した。

ＲＮＡ抽出
組織２ｇ(葉、花、熟していない果実)〜10ｇ(熟果)を液体窒素中で粉砕し、加熱した溶解緩衝液15ｍＬに加え、Langenkamper他(1998)の方法に従ってＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、標準方法でｍＲＮＡから調製した。

ＥＳＴ遺伝子構築物およびシークエンシング
ｃＤＮＡは、標準的なライブラリベクター、例えばLambda Zap ２およびLambda Zap Express(Stratagene)中にクローニングした。個々のクローンを切除し、標準方法を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、標準方法で５’末端と３’末端の両方からのシークエンシングにより配列を決定し、知られている配列に対して設計されたＰＣＲプライマーを用い、中間の配列を標準方法で決定した。

５’ＲＡＣＥ(ｃＤＮＡ末端の迅速増幅)
５’ＲＡＣＥは、その時点でＭｄａｍｙ１０配列のいわゆる５’末端に位置する３種のＭｄａｍｙ１０特異的プライマーＳＰ１、ＳＰ２、およびＳＰ３を用い、リンゴの花芽からのＲＮＡに対して行った。３種のプライマーは、Ｍｄａｍｙ１０コーディング配列の逆相補体(reverse-complement)であり、入れ子構造である。ＳＰ１は、最も大きい３’配列であり、ＳＰ３は最も大きい５’配列である。

ＳＰ１を用い、Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen)により42℃において30分間行われる初期逆転写ステップを行った。産物をＲＮａｓｅ Ｈで消化し、次いで、ＰＣＲ精製キット(Qiagen)により精製し、末端転移酵素およびｄＡＴＰによりポリＡテールを付加させた。第１回のＰＣＲは、ＳＰ２およびＲＡＣＥオリゴｄＴプライマーを用い、Expand Hi-Fidelity酵素(Roche)により行った。得られた混合物を、Qiagen PCR精製キットにより再度精製し、次いで最終回のＰＣＲにはテンプレートとしてＳＰ３およびＲＡＣＥ１プライマーを用いた。５’ＲＡＣＥの産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ(Promega)中にクローニングし、シークエンシングを行った。

Arabidopsis α−アミラーゼ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ：
Arabidopsis ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅ Ｉ(Roche)で処理し、プライマー対Ａｔａｍｙ１エキソン３(Ｆ／Ｒ)、Ａｔａｍｙ２エキソン５(Ｆ／Ｒ)、およびＡｔａｍｙ３エキソン８(Ｆ／Ｒ)を用い、Titan One Tube RT-PCR System(Roche)を用いて増幅させた。これらのプライマー対は、ドメインＢ内のそれぞれArabidopsis遺伝子Ａｔａｍｙ１、Ａｔａｍｙ２、およびＡｔａｍｙ３を増幅する。反応混合物を42℃で30分間インキュベートし、30回の標準ＰＣＲサイクリング条件に供した。

他の植物種からのファミリー３遺伝子配列の増幅
マツの木の針葉(Pinus radiata)；発芽中のジャガイモの塊茎（Solanum tuberosum）；発芽中のタマネギの鱗茎(Allium cepa)；バラの花びら(Rosa woodsii)；オリーブの葉(Olea europaea)；コーヒーの葉(Coffea arabica)；バナナの葉(Musa acuminata)；およびマンゴーの果実(Mangifera indica)を含む多くの植物組織からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出は、製造者の使用説明書に従い、Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen)により行った。ワタ(Gossypium hirsutum)からのＤＮＡは、John Lunn博士(CSIRO Plant Industry、Canberra、Australia)から提供された。

ＰＣＲは、プライマーＮｅｗＵＮＩｆ２およびＮｅｗＵＮＩｒ２を用い、Expand Hi-Fidelity酵素(Roche)で行った。これらの縮重プライマーは、広範囲の種からファミリー３遺伝子のみを増幅するため、Ａｔａｍｙ３、Ｍｄａｍｙ１０、およびＯｓａｍｙ１０のアラインメントから設計した。ＰＣＲの産物をｐＧＥＭ(登録商標)−Ｔ Ｅａｓｙ(Promega)中にクローニングし、配列決定を行った。

配列情報のコンピュータ分析：
コンピュータ分析は、Wisconsin Package Version10.1(Genetics Computer Group(GCG)、Madison、Wisc.)を用いて行った。配列同一性は、NeedlemanおよびWunsch(J.Mol.Biol.、48巻、443〜453頁、1970年)のアルゴリズムを用いる２つ１組のアラインメントプログラムＧａｐを用いて算出した。デフォルトパラメータは、Ｇａｐ開始ペナルティ50(ヌクレオチド入力の場合)または８(アミノ酸入力の場合)、およびＧａｐ伸長ペナルティ３(ヌクレオチド)または２(アミノ酸)を用いた。アミノ酸配列アラインメントは、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(Thompson他、1994)を用いて行い、プログラムGeneDoc(NicholasおよびNicholas、1997)を用いて整理し陰影をつけた。

ファミリー３ α−アミラーゼの細胞下局在化の予測
Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３、およびＯｓａｍｙ１０の細胞下局在化は、Center for Biological Sequence Analysisのサーバを用いて予測した(http：//www.cbs.dtu.dk/services/)。最初に、プログラムTarget P(Emanuelsson他、2000)を用い、タンパク質のターゲティングを予測した。次いで、プログラムChloro P(Emanuelsson他、1999)を用い、各タンパク質についてプラスチドを標的とするシグナルの長さを予測した。

植物およびEscherichia coliにおける発現用のプラスミドの遺伝子構築物
HortResearch EST遺伝子構築物「62629」から、Ｍｄａｍｙ１０配列をクローニングまたは増幅した。ＧＦＰ融合遺伝子構築物は、ｓｍＧＦＰをコードする遺伝子を有する(DavisおよびVierstra、1998)プラスミドｐＤＳ−ＧＦＰ−ＡＲＴ７中に、ＣａＭＶ ３５ＳプロモーターによってＰＣＲ産物をクローニングすることにより作製した。遺伝子のＡＴＧ開始を含むフレーム内のＫｐｎＩ部位と共に、ｓｍＧＦＰ遺伝子の上流にあるＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を残すように、ｓｍＧＦＰ遺伝子をｐＤＳ−ＧＦＰ−ＡＲＴ７中にクローニングした。E.coli発現ベクターは、ベクターｐＥＴ−３０ａおよびｐＥＴ−３０ｂ(Novagen)において作製した。

ＰＣＲを用い、ｓｍＧＦＰとの融合のために断片「ｃＴＰ」および「ＳＢＤ」を増幅させた。ｃＴＰ(プラスチドを標的とするペプチド)産物は、コーディング配列の５’末端に位置し、Ｍｄａｍｙ１０のＡＴＧ開始の上流にＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、クローニングを容易にするプライマーＡｍｙｔｅｎ１２−Ｘｈ；およびＡＴＧ開始部位の約300ｂｐ下流に位置し、Ｍｄａｍｙ１０のオープンリーディングフレームを含むフレーム内にＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むプライマーＡｍｙｔｅｎ１３ｒ−Ｋｐを用いて増幅させた。この増幅された領域は、Ｍｄａｍｙ１０のプラスチドを標的とするシグナルに加え、そのシグナルに続く35個の別のアミノ酸をコードする。

「ＳＢＤ」(デンプン結合ドメイン)産物は、ｃＴＰ産物の場合と同じプライマーであるプライマーＡｍｙｔｅｎ１２−Ｘｈ、およびＡＴＧ開始部位の約1250ｂｐ下流に位置し、Ｍｄａｍｙ１０のオープンリーディングフレームを含むフレーム内にＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むプライマーＡｍｙｔｅｎ１４ｒ−Ｋｐ(このプライマーは、Ｍｄａｍｙ１０配列に見いだされる天然に存在するＫｐｎＩ部位を除去する)を用いて増幅させた。この増幅された領域は、推定上のｃＴＰに加え、推定上のデンプン結合ドメインモチーフ対の両コピーをコードする。

ＰＣＲ後、両産物をｐＧＥＭ(登録商標)−Ｔ Ｅａｓｙ(Promega)中にクローニングし、ＸｈｏＩ(New England Biolabs)およびＫｐｎＩ(Roche)制限エンドヌクレアーゼによる消化によって切除した。次いで、制限産物を、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩによって同様に消化されたｐＤＳ−ＧＦＰ−ＡＲＴ７中にクローニングした。得られたプラスミドをｐｃＴＰ−ＡＲＴ７およびｐＳＢＤ−ＡＲＴ７と名付けた。これら２つの遺伝子構築物の発現領域は、ＮｏｔＩによる消化と、続くＮｏｔＩによって切断されているベクターｐＡＲＴ２７中へのクローニングにより切除した。これにより、最終発現ベクターｐｃＴＰ−ＡＲＴ２７およびｐＳＢＤ−ＡＲＴ２７が作製された。

制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩによる消化によって、ＥＳＴ遺伝子構築物62629からＭｄａｍｙ１０を除去した。これにより、ｃＤＮＡのｃＴＰエンコーディング領域および他の13個のアミノ酸を含むＭｄａｍｙ１０コーディング配列のうち最初の220ｂｐが除去された。この断片を、同じ酵素を用いて切断されたｐＥＴ−３０ａ中にクローニングし、遺伝子構築物ｐＡｍｙ１０ＥＴ−３０ａを作製した。これにより、Ｍｄａｍｙ１０のＮ末端に、Ｈｉｓ₆タグを含む短いペプチドが付加され、ニッケルイオン親和性精製が可能となった。

ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を用い、ｓｍＧＦＰをｐＤＳ−ＧＦＰ−ＡＲＴ７からｐＥＴ−３０ｂ中にクローニングした。このように、Ｍｄａｍｙ８−ＧＦＰ融合物(Ｎｔｅｒｍ−ＧＦＰ)もｐＥＴ−３０ｂ中にクローニングした。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を用い、ＳＢＤ−ＧＦＰをｐＳＢＤ−ＡＲＴ２７からｐＥＴ−３０ａ中にクローニングし、それによって遺伝子構築物からｃＴＰドメインを除去した。もう１度、すべてのクローニング戦略により、発現したタンパク質のＮ末端にＨｉｓ₆タグを付加した。

適格なAgrobacterium tumefaciensGV3101の調製
ゲンタマイシン25μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上で増殖させたAgrobacteriumの単一コロニーを用い、やはりゲンタマイシン25μｇ／ｍＬを含有する液体ＬＢ培地100ｍＬに播種した。培養物は、28℃のインキュベーター中、200ｒｐｍで振盪しながら48時間インキュベートした。遠心分離(４℃において3800×ｇで５分間)により細胞を収集し、氷冷した10％グリセロール50mlに再懸濁した。グリセロール中で細胞をさらに２回洗浄し、最終的に、氷冷した10％グリセロール１ｍＬに再懸濁し、微量遠心管に45μＬずつ等分した。アリコートは、-80℃で保存した。

Agrobacterium tumefaciensGV3101の形質転換
適格なAgrobacterium細胞のアリコート45μＬを氷の上で徐々に解凍した。各アリコートにプラスミドＤＮＡ50〜200ｎｇを加えて穏やかに混ぜ、次いで細胞／プラスミド混合物40μＬを、予冷した電気穿孔キュベット(ギャップ0.2cm、Bio-Rad)中にピペットで取った。以下の設定で、BioRad GenePulserを用い、細胞を電気穿孔した。
電圧：２．５ ｋＶ
キャパシタンス：２５ μＦｄ
抵抗：４００ Ｏｈｍｓ
パルスの時定数は、通常７〜９ｍｓとした。

ＬＢ培地１ｍＬを加えることにより、細胞を直ちに回収し、次いで滅菌15ml遠心管中にデカントし、振盪しながら(60ｒｐｍ)室温でインキュベートした。２時間後、形質転換細菌10μＬおよび100μＬを、リファンピシン(10μｇ／ｍＬ)；ゲンタマイシン(25μｇ／ｍＬ)；およびスペクチノマイシン(100μｇ／ｍＬ)を含有する別々のＬＢプレート上に広げ、次いで28〜30℃で48時間増殖させた。

Nicotiana benthamiana葉の一過性形質転換
形質転換は、Hawes他(2000)の方法によって行った。Agrobacterium tumefaciensは、リファンピシン(10μｇ／ｍＬ)；ゲンタマイシン(25μｇ／ｍＬ)；およびスペクチノマイシン(100μｇ／ｍＬ)を含有するＬＢ培地の培養液５ｍＬ中で48時間増殖させた。細胞を遠心分離によって集め、浸透(infiltration)培地(50ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ 5.6、0.5％(ｗ／ｖ)グルコース、２ｍＭ Ｎａ₃ＰＯ₄、100μＭアセトシリンゴン(200ｍＭ DMSOストックから新たに加える))に再懸濁して最終ＯＤ₆₀₀を0.5〜0.6とした。N.benthamiana葉の裏面上の気孔から、「鈍い」１ｍＬ注射器(すなわち、針を取り付けない)を用いて細菌懸濁液を注入した。葉を切り取り、室温で２〜３日間、暗く湿った条件に保った。

鏡検
Olympus Vanox AHBT３顕微鏡を用い、葉の試料を調べた。蛍光は、２種類のフィルタセットのうち１種類を用いて検出した。
ＵＶフィルタセット−OlympusコードBH2-DMU：励起 320〜380ｎｍ、発光 420ｎｍ。
ＧＦＰ植物−OmegaフィルタセットXF100−2：励起 455〜495ｎｍ、発光 515〜560ｎｍ。

E.coliにおけるタンパク質の発現
製造者の使用説明書に従い、すべてのｐＥＴ−30ベースの発現ベクターを、発現用BL21 CodonPlus RIL細胞(Stratagene)中に形質転換した。単一コロニーをプレートから選別し、カナマイシン30μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール50μｇ／ｍＬを含有する２ＹＴ培地(16ｇ／Ｌバクトトリプトン、10ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７)15mLに播種するのに用いた。培養液を、激しく振盪しながら(150ｒｐｍ)37℃で一夜増殖させた。15ｍＬの培養液のうち各５ｍＬを用い、１Ｌフラスコ中の２ＹＴ(カナマイシン30μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール50μｇ／ｍＬを含む)の330ｍｌアリコート３個のうちの１個に播種した。培養液のＯＤ₆₀₀が〜1.0に達するまで37℃で３〜４時間振盪させ、次いでフラスコおよびインキュベーターを18℃まで冷却し、ＩＰＴＧを最終濃度0.5ｍＭまで加えることにより発現を誘導した。振盪を継続して18℃でさらに24時間、細胞を増殖させた後、収集した。

E.coli細胞からの可溶性タンパク質の抽出
細胞は、遠心分離(2500×ｇで10分間)により収集した。次いで、培養液１Ｌからの細胞を、適切な緩衝液20ｍＬに再懸濁した。α−アミラーゼ活性ゲルの場合、細胞は、活性緩衝液(100ｍＭ Hepes ｐＨ 7.5、５ｍＭ酢酸カルシウム、10ｍＭ ＤＴＴ)に再懸濁した。ＧＦＰ遺伝子構築物は、結合緩衝液(５ｍＭイミダゾール、0.5Ｍ ＮａＣｌ、20ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ7.9)に再懸濁した。すべての緩衝液には、緩衝液50ml当たり１個の、ＥＤＴＡを含まない完全プロテアーゼ阻害薬錠剤(Roche)を入れた。

細胞懸濁液20ｍＬを12,700 psiの圧力でFrench Pressure Cell Press(American Instrument Co.Inc.、Silver Spring、Maryland、USA)に２回通過させることにより、細菌細胞を溶解した。12000×ｇで20分間、ライセートを遠心分離し、次いで孔径0.45μｍのフィルタに通した。得られた上清を、粗製抽出物と名付けた。

粗製抽出物からの組み換えタンパク質の部分精製
α−アミラーゼ緩衝液で行われたタンパク質抽出物については、粗製抽出物約10ｍＬを、結合緩衝液により予め平衡化されたＰＤ−１０ゲル濾過カラムにかけた。ＧＦＰ試料は、緩衝液交換の対象としなかった。精製は、ＮｉＳＯ₄を充填した５ｍＬのHi-Trap Chelating HPカラム(Amersham-Pharmacia Biotech)で行った。抽出物10ｍＬをカラムにかけ、製造者の使用説明書に従って洗浄した。組み換えタンパク質は、溶出緩衝液(１Ｍイミダゾール、0.5Ｍ ＮａＣｌ、20ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ 7.9)により2.5ｍＬの分画中に溶出された。α−アミラーゼおよびｐＥＴ−３０ａは、ＰＤ−１０カラムを用いて活性緩衝液中へ直ちに交換した。

タンパク質試料の変性ゲル電気泳動およびウエスタン分析
タンパク質精製ステップからの粗製抽出物および特定の分画を、10％ポリアクリルアミド分離用ゲルおよび４％ポリアクリルアミド濃縮用ゲルからなるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で標準手順より分析した。電気泳動後、ゲルは、コロイド状クーマシータンパク質染色法で染色するか、セミドライ電気泳動によりImmobilon−Ｐ ＰＶＤＦ膜(Millipore)に転写した。Ｈｉｓ₆モチーフの検出については、ブロットを、抗Ｈｉｓ₆モノクローナル抗体(Roche)と、続いて抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ(Stressgen)二次抗体と共にインキュベートした。ＧＦＰモチーフの検出については、ブロットを、抗ＧＦＰポリクローナル抗体、ＩｇＧ分画(Molecular Probes)と、続いて抗ウサギＩｇＧ−二次抗体と共にインキュベートした。両タイプのブロットは、１−ＳＴＥＰ(商標)ＮＢＴ／ＢＣＩＰアルカリホスファターゼ検出試薬(Bio-Lab laboratories)を用いて検出した。

リンゴおよびArabidopsisからのタンパク質抽出
葉の試料は、12時間の照明サイクルの終わりに、リンゴの苗木およびArabidopsisの完全ロゼット植物から切り取った。葉を液体窒素中で冷凍し、乳鉢と乳棒を用いて粉砕し、次いで抽出緩衝液(50ｍＭ Hepes ｐＨ 7.8、５ｍＭ酢酸カルシウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭ ＤＴＴ、0.5％(ｗ／ｖ)ＰＶＰＰ)に加えた。次いで、２層のMiracloth(Calbiochem、La Jolla、CA.、USA)を通して試料を濾過し、14,000×ｇで10分間遠心分離した。上清を、ネイティブＰＡＧＥゲル上へ直ちに載せた。

ネイティブゲル電気泳動
タンパク質精製ステップからの粗製抽出物および特定の分画を、２タイプのネイティブＰＡＧＥゲルで分析した。デンプンゲルは、分離用ゲル中に２％のアミロペクチンを含んでいた。10ｍＡの定電流で16〜20時間、試料を電気泳動させ、電気泳動後、ゲルを蒸留水で洗浄し、活性緩衝液２(50ｍＭ Hepes ｐＨ 7.8、５ｍＭ酢酸カルシウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭ ＤＴＴ、２０(g／ｍＬシクロヘキシミド)中で24時間インキュベートした。デンプン加水分解は、ヨウ素溶液(180ｍＭヨウ化カリウム、50ｍＭヨウ素)による染色と、続く固定液(30％メタノール、５％酢酸)による脱染により検出した。デンプンゲルをSaranプラスチックラップで覆い、４℃で保存した。

また、20ｍＡの定電流で３〜４時間、アミロペクチンを含まないネイティブＰＡＧＥゲルでも試料を分析した。次いで、活性緩衝液２を使用するキャピラリブロッティングにより、２％アミロペクチンを含有する分離用ゲル中にタンパク質を移した。一夜移動後、アミロペクチン含有ゲル(デンプン移動ゲルと呼ぶ)を洗浄し、活性緩衝液２中でさらに24時間インキュベートした。染色、脱染および保管は、デンプンゲルの場合と同様に行った。

結果
リンゴからのＭｄａｍｙ１０遺伝子の同定：
リンゴからのα−アミラーゼ遺伝子を確認するため、多くの様々なリンゴ組織に由来する配列を含むＥＳＴデータベースを、知られているリンゴα−アミラーゼ遺伝子Ｍｄａｍｙ８(Wegrzyn他、2000)のコーディング配列と比較した。HortResearchデータベース内で発見されたα−アミラーゼ様配列の大部分は、これまで特徴が明らかにされていないα−アミラーゼ遺伝子(2000年７月17日に初めて確認された)に一致した。この遺伝子の転写物は、花芽、花弁、熟していない果実および熟した果実のライブラリを含む多くの組織ライブラリ中に存在する。Genbankデータベースに対するBlast検索は、Arabidopsisからの推定上のα−アミラーゼ、ならびにArabidopsis、Lycopersicon esculentum(トマト)、Medicago truncatula、Glycine max(ダイズ)、Solanum tuberosum(ジャガイモ)およびPinus taeda(テーダマツ)を含む様々な植物からの多くのＥＳＴとのマッチを示した。出願人らがＭｄａｍｙ１０と名付けたこのα−アミラーゼの完全長ｃＤＮＡ配列は、部分ＥＳＴからの重複配列の確認に加えて、単一完全長ＥＳＴクローン、ＥＳＴ62629のシークエンシングによって得られた。Ｍｄａｍｙ１０のコーディング領域は、長さが2706ｂｐであり、901個のアミノ酸をコードする。Ｍｄａｍｙ１０の最後の400個のアミノ酸は、Ｍｄａｍｙ８(46％)とVigna mungoからのα−アミラーゼ、ａｍｙＶｍ１(48％)の双方と適度の同一性を示す。しかしながら、最初の500個のアミノ酸は、特徴が明らかにされているどのα−アミラーゼにも見いだされない(図1)。

リンゴにおけるＭｄａｍｙ１０の相同体の同定：
Ｍｄａｍｙ１０の５’領域とマッチしたリンゴＥＳＴ配列は、79％のヌクレオチド同一性を示し、長さが900個しかないヌクレオチドである完全長ｃＤＮＡに由来するもののみであった(図1)。転写物は、Ｍｄａｍｙ１０の３番目のイントロン(表1)の等価体が転写物からスプライスされていないことを除いては、Ｍｄａｍｙ１０の遺伝子相同体の産物であるように見える。これが、３番目のイントロンにおける転写物の切断およびポリアデニル化をもたらし、切断型タンパク質が生じた可能性がある。我々は、転写物Ｍｄａｍｙ１１を試みに標識化した。

我々は、Ｍｄａｍｙ１１配列のさらに２つの断片を得ている。１番目は、ゲノムＤＮＡからのわずかに異なるサイズ(1028ｂｐおよび831ｂｐ)の２個の産物を増幅させた、Ｍｄａｍｙ１０ｃＤＮＡ配列に対して設計されたプライマー対により産生される。これらの断片は、極めて類似したエキソン配列(ヌクレオチドレベルとアミノ酸レベルの双方で95％の同一性)を有し、各々は、同一位置に見いだされる３個のイントロンを含んでいた。しかしながら、２つの断片のイントロンは、配列(ヌクレオチドレベルで80％の同一性)およびサイズ(合計602ｂｐに対し405ｂｐ)が著しく異なる。大きな断片(したがって、大きなイントロン)はＭｄａｍｙ１０に由来し、小さな断片は、Ｍｄａｍｙ１１に由来すると推定される。この配列は、α−アミラーゼドメインの３’末端に近接しているため、Ｍｄａｍｙ１１転写物とは重複しない(図1)。

最後の追加断片は、リンゴの花芽ＲＮＡからのＭｄａｍｙ１０の５’ＲＡＣＥ(ｃＤＮＡ末端の迅速増幅)中に単離された。600ｂｐの領域がＭｄａｍｙ１０からの配列と重複し、重複95ｂｐのうち６ｂｐは一致しない。当初、これらは、ＥＳＴ遺伝子構築と５’ＲＡＣＥの双方から蓄積された配列エラーであると考えられたが、５’ＲＡＣＥを用いてこの領域の上流へ続ける試みは失敗した。最後に、完全長EST62629からの配列は、５’ＲＡＣＥ断片の領域に達し、ヌクレオチドレベルで86％の同一性を共有するに過ぎないことが分かった。５’ＲＡＣＥ断片は、Ｍｄａｍｙ１０配列コンティグから自動的に除去された。この断片は、ここまでのＭｄａｍｙ１１配列のいずれとも重複しないが、Ｍｄａｍｙ１０の新規Ｎ末端ドメインおよびα−アミラーゼドメインの接合部に対応している(図1)。

Ｍｄａｍｙ１１のこれら３個の断片を合わせると、Ｍｄａｍｙ１０の全コーディング配列の61％を占め、これらの領域における２つの遺伝子間のアミノ酸同一性は86％である。同一性は、Ｎ末端ドメインにおける(79％)よりＣ末端(α−アミラーゼ)ドメインにおいて(96％)はるかに大きかった。

ArabidopsisにおけるＭｄａｍｙ１０の相同体の同定：
Ａｔａｍｙ３は当初、ゲノム配列から予測され、TIGRによってGenbank中にアノテーションされた。アノテーションは、(他の植物α−アミラーゼでは約415個のアミノ酸であるのに比べ)826個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする長さ2478ｂｐのコーディング配列を示唆した。我々は、遺伝子スプライシングを予測するためEukaryotic GeneMark.hmm (LUKASHIN ＆ BORODOVSKY、1998)を用い、適切な染色体セグメントを再分析した。このアルゴリズムは、２個の余分なエキソンを含むためにサイズが887個のアミノ酸であるタンパク質を生じ(図5)、予測されるＭｄａｍｙ１０産物と68％の同一性を示す(図１)もっと大きな2661ｂｐのコーディング領域を予測した(図4)。Ｎ末端ドメイン(図５における太字および下線部)は、Ｍｄａｍｙ１０に対し56％の同一性を有し、タンパク質の残りは、Ｍｄａｍｙ１０に対し82％の同一性を有している。ポリヌクレオチド配列は、70％の同一性を示す。

我々の配列予測は、2001年８月21日にGenbankで公表された(アクセッションAY050398)Salk Institute、CA.におけるＡｔａｍｙ３ ｃＤＮＡクローンのシークエンシングによって裏付けられた。Ａｔａｍｙ３は、染色体１(BAC T17F3)上に位置する。Blast検索からは、Arabidopsisゲノム中にその他のファミリー３ α−アミラーゼ遺伝子は得られなかった。

コメ(Oryza sativa)におけるＭｄａｍｙ１０の相同体の同定：
Ｏｓａｍｙ１０は当初、ＢｌａｓｔＰプログラムを用い、クエリー配列としてＭｄａｍｙ１０を用いてgenbank非冗長データベースを検索することにより発見された。この配列は、「推定上のα−アミラーゼ」として、コメゲノム研究プログラムのメンバーによってGenbank中にアノテーションされた。コーディング配列は、ゲノム配列から予測された(アクセッションAP003408-2002年５月23日)。Ａｔａｍｙ３と同様に、我々は、遺伝子スプライシングを予測するためEukaryotic GeneMark.hmmを用い、適切な染色体セグメントを再分析した。これは、遺伝子のミスアノテーション、すなわち、実際はイントロンの一部である99ｂｐＤＮＡセグメントが含まれることを示した(これは、Ａｔａｍｙ３の相対的なイントロン位置を比較することによって裏付けられた)。Eukaryotic GeneMark.hmmにより予測された配列は2619ｂｐであり(図6)、873個のアミノ酸をコードする(図１および７)。ポリヌクレオチド配列は、Ｍｄａｍｙ１０に対して63％の同一性を示す。タンパク質配列は、その全長にわたりＭｄａｍｙ１０に対して61％の同一性を示すが、Ｎ末端ドメイン(図７における太字および下線部)は、Ｍｄａｍｙ１０に対し44％の同一性を有するに過ぎず、タンパク質の残りは、Ｍｄａｍｙ１０に対し80％の同一性を有している。

他の植物種からのゲノム配列：
縮重プライマーによりＰＣＲを行い、多くの植物種のゲノムＤＮＡからのファミリー３配列を増幅させた。図10は、ＰＣＲの結果を示している。タマネギ以外のすべてのＤＮＡ試料は、プライマー対によるＭｄａｍｙ１０ ｃＤＮＡの増幅から予想される産物のサイズである約320ｂｐの分子を産生した。これらの産物のうちいくつかのクローニングおよびシークエンシングは、それらがＭｄａｍｙ１０ ｃＤＮＡ配列であり、おそらくエアロゾル汚染によって引き起こされることを裏付けた。この産物が豊富にあることによって、試料中の他のＰＣＲ産物のクローニングが阻害されたが、その後の実験は、汚染源を特定し、かつ／または除去できなかった。

大部分のＤＮＡ試料は、320ｂｐバンドより大きな、少なくとも１個の他のＤＮＡ分子を産生した。書き込み時に、これらの産物のうち、以下の３個のみが首尾よくクローニングされた。バラからの約800ｂｐの産物(部分的にのみ配列決定)(図10、レーン４)、コーヒーからの962ｂｐの産物(図10、レーン６)、およびワタからの808ｂｐの産物(図10、レーン９)。３個の配列はすべて、単一のイントロンを含み、これが、様々な種の産物間のサイズの差のほとんどすべてを占めている。各イントロンの位置は、３個の産物間で保存され、Ａｔａｍｙ３の７番目のイントロン(表１のイントロン９)に対応している。このイントロン位置は、ファミリー１または２からのα−アミラーゼには見いだされない。ファミリー１およびファミリー２の保存位置に見いだされるイントロンは存在しない。

３個の断片はすべて、これまでに特徴が明らかにされているα−アミラーゼのドメインＡおよびＢの一部をコードするα−アミラーゼ遺伝子の領域を包含している(図１)。イントロンは、配列から除去され、得られたセグメントは、予想されるポリペプチドに翻訳された。３種のα−アミラーゼファミリーの代表例である、Ｍｄａｍｙ１０(ファミリー３)、Ｍｄａｍｙ８(ファミリー２)、およびＡｍｙＶｍ１(ファミリー１)について、ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列をアラインメントした。各対間の同一性の程度を、百分率で算出した(表４)。

３個の断片はすべて、特にアミノ酸レベルにおいて、他のファミリーからのα−アミラーゼに対するよりもＭｄａｍｙ１０に対して著しく高い同一性を示す。

植物におけるα−アミラーゼおよびα−アミラーゼ様遺伝子の構造：
植物α−アミラーゼの遺伝子構造は、これまでHUANG他(1990)において最も広く比較されている。このタイプ、しかし新たなArabidopsis、リンゴおよびコメα−アミラーゼ配列を用いて、分析を繰り返すことは、α−アミラーゼイントロン進化についてはるかに複雑な状況を生み出すことになる。これまでに配列決定されたα−アミラーゼ遺伝子は、多くても３個のイントロンを有する。一部の穀類遺伝子は、２番目のイントロンを失っているように見えるが(HUANG他、1990)、各イントロンの位置は、遺伝子間および種間で保存されている。

Ｍｄａｍｙ１０のイントロン／エキソン構造は、これまでに配列決定されたα−アミラーゼ遺伝子と著しく異なっている(表１)。この遺伝子は12個のイントロンを含み、これに比べると、特徴が明らかにされた他の植物α−アミラーゼは２または４個のイントロンを有する。Ａｔａｍｙ３のコーディング配列を遮断する12個のイントロンのうち、６個は、遺伝子のα−アミラーゼをコードする領域内(すなわち、３’側の半分)にある。ファミリー３ α−アミラーゼのどのイントロンも、ファミリー１ α−アミラーゼのイントロンに対応していない。

α−アミラーゼ様遺伝子の転写後プロセシング：
Ｍｄａｍｙ８転写物とは対照的に、Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１およびＡｔａｍｙ３はすべて、19ｂｐから46ｂｐの短い５’ＵＴＲを有しているように見える。しかしながら、Ｍｄａｍｙ１０は、557ｂｐまでの極めて長い３’ＵＴＲを有しており、４個の異なるポリアデニル化部位のうち１個は、428ｂｐという短い３’ＵＴＲを産生することができる。Ａｔａｍｙ３の３’ＵＴＲ配列は、220ｂｐであるに過ぎない。

植物α−アミラーゼの細胞下局在化：
すべてのファミリー３タンパク質は、プラスチドを標的とすることが確認され、プログラムＣｈｌｏｒｏＰ(EMANUELSSON他、1999)は、輸送ペプチド長として61個のアミノ酸(Ｍｄａｍｙ１０)、70個のアミノ酸(Ｍｄａｍｙ１１)、55個のアミノ酸(Ａｔａｍｙ３)および53個のアミノ酸(Ｏｓａｍｙ１０)を予測した。これをテストするため、Ｍｄａｍｙ１０のプラスチドを標的とする配列を、緑色蛍光タンパク質と融合させ、N.benthamianaの葉で一過性に発現させた。ＧＦＰ局在化のパターンをＧＦＰ単独と比較した。

ＧＦＰは、上皮細胞のサイトゾル(図11)と、核にも(上皮細胞の中心に見える、左上のパネル、図11)局在化するが、細胞容積の中心となる液胞には局在化しない。それに比べ、ｃＴＰ−ＧＦＰ融合物は、各細胞内の円盤状の形をした多数の細胞小器官に局在化する(図11、右上および下のパネル)。各ディスクは、最大で約４μｍの直径を有し、それに比べると、核の直径は約10μｍである。同じ細胞小器官は、ＵＶ照明の下でクロロフィル自己蛍光(赤色)を示し(図11、右上のパネル)、それらが葉緑体であることが確認される。ＧＦＰおよびクロロフィルの同時局在化は、オレンジ色／黄色(ＵＶ照明の下でのみ)として現れる。

Ｍｄａｍｙ１０の大部分のＮ末端ドメイン(ｃＴＰを含む)を含み、ＧＦＰと融合させた第２の融合遺伝子構築物ＳＢＤ−ＧＦＰを作製した。これもまたN.benthamianaの葉で発現させたが、検出可能な蛍光を生じなかった。これがＧＦＰの不適切な折りたたみによるものか、植物細胞におけるタンパク質の分解のためであるかは不明であった。我々は、抗ＧＦＰ抗体を用いる免疫学的検出によって融合タンパク質の局在化を判定しようと試みたが、ＧＦＰから有意なシグナルを一切検出できなかった。

E.coliにおけるＧＦＰ融合タンパク質の発現：
ｐＤＳ−ＧＦＰ−ＡＲＴ７、ｐＤＳ−Ｎｔｅｒｍ−ＡＲＴ７(Ｍｄａｍｙ８のＮ末端と融合したＧＦＰ)、およびｐＳＢＤ−ＡＲＴ７の挿入配列をｐＥＴ−３０ベクター中に移し、E.coli中で発現させた。Ｍｄａｍｙ１０のｃＴＰは、タンパク質の全体的な溶解性を増すことができるように、天然に存在するＥｃｏＲＩ部位においてＳＢＤ融合遺伝子構築物から除去した。ＩＰＴＧによる誘導後、培養物の試料を蛍光顕微鏡によって調べた。緑色の蛍光は３種のタンパク質すべてについて観察されたが、ｐＧＦＰ−ＥＴ−３０ｂは、他の２種の試料よりも強い蛍光を生じ、ｐＥＴ−３０ａ単独は、一切蛍光を生じなかった。このことは、培養液から抽出した可溶性タンパク質分画についても当てはまった。細胞の可溶性および不溶性分画で抽出物を作製し、試料を、図12に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析にかけた。

これらの分析は、ｐＧＦＰ−ＥＴ−３０ｂが、最も可溶性の高い完全長(31ｋＤａ)タンパク質を産生したことを示している。これは、最高レベルの蛍光に対応していた。ｐＮｔｅｒｍ−ＥＴ−３０ｂは、可溶性完全長タンパク質(78ｋＤａ)をほとんど産生しなかったが、ｐＳＢＤ−ＥＴ−３０ａは、少量の可溶性完全長産物(71ｋＤａ)を有していた。すべての融合タンパク質は、予想サイズよりもゲル上でわずかに大きく見える。ｐＳＢＤ−ＥＴ−３０ａによって産生されるタンパク質の大部分は、不溶性分画中に見いだされた。両融合遺伝子構築物は、より小さな可溶性産物を産生し、これは、ＧＦＰの分解産物であるか、融合遺伝子の内部開始に由来し、非融合ＧＦＰ分子の翻訳につながる可能性がある。このＧＦＰは、誘導培養に見られる蛍光を担うことができる。

E.coliにおけるα−アミラーゼＭｄａｍｙ１０の発現：
低温でE.coliにおいてＭｄａｍｙ１０タンパク質を発現させ、タンパク質を抽出してニッケルカラム上で部分的に精製した。精製タンパク質と未精製タンパク質の双方について、２％アミロペクチンを含有するポリアクリルアミドデル中に電気泳動させた。これらのゲルは、アミロペクチンに対する親和性に基づいてタンパク質を区別し、低親和性のタンパク質は、高親和性タンパク質以上に移動する。アミロペクチンと紫色のコンプレックスを形成するヨウ素でゲルを染色する。ゲル上の透明な領域は、基質の加水分解を示している(図13)。

ゲルは、加水分解活性を持つ多くの内因性E.coliタンパク質を示し、ｐＥＴ−３０ａを発現する細菌からのタンパク質抽出物中に認めることができる(図13でＸ、ＹおよびＺとラベルを付けた)。同じ内因性活性は、ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａを発現する細菌培養液において見ることができるが、濃縮用ゲルと分離用ゲルの境界の近くにも余分な２つのバンドが存在した(図13で１および２とラベルを付けた)。これらのバンドは、粗製タンパク質抽出物中にのみ見られ、ニッケルカラム上の脱塩または精製は、この活性の喪失をもたらした。

Ｍｄａｍｙ１０タンパク質の粗製抽出物を、リンゴおよびArabidopsisの葉からの全タンパク質試料と平行してデンプン移動ゲル上で調べた。この分析では、タンパク質は、デンプンに対する親和性よりむしろサイズおよび電荷に基づいて区別される。

図14は、ヨウ素で染色されたデンプン移動ゲルを示している。ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａを含むE.coliからの抽出物は、ｐＥＴ−３０ａ単独の対照には存在しないデンプン分解のバンドをゲルの中央に示す(図14でＡとラベルを付けた、レーン２および５)。同じサイズのかすかなバンドをリンゴの葉組織の抽出物に認めることができる(レーン３、図14)。デンプンゲルに見られる内因的なE.coli活性は、デンプン移動ゲルの最下端においてのみ見られたが、それらは、ネイティブＰＡＧＥゲルにおいて高い移動性を有するため、移動前にゲルから大部分が溶出してしまったのであろう。

我々は、様々なタンパク質分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続いて抗Ｈｉｓ₆抗体を用いるウエスタンブロッティングを行った(図15)。Ｍｄａｍｙ１０タンパク質にｐＥＴ−３０ａの６×Ｈｉｓタグを加えた予想サイズは99ｋＤａである。６×Ｈｉｓタグを持つ105ｋＤＡタンパク質は、ｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａ培養液中でのみ発現され、ニッケルカラム精製によって首尾よく回収された。予想タンパク質と発現タンパク質のサイズ間の差は、このようにサイズを決めるのに固有の不正確さによるのかもしれない。また、少量の二次産物も精製され、主なタンパク質のサイズは約55ｋＤａであった。この断片は、３番目の2.5ｍＬ溶出分画中に大部分が溶出したが、105ｋＤａタンパク質は、２番目および３番目の分画に溶出した。バンド２の強度が抽出物中の55ｋＤａタンパク質の量と関連しているように見えることから(データは示さず)、55ｋＤＡ産物は、デンプンゲルのＭｄａｍｙ１０レーンにおける下方のバンド(バンド２)の元と思われる(図13)。Ｍｄａｍｙ１０は、分解されるか置き換えられるというよりむしろ、生成中に不活性化されるようである。

植物におけるＭｄａｍｙ１０および相同体の発現プロファイル：
Ｍｄａｍｙ１０をコードするＥＳＴを以下の多種多様なリンゴ組織から配列決定した。
リンゴ果実のスキンピール、満開後日数(DAFB)が150日の木で熟した果実から。
リンゴ果実の皮質組織、150DAFBの木で熟した果実から。
熟していないリンゴ果実、10DAFB。
熟していないリンゴ果実、24DAFB。
0.5℃で24時間保存したリンゴ果実。
リンゴの木からの芽(spur bud)。
開く前のリンゴの花芽。
Venturia inaequalisに感染したリンゴの葉。

キーウィフルーツからのＥＳＴは、皮および内部皮質を含む熟果からのいくつかの組織と、割れつつある花芽にも見いだされた。単一ＥＳＴは、ブルーベリー(Vaccinium crymbosum)の皮から単離された。

Arabidopsisからの発育中の一連の組織に対し、いくつかのＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。実験は、３種のArabidopsis遺伝子の各々に特異的なプライマーを用い、各ファミリーの相対的発現を確かめた(図16)。

ＲＴ−ＰＣＲは、ArabidopsisにおけるＡｔａｍｙ１の発現レベルは極めて低いが(40回のＰＣＲ後に一部の組織で転写物が検出可能であった(データは示さず))、Ａｔａｍｙ２およびＡｔａｍｙ３は類似の発現レベルであるが異なる発現パターンを有していることを示している。Ａｔａｍｙ３発現は、成育中の茎の葉で最高であり、多くの他の組織(新生の子葉、丸ごとの苗木、および若い種子のさや)では中程度であった。

考察：
リンゴ遺伝子のシークエンシングおよび配列データベースの分析から、少数の非定型α−アミラーゼ配列が得られた。リンゴは、３つのファミリーに分類され、各々が２個の遺伝子を含む少なくとも６個の異なるα−アミラーゼ様遺伝子を有しているが、Arabidopsisは、各ファミリーに関して１個の代表例を有しているに過ぎない。リンゴは、潜在性の２倍体植物であり、すなわちリンゴは、各々が、自身の遺伝子の組および各α−アミラーゼファミリーからの１個の遺伝子コピーを持つ２個の先祖ゲノムの融合によって進化した。したがって、我々は、他のファミリー３遺伝子(Ｍｄａｍｙ１０)が完全に配列決定されていることから、Ｍｄａｍｙ１１による３つの配列断片がすべて単一遺伝子に由来すると仮定することができる。我々がキーウィフルーツからの配列断片に関して同じ仮定ができないのは、単一ファミリーの３個の遺伝子を完全に配列決定しなかったためである。

おそらく、各遺伝子ファミリー間の最も著しい差は、各遺伝子内のイントロン数およびそれらの相対的位置である。３種のファミリーの各々は、それぞれの特徴的なイントロン構造を有し、２個から12個のイントロンがどこかでコーディング配列を遮断している。ファミリー１および３は、共通のイントロン／エキソン境界を共有していないが、両者は、ファミリー２と境界を共有している。

我々の検討は、多くの植物種において様々な異なる組織でファミリー３ α−アミラーゼが発現されることを示した。最近の、A.thalianaにおける日周的および概日的に調節される遺伝子のマイクロアレイ分析(SCHAFFER他、2001)は、日周発現パターンを示す多くの転写物の１つとしてＡｔａｍｙ３からのＥＳＴを確認した。Ａｔａｍｙ３転写物は、ヘキソース輸送体とともに午後にアップレギュレートされ、早朝には再び抑制される。このパターンは、夜間に起きる、葉緑体におけるデンプンの日周性分解と、続く光合成組織からの糖の搬出に対応しており、予測されたＡｔａｍａｙ３のプラスチド局在化と整合している。Ｍｄａｍｙ１０についての発現パターンは具体的に探索されてこなかったが、多くの異なる組織におけるその存在は、ＥＳＴシークエンシングおよび一部の初期マイクロアレイ実験により立証されている。広範囲な植物からの情報は、ファミリー３α−アミラーゼが、光合成細胞(夜間)、成熟中の果実および春に破れる花芽を含む、プラスチド結合デンプンの分解に関与する植物組織中で発現されることを示唆している。

各遺伝子の５’および３’非翻訳領域は、転写後の調節に重要であり、おそらくｍＲＮＡ転写物の安定性または局在化を制御している可能性がある。コメα−アミラーゼ転写物の３’ＵＴＲは、糖が豊富にある場合、転写物を不安定化することにより、糖依存的にｍＲＮＡレベルを仲介することが分かった(CHANおよびYU、1998)。Ｍｄａｍｙ１０は、類似のｍＲＮＡ安定性要素を含む長い３’ＵＴＲを有する。

我々は、Ａｔａｍｙ３、Ｍｄａｍｙ１０、およびＯｓａｍｙ１０のＤＮＡ配列から設計した縮重プライマーを用い、いくつかの異なる植物種からのファミリー３遺伝子の配列を増幅することができた。コーヒー、ワタおよびバラからの配列はすべて、Ｍｄａｍｙ１０に対して高度な同一性を示し、各配列内における同一性の程度およびイントロンの位置に基づき、ファミリー３遺伝子に由来するのはほぼ確かである。図10に示す他のＰＣＲ産物もファミリー３α−アミラーゼに相当し、このファミリーが植物中に広範囲に分布する可能性は十分にある。このＰＣＲ断片をプローブとして用い、ソース生物体、ならびに関連生物種から完全長α−アミラーゼ配列を単離できる。また、品種改良における分子マーカーとして使用できる可能性もある。

Ｍｄａｍｙ１０は、E.coliにおいて首尾よく発現され、ネイティブゲル中でアミロペクチンを酵素的に分解する能力を有することが分かった。残念なことに、酵素の活性は、ニッケルイオン親和性クロマトグラフィによる精製で失われるように見える。粗製タンパク質抽出物は、アミロペクチン含有ゲル中を電気泳動させた場合には２つのＭｄａｍｙ１０特異的バンドを生じるが、ネイティブＰＡＧＥゲルからアミロペクチンゲル中に移動させた場合には、１つのバンドを生じるに過ぎない。デンプンゲル上に認められる下方のバンドは、部分的に分解された蛋白質によってもたらされた可能性がある。これに関するある程度の証拠が抗Ｈｉｓ₆抗体を用いるウエスタンブロットにおいて見られ、105ｋＤａのＭｄａｍｙ１０バンドよりわずかに遅れて小さな(55ｋＤａ)タンパク質が溶出する。５５ｋＤａのバンドは、Ｍｄａｍｙ１０タンパク質のＮ末端半分に相当し、Ｈｉｓ₆タンパク質タグを保持し、タンパク質のＣ末端部分が取り除かれているが、酵素的には依然として活性なままであると考えられる。Ｃ末端断片は、ニッケルイオン親和性クロマトグラフィによって精製されないようであり、抗Ｈｉｓ₆抗体によるウエスタンブロット上に現れないであろう。しかしながら、この断片の喪失は、(この断片を除去しないと思われる)ＰＤ−１０カラム上の脱塩により活性が失われることから、精製中に活性が失われる理由ではない。Ｃ末端断片は、ネイティブＰＡＧＥゲル上を完全長タンパク質よりも遠く移動すると思われ、デンプンゲル上に見られる内因性E.coli活性と一緒にゲルから溶出された可能性が十分にある。

デンプン移動ゲル上の第２活性バンドの欠如は、発現したＭｄａｍｙ１０タンパク質のプールがデンプンに対して均一な親和性を有していなければ説明できる可能性がある。これは、タンパク質のドメインのうち１個または複数の誤った折りたたみ、またはE.coliからの抽出前、抽出中、もしくは抽出後にタンパク質に対してなされた何らかの化学変化、例えばアミロペクチンと結合するのに重要なアミノ酸残基の酸化が原因である可能性がある。あるいは、Ｍｄａｍｙ１０タンパク質がアミロペクチンの存在下で多量体複合体を形成し、デンプンゲル内の移動性が低下し、複数の活性バンドを生じる可能性がある。また、デンプン移動ゲルは、E.coliにおいて発現したＭｄａｍｙ１０タンパク質と共移動するリンゴの葉に固有のデンプン分解活性が存在することを示している。

デンプンを分解するＭｄａｍｙ１０の能力は、これまでに特徴が明らかにされたα−アミラーゼ遺伝子との配列類似性とともに、Ｍｄａｍｙ１０が活性化α−アミラーゼであることをおおむね裏付けている。

植物細胞におけるＭｄａｍｙ１０−ＧＦＰ融合タンパク質の発現は、タンパク質のＮ末端が、N.benthamiana細胞の葉緑体へのＧＦＰ移入を行うことができるプラスチドを標的とするシグナルを含んでいることを立証することができた。このことは、タンパク質におけるこのようなターゲティングシグナルに関する以前のコンピュータ予測を裏付けている。他のファミリー３タンパク質における極めて類似したペプチド配列の存在は、ファミリー全体がプラスチドを標的としていることを示す。このことが有意義であるのは、植物内のデンプン貯蔵および分解の主要部位であるプラスチドを標的とするα−アミラーゼが他に報告されていないためである。

我々は、今回報告したファミリー３α−アミラーゼ(Ｍｄａｍｙ１０、Ｍｄａｍｙ１１、Ａｔａｍｙ３およびＯｓａｍｙ１０を含む)は、すべての形態のプラスチド結合デンプン、すなわち日周デンプンと貯蔵デンプンを共に分解することを担う酵素であると考えている。

（産業上の応用例）
主な態様では、本発明は、植物を含む生物体、および植物プラスチドのデンプン含量の変調における応用例を有している。本ファミリーのα−アミラーゼは、プラスチド結合デンプン、すなわち日周デンプンと貯蔵デンプンの双方の改変および分解に関与している。本発明を用い、植物を含む様々な態様の生物体を改変することができる。そのような態様には、デンプン含量、デンプン組成、デンプンポリマーのタイプ、糖度、熟成、構成(texture)、固形物含量、加工組織の粘度、冷害への抵抗力、プロセシング特性、木の品質および収量が含まれる。

トランスジェニック植物におけるデンプン分解の変調を対象とする本発明の方法が有用である商業的に価値のある方法の例には、
１）デンプン分解の阻害を必要とする、ジャガイモの塊茎における低温甘化(sweetening)の予防、
２）デンプン分解の阻害を必要とする、塊茎の発芽予防、
３）デンプン分解の阻害が、おそらく低温貯蔵の必要性のない果実の貯蔵の助けとなる、バナナ、リンゴ、キーウィフルーツ、パパイアおよびマンゴーなどのデンプン含有果実の貯蔵の改善、および
４）新たな成長のためのエネルギーを得るためにデンプン分解酵素の作用を必要とする休眠打破(および種子の発芽)
が含まれる。

本発明によるキメラ遺伝子構築物を用い、ワクチンのバイオファーミング、またはトランスジェニック植物においてプラスチドもしくは非プラスチドデンプンを改変するためのタンパク質のターゲティングを含む様々な目的で、プラスチドおよび／またはデンプン粒をキメラタンパク質の標的にすることができる。また、このような遺伝子構築物を用い、トランスジェニック植物のデンプン粒および／またはプラスチドを細菌、真菌、または藻類アミラーゼの標的とすることができる。また、本発明の配列を用いるＤＮＡシャフリングの機会も存在する。

本発明のα−アミラーゼは、知られているデンプン分解が必要とされる産業上の応用例で用いられることは言うまでもない。これには、動物飼料の加工、洗浄剤、飲食料品、繊維、ヘルスケアおよび醸造が含まれる。

また、産業上の応用例で使用するために、発酵プロセスまたは組み換え発現により、本発明のα−アミラーゼ、酵素の変異体またはデンプン結合ドメイン／モチーフを含むキメラタンパク質を生産する機会も存在する。例えば、本発明の遺伝子構築物を用い、廃棄物処理における植物デンプンのより効率的な分解のために、本発明の真菌アミラーゼおよびデンプン結合ドメイン／モチーフを含むキメラタンパク質を産生できる可能性がある。

さらに、本説明は一例として提供されているに過ぎず、本発明の範囲は本説明に限定されないことは当業者に理解されるであろう。

ファミリー３α−アミラーゼ配列とリンゴα−アミラーゼ８(Ｍｄａｍｙ８)との比較アラインメントを示す図である。 Ｍｄａｍｙ１０のヌクレオチド配列を示す図である。 Ｍｄａｍｙ１０のアミノ酸配列を示す図である。 Ａｔａｍｙ３のヌクレオチド配列を示す図である。 Ａｔａｍｙ３のアミノ酸配列を示す図である。 Ｏｓａｍｙ１０のヌクレオチド配列を示す図である。 Ｏｓａｍｙ１０のアミノ酸配列を示す図である。 ファミリー３α−アミラーゼのデンプン結合ドメインからのポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。 ファミリー３のα−アミラーゼのデンプン結合ドメインと、さらにジャガイモからのＲ１タンパク質(Genbank-CAA70725)、Arabidopsisからのその相同体、Ｓｅｘ１(Genbank-AAG47821)、およびArabidopsisからの推定上のデンプン枝作り酵素(SBE様)(Genbank-BAB02827)からのポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。 多くの植物種からのゲノムＤＮＡに対するプライマーＮｅｗＵＮＩｆ２およびＮｅｗＵＮＩｒ２によるＰＣＲの結果を示す図である。 N.benthamiana上皮細胞において発現されたGFP融合遺伝子構築物の蛍光顕微鏡画像を示す図である。 ｐＥＴ−３０ａをベースとするＧＦＰ構築物を含むＩＰＴＧ誘導E.coliからのタンパク質のSDS-PAGE(A)およびウエスタンブロット(B)を示す図である。 ヨウ素で染色されたアミロペクチン含有ゲル上のタンパク質試料を示す図である。 ヨウ素で染色されたデンプン移動ゲルを示す図である。 ｐＥＴ−３０ａおよびｐＡｍｙ１０−ＥＴ−３０ａプラスミドを含むＩＰＴＧ誘導E.coli由来のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(A)およびウエスタンブロット(B)を示す図である。 10種の異なる組織からのArabidopsisα−アミラーゼ転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す図である。

【配列表】

Claims (52)

1. プラスチドアルファ−アミラーゼを含む単離ポリペプチド。
2. 配列番号２のＭｄａｍｙ１０アミノ酸配列に由来する成熟配列を有する請求項１に記載の単離ポリペプチドまたは機能的に等価なその変異体。
3. 成熟配列が配列番号２の配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列に由来する請求項２に記載の単離ポリペプチド。
4. 成熟配列が配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列に由来する請求項２に記載の単離ポリペプチド。
5. 成熟配列が配列番号２の配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列に由来する請求項２に記載の単離ポリペプチド。
6. 配列番号２の配列に由来する成熟配列を含む請求項２に記載の単離ポリペプチド。
7. 配列番号２のアミノ酸配列を有するプラスチドを標的とするアルファ−アミラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドまたは機能的に等価なその変異体。
8. アミノ酸配列が配列番号２の配列と少なくとも７０％の同一性を有する請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
9. アミノ酸配列が配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
10. アミノ酸配列が配列番号２の配列と少なくとも９５％の同一性を有する請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
11. 配列番号２のアミノ酸配列をコードする請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
12. 配列番号１の配列を有する単離ポリヌクレオチドまたは機能的に等価なその変異体。
13. ポリヌクレオチドの配列が配列番号１の核酸配列に対し少なくとも７０％同一である請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
14. ポリヌクレオチドの配列が配列番号１の核酸配列に対し少なくとも９０％同一である請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
15. ポリヌクレオチドの配列が配列番号１の核酸配列に対し少なくとも９５％同一である請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
16. 配列番号１の配列すべてを含む請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
17. 配列番号１の配列のうち少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド。
18. 配列番号３のポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
19. 配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドまたは機能的に等価なその変異体。
20. 配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列を含む単離ポリヌクレオチド。
21. 配列番号５のアミノ酸配列をコードする単離ポリヌクレオチドまたは機能的に等価なその変異体。
22. 配列番号６のポリヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド。
23. 配列番号７、配列番号８、配列番号１０の残基１〜７０および配列番号５３の残基１〜５３から選択されるアミノ酸配列の、プラスチドを標的とするペプチドをコードするキメラタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドまたは機能的に等価なその変異体。
24. 下式に定義したポリペプチドモチーフ対のうち少なくとも１個の反復を含むポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
    

    

    ［式中、大文字は保存されたアミノ酸を表し、括弧内の文字は部分的に保存されたアミノ酸を表し、ｙは疎水性残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表し、［Ｘ］₄〜₆は連続した４〜６個の不特定のアミノ酸を表す。］
25. 下式に定義したポリペプチドモチーフ対のうち少なくとも１個の反復を含むキメラポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
    

    

    ［式中、大文字は保存されたアミノ酸を表し、括弧内の文字は部分的に保存されたアミノ酸を表し、ｙは疎水性残基を表し、Ｘは任意のアミノ酸を表し、［Ｘ］₄〜₆は連続した４〜６個の不特定のアミノ酸を表す。］
26. 請求項７から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
27. ５’−３’方向に、
    （ａ）プロモーター配列、
    （ｂ）請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームポリヌクレオチド、および
    （ｃ）終止配列
    を含む請求項２６に記載の遺伝子構築物。
28. コードされるポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２の配列を含む請求項２７に記載の遺伝子構築物。
29. オープンリーディングフレームがセンス配向である請求項２７に記載の遺伝子構築物。
30. オープンリーディングフレームがアンチセンス配向である請求項２７に記載の遺伝子構築物。
31. ５’−３’方向に、
    （ａ）プロモーター配列、
    （ｂ）請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の非コーディング領域または機能的に等価なその変異体、および
    （ｃ）終止配列
    を含む遺伝子構築物。
32. ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有し、非コーディング領域がアンチセンス配向である請求項３１に記載の遺伝子構築物。
33. ５’−３’方向に、
    （ａ）プロモーター配列、
    （ｂ）請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列のうち少なくとも１５個の残基と相補的なポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または機能的に等価な変異体、および
    （ｃ）終止配列
    を含む遺伝子構築物。
34. 請求項２６から３３のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
35. 請求項２６から３３のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
36. 植物のデンプン含量を変調するための方法であって、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現を増大または低減させることを含み、前記増大または低減は、遺伝子組み換えにより、プラスチドを標的とするアルファ−アミラーゼをコードする遺伝子の発現を変化させることによって行われる方法。
37. ポリペプチドが配列番号２の配列を有するポリペプチドを含む請求項３６に記載の方法。
38. 配列番号７のプラスチドを標的とするシグナルを含むポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物。
39. 植物におけるデンプン代謝を変えるための方法であって、
    （ａ）請求項２６から３３に記載の遺伝子構築物を植物中に導入すること、および
    （ｂ）植物中でポリヌクレオチドを転写的に発現させること
    を含む方法。
40. 植物におけるデンプン代謝を変えるための方法であって、
    （ａ）請求項２６から３３に記載のＤＮＡ遺伝子構築物を植物中に導入すること、および
    （ｂ）植物中でポリペプチドを発現させること
    を含む方法。
41. ５’−３’方向に、
    （ａ）プロモーター配列、
    （ｂ）付加的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに翻訳的に融合されている、請求項２３に記載のプラスチドを標的とするシグナルポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または機能的に等価なその変異体、および
    （ｃ）終止配列
    を含む遺伝子構築物。
42. プラスチドを標的とするシグナルポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が配列番号６の配列を含む請求項４１に記載の遺伝子構築物または機能的に等価なその変異体。
43. 本発明のプラスチドを標的とするシグナルポリペプチドが配列番号７の配列を含む請求項４２に記載の遺伝子構築物または機能的に等価なその変異体。
44. 請求項４１から４３に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
45. 請求項４１から４３に記載の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞。
46. デンプン結合ドメインポリペプチドをコードする請求項２４または２５に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物。
47. ５’−３’方向に、
    （ａ）プロモーター配列、
    （ｂ）付加的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに翻訳的に融合されている、請求項２４または２５に記載のデンプン結合ドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または機能的に等価なその変異体、および
    （ｃ）終止配列
    を含む遺伝子構築物。
48. デンプン結合ドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が配列番号５の配列を含む請求項４７に記載の遺伝子構築物および機能的に等価なその変異体。
49. 請求項４６から４８に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
50. 請求項４６から４９に記載の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物細胞、ならびにそのような細胞を含むトランスジェニック植物。
51. 配列番号４および配列番号５から選択されるペプチドが発現されないように遺伝子組み換えされた植物、または機能的に等価なその変異体。
52. 遺伝子構築物が配列番号１、配列番号１５および配列番号５２、または機能的に等価なそれらの変異体から選択されるポリヌクレオチドを含む請求項３９または４０に記載の方法。

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